Artykuł metodologiczny

Rozwój organoidów z przysadki mysiej jako modelu in vitro w celu zbadania biologii przysadkowych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/63431

⸱

25 lutego 2022

 ,  , 
1Laboratory of Tissue Plasticity in Health and Disease, Cluster of Stem Cell and Developmental Biology, Department of Development and Regeneration, Leuven Stem Cell Institute, KU Leuven (University of Leuven)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przysadka mózgowa jest kluczowym regulatorem układu hormonalnego organizmu. W artykule opisano rozwój organoidów z przysadki myszy jako nowatorski model 3D in vitro do badania populacji komórek macierzystych gruczołu, których biologia i funkcja pozostają słabo poznane.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przysadka mózgowa jest głównym gruczołem dokrewnym regulującym kluczowe procesy fizjologiczne, w tym wzrost ciała, metabolizm, dojrzewanie płciowe, reprodukcję i reakcję na stres. Ponad dekadę temu w przysadce mózgowej zidentyfikowano komórki macierzyste. Jednak pomimo zastosowania transgenicznych podejść in vivo, ich fenotyp, biologia i rola pozostają niejasne. Aby rozwiązać tę zagadkę, opracowano nowy i innowacyjny model organoidów in vitro, który pozwoli dogłębnie rozwikłać zagadkę biologii przysadki komórek macierzystych. Organoidy reprezentują struktury komórkowe 3D, które w określonych warunkach hodowli rozwijają się samoczynnie z (nabłonkowych) komórek macierzystych tkanki i podsumowują wiele cech charakterystycznych tych komórek macierzystych i ich tkanki. Pokazano tutaj, że organoidy pochodzące z przysadki myszy rozwijają się z komórek macierzystych gruczołu i wiernie odwzorowują ich cechy fenotypowe i funkcjonalne in vivo. Między innymi odtwarzają one stan aktywacji komórek macierzystych jako in vivo, który występuje w odpowiedzi na transgenicznie zadane uszkodzenia miejscowe. Organoidy są długotrwale rozszerzalne, zachowując jednocześnie swój fenotyp łodygi. Nowy model badawczy jest bardzo cenny dla rozszyfrowania fenotypu i zachowania komórek macierzystych w kluczowych warunkach przebudowy przysadki, od dojrzewania noworodków po zanikanie związane ze starzeniem się, od zdrowych do chorych gruczołów. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół mający na celu ustalenie organoidów pochodzących z przysadki myszy, które stanowią potężne narzędzie do zanurzenia się w tajemniczym jeszcze świecie przysadkowych komórek macierzystych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przysadka mózgowa to maleńki gruczoł dokrewny znajdujący się u podstawy mózgu, gdzie jest połączony z podwzgórzem. Gruczoł integruje wejścia obwodowe i ośrodkowe (podwzgórze) w celu wygenerowania dostrojonego i skoordynowanego uwalniania hormonów, regulując w ten sposób docelowe narządy dokrewne (takie jak nadnercza i gonady) w celu produkcji odpowiednich hormonów we właściwym czasie. Przysadka mózgowa jest kluczowym regulatorem układu hormonalnego i dlatego jest słusznie nazywana gruczołem głównym1.

Przysadka mysza składa się z trzech płatów (Rysunek 1), tj. płata przedniego (AL), płata pośredniego (IL) i płata tylnego (PL). Główny endokrynny AL zawiera pięć typów komórek hormonalnych, w tym somatotropy, które wytwarzają hormon wzrostu (GH); laktotropy wytwarzające prolaktynę (PRL); kortykotropy, które wydzielają hormon adrenokortykotropowy (ACTH); tyreotropy odpowiedzialne za produkcję hormonu tyreotropowego (TSH); oraz gonadotropy, które wytwarzają hormon luteinizujący (LH) i hormon folikulotropowy (FSH). PL składa się z wypustek aksonalnych z podwzgórza, w których przechowywane są hormony oksytocyna i wazopresyna (hormon antydiuretyczny). IL znajduje się pomiędzy AL i PL i zawiera melanotropy, które wytwarzają hormon stymulujący melanocyty (MSH). W ludzkiej przysadce mózgowej IL cofa się podczas rozwoju, a melanotropy rozprzestrzeniają się w AL1. Oprócz komórek endokrynnych, przysadka mózgowa zawiera również pulę komórek macierzystych, zasadniczo oznaczonych przez czynnik transkrypcyjny SOX22,3,4,5,6. Te komórki SOX2+ znajdują się w strefie brzeżnej (MZ), wyściółce nabłonka szczeliny (embrionalna pozostałość światła między AL i IL) lub są rozmieszczone jako skupiska w miąższu AL, proponując w ten sposób dwie nisze komórek macierzystych w gruczole (Rysunek 1)2,3,4,5,6.

