Artykuł metodologiczny

Metoda podwójnego barwienia do wykrywania pektyn w interakcji roślina-grzyb

4.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63432

⸱

4 lutego 2022

 , 
1Faculty of Animal Science and Food Engineering, Department of Basic Sciences, University of São Paulo, 2Laboratory of Nuclear Instrumentation, Center of Nuclear Energy in Agriculture, University of São Paulo

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje mikroskopijną metodę wykrywania pektyn w interakcji między kawą a grzybem.

Streszczenie

Komórki roślinne używają różnych mechanizmów strukturalnych, konstytutywnych lub indukowalnych, aby bronić się przed infekcją grzybiczą. Enkapsulacja jest skutecznym, indukowalnym mechanizmem izolowania haustorii grzyba od protoplastu komórki roślinnej. I odwrotnie, pektyna, jeden z polimerowych składników ściany komórkowej, jest celem kilku enzymów pektolitycznych w interakcjach nekrotroficznych. W tym miejscu przedstawiono protokół wykrywania pektyn i strzępek grzybów za pomocą mikroskopii optycznej. Badana jest bogata w pektyny enkapsulacja w komórkach liści kawy zakażonych grzybem rdzy Hemileia vastatrix oraz modyfikacja ściany komórkowej mezofilu indukowana przez Cercospora coffeicola. Uszkodzone próbki liści utrwalono roztworem Karnovsky'ego, odwodniono i zatopiono w metakrylanie glikolu na 2-4 dni. Po wszystkich krokach przeprowadzono pompowanie próżniowe w celu usunięcia powietrza z przestrzeni międzykomórkowych i poprawy procesu osadzania. Osadzone bloki podzielono na sekcje o grubości 5-7 μm, które osadzano na szkiełku pokrytym wodą, a następnie podgrzewano w temperaturze 40 °C przez 30 minut. Następnie szkiełka zostały podwójnie wybarwione 5% błękitem bawełnianym w laktofenolu w celu wykrycia grzyba i 0,05% czerwieni rutenowej w wodzie w celu wykrycia pektyn (kwaśnych grup kwasów poliuronowych pektyny). Stwierdzono, że grzyby haustoria Hemileia vastatrix są otoczone pektyną. W cerkosporze kawy komórki mezofilu wykazywały rozpuszczanie ścian komórkowych, obserwowano strzępki międzykomórkowe i konidiofory. Przedstawiona tutaj metoda jest skuteczna w wykrywaniu odpowiedzi związanej z pektynami w interakcji roślina-grzyb.

Wprowadzenie

Mechanizmy obronne ściany komórkowej u roślin są kluczowe dla powstrzymania infekcji grzybiczych. Badania wykazały zmiany w grubości i składzie ścian komórkowych od XIX wieku"xref">1,2. Zmiany te mogą być wywołane przez patogen grzybowy, który stymuluje tworzenie brodawki, która zapobiega przedostawaniu się grzybów do komórki lub może być wykorzystana do enkapsulacji strzępek w celu wyizolowania protoplastu komórki gospodarza od haustorii grzyba. Wytwarzanie dynamicznej bariery ściany komórkowej (tj. brodawek i całkowicie zamkniętego haustorium) jest ważne dla promowania odporności roślin3. Badania histopatologiczne nad chorobami związanymi z grzybami badały występowanie tych mechanizmów i opisały polimery ściany komórkowej, celulozę, hemicelulozę (arabinoksylany) i kallozę jako mechanizmy odporności na atak grzybów4,5,6,7.

Ściana komórkowa jest pierwszą barierą przed atakiem mikroorganizmów, utrudniając interakcję roślina-grzyb. Polisacharydy pektynowe tworzą ścianę komórkową i stanowią około 30% składu ściany komórkowej w pierwotnych komórkach roślin dwuliściennych, w których homogalakturonany są najliczniejszym polimerem (około 60%)8. Golgi wydziela złożone związki pektynowe, które składają się na łańcuchy kwasu galakturonowego, które mogą, ale nie muszą być metylowane8,9. Od 2012 r. w literaturze zwraca się uwagę, że stopień estryfikacji metylowej pektyn ma kluczowe znaczenie dla określenia zgodności podczas infekcji przez mikrobiologiczne enzymy pektynowe10,11,12. W związku z tym wymagane są protokoły weryfikacji obecności i rozmieszczenia związków pektynowych w patosystemach roślinno-grzybowych.

