Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mapowanie transferu energii rezonansu Förster: nowa metodologia wyjaśniająca globalne cechy strukturalne

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63433

⸱

16 marca 2022

 ,  , 
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

W tym artykule

Podsumowanie

Badanie szczegółowo opisuje metodologię mapowania FRET, w tym wybór miejsc etykietowania, wybór barwników, akwizycję i analizę danych. Metodologia ta jest skuteczna w określaniu miejsc wiązania, zmian konformacyjnych i ruchów dynamicznych w układach białkowych i jest najbardziej użyteczna, jeśli jest wykonywana w połączeniu z istniejącymi informacjami strukturalnymi 3D.

Streszczenie

Förster resonance energy transfer (FRET) to sprawdzona metoda oparta na fluorescencji, używana do skutecznego pomiaru odległości w i pomiędzy biomolekułami in vitro, jak również w komórkach. W FRET wydajność transferu energii, mierzona zmianami intensywności fluorescencji lub czasu życia, odnosi się do odległości między dwiema cząsteczkami fluorescencyjnymi lub znacznikami. Wyznaczanie dynamiki i zmian konformacyjnych na podstawie odległości to tylko niektóre przykłady zastosowań tej metody w układach biologicznych. W pewnych warunkach metodologia ta może wzbogacić i ulepszyć istniejące struktury krystaliczne promieniowania rentgenowskiego, dostarczając informacji dotyczących dynamiki, elastyczności i adaptacji do powierzchni wiążących. Opisujemy zastosowanie FRET i związanych z nim wyznaczania odległości w celu wyjaśnienia właściwości strukturalnych poprzez identyfikację miejsca wiązania lub orientacji podjednostek dimerów. Dzięki rozsądnemu wyborowi miejsc znakowania i częstemu stosowaniu wielu strategii znakowania, z powodzeniem zastosowaliśmy te metody mapowania do określenia globalnych właściwości strukturalnych kompleksu białko-DNA i systemu translokacji białek SecA-SecYEG. W systemie SecA-SecYEG zastosowaliśmy metody mapowania FRET w celu zidentyfikowania miejsca wiązania preprotein i określenia lokalnej konformacji związanego regionu sekwencji sygnałowej. W badaniu tym przedstawiono etapy wykonywania badań mapowania FRET, w tym identyfikację odpowiednich miejsc etykietowania, omówienie możliwych etykiet, w tym nienatywnych reszt aminokwasowych, procedury znakowania, sposób wykonywania pomiarów i interpretację danych.

Wprowadzenie

Dla białek, wyjaśnienie dynamiki wraz z trójwymiarową (3-D) wiedzą strukturalną prowadzi do lepszego zrozumienia relacji struktura-funkcja systemów biomolekularnych. Metody strukturalne, takie jak krystalografia rentgenowska i kriogeniczna mikroskopia elektronowa, rejestrują strukturę statyczną i często wymagają określenia wielu struktur w celu wyjaśnienia aspektów wiązania i dynamiki biomolekuł1. W tym artykule omówiono opartą na rozwiązaniach metodę mapowania globalnych elementów strukturalnych, takich jak miejsca wiązania lub interakcje wiązania, które są potencjalnie bardziej przejściowe i trudniej uchwycone metodami statycznymi. Mocnymi systemami kandydującymi do tej metodologii są te, w których struktura 3D została wcześniej określona za pomocą krystalografii rentgenowskiej, spektroskopii NMR lub innych metod strukturalnych. W tym przypadku wykorzystujemy rentgenowską strukturę krystaliczną kompleksu SecA-SecYEG, centralnego gracza w ogólnym szlaku wydzielniczym białka, do mapowania lokalizacji miejsca wiązania peptydu sygnałowego za pomocą rezonansowego transferu energii rezonansu Förstera (FRET) przed transportem preproteiny przez błonę2. Manipulacja systemem biologicznym poprzez modyfikacje genetyczne w połączeniu z naszą wiedzą na temat struktury 3D umożliwiła określenie konformacji sekwencji sygnałowej i wczesnego dojrzałego regionu bezpośrednio przed wprowadzeniem do kanału 3.

FRET polega na bezemisyjnym przenoszeniu energii z jednej cząsteczki (donora) do drugiej (akceptora) w sposób zależny od odległości, czyli przez przestrzeń4,5. Skuteczność tego transferu jest monitorowana poprzez zmniejszenie dawcy lub zwiększenie intensywności fluorescencji akceptora. Efektywność transferu energii można opisać jako

E = R06/(R06 + R6)

w którym wartość R0 to odległość, przy której transfer jest wydajny w 50%6. Technika ta została wcześniej opisana jako linijka molekularna i jest skuteczna w określaniu odległości w zakresie 2,5-12 nm, w zależności od tożsamości barwników donor-akceptor4,7,8,9. Intensywności i czasy życia fluorescencji donora z akceptorem lub bez niego pozwalają określić efektywność transferu, a co za tym idzie, odległości5,8. Ze względu na dostępność technologii, czułość metody i łatwość użycia, FRET znalazł również szerokie zastosowanie w takich dziedzinach jak spektroskopia fluorescencji pojedynczej cząsteczki i mikroskopia konfokalna6. Pojawienie się białek fluorescencyjnych, takich jak białko zielonej fluorescencji, sprawiło, że obserwacja dynamiki wewnątrzkomórkowej i obrazowanie żywych komórek stały się stosunkowo łatwe10,11. Wiele aplikacji FRET, takich jak te, zostało szczegółowo omówionych w tym wirtualnym wydaniu.