Biorąc pod uwagę nieodzowną naturę przysadki mózgowej, nieprawidłowe działanie gruczołu wiąże się z poważną chorobowością. Nadczynność przysadki (charakteryzująca się nadmiernym wydzielaniem jednego lub więcej hormonów) i niedoczynność przysadki (wadliwa lub brakująca produkcja jednego lub więcej hormonów) mogą być spowodowane przez guzy neuroendokrynne przysadki (PitNETs; np. guzy wytwarzające ACTH prowadzące do choroby Cushinga) lub przez wady genetyczne (np. niedobór GH powodujący karłowatość)7. Ponadto chirurgia przysadki mózgowej (np. w celu usunięcia guzów), infekcje (np. gruźlica podwzgórze-przysadka lub infekcje po bakteryjnym zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych lub mózgu), zespół Sheehana (martwica spowodowana niewystarczającym przepływem krwi z powodu dużej utraty krwi podczas porodu), apopleksja przysadki i urazowe uszkodzenie mózgu to inne ważne przyczyny niedoczynności przysadki8. Wykazano, że przysadka mózgowa myszy posiada zdolność regeneracyjną, będąc w stanie naprawić miejscowe uszkodzenia wprowadzone przez transgeniczną ablację komórek endokrynnych9,10. Komórki macierzyste SOX2+ ostro reagują na zadane urazy, wykazując aktywowany fenotyp, charakteryzujący się zwiększoną proliferacją (prowadzącą do ekspansji komórek macierzystych) i zwiększoną ekspresją czynników i szlaków związanych z macierzystą (np. WNT / NOTCH). Co więcej, komórki macierzyste zaczynają wyrażać hormon, któremu uległa ablacja, co ostatecznie skutkuje znacznym przywróceniem zubożonej populacji komórek w ciągu następnych (5 do 6) miesięcy9,10. Ponadto, podczas fazy dojrzewania gruczołu noworodkowego (pierwsze 3 tygodnie po urodzeniu), przysadkowe komórki macierzyste rozwijają się w stanie aktywowanym6,11,12,13, podczas gdy starzenie się organizmu wiąże się ze spadkiem funkcjonalności komórek macierzystych in situ, z powodu rosnącego środowiska zapalnego (mikro) podczas starzenia się (lub 'inflammaging')10,14. Ponadto nowotworzenie gruczołu jest również związane z aktywacją komórek macierzystych7,15. Chociaż aktywacja komórek macierzystych została wykryta w kilku sytuacjach przebudowy przysadki mózgowej (przegląd w7,16), mechanizmy leżące u podstaw pozostają niejasne. Ponieważ podejścia in vivo (takie jak śledzenie linii u myszy transgenicznych) nie dostarczyły jasnego ani kompleksowego obrazu przysadkowych komórek macierzystych, niezbędne jest opracowanie wiarygodnych modeli in vitro w celu zbadania biologii komórek macierzystych w prawidłowej i chorej przysadce. Standardowa hodowla in vitro pierwotnych komórek macierzystych przysadki pozostaje niewystarczająca ze względu na bardzo ograniczoną zdolność wzrostu i niefizjologiczne (2D) warunki z szybką utratą fenotypu (bardziej szczegółowy przegląd można znaleźć w 16). Hodowle sferyczne 3D (przysadki mózgowe) zostały stworzone z komórek macierzystych przysadki mózgowej, zidentyfikowanych na podstawie populacji bocznej i fenotypu SOX2+2,3,4. Przysadki mózgowe wyrastają klonalnie z komórek macierzystych, wyrażają markery macierzyste i wykazują zdolność różnicowania się do typów komórek endokrynnych. Nie rozszerzają się one jednak znacząco, wykazując jedynie ograniczoną przechodniość (2-3 przejścia)3,4. Struktury podobne do kul uzyskano również z niezdysocjowanych klastrów przysadkowych komórek macierzystych, gdy hodowano je w 50% rozcieńczonym Matrigel przez 1 tydzień, ale nie wykazano rozszerzalności17. Podejście oparte na przysadce mózgowej jest najczęściej używane jako narzędzie do odczytu liczby komórek macierzystych, ale dalsze zastosowania są ograniczone przez gorszą zdolność ekspansji16.