Różne techniki zostały użyte do wykrycia enkapsulacji brodawek lub haustorii. Stosowanymi metodami referencyjnymi są transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) tkanek utrwalonych oraz mikroskopia świetlna tkanek żywych i utrwalonych. Jeśli chodzi o TEM, kilka badań wykazało strukturalną rolę apozycji ściany komórkowej w odporności na grzyby13,14,15,16, oraz że stosowanie lektyn i przeciwciał jest skomplikowaną metodą lokalizacji polimerów węglowodanowych16. Jednak badania pokazują, że mikroskopia świetlna jest ważnym podejściem, a narzędzia histochemiczne i immunohistochemiczne pozwalają lepiej zrozumieć skład brodawek i powłoki haustorium6,7.

Grzyby chorobotwórcze prezentują dwa główne typy stylu życia: biotroficzny i nekrotroficzny. Grzyby biotroficzne są zależne od żywych komórek, podczas gdy grzyby nekrotroficzne zabijają komórki gospodarza, a następnie żyją w martwych tkankach17. W Ameryce Łacińskiej rdza liści kawy, wywoływana przez grzyba Hemileia vastatrix, jest ważną chorobą upraw kawy18,19. Hemileia vastatrix wykazuje zachowanie biotroficzne, a wśród zmian strukturalnych obserwowanych u odpornych gatunków lub odmian kawy odnotowano reakcję nadwrażliwości, odkładanie się modelozy, celulozy i ligniny na ścianach komórkowych, a także przerost komórek14. Według wiedzy autorów, w literaturze nie ma informacji na temat znaczenia pektyn w odporności kawy na rdzę. Z drugiej strony, grzyby nekrotroficzne, które powodują cerkospomoriozę, atakują pektyny za pośrednictwem zestawu enzymów związanych z degradacją ściany komórkowej, takich jak pektynazy i poligalakturonaza20. Cerkospomorze w kawie, wywoływana przez grzyba Cercospora coffeicola, jest również poważnym zagrożeniem dla upraw kawy21,22. Grzyb ten powoduje zmiany nekrotyczne zarówno w liściach, jak i jagodach. Po penetracji C. coffeicola kolonizuje tkanki roślinne poprzez szlaki wewnątrzkomórkowe i międzykomórkowe23,24,25.

Obecny protokół bada obecność struktur grzybowych i pektyn na ścianach komórkowych. Protokół ten jest przydatny do identyfikacji reakcji roślin związanej z pektyną (barwioną czerwonym barwnikiem rutenowym, który jest specyficzny dla kwaśnych grup kwasów poliuronowych pektyny), indukowaną przez gospodarza w biotroficznej interakcji z grzybem. Pomaga również zweryfikować wpływ grzybów nekrotroficznych na degradację pektynowych ścian komórkowych. Obecne wyniki wskazują, że metoda podwójnego barwienia jest skuteczna w rozróżnianiu struktur i fazy rozrodczej grzybów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie roztworu buforowego i odczynników

  1. Przygotować 2 M bufor kakodylowy, dodając 4,28 g kakodylanu sodu do 100 ml wody destylowanej i dostosować pH do 7,25 za pomocą 0,2 N HCl.
  2. Przygotować 100 ml roztworu utrwalającego Karnovsky'ego, mieszając 10 ml 25% wodnego aldehydu glutarowego, 10 ml 10% wodnego roztworu formaldehydu, 25 ml 2 M buforu kakodylowego i 0,5 ml 0,5 M CaCl226. Uzupełnić objętość do 100 ml wodą destylowaną.
    UWAGA: Roztwór można przechowywać w lodówce przez 6 miesięcy.
    UWAGA: Roztwór buforujący kakodylan jest toksyczny; Dlatego roztwór utrwalający należy obchodzić się z wyciągiem lub na otwartej przestrzeni. Unikać wdychania oparów roztworu i nosić rękawice podczas obchodzenia się z roztworem.
  3. Przygotować wodny roztwór odżywczy Hoaglanda, mieszając następujące elementy: 3 mM Ca(NO3)2.4H 2O, 2 mM NH4H2PO4, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H 2O, 9.07 mM MnSO4, 0.765 mM ZnSO4.7H 2O, 46.4 mM H3BO3, 0,09 mM na2MoO4. H2O, 0,01 mMCuSO4 i 36 mM FeSO 4,7H2 O jako żelazo-EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)27.

