Artykuł metodologiczny

Hodowla i badania przesiewowe pasożytniczego nicienia Ditylenchus dipsaci

5.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63438

⸱

31 stycznia 2022

 ,  , 
1Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3The Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 4Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje niezawodną i prostą metodę hodowli, zbierania i badania przesiewowego Ditylenchus dipsaci.

Streszczenie

Nicienie pasożytujące na roślinach (PPN) niszczą ponad 12% światowych upraw żywności każdego roku, co równa się około 157 miliardom dolarów (USD) strat rocznie. Przy rosnącej liczbie ludności na świecie i ograniczonej powierzchni gruntów ornych, kontrolowanie porażenia PPN ma kluczowe znaczenie dla produkcji żywności. Wyzwaniem związanym z maksymalizacją plonów są rosnące ograniczenia dotyczące skutecznych pestycydów ze względu na brak selektywności nicieni. W związku z tym opracowanie nowych i bezpiecznych nematocydów chemicznych ma zasadnicze znaczenie dla bezpieczeństwa żywnościowego. W protokole tym przedstawiono hodowlę i zbieranie gatunków PPN Ditylenchus dipsaci. D. dipsaci jest zarówno szkodliwy ekonomicznie, jak i stosunkowo odporny na większość współczesnych nematocydów. Obecne prace wyjaśniają również, w jaki sposób wykorzystać te nicienie w badaniach przesiewowych nowych nematocydów drobnocząsteczkowych oraz zawierają raporty na temat metodologii gromadzenia i analizy danych. Zademonstrowany rurociąg zapewnia przepustowość tysięcy związków tygodniowo i może być łatwo przystosowany do stosowania z innymi gatunkami PPN, takimi jak Pratylenchus penetrans. Techniki opisane w niniejszym dokumencie mogą być wykorzystane do odkrycia nowych nematocydów, które z kolei mogą być dalej rozwijane w wysoce selektywne produkty komercyjne, które bezpiecznie zwalczają PPN, pomagając nakarmić coraz bardziej głodny świat.

Wprowadzenie

Szacuje się, że nicienie pasożytujące na roślinach (PPN) są odpowiedzialne za utratę 12,3% światowej produkcji żywności i powodują około 157 miliardów dolarów szkód rocznie1,2,3. Niestety, zdolność do kontrolowania PPN słabnie, ponieważ skuteczne nematocydy chemiczne zostały zakazane lub stoją w obliczu rosnących ograniczeń ze względu na bezpieczeństwo ludzi i obawy o środowisko. Wynika to przede wszystkim ze słabej selektywności nicieni poprzednich generacji pestycydów4. W ciągu ostatnich 25 lat sześć nowych nematocydów chemicznych zostało pilotażowo wprowadzonych lub wprowadzonych na rynek5. Jeden z nich został już zakazany w Europie, a drugi został wycofany w trakcie dochodzenia pod kątem jego wpływu na ludzi heatlh6,7. W związku z tym istnieje pilne zapotrzebowanie na nowe nematocydy, które są wysoce selektywne dla PPN.

Nicień łodygowy i cebulowy, Ditylenchus dipsaci (D. dipsaci) jest ekonomicznie wpływowym PPN4. D. dipsaci infekuje prawie 500 gatunków roślin w 30 rasach biologicznych i atakuje niektóre z najważniejszych dla rolnictwa upraw, takich jak żyto, owies, czosnek, cebula i por8,9. Na przykład D. dipsaci niedawno przeczesywał pola czosnku w Ontario i Quebecu, powodując straty do 90%10,11. Jego rozmieszczenie geograficzne jest prawie wszechobecne i obejmuje obie Ameryki (w tym Kalifornię i Florydę), Europę, znaczną część Azji (w tym Chiny) i Oceanię9. D. dipsaci jest wędrownym endopasożytem, który dostaje się do aparatów szparkowych na liściach lub ranach i przetchlinkach, gdzie uwalnia enzymy rozkładające ścianę komórkową12. Potęgując wpływ D. dipsaci na uprawy, uszkodzenia spowodowane przez PPN sprawiają, że roślina jest podatna na wtórną infekcję11. Niestety, D. dipsaci wykazuje wysoki poziom tolerancji na obecne nematocydy w porównaniu z innymi szczepami nicieni13,14.