Aby rozwiązać te niedociągnięcia, niedawno stworzono nowy model 3D, tj. organoidy, zaczynając od głównego endokrynologicznego AL myszy zawierającego MZ i miąższowe komórki macierzyste. Wykazano, że organoidy rzeczywiście pochodzą z komórek macierzystych przysadki mózgowej i wiernie oddają ich fenotyp18. Co więcej, organoidy są podatne na długotrwałą ekspansję, zachowując przy tym swoją naturę łodygi. W związku z tym stanowią niezawodną metodę ekspansji pierwotnych przysadkowych komórek macierzystych w celu dogłębnej eksploracji. Taka eksploracja nie jest osiągalna przy ograniczonej liczbie komórek macierzystych, które można wyizolować z przysadki mózgowej, które również nie są rozszerzalne w warunkach 2D16. Wykazano, że organoidy są cennymi i niezawodnymi narzędziami do odkrywania nowych cech przysadkowych komórek macierzystych (przekładających się na in vivo)14,18. Co ważne, model organoidowy wiernie odzwierciedla stan aktywacji przysadki komórek macierzystych występujący podczas miejscowego uszkodzenia tkanek i dojrzewania noworodków, wykazując zwiększoną wydajność tworzenia i replikację regulowanych w górę szlaków molekularnych14,18. W związku z tym model organoidów pochodzących z przysadki jest innowacyjnym i potężnym modelem badawczym biologii przysadkowych komórek macierzystych, a także narzędziem do odczytu aktywacji komórek macierzystych.

Ten protokół szczegółowo opisuje tworzenie organoidów pochodzących z przysadki myszy. W tym celu AL jest izolowany i dysocjowany na pojedyncze komórki, które są osadzone w Matrigel naśladującym macierz zewnątrzkomórkową (zwaną dalej ECM). Zespół komórka-ECM jest następnie hodowany w określonym pożywce, zasadniczo zawierającej czynniki wzrostu komórek macierzystych i regulatory embrionalne przysadki (dalej określane jako "przysadkowe podłoże organoidowe" (PitOM)18; Tabela 1). Gdy organoidy są w pełni rozwinięte (po 10-14 dniach), można je dalej namnażać poprzez sekwencyjne pasażowanie i poddawać szeroko zakrojonym dalszym badaniom (np. immunofluorescencja, RT-qPCR i transkryptomika masowa lub jednokomórkowa; Rysunek 1). W dłuższej perspektywie oczekuje się, że organoidy przysadki komórek macierzystych utorują drogę do metod naprawy tkanek i medycyny regeneracyjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Eksperymentów na Zwierzętach KU Leuven (P153/2018). Wszystkie myszy były trzymane w uniwersyteckim ośrodku dla zwierząt w znormalizowanych warunkach (stała temperatura 23 ± 1,5 °C, wilgotność względna 40%-60% i cykl dnia i nocy 12 godzin), z dostępem do wody i pożywienia ad libitum.

1. Myszy

  1. Używaj dostępnych na rynku szczepów myszy, takich jak myszy C57BL/6J, w wieku młodych dorosłych (8-12 tygodni). Ogólnie rzecz biorąc, 2-3 myszy zapewniają wystarczającą liczbę komórek AL do protokołu.

2. Izolacja i dysocjacja myszy AL

UWAGA: Średnie A, B i C są przygotowywane z wyprzedzeniem19,20. Składy przedstawiono w tabeli 2.