2. Próbki roślin i inokulacja grzybów

UWAGA: Do eksperymentów na liściach dotkniętych rdzą kawy, wyhodowano pięć 2-miesięcznych sadzonek Coffee arabica odmiany Catuaí i trzymano je w szklarni w Centrum Energii Jądrowej w Rolnictwie (CENA) Uniwersytetu w São Paulo, Piracicaba, stan São Paulo, Brazylia.

  1. Uprawiaj krzewy kawy w plastikowych doniczkach o pojemności 500 ml wypełnionych wodnym roztworem odżywczym Hoagland (pH ~5,5) przez 4 miesiące w komorze wzrostowej utrzymywanej w temperaturze 27 ± 3 °C z 12-godzinnym fotoperiodem utworzonym przez lampy LED przy strumieniu fotonów 250 μmol fotonów s-1 m-2. Pożywkę Hoagland należy wymieniać co tydzień przez 4 miesiące.
  2. Zaszczepić cztery ekspandowane liście z pięciu roślin na ich powierzchni aosijalnej za pomocą uredospor 1 x 103 H. vastatrix zgodnie z metodą opisaną w reference28. Po zaszczepieniu trzymaj rośliny przez 48 godzin w ciemności, przykrywając je czarną plastikową torbą. Zbierz zmiany chorobowe 30 dni po zaszczepieniu.
  3. Zbiory charakterystycznych zmian spowodowanych przez Cercospora coffeicola z Coffea arabica cv. Obatã rośliny zlokalizowane (współrzędne: -22.906506126269942, -47.015075902025266) w Instytucie Biologicznym, Campinas, stan São Paulo, Brazylia. Przed przetworzeniem próbki należy przeanalizować zmiany chorobowe w mikroskopie stereoskopowym, aby zweryfikować obecność kawy C. coffeicola conidia. Następnie zamontuj kilka slajdów z konidiami, aby potwierdzić etiologię choroby22.

3. Pobieranie próbek, utrwalanie i odwadnianie

  1. Za pomocą skalpela i pęsety zbierz próbkę liści o wielkości ~10 mm2 w środkowej części zmiany (żółte plamy; Rysunek 1) i zanurz go w 30 ml roztworu utrwalającego Karnovsky'ego (Rysunek 1 i Rysunek 2A). Etap utrwalania może odbywać się w lodówce przez 48 godzin.
  2. Co najmniej czterokrotnie należy poddać próbkę liści działaniu niskiej próżni (500-600 mBar) za pomocą pompy olejowej przez 15 minut każda, aby zwiększyć przepuszczalność roztworu utrwalającego w tkance liścia. Wykonaj ten krok z rotacją próbki (Rysunek 1).
  3. Po utrwaleniu przemyć próbkę liści trzykrotnie w 0,5 M buforze kakodylowym (pH 7,2) rozcieńczonym w wodzie destylowanej przez 5 minut każdy, a następnie przenieść ją do stopniowanej serii etanolowej (30%, 50%, 70%, 90% (2x) i 100% (2x)) przez 15 minut przy każdym stężeniu etanolu (Rysunek 1 i Rysunek 2B).

4. Procedura osadzania Historesin

  1. Stopniowo przenoś próbki do metakrylanu glikolu (GMA) w trzech etapach, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Najpierw przygotuj roztwór A, mieszając proszek GMA (1 g) ze 100 ml żywicy zasadowej (zestaw himagazynin; Tabela materiałów) pod mieszaniem magnetycznym, a następnie wykonaj poniższe czynności.
    1. Zanurz próbki w roztworze A w stosunku 1:2: 100% etanol na 3 godziny.
    2. Zanurz próbki w roztworze A w stosunku 1:1: 100% etanol na 3 godziny.
    3. Zanurz próbki w czystej żywicy zasadowej na 2-4 dni. Na tym etapie należy poddać próbki działaniu niskiej próżni co najmniej cztery razy dziennie przez 15 minut, a następnie obrócić.

5. Polimeryzacja

UWAGA: Proces polimeryzacji wymaga 1,2 ml plastikowych form, podstawowej żywicy i utwardzacza (szczegóły dotyczące zestawu komercyjnego znajdują się w Tabeli Materiałów).