Ten protokół opisuje hodowlę D. dipsaci i jej zastosowanie w badaniach przesiewowych na dużą skalę dla małych cząsteczek kandydujących na nematocydy. Krótko mówiąc, populacje D. dipsaci są utrzymywane i rozwijane na roślinach grochu hodowanych w sterylnym pożywce Gamborg B-5 (GA)15. Przed wyhodowaniem kiełków nasiennych na podłożu GA, nasiona muszą zostać wysterylizowane przez serię myć i pokryte na agarze odżywczym (NA) w celu sprawdzenia zanieczyszczenia. Sterylizacja nasion jest niezbędna do wykrycia zanieczyszczeń bakteryjnych i grzybiczych, które mogą być obecne. Niezanieczyszczone nasiona są następnie przenoszone na płytki GA, gdzie kiełki nasion będą rosły w ramach przygotowań do infekcji. Płytki GA zawierające kiełki nasienne są zakażone nicieniami z poprzedniej płytki hodowlanej poprzez przeniesienie kawałka agaru zawierającego tkankę korzeniową na świeże płytki. Po 6-8 tygodniach nicienie są ekstrahowane z pożywki GA i filtrowane przez lejek wyłożony filtrem kawy do zlewki zbiorczej. Nicienie mogą być wykorzystywane w różnych testach biologicznych po zebraniu odpowiedniej liczby. Technika opisana w tym protokole generuje około 15 000 D. dipsaci na płytkę hodowlaną. Opublikowano alternatywne protokoły uprawy D. dipsaci16,17.

Test przesiewowy małych cząsteczek in vitro oparty na poprzednich pracach18 jest również opisany tutaj. Jako wskaźnik zdrowia robaków, mobilność 20 nicieni na studzienkę jest badana po 5 dniach ekspozycji na małe cząsteczki. Aby lepiej zobrazować ruchliwość robaków, dodaje się NaOH w celu zwiększenia ruchu żywych robaków19,20. Protokół ten umożliwia badania przesiewowe o średniej przepustowości i dostarcza cennych danych do oceny potencjału nematobójczego małych cząsteczek. Jeśli stosowana jest inna technika zbierania nicieni16,17, metodologia badań przesiewowych małych cząsteczek opisana w niniejszym dokumencie może mimo wszystko zostać zaimplementowana.

Protokół

Szczep G-137 D. dipsaci użyty do niniejszej pracy został zebrany z czosnku odmiany Fish Lake 4 w hrabstwie Prince Edward i dostarczony przez Agriculture and Agri-food Canada. Jeśli rozpoczynasz nową hodowlę, skonsultuj się z Poirier et al., aby uzyskać metodologię inokulacji15.