  1. Izolacja mysiego AL
    1. Poddaj myszy eutanazji przez uduszenie CO2 , a następnie ścięcie głowy (Ryc. 2A). Umyj głowy myszy wodą dejonizowaną, aby usunąć krew i spryskaj je 70% EtOH, aby wytworzyć sterylne środowisko.
    2. Za pomocą sterylnych narzędzi chirurgicznych usuń skórę głowy między uszami (Ryc. 2B).
    3. Otwórz czaszkę i usuń mózg.
      1. Złam "grzbiet nosowy" (tj. przednią część kości czołowej; Rysunek 2B) za pomocą sterylnych nożyczek.
      2. Otwórz czaszkę dalej nożyczkami, zaczynając od złamanego grzbietu nosa w kierunku uszu, po obu stronach (Rysunek 2C).
      3. Usuń czaszkę i mózg za pomocą sterylnej pęsety, nie dotykając przysadki mózgowej (Rysunek 2D).
    4. Usuń przeponę za pomocą pęsety, nie uszkadzając przysadki mózgowej. Odrzuć PL i IL z AL pod mikroskopem stereoskopowym.
      UWAGA: PL i IL są połączone, a tym samym usuwane jednocześnie. Części te wyglądają jak biała tkanka, w porównaniu z różowym AL (Rysunek 2D).
    5. Ostrożnie wyizolować AL pęsetą i zebrać go w kolbie Erlenmeyera o pojemności 10 ml, wypełnionej 3 ml pożywki A (patrz Tabela 2). Umieścić kolbę na lodzie do czasu dalszej obróbki.
  2. Dysocjacja AL myszy
    1. Usunąć sklarowaną nad osadem (SN) pożywkę A z kolby Erlenmeyera zawierającej wyizolowany AL. Dodać 2 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) 2,5% roztworu trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
    2. Nie usuwając roztworu trypsyny, dodać 2 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) roztworu DNazy (2 μg/ml w pożywce A; sterylnie przefiltrowanej przez siatkę 0,22 μm) i zamieszać kolbę Erlenmeyera 10 razy. Pozwól, aby przysadka opadła na dno (~1 min) i usuń SN.
    3. Dodać 2 ml podgrzanego (37 °C) roztworu inhibitora trypsyny (0,1 mg/ml w pożywce A; sterylnie przefiltrowanym przez siatkę 0,22 μm) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Niech przysadka osadza się na dnie i usuń SN.
    4. Dodać 2 ml podgrzanego (37 °C) podłoża B (patrz tabela 2) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Nie usuwając SN, dodać 2 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) podłoża C (patrz tabela 2) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
    5. Pozwól, aby przysadka opadła na dno i usuń SN. Przepłukać przysadkę trzykrotnie podgrzanym (37 °C) medium C.
    6. Dysocjuj przysadkę mózgową na pojedyncze komórki.
      1. Dodać 2 ml podgrzanego (37 °C) podłoża C. Kilkakrotnie odessać i wydalić przysadkę mózgową sterylną, wypolerowaną płomieniowo pipetą Pasteura, aż fragmenty przestaną być widoczne.
      2. Przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 15 ml z 4,5 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) roztworu DNazy (2 μg/ml w pożywce A; sterylnie przefiltrowane przez siatkę 0,22 μm). Przepłukać Erlenmeyera trzykrotnie 2 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) podłoża C i przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 15 ml.
    7. Wymieszaj zebraną zawiesinę komórek i przefiltruj ją przez sitko o pojemności 40 μm do probówki o pojemności 30 ml. Przepłukać trzykrotnie probówkę o pojemności 15 ml i sitko do komórek 2 ml pożywki C i przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 30 ml.
    8. Umieścić końcówkę szklanej pipety Pasteura, wypełnioną 2 ml 3% roztworu albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (w pożywce A; sterylnie przefiltrowanej przez siatkę 0,22 μm) na dnie probówki i delikatnie odpipetować, aby utworzyć widoczną warstwę gęstości. Wirować przy 190 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    9. Usuń SN, odwracając rurkę jednym płynnym ruchem i usuń pozostałe kropelki SN za pomocą końcówki P1000. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml lodowatego Advanced DMEM/F12 (Adv DMEM/F12) i oznaczyć ilościowo komórki za pomocą licznika komórek.

3. Zakładanie i hodowla organoidów pochodzących z AL

UWAGA: Rozmrozić ECM na lodzie z wyprzedzeniem (2-3 godziny na 1 ml) i trzymać go na lodzie przez cały czas trwania protokołu.