  1. Zmieszać 15 ml roztworu A (krok 4.1) z 1 ml utwardzacza w zlewce obracającej się przez 2 minuty, aby otrzymać roztwór polimeryzacyjny (roztwór B).
  2. Umieść 1,2 ml roztworu polimeryzacyjnego (roztwór B) w plastikowych foremkach. Za pomocą drewnianego kilofa przenieś uszkodzone próbki liści z czystej żywicy zasadowej do roztworu B (Rysunek 2C). Unikaj używania pęsety, ponieważ może to spowodować zgniecenie tkanki.
  3. Upewnij się, że próbki liści są szybko ustawione prostopadle do plastikowych form, ponieważ roztwór B szybko staje się lepki w ciągu 5 minut. W jednej formie można umieścić więcej niż jedną próbkę liści z uszkodzeniami.
    UWAGA: Zaleca się kilkukrotne przećwiczenie powyższego kroku przed złożeniem wniosku o wiele próbek. Gdy jest wiele próbek, czas polimeryzacji jest różny w zależności od formy, a prostopadła orientacja próbek liści może być trudna do osiągnięcia.
  4. Po osiągnięciu prostopadłej orientacji próbek liści odczekaj 30 minut, a następnie przenieś plastikową formę do plastikowej lub szklanej komory zawierającej żel krzemionkowy, aby zapobiec wilgoci. Poczekaj 2-3 godziny na polimeryzację.
  5. Gdy żywica i próbka liścia zostaną spolimeryzowane po okresie 2-3 godzin, odłącz powstały blok od plastikowej formy, szlifując podstawę bloku pilnikiem szlifierskim. Następnie przyklej klocek do kawałka drewna (Rysunek 2D).

6. Podział na sekcje

  1. Za pomocą mikrotomu obrotowego wyposażonego w stalowe ostrza o średnicy 8 cm (Rysunek 2E), pokrój blok na odcinki o grubości 5 μm. Umieść skrawki na szkiełkach pokrytych wodą destylowaną. Przenieść szkiełka z sekcjami unoszącymi się nad wodą na płytę grzejną w temperaturze 40 °C w celu wyschnięcia i zwiększenia przyczepności sekcji do szkiełek.
  2. Po wyschnięciu (Rysunek 2F), oznacz szkiełka nazwą odniesienia do bloku i numerem slajdu.

7. Proces podwójnego barwienia

  1. Przykryj sekcje 2 ml 5% błękitu bawełnianego w laktofenolu (40% glicerolu, 20% fenolu i 20% kwasu mlekowego w wodzie) i podgrzej je na gorącej płycie w temperaturze 45 °C przez 5 minut (Rysunek 3A).
  2. Usuń nadmiar barwnika, myjąc szkiełko trzykrotnie w zlewce wypełnionej wodą destylowaną (Rysunek 3B-D).
  3. Zabarwić 2 ml 0,01% czerwieni rutenowej w wodzie przez 1 minutę (Rysunek 3E).
  4. Usuń nadmiar barwnika, myjąc szkiełko trzykrotnie w zlewce wypełnionej wodą destylowaną (Rysunek 3F,G).
  5. Umieść kroplę wody destylowanej na skrawki i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 mm x 60 mm w celu przeprowadzenia analizy mikroskopowej w świetle.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Barwienie błękitem bawełnianym w laktofenolu na przekrojach zatopionych w GMA ujawniło obecność kilku struktur grzybowych pomiędzy i wewnątrz komórek mezofylu kawy w przypadku zarówno biotroficznych, jak i nekrotroficznych interakcji grzybowych.

W biotroficznym patosystemie, po zastosowaniu metody podwójnego barwienia, strzępki Hemileia vastatrix zawierające ściany komórkowe i gęstą treść protoplastu wybarwiają się na ciemnoniebiesko zarówno w parenchymie gąbczastej, jak i palisadowej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszej pracy przedstawiono alternatywny test histochemiczny z podwójnym barwieniem w celu zbadania składu pektyn ścian komórkowych otaczających haustorię w biotroficznym patosystemie. Celem jest również wykazanie skuteczności metody w wykrywaniu grzybów nekrotroficznych i wywołanych przez nich zmian w ścianie komórkowej. Tutaj pektyny ścian komórkowych miąższu kawy mogą otaczać zarówno szyję, jak i haustorium grzyba rdzy Hemileia vastatrix. Silva i wsp. opisali również enkapsulację przez celulozę i kalozę ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Dr. Hudsonowi W. P. de Carvalho za wsparcie w rozwijaniu tej pracy. Autorzy są również wdzięczni Laboratorium Mikroskopii Elektronowej "Prof. Elliot Watanabe Kitajima" za udostępnienie urządzenia do mikroskopii świetlnej. Autorzy dziękują dr Flávii Rodrigues Alves Patrício za dostarczenie materiału roślinnego ze zmianami chorobowymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ostrza DB80 HSLeica14035838383Bufor
kakodylowydo sekcji EMS# 11652Fixation
Bawełna Niebieski LaktofenolMetaquí mica70SOLSIG024629Barwienie
formaldehyduEMS#15712Utrwalanie
aldehydu glutarowegoEMS#16216Zestaw do utrwalania
HistoresinTechnovit /EMS#14653Historesin do zatapiania
Płyta grzejnaDubesserSSCD25X30-110VMikroskopia barwienia
Zeiss#490040-0030-000Przechwytywanie obrazu
Mikrotom (Leica RM 2540)Leica149BIO000C1 14050238005Sekcja
Plastikowa taca na kubki do formowaniaEMS10176-30Barwienie
rutenu czerwonegoLABHouse#006004Oprogramowanie do barwienia
Axion VisionZeiss#410130-0909-000Przechwytywanie obrazu
Pompa próżniowaPrismatec131 TIPO 2 V.C.Utrwalenie