1. Hodowla D. dipsaci

  1. Przygotuj nośniki i płyty zgodnie z wcześniej zgłoszonymi pracami15.
    1. Przygotuj 500 ml pożywki z agarem odżywczym (NA) z 23 g/l NA (patrz Tabela Materiałów) i ultraczystą wodą. Stosując sterylną technikę, wlej 25 ml autoklawizowanej pożywki NA do 20 jednorazowych szalek Petriego (średnica 100 mm x głębokość 15 mm). Pozostawić agar do zestalenia się w temperaturze pokojowej (22 °C) z założoną pokrywką na ~2 godziny i odstawić do późniejszego użycia.
    2. Przygotować 500 ml pożywki Gamborg B-5 (GA) zawierającej 3,2 g/l podłoża podstawowego GA z minimalną ilością substancji organicznych, 20 g/l sacharozy, 15 g/l agaru i wody destylowanej (patrz tabela materiałów). Stosując sterylną technikę, wlej 50 ml autoklawizowanej pożywki GA do 10 jednorazowych szalek Petriego (średnica 100 mm x głębokość 25 mm). Pozostaw agar do zestalenia się w temperaturze pokojowej (22 °C) z założoną pokrywką przez ~5 godzin i przechowuj w pozycji pionowej w temperaturze pokojowej w sterylnej torbie do momentu przeniesienia kiełków.
      UWAGA: Płyty z nadmiarem mediów są wykonywane na wypadek wystąpienia zanieczyszczenia.
  2. Wykonaj sterylizację nasion zgodnie z metodą zmodyfikowaną w stosunku do poprzedniej work15.
    1. Autoklaw jedną zlewkę o pojemności 2 l z mieszadłem, 2 kleszcze, szklaną szalką Petriego i 1 litrem wody destylowanej. Przygotuj 200 ml 95% roztworu EtOH i 200 ml 15% dostępnego w handlu roztworu wybielacza.
    2. Użyj nasion grochu (patrz tabela materiałów). Wlej 150 nasion do sterylnej 2-litrowej zlewki z mieszadłem w pobliżu płomienia palnika Bunsena na stole laboratoryjnym.
    3. Dodać 200 ml 95% EtOH do nasion w zlewce, energicznie mieszać na płytce mieszającej przez 5 minut, a następnie wylać EtOH do pojemnika na odpady.
    4. Wlej roztwór wybielacza do zlewki, aby całkowicie zanurzyć nasiona. Mieszaj energicznie na talerzu mieszającym przez 20 minut, a następnie odlej wybielacz do pojemnika na odpady.
    5. Wlej wodę destylowaną do zlewki, aby zanurzyć nasiona i energicznie mieszaj na talerzu mieszającym przez 20 minut. Powtórz mycie wodą trzy razy, po każdym umyciu odlewać wodę destylowaną. Po ostatnim umyciu wodą wlej wysterylizowane nasiona do szklanej szalki Petriego.
    6. Aby sprawdzić, czy nie ma zanieczyszczenia, przenieś 6 nasion na każdą 10 cm płytkę NA (przygotowaną w kroku 1.1.1) w laminarnym okapie przeciwpowodziowym za pomocą wysterylizowanych kleszczy. Ułóż nasiona na obwodzie talerza (najlepiej sprawdzają się pulchniejsze nasiona). Owinąć płytki pojedynczo w laboratoryjną folię do owijania i inkubować w ciemności przez 3 dni w temperaturze 26 °C.
      UWAGA: Posiew większej liczby nasion niż to konieczne pozwoli na selektywne użycie nasion niezanieczyszczonych.
  3. Wykonaj transfer kiełków, postępując zgodnie z poniższym krokiem.
    1. W okapie z przepływem laminarnym użyj wysterylizowanych kleszczyków, aby umieścić 2 niezanieczyszczone nasiona na każdej płytce GA (przygotowanej w kroku 1.1.2). Zawiń płytki pojedynczo w laboratoryjną folię do owijania i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 7-10 dni, aby nasiona mogły wykiełkować.
  4. Hodowlę in vitro należy przeprowadzić zgodnie z metodą zmodyfikowaną w stosunku do poprzedniej metody work15.
    1. Przygotować 50 ml roztworu sacharozy o stężeniu 20 g/l. Przefiltrować, wysterylizować roztwór sacharozy i odstawić.
    2. W okapie z przepływem laminarnym wytnij kawałek agaru zawierającego tkankę korzeniową (~2 cm3) z istniejącej płytki hodowlanej. Odpipetować 500 μl roztworu sacharozy na nowej płytce GA z sadzonkami grochu i umieścić kostkę agarową na wierzchu sacharozy. Zawiń płytki pojedynczo w laboratoryjną folię do owijania i utrzymuj kulturę w pudełku wyłożonym folią aluminiową w temperaturze pokojowej (~22 °C).
    3. Nicienie subkulturowe na świeżych talerzach GA co 8-9 tygodni, aby utrzymać kulturę. Nicienie są gotowe do ekstrakcji po ~8 tygodniach.

2. Ekstrakcja i zbieranie D. dipsaci

  1. Wykonaj ekstrakcję D. dipsaci, wykonując poniższe czynności.
    1. Autoklaw w zlewce o pojemności 50 ml, lejku 80 mm, 150 ml wody destylowanej i filtrach do kawy. Umieść lejek w zlewce i wyłóż go sterylnym filtrem do kawy.
    2. W kapturze z przepływem laminarnym pokrój agar i tkankę korzeniową na 1 cm3 za pomocą sterylnego skalpela. Przenieś kostki agaru do lejka wyłożonego filtrem do kawy i powoli wlej wodę destylowaną na agar, aby zwilżyć filtr do kawy.
    3. Wyjmij lejek wyłożony filtrem kawy ze zlewki i napełnij zlewkę wodą destylowaną, aż poziom wody dotknie dna filtra po wymianie lejka wyłożonego filtrem kawy.
    4. Przykryj lejek i zlewkę wyłożone filtrem kawy folią aluminiową. Pozostaw na noc (16 godzin) na blacie, aby robaki mogły przedostać się przez filtr do kawy do zlewki zbiorczej.
      UWAGA: Płytka do hodowli nicieni jest gotowa do ekstrakcji, gdy robaki wpełzną do agaru podczas badania pod mikroskopem preparacyjnym. Zazwyczaj płytka jest gotowa do ekstrakcji 6-8 tygodni po początkowym zaszczepieniu.
  2. Wykonaj zbieranie D. dipsaci.
    UWAGA: Następnego dnia robaki D. dipsaci osiądą na dnie zlewki.
    1. Wyjąć lejek wyłożony filtrem do kawy i odessać górne 40 ml wody ze zlewki zbiorczej; uważając, aby nie naruszyć osadzonych robaków. Za pomocą plastikowej pipety serologicznej o pojemności 10 ml zebrać pozostały płyn do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Ta kolekcja może być używana bezpośrednio w testach. Umieścić w temperaturze 4 °C, jeśli nie zostaną użyte w ciągu 24 godzin. Robaki można pozostawić na 3 dni w temperaturze 4 °C bez widocznego wpływu na mobilność. Wyjęcie lejka może zakłócić działanie robaków w zlewce zbiorczej. Pozwól im osiąść na dnie przed zebraniem.