  1. Siew i hodowla organoidów
    1. Odwirować zawiesinę komórek AL o stężeniu 190 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i usunąć SN. Ponownie zawiesić osad komórkowy w Adv DMEM/F12, używając objętości właściwej obliczonej w celu osiągnięcia gęstości komórek 1,1 x 106 komórek/mL.
      UWAGA: Na przykład, jeśli zawiesina komórek zawiera 500 000 komórek/ml, należy ponownie zawiesić osad komórkowy w 454,54 μl Adv DMEM/F12, aby osiągnąć pożądaną gęstość 1,1 x 106 komórek/ml.
    2. Pobrać objętość zawiesiny komórek potrzebną do posiewu (zgodnie z pożądaną liczbą dołków do wysiewu w celu rozwoju organoidów) i dodać ECM w stosunku 30:70 (30% zawiesiny komórek (w Adv DMEM/F12 ) i 70% ECM). Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół.
      UWAGA: Na przykład, dla jednej kropli 30 μL (patrz krok 3.1.3), należy (delikatnie) zmieszać 9 μl zawiesiny komórkowej (zawierającej ~10 000 komórek pobranych z zawiesiny 1,1 x 106 komórek/ml) z 21 μl ECM.
    3. Na każdy studzienek należy nanieść 30 μl kropli mieszaniny zawiesiny komórek/ECM (patrz krok 3.1.2) na wstępnie ogrzaną (37 °C) 48-dołkową płytkę. Odwrócić płytkę do góry nogami i pozostawić ECM do zestalenia się w temperaturze 37 °C przez 20 minut
      UWAGA: Wstępnie podgrzej płytki hodowlane przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 37 °C.
    4. Przywróć płytkę do właściwej orientacji i ostrożnie dodaj 250 μl wstępnie podgrzanego (37 °C) PitOM (patrz Tabela 1) uzupełnionego 10 μM inhibitorem skał (Y-27632).
    5. Kontynuuj hodowlę organoidów, zmieniając podłoże (pozbawione Y-27632) co 2-3 dni, aż organoidy będą w pełni rozwinięte, co zajmuje od 10 do 14 dni (Rysunek 3A). Następnie przełóż organoidy.
      UWAGA: Podczas zasysania medium należy uważać, aby nie zakłócić pracy kopuły ECM. Lekko przechyl płytkę hodowlaną i usuń pożywkę z dolnej krawędzi studzienki. Świeże (podgrzane w temperaturze 37 °C) podłoże należy delikatnie dodać na bok studzienki. Jeśli kropelki żelu odczepią się, zebrać organoidy i ponownie je zawiesić, a następnie ponownie wyhodować w nowej kropli ECM.
  2. Pasażowanie organoidów
    1. Delikatnie odessać pożywkę i dodać 400 μl lodowatego Adv DMEM/F12 w celu rozdrobnienia ECM i zebrania organoidów w probówce do mikrowirówki. Przemyć raz 400 μl lodowatego Adv DMEM/F12 EM. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Ostrożnie usunąć SN i dodać 400 μl podgrzanego (37 °C) enzymu TrypLE Express (1X). Wymieszać kilkakrotnie odwracając probówkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    3. Dodać 400 μl lodowatego Adv DMEM/F12 i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć SN.
    4. Zawiesić osad w 100 μl lodowatego Adv DMEM/F12, a następnie rozbić organoidy poprzez energiczne pipetowanie w górę iw dół zwężoną końcówką P200 (tj. docisnąć pustą końcówkę do dna probówki do mikrowirówki, aby zmniejszyć jej średnicę otworu), aż do uzyskania fragmentów organoidów (o średnicy około 50 μm) (Rysunek 3B).
      UWAGA: Mieszanina dysocjująca powinna zawierać głównie fragmenty organoidów i tylko kilka pojedynczych komórek. Ostra dysocjacja organoidów na pojedyncze komórki negatywnie wpływa na ponowny wzrost organoidów.
    5. Dodać 800 μl Adv DMEM/F12 i odwirować przy 190 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć SN.
    6. Pasaż organoidy w stosunku 1:2 do 1:4. Ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości Adv DMEM/F12 zgodnie z potrzebami do posiewu i dodać ECM w stosunku 30:70 (30% zawiesiny komórek i 70% ECM). Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół.
    7. Wysiewanie nasion i hodowla organoidów zgodnie z powyższym opisem w krokach 3.1.3-3.1.5.
      UWAGA: Średnio z 10 000 wysianych komórek całego AL (0,2%) rozwija się średnio 20 organoidów na studzienkę. Te organoidy pasażowe 0 można podzielić w stosunku 1:2, co daje >50 organoidów rozwijających się na dołek (pasaż 1). Organoidy mogą być następnie dzielone w stosunku 1:2 do 1:4 podczas kolejnych pasaży. Ponowny wzrost organoidów spowalnia po ~10 pasażach (co odpowiada 3 miesiącom hodowli), konkretyzując się w stopniowo coraz mniejszej liczbie i mniejszych organoidach.