W tym badaniu szczególnie skupiamy się na wykorzystaniu pomiarów FRET do uzyskania wartości odległości w celu określenia szczegółów strukturalnych. Wcześniej pomiary FRET były skutecznie wykorzystywane do określania konformacji cząsteczek DNA po związaniu z białkiem12,13,14, wewnętrzna dynamika białek i interakcje wiązania białek15,16,17. Zaletą tej metody jest możliwość wyznaczenia elastycznych i dynamicznych elementów konstrukcyjnych w roztworze o stosunkowo niewielkiej ilości materiału. Co istotne, metoda ta jest szczególnie skuteczna w połączeniu z istniejącymi informacjami konstrukcyjnymi i nie może być stosowana jako sposób określania struktury 3D. Metoda zapewnia najlepszy wgląd i udoskonalenie struktury, jeśli praca opiera się na istniejących informacjach konstrukcyjnych, często w połączeniu z symulacją obliczeniową18,19. W tym miejscu opisano wykorzystanie odległości uzyskanych z pomiarów FRET w stanie ustalonym i rozdzielczym w czasie do mapowania miejsca wiązania, którego lokalizacja nie była znana, na istniejącej strukturze krystalograficznej kompleksu SecA-SecYEG, głównych białek w ogólnym szlaku wydzielniczym3.

Ogólny szlak wydzielniczy, wysoce zachowany system od prokariontów przez eukarionty do archeonów, pośredniczy w transporcie białek przez błonę lub do ich funkcjonalnego miejsca w komórce. W przypadku bakterii Gram-ujemnych, takich jak E. coli, organizm użyty w naszym badaniu, białka są wprowadzane lub przemieszczane przez błonę wewnętrzną do peryplazmy. Bakteryjny kompleks kanałów SecY (określany jako translokon) koordynuje się z innymi białkami w celu translokacji nowo zsyntetyzowanego białka, które jest kierowane do właściwej lokalizacji w komórce poprzez sekwencję sygnałową zwykle zlokalizowaną na N-20,21. W przypadku białek związanych z peryplazmą, białko ATPazy SecA wiąże się z tunelem wyjściowym rybosomu oraz z preproteiną po translacji około 100 reszt22. Wraz z białkiem opiekuńczym SecB utrzymuje preproteinę w stanie rozłożonym. SecA wiąże się z translokonem SecYEG i poprzez wiele cykli hydrolizy ATP ułatwia transport białek przez błonę23,24.

SecA to białko wielodomenowe, które występuje w formie cytozolowej i błonowej. Białko homodimeryczne w cytozolu, SecA składa się z domeny wiążącej lub sieciującej preproteiny25, dwóch domen wiążących nukleotydy, domeny skrzydła spiralnego, domeny rusztowania spiralnego i dwóch palców helisy (THF)26,27,28,29 (Rysunek 1). W poprzednich badaniach krystalograficznych kompleksu SecA-SecYEG lokalizacja THF sugerowała, że był on aktywnie zaangażowany w translokację białka, a późniejsze eksperymenty z sieciowaniem z peptydem sygnałowym dodatkowo ustaliły znaczenie tego regionu w translokacji białek30,31. Poprzednie badania, wykorzystujące metodologię mapowania FRET, wykazały, że egzogenne peptydy sygnałowe wiążą się z tym regionem klasy SecA2,32. Aby w pełni zrozumieć konformację i lokalizację sekwencji sygnałowej i wczesnego dojrzałego regionu preproteiny przed insercją do kanału SecYEG, stworzono chimerę białkową, w której sekwencja sygnałowa i reszty wczesnego dojrzałego regionu zostały przyłączone do SecA za pomocą łącznika Ser-Gly (Rysunek 1). Korzystając z tego biologicznie żywotnego konstruktu, wykazano ponadto, że sekwencja sygnałowa i wczesny dojrzały region preproteiny wiążą się z THF w sposób równoległy2. Następnie wykorzystano metodologię mapowania FRET w celu wyjaśnienia konformacji i lokalizacji sekwencji sygnałowej oraz wczesnego dojrzałego regionu w obecności SecYEG, jak opisano poniżej3.

Znajomość struktury 3D kompleksu SecA-SecYEG33,34,35 i możliwa lokalizacja miejsca wiązania pozwoliły nam rozsądnie umieścić etykiety darczyńca-akceptor w miejscach, w których przecięcie poszczególnych odległości FRET identyfikuje lokalizację miejsca wiązania. Te pomiary mapowania FRET ujawniły, że sekwencja sygnałowa i wczesny dojrzały region preproteiny tworzą spinkę do włosów, której końcówka znajduje się u ujścia kanału SecYEG, co pokazuje, że struktura spinki do włosów jest szablonowa przed wprowadzeniem kanału.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wybór miejsc znakowania

  1. Zidentyfikuj co najmniej trzy potencjalne miejsca znakowania, aby przeprowadzić triangulację domniemanego miejsca wiązania na istniejących strukturach białek. W tym przypadku zidentyfikowano SecA, SecYEG oraz prebiałko przyłączone do SecA poprzez fuzję genetyczną2.
    1. Wybierz miejsca znakowania w odległości 25-75 Å od domniemanego miejsca wiązania i w stosunkowo statycznych regionach białka; odległość ta zdeterminuje konkretną parę barwników FRET, która zostanie użyta36. Zlokalizuj miejsca znakowania w regionach białka, które są od siebie stosunkowo oddalone, tak aby miejsca te wyznaczały wierzchołki trójkąta z domniemanym miejscem wiązania znajdującym się w centrum (Rysunek 1A-D).
    2. Wprowadź lub zidentyfikuj reszty cysteiny (Cys) w interesujących miejscach znakowania w białku, które nie posiada innych reszt Cys, aby zwiększyć wydajność znakowania konkretnego miejsca37,38.
    3. Wprowadź nienaturalne aminokwasy, np. p-azydofenylalaninę do znakowania metodą chemii klik, aby skutecznie oznakować jedno białko w dwóch różnych pozycjach różnymi barwnikami39,40.
    4. Przetestuj mutanty Cys pod kątem utraty funkcji. Zweryfikuj aktywność mutanta pozbawionego Cys oraz mutanta z nienaturalnym aminokwasem za pomocą odpowiedniego testu aktywności. W tym przypadku aktywność zweryfikowano testem wzrostu, a następnie testem ATPase z użyciem zieleni malachitowej in vitro32,41,42