3. Badanie przesiewowe małych cząsteczek in vitro

  1. Przygotuj płytki testowe, wykonując poniższe czynności.
    1. Wlać autoklawowaną wodę destylowaną do sterylnego koryta i za pomocą pipety wielokanałowej dozować 40 μl wody destylowanej z koryta do każdej studzienki 96-dołkowej płytki z płaskim dnem.
  2. Przygotuj narzędzie do przypinania i dodaj chemikalia
    1. Ustaw tace na kołki (patrz tabela materiałów) w pobliżu płomienia palnika Bunsena na stole laboratoryjnym. Do kolejnych tacek na szpilki dodaj następujące ilości: 25 ml roztworu do czyszczenia szpilek, 35 ml 50% DMSO (w wodzie), 45 ml wody destylowanej, 55 ml 70% EtOH i 65 ml 95% EtOH. Umieść jeden kawałek bibuły przed każdą tacą
    2. Wyczyść narzędzie do przypinania, zanurzając kołki w roztworze czyszczącym i przesuwając kołki w górę iw dół trzy razy (3x) w roztworze. W tym protokole "3x" i "10x" są zdefiniowane jako przesuwanie pinnera w górę i w dół w roztworze odpowiednio trzy lub dziesięć razy. Osusz szpilki na bibułce. Powtórz tę procedurę jeszcze raz.
      1. Następnie opłucz szpilki 3x w wodzie destylowanej, a następnie osusz szpilki. Powtórz procedurę jeszcze raz.
      2. Na koniec opłucz szpilki 3x w 95% EtOH, a następnie osusz szpilki. Powtórz jeszcze raz. Zapal szpilkę i pozwól, aby etanol odparował.
    3. Dodaj substancje chemiczne z 96-dołkowych chemicznych płytek wyjściowych do płytek testowych, przypinając 3x do płytki chemicznej, a następnie przenosząc szpilki 10X do płytki testowej. Zetrzyj na papierze przed roztworem czyszczącym.
    4. Czyścić przypinacz między płytkami, myjąc w następującej kolejności, osuszając pomiędzy nimi bibułę: 3x w 50% DMSO (raz), 3x w wodzie destylowanej (raz), 3x w 75% EtOH (raz), 3x w 95% EtOH (dwukrotnie). Podpal szpilkę i pozwól, aby etanol odparował.
    5. Powtórz krok 3.2.2 po zakończeniu przypinania.
      UWAGA: Badanie przesiewowe przeprowadzono przy końcowym stężeniu 60 μM.
  3. Dodawanie robaków
    1. Policz liczbę nicieni z pobranej kolekcji, najpierw ponownie zawieszając, a następnie pipetując 5 μl za pomocą końcówek o niskiej retencji na szkiełku w celu obserwacji. Policz liczbę nicieni w 5 μl za pomocą mikroskopu preparacyjnego.
      1. Dostosuj stężenie do 2 robaków/μl za pomocą sterylnej wody destylowanej. Za pomocą pipety wielokanałowej i koryta dodaj 10 μl (~20 robaków) do każdego dołka z 96-dołkowych płytek.
        UWAGA: Około 15 000 nicieni D. dipsaci zostanie zebranych na płytkę hodowlaną przy użyciu opisanej metody hodowli i zbierania. Na studnię używa się dwudziestu robaków, ponieważ niewielka liczba ułatwia przejrzystą wizualizację i rozliczanie robaków ruchomych i nieruchomych.
    2. Zawiń płytki w laboratoryjną folię do pakowania i owiń wilgotnym ręcznikiem papierowym. Umieścić w pudełku i przymocować na lepkiej podkładce w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 200 °C ustawionym na 200 obr./min. Upewnij się, że talerze są ustabilizowane w pudełku, dodając dodatkowy wilgotny ręcznik papierowy, aby zapewnić minimalny ruch talerzy.