Bibliografia

  1. deBary, A. Research on the development of some parasitic fungi. Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5(1863).
  2. Mangin, L. Research on the Peronospores. Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 (1895).
  3. Underwood, W. The plant cell wall: a dynamic barrier against pathogen invasion. Frontiers in Plant Science. 3 (85), 1-6 (2012).
  4. Hückelhoven, R. Cell wall-associated mechanisms of disease resistance and susceptibility. Annual Review of Phytopathology. 45, 101-127 (2007).
  5. Voigt, C. A. Callose-mediated resistance to pathogenic intruders in plant defense-related papillae. Frontiers in Plant Science. 5 (168), 1-6 (2014).
  6. Chowdhury, J., et al. Differential accumulation of callose, arabinoxylan and cellulose in nonpenetrated versus penetrated papillae on leaves of barley infected with Blumeria graminis f. sp. Hordei. New Phytologist. 204 (3), 650-660 (2014).
  7. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum. Frontiers in Plant Science. 9 (698), 1-14 (2018).
  8. Caffall, K. H., Mohnen, D. The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides. Carbohydrate Research. 344, 1879-1900 (2009).
  9. Carpita, N. C., Ralph, J., McCann, M. C. The cell wall. Biochemistry and Molecular Biology of Plants., 2nd Edition. , Wiley Blackwell. New York. 45(2015).
  10. Lionetti, V., Cervone, F., Bellincampi, D. Methyl esterification of pectin plays a role during plant-pathogen interactions and affects plant resistance to diseases. Journal of Plant Physiology. 169 (16), 1623-1630 (2012).
  11. Lionetti, V. Pectoplate: the simultaneous phenotyping of pectin methylesterases, pectinases, and oligogalacturonides in plants during biotic stresses. Frontiers in Plant Science. 6 (331), 1-8 (2015).
  12. Lionetti, V., et al. Three pectin methylesterase inhibitors protect cell wall integrity for Arabidopsis immunity to Botrytis. Plant Physiology. 173 (3), 1844-1863 (2017).
  13. Heath, M. C. Haustorium sheath formation in cowpea leaves immune to rust infection. Phytopathology. 61, 383-388 (1971).
  14. Silva, M. C., et al. Coffee resistance to the main diseases: leaf rust and coffee berry disease. Brazilian Journal of Plant Physiology. 18 (1), 119-147 (2006).
  15. An, P., Li, X., Zheng, Y., Eneji, A. E., Inanaga, S. Calcium effects on root cell wall composition and ion contents in two soybean cultivars under salinity stress. Canadian Journal of Plant Science. 94 (4), 733-740 (2014).
  16. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane smut: shedding light on the development of the whip-shaped sorus. Annals of Botany. 119 (5), 815-827 (2017).
  17. Delaye, L., García-Guzmán, G., Heil, M. Endophytes versus biotrophic and necrotrophic pathogens-are fungal lifestyles evolutionarily stable traits. Fungal Diversity. 60 (1), 125-135 (2013).
  18. Avelino, J., et al. The coffee rust crises in Colombia and Central America (2008-2013): impacts, plausible causes and proposed solutions. Food Security. 7, 303-321 (2015).
  19. Zambolim, L. Current status and management of coffee leaf rust in Brazil. Tropical Plant Pathology. 41, 1-8 (2016).
  20. Swiderska-Burek, U., et al. Phytopathogenic Cercosporoidfungi-from taxonomy to modern biochemistry and molecular biology. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8555(2020).
  21. Andrade, C. C. L., et al. Infection process and defense response of two distinct symptoms of Cercospora leaf spot in coffee leaves. Phytoparasitica. 49 (7), 727-737 (2021).
  22. Zambolim, L. Coffee tree diseases. Handbook of Phytopathology: Diseases of cultivated plants. 5th ed. , Agronômica Ceres Santana (in Portuguese). São Paulo. 810(2016).
  23. Castaño, A. J. J. Coffee rust. Informative report Cenicafé. 82, 313-327 (1956).