2. Znakowanie białka

  1. Oczyść białko lub białka docelowe do czystości co najmniej 95%, aby zapewnić dokładne znakowanie. Oczyść białka SecA i SecYEG zgodnie z protokołami szczegółowo opisanymi w literaturze.3Upewnij się, że posiadasz co najmniej 5 μg oczyszczonego białka na tym etapie, ponieważ część białka zostanie utracona podczas procesu znakowania.
  2. Wybierz dwa barwniki do pomiarów FRET w zależności od ich R00 wartość i przewidywane odległości między znakowanymi miejscami. Oszacuj R0 wartości i zaobserwuj nakładanie się emisji donora i absorpcji akceptora, korzystając z informacji z bazy danych białek fluorescencyjnych, która dostarcza również widm dla powszechnie stosowanych barwników (https://www.fpbase.org/spectra/)36.
    UWAGA: R0 definiuje się jako odległość, przy której wydajność transferu wynosi 50% dla danej pary barwników. W eksperymentach mapowania przewidywane odległości powinny być zbliżone do R₀0 wartość pary barwników, aby zapewnić dokładny pomiar odległości.
  3. Oznacz pozycje zidentyfikowane w kroku 1.1.1. parą barwnika donor-akceptor.
    1. Oznakuj białko zgodnie z instrukcjami producenta, zwracając szczególną uwagę na parametry takie jak optymalne stężenie białka, temperatura, pH, czas trwania inkubacji oraz bufor odpowiedni dla stosowanych barwników43,44.
    2. Przygotuj białko o stężeniu 1-2 mg/mL lub w przybliżeniu 10 μM w buforze TKE (25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM KCl, 1 mM EDTA). Barwnik rozpuścić w dimetyluformamidzie (DMF) lub dimetylosulfoksydzie (DMSO) do stężenia końcowego 1 mM. Barwnik dodawać kroplowo do roztworu podczas mieszania, aby uzyskać stosunek molowy barwnika do białka wynoszący 5:1 (50 μM barwnik: 10 μM białko).
    3. Pozostawić reakcję na 4 h w temperaturze pokojowej (RT) w szklanej fiolce przy łagodnym wstrząsaniu lub przez noc w 4 °CZatrzymać reakcję poprzez dodanie β-merkaptoetanolu.
      UWAGA: Jeśli białko nie jest kompatybilne z buforem Tris, można zastosować bufory fosforanowe lub HEPES. Należy utrzymać pH w zakresie 7,0–7,5. Jeśli białko posiada mostki disiarczkowe, przed znakowaniem należy dodać środek redukujący, taki jak DTT lub TCEP. Przed dodaniem barwnika należy usunąć DTT za pomocą dializy lub filtracji żelowej.
  4. Aby uzyskać dokładne pomiary FRET, należy usunąć wolny barwnik za pomocą koncentratora odśrodkowego o odpowiednim progu odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO), co pozwoli na przepływ wolnego barwnika przy jednoczesnym zatrzymaniu znakowanego białka.
    1. Przygotuj membranę koncentratora, umieszczając ok. 1 ml wody w górnej części koncentratora o pojemności 3 ml, a następnie odwiruj wodę przez membranę (przez co najmniej 10 min przy 4300 x g).
    2. Usuń wolny barwnik, wirując oznakowaną próbkę w koncentratorze (20 min przy 4 300 x g). Powtórzyć 3–4 razy i zutylizować przelew.
    3. Oceń efektywność znakowania znakowanej białka za pomocą spektroskopii absorpcyjnej UV-Vis.
      UWAGA: Pomiary FRET wymagają wydajności znakowania na poziomie 50% lub wyższym. Niższa wydajność znakowania osłabia sygnał FRET i może prowadzić do błędów pomiarowych.
    4. Należy zarejestrować widmo UV-Vis znakowanego białka w zakresie od 250 do 700 nm, aby zaobserwować zarówno pasmo absorpcji białka, jak i maksimum pasma absorpcji barwnika. Należy zmierzyć absorbancję przy piku absorpcji barwnika oraz przy 280 nm dla białka.
    5. Wyznacz stężenie białka i skoryguj wszelkie wartości wynikające z obecności barwnika, używając współczynnika korekcji (CF) oraz następujących równań45,46:
      Równanie stężenia białka, C=(A280−(Amax*CF))/εProtein, istotne dla analizy spektroskopowej.
      gdzie C to stężenie białka (M), A280 jest absorbancją próbki przy 280 nm, Amaksymalny jest absorbancją przy maksimum absorpcji barwnika, ε białka to współczynnik ekstynkcji białka przy 280 nm, a CF to współczynnik korekcyjny, A'280/A'maks., gdzie A'280 jest absorbancja przy 280 nm i A'maks. absorbancja w maksimum szczytu dotyczy wyłącznie barwnika.
    6. Wyznaczyć wydajność znakowania, korzystając z następującego równania:
      Równowaga statyczna; E=Amax/(εdye*C); wzór na spektroskopię absorpcyjną; schemat do celów edukacyjnych.
      gdzie εbarwnik gdzie ε jest współczynnikiem ekstynkcji molowej barwnika, C jest stężeniem białka wyznaczonym w kroku 2.4.5, a E jest wydajnością znakowania. Powtarzać krok 2.4.2 do momentu, aż wartość wydajności znakowania osiągnie plateau i będzie wynosić mniej niż 100%.