4. Zbieranie i analiza danych

  1. Obserwuj płytki w dniu 5 pod mikroskopem preparacyjnym. Policz liczbę ruchomych i całkowitą liczbę D. dipsaci w kontrolach rozpuszczalnikowych DMSO i studzienkach poddanych działaniu leków.
    1. Jeśli robaki są względnie nieruchome, dodaj 2 μl 1 M NaOH do końcowego stężenia 40 mM do studzienki, aby stymulować ruch19, 20.
      UWAGA: Po dodaniu NaOH robaki będą się natychmiast przemieszczać i należy je obejrzeć w ciągu 5 minut. Liczba robaków mobilnych i całkowita liczba robaków zostaną wykorzystane do obliczenia proporcji robaków mobilnych. Długość testu może się zmieniać w zależności od celu ekranu.
  2. Oblicz proporcję robaków mobilnych. Na ekranach D. dipsaci studnie, które w sposób powtarzalny dały 0% mobilnych robaków, są klasyfikowane jako silne trafienia.
    UWAGA: Unika się długotrwałej ekspozycji płytek na etapie mikroskopów preparacyjnych, ponieważ źródło światła może podgrzewać płytki i wywoływać zmienny wpływ na test biologiczny.

Wyniki

Niezależne powtórzenia ujawniają powtarzalne wyniki
Aby zilustrować oczekiwaną zmienność między powtórzeniami przesiewania, przedstawiono średnie i odchylenia ruchliwości próbek z trzech reprezentatywnych płytek z niedawnego badania (Rysunek 1). Trzy powtórzenia przesiewania przeprowadzono w trzy różne dni. Wszystkie trzy płytki zawierają kontrole negatywne (sam rozpuszczalnik, ciemniejsze słupki), a zestawy próbek zawierały znane nematicides. Pozostałe związki pochodzą z niestandardowej biblioteki, która jest obecnie charakteryzowana w laboratorium Roya. W porównaniu do podobnych badań przeprowadzonych z użyciem C. elegans przy zastosowaniu tych samych cząsteczek (SC, JK, PJR, nieopublikowane wyniki), odsetek trafień dla D. dipsaci jest znacznie niższy, a wiele płytek z lekami nie wykazuje żadnej aktywności (Rysunek 1A). Niektóre płytki mają w pełni powtarzalne trafienia (Rysunek 1B,C), podczas gdy inne wykazują zmienną aktywność (Rysunek 1C). W stosunku do innych badanych gatunków (nie pokazano), D. dipsaci wykazuje mniejszą zmienność w odpowiedzi na związki. Niemniej jednak, powtórzenia są uważane za niezbędne w celu identyfikacji powtarzalnych wyników.

Nematicydy różnią się zdolnością do unieruchamiania Ditylenchus dipsaci
Z siedmiu scharakteryzowanych nematicydów przetestowanych przeciwko D. dipsaci, tylko fluopyram wykazuje silną aktywność w opisanym tutaj teście (Rysunek 1C). Jest to zgodne z wcześniejszymi badaniami wykazującymi, że D. dipsaci jest tolerancyjny na nematicydy13,14. Fluopyram hamuje kompleks II łańcucha transportu elektronów w sposób selektywny dla nicieni i jest komercyjnym nematicydem stosowanym do zwalczania różnych PPN, w tym Rotylenchulus reniformis i Meloidogyne incognita4,21,2. Fluopyram oraz jeden z nematicydów, który nie wykazał aktywności w przetestowanym stężeniu (oksamyl)23, zostały poddane bardziej szczegółowym badaniom poprzez analizę zależności dawka-odpowiedź dla D. dipsaci. Fluopyram wywołuje wyraźny zależny od dawki efekt na mobilność D. dipsaci z wartością EC50 wynoszącą 9.3 μM (przy 95% przedziale ufności od 8.2 do 10.5 μM) (Rysunek 2A,B). Wynik ten jest oczekiwany na podstawie opublikowanych wyników in vitro Storelli i wsp., 202013. Oksamyl nie wykazuje istotnego wpływu na mobilność przy stężeniu do 120 µM (p = 0.3632, nieparzysty test t) (Rysunek 2C,D).