  24. Echandi, E. Coffee rust, caused by the fungus Cercospora coffeicola. Turrialba. 9 (2), 54-67 (1959).
  25. Souza, A. G. C., Rodrigues, F. A., Maffia, L. A., Mizubuti, E. S. G. Infection process of Cercospora coffeicola on coffee leaf. Journal of Phytopathology. 159 (1), 6-11 (2011).
  26. Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
  27. Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. College of Agriculture, Agricultural Experiment Station. , University of California. Berkeley, California. 347(1950).
  28. Eskes, A. B. Resistance. Coffee rust: epidemiology, resistance and management. 1, Boca Raton. 171(1989).
  29. Silva, M. C., Nicole, M., Rijo, L., Geiger, J. P., Rodrigues, C. G. Cytochemical aspects of the plant-rust fungus interface during the compatible interaction Coffea arabica (cv. Caturra)-Hemileia vastatrix (race III). International Journal of Plant Sciences. 160 (1), 79-91 (1999).
  30. Alves, R. F., Marques, J. P. R., Apezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Process of infection and colonization of Pseudocercospora kaki in persimmon leaves. Journal of Phytopathology. 169 (3), 168-175 (2020).
  31. Hayat, M. A. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications, Vol. 1. , International Publishing. Berkeley Heights. 564(1981).
  32. Paiva, E. A. S., Pinho, S. Z., Oliveira, D. M. T. Large plant samples: how to process for GMA embedding. Light microscopy: methods and protocols. Chiarini-Garcia, H., Melo, R. C. N. 689, Humana Press. 37-49 (2011).
  33. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Appezzato-da-Glória, B. New staining technique for fungal-infected plant tissues. Turkish Journal of Botany. 37 (4), 784-787 (2013).
  34. Schuller, A., Ludwig-Müller, J. Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle. Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).
  35. Braga, Z. V., Santos, R. F., Amorim, L., Appezzato-da-Glória, B. Histopathological evidence of concomitant sexual and asexual reproduction of Elsinoë ampelina in grapevine under subtropical climate. Physiological and Molecular Plant Pathology. 111, 101517(2020).
  36. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. Manual of Techniques Applied to Plant Histopathology. Piracicaba, F. E. A. L. Q. , Santana. in Portuguese 140(2021).
  37. Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera. European Journal of Plant Pathology. 154, 1185-1193 (2019).
  38. Chesters, C. G. C. Three methods of using cotton blue as a mycological stain. Annals of Botany. 48 (3), 820-822 (1934).
  39. Macedo, N. A. Manual of Techniques in Plant Histology. Feira de Santana: State University of Feira de Santana. , in Portuguese 68(1997).
  40. Lecker, A. Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts. Community Eye Health Journal. 12 (30), 24(1999).
  41. Whitakaer, F. C. S., Denison, F. C. S. Lactic acid in wool dyeing. Journal of the Society of Dyers and Colourists. 98, 103(1895).
  42. Chamberlain, C. J. Methods in Plant Histology. , The University of Chicago Press. Chicago. 349(1932).
  43. Sterling, C. Crystal-structure of ruthenium red and stereochemistry of its pectin stain. American Journal of Botany. 57, 172-175 (1970).
  44. Luft, J. H. Ruthenium red and violet. 1. Chemistry, purification, methods of use for electron microscopy and mechanism of action. The Anatomical Record. 171 (3), 347-368 (1971).
  45. Buckeridge, M. S., Cavalari, A. A., Silva, G. B. D. A. Cell Wall. Plant Physiology. Kerbauy, G. B. , Guanabara Koogan. Rio de Janeiro. in Portuguese 165-181 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wykrywanie pektynmikroskopia optycznahaustoria grzybowemodyfikacja ciany kom rkowejbarwienie czerwieni rutenowbarwienie b kitem bawe nianympatologia li ci kawowcabadania histopatologiczne

Powiązane artykuły