3. Wyznaczenie wartości R 0

  1. Zmierz wartości R0 in situ. Przygotuj dwie próbki białka o tej samej stężeniu całkowitego białka, 4 μM: jedną z białkiem znakowanym wyłącznie barwnikiem donorem i jedną z białkiem znakowanym wyłącznie barwnikiem akceptorem. W przypadku SecA do tych pomiarów dobrze sprawdza się stężenie 4 μM monomeru SecA.
    1. Przygotuj objętości próbek wynoszące 2,5 mL dla kuwety 1 cm x 1 cm, 600 μL dla kuwety 5 mm x 5 mm lub 200 μL dla kuwety 3 mm x 3 mm.
  2. Włącz fluorometr i uruchom program do akwizycji i analizy widm w oprogramowaniu do fluorescencji, jeśli używasz spektrofluorometru. Kliknij czerwoną literę M, aby połączyć komputer z instrumentem (Rysunek 2A) i wybierz Emission Spectra (Widma emisji).
    1. Wprowadź parametry skanowania, takie jak długość fali wzbudzenia, zakres skanowania emisji, temperaturę i pozycję zmieniacza próbek, korzystając z pozycji menu Collect Experiment (Rysunek 2B).
    2. Kliknij RTC i zoptymalizuj ustawienia instrumentu (np. szczeliny widmowe), monitorując emisję fluorescencji w szczycie, używając długości fali wzbudzenia ustawionej na maksimum absorpcji barwnika. Dla SecA ustaw następujące parametry: szerokość pasma (bandpass) 1 nm; szczeliny wzbudzenia i emisji odpowiednio 1 i 1,5 mm, temperaturę 25 °C i prędkość mieszania 250 rpm.
      UWAGA: Nie przekraczaj maksymalnej liczby zliczeń na sekundę (cps) instrumentu (zazwyczaj 2 x 106 cps).
  3. Umieść próbkę białka znakowanego donorem w uchwycie na próbki i kliknij Run, aby uzyskać skan emisji białka znakowanego wyłącznie barwnikiem donorem (białko tylko z donorem), wzbudzając próbkę przy maksimum absorpcji barwnika (np. 488 nm dla AF488) i skanując szczyt emisji (505-750 nm dla białka SecA znakowanego tylko AF488).
  4. Ustal linię bazową skanowania, przedłużając skan o 25-50 nm poza koniec szczytu. Zmierz wydajność kwantową białka tylko z donorem, wykonując pomiary absorpcji i fluorescencji na próbkach o różnych stężeniach, jak opisano47. Zachowaj te same ustawienia szczelin dla tych pomiarów.
    1. Użyj wolnego barwnika donora jako referencji dla wydajności kwantowej. Wykonaj co najmniej cztery pomiary dla białka tylko z donorem i wolnego barwnika przy różnych stężeniach w celu dokładnego oznaczenia.
    2. Wykreśl intensywność fluorescencji lub pole całkowane w funkcji absorbancji dla białka tylko z donorem oraz dla wolnego barwnika lub referencji. Wyznacz nachylenia dla białka tylko z donorem (SlopeD) i dla referencji (SlopeR).
    3. Wydajność kwantową (Φ) oblicza się za pomocą następującego równania:
      równanie wydajności kwantowej fluorescencji, schemat z parametrami nachylenia i lepkości dla analizy fotonicznej
      gdzie ΦD to wydajność kwantowa białka tylko z donorem, ΦR to wydajność kwantowa wolnego barwnika (zazwyczaj można ją uzyskać od producenta), SlopeD i SlopeR to nachylenia wyznaczone w kroku 3.4.2 odpowiednio dla białka tylko z donorem i referencji, a ηD i ηR reprezentują współczynnik załamania światła odpowiednio dla roztworów białka tylko z donorem i wolnego barwnika referencyjnego 47.
  5. Uzyskaj widmo absorpcji białka tylko z akceptorem, używając kuwety o drodze optycznej 1 cm. Wygeneruj widmo współczynnika wymierania dla białka tylko z akceptorem, dzieląc widmo absorpcji przez stężenie barwnika.
  6. Wyznacz całkę nakładania widm, J (λ), używając programu do analizy graficznej. Do tego procesu można również użyć standardowego programu do arkuszy kalkulacyjnych.
    1. Pomnóż widmo emisji fluorescencji białka tylko z donorem (krok 3.4) przez widmo współczynnika wymierania białka tylko z akceptorem, aby uzyskać widmo nakładania.
    2. Pomnóż otrzymane widmo nakładania przez λ4.
    3. Wyznacz pole pod krzywą poprzez całkowanie obszaru nakładania. Obszar nakładania definiuje się jako obszar, w którym iloczyn widma emisji donora i widma współczynnika wymierania akceptora daje wartości dodatnie. Całka nakładania widm jest zdefiniowana jako:
      J(λ)=∫₀^∞ F_D(λ)ε_A(λ)λ⁴dλ; równanie, transfer radiacyjny, analiza absorpcji widmowej.
      gdzie FD (λ) to widmo emisji białka tylko z donorem (uzyskane w kroku 3.4), a εA(λ) to widmo współczynnika wymierania białka tylko z akceptorem, wyrażone w jednostkach M-1cm-1 (uzyskane w kroku 3.5). Wynikowa całka nakładania widm powinna mieć jednostki M-1cm-1nm4.
    4. Znormalizuj całkę nakładania widm. Podziel całkę nakładania przez pole całkowane widma białka tylko z donorem w tym samym zakresie widmowym:
      Försterowski transfer energii rezonansowej, wzór na całkę J(λ), schemat analizy nakładania widm.
    5. Oblicz wartość R0 w Å za pomocą następującego równania:
      równanie promienia Förstera \( R_0 \); statyczna stała równowagi; istotne w badaniach fluorescencji.
      gdzie κ2 to czynnik orientacji, zazwyczaj przyjmuje się wartość 2/3 dla swobodnie rotujących barwników, η to współczynnik załamania, który można przybliżyć do 1,33 dla rozcieńczonych roztworów wodnych, QD to wydajność kwantowa donora (krok 3.4), a J(λ) to całka nakładania widm wyznaczona w kroku 3.6.35. UWAGA: Jeśli barwniki nie rotują swobodnie, można wprowadzić poprawki opisane przez Ivanova 48 i zaimplementowane przez Auclaira49 oraz Zhanga2,3.