Wodorotlenek sodu zwiększa czułość testu
W przeciwieństwie do niemal ciągłej aktywności pływakowej C. elegans w hodowli płynnej18, osobniki D. dipsaci są znacznie mniej mobilne. Nie jest to zjawisko rzadkie wśród nicieni pasożytniczych w hodowli16. Aby pomóc w odróżnieniu nicieni „spoczywających” od chorych, w punkcie końcowym testu stosuje się 40 mM NaOH w celu stymulacji ruchu u osobników zdolnych do poruszania się (Rysunek 3)19,20. Technika ta pozwala na wyraźną identyfikację małych cząsteczek unieruchamiających nicienie, ponieważ wszystkie nicienie w studzienkach kontroli negatywnej poruszają się, co skutkuje wyjątkowo niskim poziomem fałszywie dodatnich wyników w przesiewie.

figure-results-1
Rycina 1: Przykłady wyników przesiewania. Przeprowadzono trzy powtórzenia biologiczne (otwarte kółka) z D. dipsaci przeciwko małym cząsteczkom (60 µM) na każdej z trzech pokazanych płytek. Wszystkie trzy płytki zawierają kontrolki z samym rozpuszczalnikiem DMSO 0,6% (ciemniejsze słupki). Z wyjątkiem kontrolek z rozpuszczalnikiem lub znanych nematycydów, dołki w trzech płytkach zawierają stosunkowo nieopisane związki o charakterze lekowym zakupione od dostawców (patrz Burns et al., 2015)18. (A) Płytka 96-dołkowa z biblioteki małych cząsteczek nie zawiera żadnej cząsteczki o zauważalnej bioaktywności przeciwko D. dipsaci. (B) Płytka 96-dołkowa z biblioteki małych cząsteczek zawiera pojedynczą cząsteczkę, która w sposób powtarzalny zaburza ruchliwość D. dipsaci. (C) 96-dołkowa płytka z lekami zawierająca opisane nematycydy: fluopyram (fluo), iprodione (ipro), abamectin (abam), fluensulfone (flue), tioxazafen (tiox), oxamyl (oxam) oraz wact-1. Słupki błędów reprezentują standardowy błąd średniej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 2: Przykład wyników pozytywnych i negatywnych w teście mobilności. (A) Przykłady fenotypów końcowych po wystawieniu D. dipsaci na działanie rosnących stężeń fluopyramu po 5 dniach, przed dodaniem NaOH. (B) Analiza zależności dawka-odpowiedź dla ruchu D. dipsaci po 5 dniach ekspozycji na wskazane stężenia fluopyramu. (C,D) Analogicznie jak w A i B, lecz dla oksamylu. Każdy wykres przedstawia próby wykonane w dwa oddzielne dni, z trzema powtórzeniami w każdym dniu. Oś Y każdego wykresu wskazuje frakcję mobilnych nicieni w każdej studzience, obliczoną jako liczba poruszających się osobników w stosunku do całkowitej liczby osobników w studzience. Słupki błędu na obu wykresach reprezentują błąd standardowy średniej. Pasek skali oznacza 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Mobilność D. dipsaci po dodaniu 40 mM NaOH. Efekt dodania NaOH do próbek D. dipsaci w obecności kontroli zawierającej tylko rozpuszczalnik (A), tioxazafenu (B) lub fluopyramu (C) po 5 dniach wspólnej inkubacji. Pasek skali reprezentuje 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Kroki krytyczne
Pomimo prostoty protokołu, istnieją krytyczne kroki w protokole, które zasługują na dodatkową uwagę, aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo sukcesu. Po pierwsze, nadmierne bielenie nasion może zakłócić ich wzrost. Dlatego niezbędne jest ograniczenie czasu nasion w roztworze wybielającym do 20 minut lub mniej. Po drugie, jak wcześniej zauważyli Storelli i wsp., pozorny stan zdrowia nicieni pogarsza się z czasem, gdy są przechowywane w temperaturze 4 °C16. Stosowanie nicieni wkrótce po ich pobraniu daje dodatkową pewność, że można osiągnąć optymalne warunki przesiewowe. Jeśli konieczne jest dłuższe przechowywanie, upewnij się, że pokrywa rurki nie jest szczelna, aby umożliwić wymianę tlenu. Po trzecie, upewnienie się, że groszek rośnie na talerzach NA przez sugerowany czas, pozwala eksperymentatorowi ocenić, które nasiona są zanieczyszczone. Po czwarte, przerastanie grochu na płytkach GA przed dodaniem nicieni osłabi infekcję i zmniejszy plon nicieni. Wreszcie, wiele czynników, które są trudne do kontrolowania, może wpływać na wyniki badań przesiewowych. W związku z tym konieczne jest przeprowadzenie wielu niezależnych badań przesiewowych replikacji w różnych dniach, a najlepiej z PPN pobranymi z różnych płytek hodowlanych, aby zapewnić powtarzalność wyników.