4. Kriokonserwacja organoidów pochodzących z AL i ich rozmrażanie

  1. Kriokonserwacja organoidów
    1. Postępuj zgodnie z protokołem przejścia od kroku 3.2.1 do kroku 3.2.5.
    2. Zawiesić osad organoidowy (zawierający fragmenty i komórki) w 1 ml pożywki do kriokonserwacji (Tabela 3). Przenieść zawiesinę do kriowialnego i umieścić na lodzie.
      UWAGA: Organoidy (tj. powstałe fragmenty i komórki) z maksymalnie czterech dołków 48-dołkowej płytki można połączyć w jednym kriowialu.
    3. Umieścić kriowiale w pojemniku do zamrażania i przenieść je do temperatury -80 °C.
    4. Po 24 godzinach przenieść próbki do krioboxu i przechowywać je w ciekłym azocie (-196 °C) do długotrwałego przechowywania.
  2. Rozmrażanie kriokonserwowanych organoidów
    1. Wyjmij kriowial ze zbiornika ciekłego azotu i umieść go na lodzie. Natychmiast przejdź do protokołu rozmrażania.
    2. Rozmrozić roztwór z kriokonserwowanymi fragmentami organoidów i pojedynczymi komórkami w temperaturze 37 °C (łaźnia wodna).
      UWAGA: Nie przechowywać roztworu dłużej niż 2 minuty w temperaturze 37 °C, aby uniknąć toksyczności komórek przez DMSO.
    3. Przenieść zawartość do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml lodowatego Adv DMEM/F12 z 30% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Przepłukać kriowial 1 ml Adv DMEM/F12 z 30% FBS.
    4. Wirować przy 190 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 1 ml lodowatego Adv DMEM/F12 i przenieść zawiesinę do probówki do mikrowirówki.
    5. Wirować przy 190 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w odpowiedniej objętości Adv DMEM/F12 zgodnie z potrzebami do posiewu i dodać ECM w stosunku 30:70. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół.
    6. Wysiewanie nasion i hodowla organoidów zgodnie z powyższym opisem w krokach 3.1.3–3.1.5.