4. Wykonanie pomiarów spektralnych FRET

  1. Przygotować próbki białka z samym donorem, białka z samym akceptorem oraz białka z donorem i akceptorem o tym samym stężeniu; zalecane stężenie to 4 μM. Użyć 200 μL roztworu w przypadku kuwety 3 mm x 3 mm, 600 μL dla kuwety 5 mm x 5 mm lub 2,5 mL dla kuwety 1 cm x 1 cm.
    1. Przygotować próbkę białka z donorem i akceptorem, stosując równe ilości molowe białka z samym donorem i białka z samym akceptorem.
    2. Zachować taką samą ilość znakowanej próbki w kontrolnych próbkach białka z samym donorem i z samym akceptorem poprzez dodanie równej ilości molowej białka nieznakowanego do próbek z samym donorem lub samym akceptorem. Na przykład, dla roztworów o tym samym stężeniu, każda próbka FRET z samym donorem powinna zawierać 100 μL białka z samym donorem i 100 μL białka nieznakowanego, aby uzyskać objętość 200 μL.
  2. Wyznaczyć widma emisji fluorescencji dla próbek z samym donorem, samym akceptorem oraz z donorem i akceptorem. Zoptymalizować sygnał zgodnie z opisem w kroku 3.2. Po optymalizacji zachować te same ustawienia dla wszystkich próbek.
    1. Wykonać skan dla samego donora zgodnie z opisem w kroku 3.3. Wzbudzać roztwór przy maksimum absorpcji barwnika donora i skanować zakres obejmujący piki emisji donora oraz (przewidywanego) akceptora.
    2. Wymienić próbkę na białko z samym akceptorem lub zmienić pozycję próbownika na kuwetę zawierającą białko z samym akceptorem.
    3. Wykonać skan emisji białka znakowanego tylko barwnikiem akceptora (białko z samym akceptorem), używając tych samych ustawień, co w kroku 4.2.1. Wzbudzać próbkę przy długości fali wzbudzenia donora.
      UWAGA: Widmo to służy do korekcji ilości akceptora wzbudzonego przy długości fali donora (FA w kroku 5.1.2)
    4. Wymienić próbkę na białko z donorem i akceptorem lub zmienić pozycję próbownika na kuwetę zawierającą białko znakowane donorem i akceptorem.
    5. Wykonać skan emisji próbki białka z donorem i akceptorem, stosując te same ustawienia, co w krokach 4.2.1 i 4.2.3.
    6. Dla wszystkich widm skorygować fluorescencję tła poprzez odjęcie wartości tła zmierzonej na końcu skanu.
  3. Zmierzyć czasy życia donora dla próbek z samym donorem oraz z donorem i akceptorem, przygotowanych zgodnie z opisem w kroku 4.1.2. Użyć instrumentu do pomiaru fluorescencji metodą zliczania pojedynczych fotonów z korelacją czasową (TCSPC), zdolnego do pomiaru i rozdzielczości zaników fluorescencji w zakresie nanosekundowym (10-9 s).
    UWAGA: W przypadku par barwników FRET dopasować źródło światła wzbudzającego do maksimum absorpcji barwnika donora.
    1. Włączyć instrument. Uruchomić oprogramowanie do akwizycji danych; użyć oprogramowania sterującego instrumentem do zbierania danych ze spektrometru fluorescencyjnego.
    2. W ustawieniach akwizycji wybrać TCSPC Decay, z zakresem czasu 55 ns, wzmocnieniem (gain) 1 i liczbą kanałów 4096.
    3. Wyznaczyć funkcję odpowiedzi instrumentu (IRF), używając roztworu niesmietanowej śmietanki do kawy lub komercyjnego roztworu rozpraszającego, monitorując rozpraszanie przy 490 nm. Dostosować ustawienia szczeliny i użyć filtrów neutralnych w celu utrzymania wystarczająco niskiej szybkości zliczania, aby uniknąć zjawiska spiętrzenia impulsów (pulse pile-up)5. Kliknąć Accept, a następnie Start, aby rozpocząć akwizycję.
      UWAGA: Maksymalna szybkość zliczania 4000 cps jest stosowana dla częstotliwości repetycji 180 kHz.
    4. Zbierać IRF przy 490 nm, aż kanał szczytowy osiągnie maksymalnie 20 000 zliczeń. Wyznaczyć IRF przed i po pomiarze każdego zaniku fluorescencji.
    5. Wyznaczyć zaniki fluorescencji próbek z samym donorem oraz z donorem i akceptorem, monitorując emisję fluorescencji przy długości fali emisji donora 520 nm.
    6. Dostosować ustawienia szczeliny do maksymalnej szybkości zliczania 4000 cps lub mniej. Ustawienia szczeliny dla próbek białek zazwyczaj wynoszą 15-20 nm szerokości pasma. Zbierać dane o zaniku do momentu uzyskania 20 000 zliczeń w kanale szczytowym.
  4. Przeanalizować zanik lub intensywność fluorescencji (I) jako funkcję czasu (t) w celu wyznaczenia czasu życia fluorescencji (τ). Dopasować zanik do sumy funkcji wykładniczych za pomocą następującego równania:
    Równanie sygnału zaniku: I(t)=Σa_ie^(-t/τ_i), ilustrujące analizę zaniku wielowykładniczego.
    gdzie αI jest czynnikiem przedwykładniczym i-tej składowej, a τI jest czasem życia. Dopasowanie jest ponownie splotowane z IRF, aby odpowiadało zanikowi fluorescencji. Jakość dopasowania oceniać na podstawie zredukowanego parametru Χ2.