Ograniczenia metody
Ograniczeniem protokołu jest to, że nie synchronizuje on etapu rozwojowego zebranych robaków, które wahają się od osobników młodocianych do dorosłych. W związku z tym silne trafienia ujawniane przez dowolny ekran są prawdopodobnie skuteczne na wielu etapach. Protokół zwiększa jednak ryzyko przeoczenia skutecznych trafień specyficznych dla danego etapu. Drugą kwestią jest to, że badania przesiewowe in vitro powinny być uważane za pierwszy krok w procesie odkrywania nematocydów; Testy oparte na glebie są doskonałym uzupełnieniem rurociągu do testowania translatowalności trafień.

Znaczenie i zastosowanie protokołu
Opisane tutaj protokoły są proste i łatwe do powielenia. Co więcej, protokół ten został z powodzeniem zastosowany do innych PPN w laboratorium, w tym Pratylenchus penetrans, poprzez wprowadzenie tylko niewielkich modyfikacji. Opracowanie nowych i bezpiecznych środków kontroli PPN ma zasadnicze znaczenie dla zapewnienia globalnego bezpieczeństwa żywnościowego. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku gatunków takich jak D. dipsaci, które są ogólnie tolerancyjne na szeroką gamę obecnie dopuszczalnych nematocydów chemicznych13,14. W związku z tym przedstawione tutaj protokoły mogą wnieść istotny wkład w zdrowie ludzkie w skali globalnej.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Dr. Qing Yu (Agriculture and Agri-Food Canada) za dostarczenie kultury Ditylenchus dipsaci i za porady dotyczące metod hodowli; Dr. Benjaminowi Mimee (Agriculture and Agri-Food Canada) i Nathalie Dauphinais (Agriculture and Agri-Food Canada) za porady dotyczące hodowli in vitro nicieni pasożytujących na roślinach; Dr. Andrew Burnsowi i Seanowi Harringtonowi za pomocne sugestie dotyczące projektu i manuskryptu. JK jest stypendystą NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholar. PJR jest wspierany przez grant projektowy CIHR (313296). PJR jest Kanadyjską Katedrą Badawczą (Tier 1) w dziedzinie genetyki chemicznej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka 15 mlSarstedt62.554.205
2 kleszczeAlmedic7747-A10-108
Zlewka 2LPyrexCLS10002L
Zlewka 50 mlPyrexCLS100050
96-dołkowa płytkaSarstedt83.3924
folia aluminiowaAlcan Plus
agar bakteriologicznyBioShopAGR001.5
No name brand716
wybielacz komercyjny 6%Lavo Pro 6DIN102358107
(10cm x 1,5cm)JednorazoweFB0875712
(10cm x 2,5cm)Sigma-Aldrich
LeicaLeica MZ75
DMSOSigma-Aldrich472301-500ML
LejekVWR414004-270
Gamborg B5Sigma-AldrichG5893-10L
szklana szalka PetriegoSzkiełko szklane VWR75845-546
MAGNA60-1200
Niestrzępiąca się bibułaV& P ScientificVP 522-100
Końcówki do pipet o niskiej retencji (200uL)Pipeta1159M44
Eppendorf research plus3125000036
NaOHSigma-AldrichS8045-500G
agar odżywczySigma-Aldrich70148-100G
parafilmBemisPM-996
nasiona grochuOntario Seed CompanyD-1995-250G
roztwory do czyszczenia szpilekV& P ScientificVP110A
pinnerV& P ScientificVP381N
tacki do płukania kołkówV& P ScientificVP 421
zbiornik na odczynniki z pokrywką do pipet wielokanałowychSigma-AldrichBR703459
New Brunswick ScientificI26
sterylne ostrze chirurgiczneMAGNAsb21-100-a
Fisherbrand2109 - 1451359
sacharozaBioShopSUC507.1
Filtr do kawy Jednorazowe szalki Petriego szalki Petriego Fisherbrand Luneta sekcyjna Z358762 wielokanałowa LABFORCE Inkubator z wytrząsaniem