5. Walidacja organoidów pochodzących z AL

  1. Pobieranie i liza organoidów do izolacji RNA
    1. Zebrać i odwirować organoidy w sposób opisany powyżej (etap 3.2.1).
    2. Usunąć SN i dodać 350 μl buforu do lizy z 1% 2-merkaptoetanolem. Wirować przez 30 s i przechowywać w temperaturze -80 °C lub natychmiast przejść do izolacji RNA.
      UWAGA: Należy pamiętać, że 2-merkaptoetanol jest związkiem toksycznym. Wszystkie prace należy wykonywać w okapie oparów chemicznych w rękawicach nitrylowych, masce przeciwpyłowej i okularach ochronnych. 2-merkaptoetanol może powodować nieodwracalne uszkodzenia oczu i skóry.
  2. Utrwalanie i osadzanie organoidów do barwienia immunohistochemicznego/fluorescencyjnego
    1. Zebrać i odwirować organoidy w sposób opisany powyżej (etap 3.2.1).
    2. Usuń SN, dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) na wytrząsarce orbitalnej (100 obr./min).
      UWAGA: PFA jest znanym czynnikiem rakotwórczym dla ludzi, który może powodować nieodwracalne uszkodzenie rogówki. Wszystkie prace należy wykonywać w dygestoriach chemicznych. Należy zawsze nosić rękawice nitrylowe i okulary ochronne.
    3. Wirować przy 200 x g przez 5 minut i usunąć SN. Dodać 1 ml PBS, inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej (100 obr./min) i odwirować przy 90 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Powtórzyć etap mycia dwukrotnie. Przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C.
    4. W celu przetworzenia tkanek i odwodnienia usuń SN i dodaj 150 μl 2% żelu agarozowego (w PBS) do osadu organoidowego za pomocą wstępnie podgrzanej, poszerzonej końcówki p200 (wykonanej przez odcięcie małego kawałka końcówki). Natychmiast odpipetować całą objętość i wysunąć do pokrywy probówki do mikrowirówki.
      UWAGA: Ważne jest, aby pracować szybko, ponieważ żel zawierający organoidy szybko zastygnie.
    5. Pozwól żelowi mocno zestalić się przez 30 minut i przenieś krążek żelu do kasety histologicznej. Zanurz i przechowuj w 50% EtOH, aż do odwodnienia w procesorze tkankowym.
    6. W celu zatopienia parafiny umieścić krążek żelu (za pomocą kleszczy) w formie do zatapiania i wypełnić ciepłą parafiną (60 °C). Umieść foremki w temperaturze 4 °C, aż parafina stanie się twarda (około 45 min). Próbki te mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C lub mogą być natychmiast poddane podziałowi.
    7. Mikrotomować bloki parafinowe zawierające organoidy o grubości 5 μm i pobrać próbki na szkiełkach podstawowych. Dodaj jedną kroplę wody dejonizowanej pod każdą sekcję, aby umożliwić prawidłowe rozciągnięcie sekcji i umieść szkiełka na płaskiej płycie grzewczej w temperaturze 37 °C przez noc. Przechowywać szkiełka z sekcjami w temperaturze 4 °C lub bezpośrednio kontynuować barwienie immunohistochemiczne lub immunofluorescencyjne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po izolacji i dysocjacji AL, uzyskane pojedyncze komórki są umieszczane w ECM i hodowane w PitOM (Rysunek 1, Tabela 1). Rysunek 3A przedstawia hodowlę komórkową i gęstość podczas siewu (Dzień 0). Mogą być tam obecne drobne odłamki (Rysunek 3A, białe groty strzałek), ale znikną one po przejściu. Czternaście dni po wysianiu organoidy pochodzące z AL są w pełni rozwinięte (Rysunek 3A). Organoidy wykazują torbielowatą morfologię,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoidy pochodzące z AL, jak opisano tutaj, stanowią potężny model badawczy do badania przysadkowych komórek macierzystych in vitro. Obecnie to podejście organoidalne jest jedynym dostępnym narzędziem do niezawodnego i solidnego wzrostu i ekspansji pierwotnych przysadkowych komórek macierzystych. Model organoidu przysadki pochodzący z embrionalnych komórek macierzystych (ESC) lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) został opisany wcześniej, co ściśle podsumowuje organogenezę zarodkową ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Funduszu Badawczego KU Leuven i Funduszu Badań Naukowych (FWO) - Flandria. E.L. (11A3320N), i C.N. (1S14218N) są wspierane przez stypendium doktoranckie z FWO/FWO-SB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanolSigma-AldrichM6250
48-dołkowe płytki, poddane obróbce TC, pakowane pojedynczoCostar734-1607
A83-01Sigma-AldrichSML0788
Advanced DMEM/F12Gibco12634010
Albumina bydlęca (klasa hodowli komórkowych)Suplement Serva47330
B-27 ( 50X), bez witaminy AFormy bazowe Gibco12587010
VWR720-1918
Bufor RLTQiagen79216
Kasety, Q Path MicrotwinVWR720-2191
Sitko do komórek, 40 i mikro; m siatka, jednorazowaFalcon352340
Toksyna z Vibrio choleraeSigma-AldrichC8052
Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydłaSigma-AldrichD5025
D-glukozaMerck108342
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650
DMEM, proszek, rurkiEppendorf52100039 Safe-Lock
, 1,5 ml
Epredia SuperFrost Plus ThermoFisher ScientificJ1800AMNZ
Stacja robocza do osadzania Epredia HistoStar, 220 do 240 V ACThermo Fisher Scientific12587976
Absolut etanolu 99,8+%Thermo Fisher Scientific
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma-AldrichF7524
GlutaMAX SuplementGibco35050061
HEPESSigma-AldrichH4034
HEPES Roztwór buforowyGibco15630056
InSolution Y-27632Sigma-Aldrich688001
L-Glutamina (200 mM)Gibco25030081
Matrigel Matryca membrany podstawnej o obniżonym czynniku wzrostu (GFR), bez LDEVPojemnik
Mr. FrostyThermo Fisher Scientific5100-0001
100X)Thermo Fisher Scientific17502048
N-acetylo-L-cysteinaSigma-AldrichA7250
Nunc Biobank i hodowle komórkowe Probówki kriogeniczneThermo Fisher Scientific375353
Paraformaldehyd do syntezy (PFA)Merck818715
PBS, pH 7,4Gibco10010023
Sól sodowa penicyliny GSigma-AldrichP3032
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Gibco15140122
Czerwień fenolowaMerck107241
Chlorek potasu (KCl)
Merck, CFR& Systemy D236-EG
Rekombinowany ludzki FGF zasadowy/FGF2/bFGF (157 aa) BiałkoR& Systemy D234-FSE
Rekombinowany ludzki FGF-10Peprotech100-26
Rekombinowany ludzki IGF-1Peprotech100-11
Rekombinowany ludzki IL-6Peprotech200-06
Rekombinowany ludzki NogginPeprotech120-10C
Rekombinowany ludzki R-Spondin-1Peprotech120-38
Rekombinowany człowiek/mysz FGF-8bPeprotech100-25
Rekombinowana mysz Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-EndusR& D systems464-SH
RNeasy micro kitQiagen74004
SB202190Sigma-AldrichS7067
SeaKem LE AgarozaLonza50004
Chlorek sodu (NaCl)BDH102415K
Sodu Di-wodorofosforan 1-hydratPanReac-AppliChemA1047
Sód Wodorowęglan (NaHCO3)Merck106329
pirogronian sodu (C3H3NaO3)Sigma-AldrichP5280
Stericup-GP, 0,22 i mikro; mMilliporeSCGPU02RE
Steriflip-GP Sterylny filtr górny z probówką wirówkową, 0,22 & mu; mMilliporeSCGP00525
Sterylna wodaFreseniusB230531
Sól siarczanu streptomycynySigma-AldrichS6501
Thermo Scientific Excelsior ES Procesor tkanekThermo Scientific12505356
Titriplex IIIMerck108418
TrypL Express Enzyme (1X), czerwień fenolowaThermo Fisher Scientific12605028
Inhibitor trypsyny z Glycine max (soja)Sigma-AldrichT9003
Roztwór trypsyny 2,5 %Thermo Fisher Scientific15090046
o wysokiej zawartości glukozy Szkiełka adhezyjne Eppendorf 30120086 10342652 do zamrażania Corning 15505739 Suplement N-2 (Rekombinowane ludzkie białko EGF 104936