5. Analiza danych FRET

  1. Oblicz wydajność FRET na podstawie spadku intensywności fluorescencji donora w próbce donor-akceptor w stosunku do próbki z samym donorem, korzystając z poniższego równania.
    Równanie wydajności transferu energii przez rezonans fluorescencyjny, E=1-(FDA/FD), formuła.
    gdzie FDA to intensywność fluorescencji próbki donor-akceptor, a FD to intensywność fluorescencji próbki z samym donorem w szczycie fluorescencji donora. W przypadku danych z dużym poziomem szumu należy zastosować zintegrowane powierzchnie pików.
    1. Skoryguj wszelkie różnice w znakowaniu między próbką z samym donorem a próbką donor-akceptor. Oblicz korekty na podstawie stopnia znakowania donora w następujący sposób:
      Równanie wygaszania fluorescencji: F'D=FD(fDA/fD) w analizie procesów fotochemicznych.
      gdzie fDA to wydajność znakowania donora w próbce donor-akceptor, a fD to wydajność znakowania w próbce z samym donorem.
    2. Skoryguj wkład fluorescencji akceptora do widma wzbudzonego donora poprzez odjęcie widma białka z samym akceptorem (krok 4.2) od widma białka donor-akceptor.
      Równanie przedstawiające obliczanie siły dynamicznej: F'DA = FDA - FA.
    3. Skoryguj różnice w wydajności znakowania białka z samym akceptorem względem próbki białka donor-akceptor, co prowadzi do następującego równania obliczania wydajności:
      Równanie równowagi statycznej dla wydajności; formuła E=((1-F'DA/F'D)*1/fA); koncepcja fizyczna.
      gdzie fA oznacza ułamkową ilość znakowania akceptora. Równanie to uwzględnia wszystkie korekty wynikające ze znakowania barwnikiem i fluorescencji akceptora.
    4. Oblicz odległości FRET z wydajności korzystając z następującego równania:
      Formuła wydajności transferu energii przez rezonans Förstera (FRET); równanie obliczania transferu energii.
      wykorzystując wartość R0 uzyskaną w kroku 3.6.5.
    5. Oblicz wydajność FRET, wykorzystując czasy życia fluorescencji próbek z samym donorem i donor-akceptor, zmierzone w krokach 4.3.3-4.3.5:
      Formuła wydajności transferu energii przez rezonans fluorescencyjny (FRET); E=1–(τDA/τD); równanie naukowe.
    6. Użyj czasu życia ważonego amplitudą do obliczenia wydajności FRET i porównaj wyniki z pomiarami w stanie stacjonarnym5.
      Formuła równowagi statycznej, ⟨τ⟩=Σaiτi, równanie stosowane w analizie fizycznej lub chemicznej.
    7. Oblicz odległość w sposób opisany w kroku 5.1.4 na podstawie wydajności określonych przez czas życia fluorescencji. Porównaj wartości wydajności i odległości FRET otrzymane w stanie stacjonarnym oraz w pomiarach rozdzielonych w czasie i upewnij się, że mieszczą się one w granicach błędu względem siebie.