Bibliografia

  1. Sasser, J. N., Freckman, D. W. A. world perspective on nematology: the role of the society. Vistas on nematology. , Hyattsville: Society of Nematologists Inc. 7-14 (1987).
  2. Abad, P., et al. Genome sequence of the metazoan plant parasitic nematode Meloidogyne incognita. Nature Biotechnology. 26 (8), 909-915 (2008).
  3. Auwal, M., Hassan, T. H. P., Hongli, S., Jingwu, Z. Nematodes threats to global food security. Acta Agriculturae Scandinavica, Section B - Soil & Plant Science. 63 (5), 420-425 (2013).
  4. Chen, Z. X., Chen, S. Y., Dickson, D. W. Nematicides: Past and present uses. Nematology Vol 2, Nematode Management and Utilization. , CABI Publishing. 1179-1200 (2004).
  5. Desaeger, J., Wram, C., Zasada, I. New reduced-risk agricultural nematicides - and review. Journal of nematology. 52, (2020).
  6. Donely, N. The USA lags behind other agricultural nations in banning harmful pesticides. Environmental Health. 18 (1), 44(2019).
  7. Polansek, T. Monsanto halts launch of chemical after users complain of rashes. Reuters. , (2017).
  8. Sturhan, D., Brzeski, M. W. Stem and bulb nematodes, Ditylenchus spp. Manual of agricultural nematology. , 423-464 (1991).
  9. The European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). Data Sheets on Quarantine Pests; Ditylenchus dipsaci. Prepared by CABI and EPPO for the EU under Contract 90/399003. The European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). , (2021).
  10. Quebec (Canada), Agriculture, Pêcherie et Alimentation Quebec. Réseau d'avertissements phytosanitaires (RAP). Avertissement Carotte, Céleri, Laitue, Oignon, Poireau [Warning carrot celery, lettuce, onion, leek]. Quebec (Canada), Agriculture, Pêcherie et Alimentation Quebec. , (2011).
  11. Abawi, G. S., Moktan, K. Bloat nematode problem on garlic: symptoms, distribution, and management guidelines. Department of Plant Pathology and Plant-microbe Biology, Geneva. , Cornell University. (2010).
  12. Taylor, R. Chapter 7. Nematodes and other worms. , Academic Press. 143-234 (2019).
  13. Storelli, A., Keiser, A., Eder, R., Jenni, S., Kiewnick, S. Evaluation of fluopyram for the control of Ditylenchus dipsaci in sugar beet. Journal of nematology. 52, 1-10 (2020).
  14. Oka, Y. Nematicidal activity of fluensulfone against some migratory nematodes under laboratory conditions. Pest Management Science. 70, 1850(2014).
  15. Poirier, S., Dauphinais, N., Van Der Heyden, H., Véronneau, P. Y., Bélair, G., Gravel, V., Mimee, B. Host Range and Genetic Characterization of Ditylenchus dipsaci Populations from Eastern Canada. Plant disease. 103, 456-460 (2019).
  16. Storelli, A., Kiewnick, S., Daub, M., et al. Virulence and pathogenicity of four Ditylenchus dipsaci populations on sugar beet. Eur J Plant Pathol. 161, 63-71 (2021).
  17. Kühnhold, V., Kiewnick, S., Sikora, R. A. Development of an in vivo bioassay to identify sugar beet resistance to the stem nematode Ditylenchus dipsaci. Nematology. 8 (5), 641-645 (2006).
  18. Burns, A., Luciani, G., Musso, G. Caenorhabditis elegans is a useful model for anthelmintic discovery. Nat Communications. 6, (2015).
  19. Chen, S. Y., Dickson, D. W. A Technique for Determining Live Second-stage Juveniles of Heterodera glycines. Journal of nematology. 32, 117-121 (2000).
  20. Xiang, N., Lawrence, K. S. Optimization of In Vitro Techniques for Distinguishing between Live and Dead Second Stage Juveniles of Heterodera glycinesand Meloidogyne incognita. PLoS ONE. 11 (5), (2016).
  21. US EPA. Fluopyram. US EPA. , OFFICE OF CHEMICAL SAFETY AND POLLUTION PREVENTION (2016).
  22. US EPA. Fluopyram. US EPA. , OFFICE OF CHEMICAL SAFETY AND POLLUTION PREVENTION (2020).
  23. US EPA. Oxamyl Facts. Prevention, Pesticides and Toxic Substances. US EPA. , (2000).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nematody fitoparasytycznehodowla nematod wprzesiew chemicznyma ocz steczkowe nematycydysterylizacja nasiontest na p ytkach agarowychekstrakcja nematod wtest mobilno cimikroskop sekcyjny

Powiązane artykuły