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melmed, S. The pituitary. 3rd ed. , Elsevier/Academic Press. Cambridge. 1(2011).
  2. Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
  3. Chen, J., et al. Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection. Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).
  4. Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).
  5. Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand. Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).
  6. Andoniadou, C. L., et al. Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential. Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).
  7. Nys, C., Vankelecom, H. Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved. Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176(2021).
  8. Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E. Hypopituitarism. Lancet. 369 (9571), 1461-1470 (2007).
  9. Fu, Q., et al. The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration. Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).
  10. Willems, C., et al. Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis. Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).
  11. Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland. Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).
  12. Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland. Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).
  13. Russell, J. P., et al. Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells. eLife. 10 (1), 59142(2021).
  14. Vennekens, A., et al. Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118(2021).
  15. Mertens, F., et al. Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics. Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).
  16. Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved. Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519(2021).
  17. Yoshida, S., et al. Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe. Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).
  18. Cox, B., et al. Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
  19. Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation. Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).
  20. Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates. Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).
  21. Claes, C., et al. Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2. Alzheimer's and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).
  22. Trompeter, H. -I., et al. MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood. BMC Genomics. 14, 111(2013).
  23. Suga, H., et al. Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture. Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).
  24. Matsumoto, R., et al. Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).
  25. Kanie, K., et al. Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells. Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).
  26. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
  27. Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
  28. Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment. Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Organoidy przysadkimacierzyste kom rki przysadkihodowla organoid wmarkery nab onkowebarwienie immunofluorescencyjnepasa owanie organoid wmorfologia torbielowatamarkery pluripotencji

Powiązane artykuły