6. Mapowanie odległości

  1. Wykorzystaj obliczone odległości do zmapowania miejsca wiązania na strukturze trójwymiarowej. Oblicz odległości i błędy dla wszystkich badanych par barwników i lokalizacji, korzystając z równania podanego w kroku 5.1.4 oraz wartości R0 uzyskanych w kroku 3.6.5 dla każdej pary FRET.
    1. Użyj programu do graficznej wizualizacji 3D, takiego jak PyMOL50, aby nanieść odległości na strukturę (skrypt znajduje się w Pliku uzupełniającym). Polecenia ze skryptu można wprowadzać bezpośrednio do okna poleceń, podając odpowiednie informacje o odległościach.
    2. Wygeneruj powłokę dla każdej zmierzonej odległości oraz przypisany do niej błąd (Rycina 3, Rycina 4, Ryciny uzupełniające 1-3).
    3. Wyznacz pozycję poprzez przecięcie różnych powłok (Ryciny uzupełniające 1-3). Miejsce wiązania peptydu sygnałowego zostało zmapowane poprzez trzy różne lokalizacje na SecA i SecYEG oraz cztery różne lokalizacje na peptydzie sygnałowym (Rycina 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejsze badanie koncentrowało się na określeniu lokalizacji miejsca wiązania prebiałka w białku SecA przed wprowadzeniem prebiałka do kanału SecYEG. W celu zmapowania miejsca wiązania przeprowadzono eksperymenty FRET pomiędzy różnymi regionami prebiałka a trzema odrębnymi lokalizacjami w białkach SecA i SecYEG (Rysunek 1A-D). Na podstawie uzyskanych odległości oraz struktur trójwymiarowych SecA, SecYEG i prebiałka przewidziano lokalizację miejsca wiązania ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dzięki zastosowaniu metodologii mapowania FRET zidentyfikowaliśmy miejsce wiązania sekwencji sygnałowej na białku SecA. Co ważne, obecność trójwymiarowej struktury krystalicznej kompleksu znacznie ułatwiła nam badania. Mocną stroną tej metodologii mapowania jest możliwość wykorzystania istniejącej struktury do identyfikacji lokalizacji do etykietowania. Metodologia ta nie może być stosowana do określania struktury 3D; Jednak wyznaczenie elementów konstrukcyjnych56, udoskonalenie istniejącej strukt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez R15GM135904 grantów National Institutes of Health (przyznanych IM) oraz Grantów Narodowych Instytutów Zdrowia GM110552 (przyznanych DBO).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Laser LED 490 nmHoriba1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimid//DIBO AlkyneLife TechnologiesA20347
AgarDifcoDF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimid/DIBO AlkyneLife TechnologiesA10254
Alexa Fluor 488 DIBO AlkyneLife TechnologiesS10904
Alexa Fluor 647 DIBO AlkyneLife TechnologiesS10906
Amicon Ultra­ 4 Filtr odśrodkowy (50kDa MWCO)SigmaUFC805008
Dodecylmaltoside (DDM)AnatraceD310
E. coli peptyd sygnałowy fosfatazy alkalicznej SP22Biomolekuły Środkowy ZachódNie dotyczyZsyntetyzowany niestandardowy element
rozszerzony peptyd sygnałowy SP41Biomolekuły Środkowy ZachódNie dotyczyZsyntetyzowany niestandardowy przedmiot
FluorEssenceHoribawersja 2.4program akwizycji spektralnej dla spektrofluorometru Fluoromax4
Spektrofluorometr Fluoromax 4HoribaN/A
GlobalsWELaboratorium Dynamiki Fluorescencji, Uniwersytet Kalifornijski, Irvineprogram analizy spektralnej dla rozpadów czasowo-rozdzielczych
H­ 4&nieśmiały; Azido&nieśmiały; Uff nieśmiały; OHBACHEM4020250.0001
LB (Miller) BulionFisher ScientificBP9723
Ludox HS-40 krzemionka koloidalna (40% wag. zawiesina w H2O)Do uzyskania prawidłowego roztworu rozpraszającego potrzebne jest rozcieńczenie420816 Sigma-Aldrich
PTI Felix GXHoribawersja 4.1.0.4096program akwizycji spektralnej dla PTI Time Master Instrument
PTI Time Master InstrumentHoribaNA
Pymol Molecular Graphics ProgramSchrödingerwersja 2.4
Łaźnia wodnaThermo ScientificNESLAB RTE 10
, aby uzyskać prawidłowe rozwiązanie rozpraszające

Bibliografia

  1. Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
  2. Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Conserved SecA signal peptide-binding site revealed by engineered protein chimeras and Forester resonance energy transfer. Biochemistry. 55 (9), 1291-1300 (2016).
  3. Zhang, Q., et al. Alignment of the protein substrate hairpin along the SecA two-helix finger primes protein transport in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9343-9348 (2017).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2006).
  6. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  7. Magde, D., Wong, R., Seybold, P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields. Photochemistry and Photobiology. 75 (4), 327-334 (2002).
  8. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in Enzymology. 211, 353-388 (1992).
  9. Scientific, T. F. R0 Values from Some Alexa Fluor Dyes - Table 1.6. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values-for-some-alexa-fluor-dyes.html (2021).
  10. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors. 16 (9), Basel, Switzerland. 1488(2016).
  11. Day, R. N., Davidson, M. W. Fluorescent proteins for FRET microscopy: monitoring protein interactions in living cells. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular, and Developmental Biology. 34 (5), 341-350 (2012).
  12. Lee, S. J., Syed, S., Ha, T. Single-Molecule FRET Analysis of Replicative Helicases. Methods in Molecular Biology. 1805, Clifton, N.J. 233-250 (2018).
  13. Uhm, H., Hohng, S. Single-Molecule FRET Assay for Studying Cotranscriptional RNA Folding. Methods in Molecular Biology. 2106, 271-282 (2020).
  14. Globyte, V., Joo, C. Single-molecule FRET studies of Cas9 endonuclease. Methods in Enzymology. 616, 313-335 (2019).
  15. Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-Molecular Förster Resonance Energy Transfer Measurement on Structures and Interactions of Biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492(2021).
  16. Catipovic, M. A., Bauer, B. W., Loparo, J. J., Rapoport, T. A. Protein translocation by the SecA ATPase occurs by a power-stroke mechanism. The EMBO Journal. 38 (9), 101140(2019).
  17. Seinen, A. B., Spakman, D., van Oijen, A. M., Driessen, A. J. M. Cellular dynamics of the SecA ATPase at the single molecule level. Scientific Reports. 11 (1), 1433(2021).
  18. Dimura, M., et al. Quantitative FRET studies and integrative modeling unravel the structure and dynamics of biomolecular systems. Current Opinion in Structural Biology. 40, 163-185 (2016).
  19. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nature Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  20. Paetzel, M. Structure and mechanism of Escherichia coli type I signal peptidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (8), 1497-1508 (2014).
  21. Ng, D., Brown, J., Walter, P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. The Journal of Cell Biology. 134 (2), 269-278 (1996).
  22. Huber, D., et al. SecA Cotranslationally Interacts with Nascent Substrate Proteins In Vivo. Journal of Bacteriology. 199 (2), 00622(2017).
  23. Lill, R., et al. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli. The EMBO Journal. 8 (3), 961-966 (1989).
  24. Lill, R., Dowhan, W., Wickner, W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60 (2), 271-280 (1990).
  25. Kimura, E., Akita, M., Matsuyama, S., Mizushima, S. Determination of a region of SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6600-6606 (1991).
  26. Hunt, J. F., et al. Nucleotide control of interdomain interactions in the conformational reaction cycle of SecA. Science. 297 (5589), New York, N.Y. 2018-2026 (2002).
  27. Sharma, V., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis SecA, a preprotein tranlsocating ATPase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2243-2248 (2003).
  28. Vassylyev, D., et al. Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals a parallel, head-to-head dimer. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 248-258 (2006).
  29. Zimmer, J., Li, W., Rapoport, T. A. A novel dimer interface and conformational changes revealed by an X-ray structure of B. subtilis SecA. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 259-265 (2006).
  30. Zimmer, J., Rapoport, T. A. Conformational flexibility and peptide interaction of the translocation ATPase SecA. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 606-612 (2009).
  31. Bauer, B. W., Rapoport, T. A. Mapping polypeptide interactions of the SecA ATPase during translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (49), 20800-20805 (2009).
  32. Auclair, S., et al. Mapping of the signal peptide-binding domain of Escherichia coli SecA using Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 49 (4), 782-792 (2010).
  33. Zimmer, J., Nam, Y., Rapoport, T. A. Structure of a complex of the ATPase SecA and the protein-translocation channel. Nature. 455 (7215), 936-943 (2008).
  34. Li, L., et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531 (7594), 395-399 (2016).
  35. Ma, C., et al. Structure of the substrate-engaged SecA-SecY protein translocation machine. Nature Communications. 10 (1), 2872(2019).
  36. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  37. Jilaveanu, L. B., Oliver, D. In vivo membrane topology of Escherichia coli SecA ATPase reveals extensive periplasmic exposure of multiple functionally important domains clustering on one face of SecA. The Journal of Biological Chemistry. 282 (7), 4661-4668 (2007).
  38. Ramamurthy, V., Oliver, D. Topology of the integral-membrane form of Escherichiacoli SecA protein. The Journal of Biological Chemistry. 272 (37), 23239-23246 (1997).
  39. Chin, J., et al. Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  40. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Journal of the American Chemical Society. 125 (39), 11782-11783 (2003).
  41. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochemistry. 100 (1), 95-97 (1979).
  42. Mitchell, C., Oliver, D. B. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Molecular Microbiology. 10 (3), 483-497 (1993).
  43. Thiol-reactive Probe Labeling Protocol. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/thiol-reactive-probe-labeling-protocol.html (2021).
  44. Click Chemistry - Section 3.1. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/reagents-for-modifying-groups-other-than-thiols-or-amines/click-chemistry.html (2021).
  45. Correction Factor. AAT Bioquest. , Available from: https://www.aatbio.com/resources/correction-factor/ (2019).
  46. Calculate dye:protein (F/P) molar ratios. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://tools.thermofischer.com/content/sfs/brochures/TR0031-Calc-FP-rations.pdf (2011).
  47. A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields. Horiba Scientific. , Available from: https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Materials/Material_Research/Quantum_Dots/quantumyieldstrad.pdf (2011).
  48. Ivanov, V., Li, M., Mizuuchi, K. Impact of emission anisotropy on fluorescence stectroscopy and FRET distance measurements. Biophysical Journal. 97 (3), 922-929 (2009).
  49. Auclair, S., Oliver, D., Mukerji, I. Defining the solution state dimer structure of Escherichia coli SecA using Forster resonance energy transfer. Biochemistry. 52 (14), 2388-2401 (2013).
  50. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4. , Schrodinger, LLC. New York. Available from: https://pymol.org/2/ (2021).
  51. Musial-Siwek, M., Rusch, S. L., Kendall, D. A. Selective photoaffinity labeling identifies the signal peptide binding domain on SecA. Journal of Molecular Biology. 365 (3), 637-648 (2007).
  52. Miller, A., Wang, L., Kendall, D. A. Synthetic signal peptides specifically recognize SecA and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. The Journal of Biological Chemistry. 273 (19), 11409-11412 (1998).
  53. Gelis, I., et al. Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR. Cell. 131 (4), 756-769 (2007).
  54. Erlandson, K. J., et al. A role for the two-helix finger of the SecA ATPase in protein translocation. Nature. 455 (7215), 984-988 (2008).
  55. Das, S., Oliver, D. Mapping of the SecA-SecY and SecA-SecG interfaces by site-directed in vivo photocross-linking. The Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12371-12380 (2011).
  56. Wheatley, E. G., Pieniazek, S. N., Vitoc, I., Mukerji, I., Beveridge, D. L. Molecular Dynamics Structure Prediction of a Novel Protein-DNA Complex: Two HU Proteins with a DNA Four-way Junction. Innovations in Biomolecular Modeling and Simulations: Volume 2. , The Royal Society of Chemistry. 111-128 (2012).
  57. Vitoc, C. I., Mukerji, I. HU binding to a DNA four-way junction probed by Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 50 (9), 1432-1441 (2011).
  58. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mapowanie FRETanaliza strukturalna bia ekmiejsce wi zania ligandaznakowanie bia ekspektroskopia fluorescencyjnapara donor akceptorpomiar wydajno ci kwantowejkompleks bia ko DNAsystem SecA SecYEG
Mapowanie transferu energii rezonansu Förster: nowa metodologia wyjaśniająca globalne cechy strukturalne
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.