Ten protokół przedstawia szczegółowe podsumowanie strategii inokulacji korzeni roślin mikrobami przenoszonymi przez glebę. Na przykładzie grzybów Verticillium longisporum i Verticillium dahliae opisano trzy różne systemy infekcji korzeni. Przedstawiono potencjalne zastosowania i możliwe dalsze analizy, a także omówiono zalety i wady każdego systemu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Strategie inokulacji w celu infekowania korzeni roślin mikroorganizmami przenoszonymi przez glebę
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ryzosfera kryje w sobie bardzo złożoną społeczność mikroorganizmów, w której korzenie roślin są nieustannie zagrożone. Korzenie mają bliski kontakt z wieloma różnymi mikroorganizmami, ale badania nad interakcjami przenoszonymi przez glebę wciąż pozostają w tyle za tymi przeprowadzanymi na narządach nadziemnych. Chociaż w literaturze opisano niektóre strategie inokulacji roślin modelowych za pomocą modelowych patogenów korzeni, nadal trudno jest uzyskać kompleksowy przegląd metodologiczny. Aby rozwiązać ten problem, dokładnie opisano trzy różne systemy inokulacji korzeni, które można zastosować w celu uzyskania wglądu w biologię interakcji między korzeniami a drobnoustrojami. Dla ilustracji, gatunki Verticillium (a mianowicie V. longisporum i V. dahliae) zostały wykorzystane jako modelowe patogeny atakujące korzenie. Metody te można jednak łatwo dostosować do innych drobnoustrojów kolonizujących korzenie - zarówno chorobotwórczych, jak i korzystnych. Poprzez kolonizację rośliny ksylemu, naczyniowe grzyby przenoszone przez glebę, takie jak Verticillium spp., wykazują unikalny styl życia. Po inwazji korzeni rozprzestrzeniają się przez naczynia ksylemu akropetalnie, docierają do pędu i wywołują objawy chorobowe. Jako żywicieli modelowych wybrano trzy reprezentatywne gatunki roślin: rzodkiewnik pospolity (Arabidopsis thaliana), rzepak o znaczeniu gospodarczym (Brassica napus) i pomidor (Solanum lycopersicum). Podano protokoły krok po kroku. Przedstawiono reprezentatywne wyniki testów patogenności, analiz transkrypcyjnych genów markerowych oraz niezależnych potwierdzeń za pomocą konstruktów reporterowych. Ponadto dokładnie omówiono zalety i wady każdego systemu inokulacji. Te sprawdzone protokoły mogą pomóc w dostarczeniu podejść do pytań badawczych dotyczących interakcji między korzeniami a drobnoustrojami. Wiedza o tym, jak rośliny radzą sobie z mikroorganizmami w glebie, ma kluczowe znaczenie dla opracowania nowych strategii usprawnienia rolnictwa.
Wprowadzenie
Naturalne gleby są zamieszkane przez zdumiewającą liczbę mikrobów, które mogą być neutralne, szkodliwe lub korzystne dla roślin1. Wiele patogenów roślinnych jest przenoszonych przez glebę, otacza korzenie i atakuje podziemne narządy. Mikroorganizmy te należą do wielu różnych kladów: grzybów, lęgniowców, bakterii, nicieni, owadów i niektórych wirusów1,2. Gdy warunki środowiskowe sprzyjają infekcji, podatne rośliny ulegną chorobie, a plony spadną. Skutki zmian klimatycznych, takie jak globalne ocieplenie i ekstremalne zjawiska pogodowe, zwiększą odsetek patogenów roślinnych przenoszonych ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Pożywki do hodowli grzybów i systemy inokulacji roślin
- Płynna pożywka ziemniaczana z dekstrozą (PDB): Przygotować 21 g/L PDB w wodzie ultrapurej w kolbie odpornej na wysoką temperaturę.
- Płynna pożywka Czapek z dekstrozą (CDB): Przygotować 42 g/L CDB w wodzie ultrapurej w kolbie odpornej na wysoką temperaturę.
- Pożywka do systemu inokulacji na szalkach Petriego: Przygotować w kolbie odpornej na wysoką temperaturę 1,5 g/L pożywki Murashige i Skooga (MS) oraz 8 g/L agaru w wodzie ultrapurej.
UWAGA: Należy unikać dodawania cukru do tej pożywki, ponieważ doprowadzi to do nadmiernego wzrostu grzybni po inokulacji. ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zgodnie z protokołem rośliny hodowano i inokulowano V. longisporum (szczep Vl4325) lub V. dahliae (izolat JR218). Zaprojektowano różne scenariusze, aby udowodnić skuteczność i podkreślić pewne możliwości zastosowanych protokołów. Przedstawiono reprezentatywne wyniki.
Indukcja ekspresji genów zaangażowanych w biosyntezę przeciwgrzybicznych glukozynolanów indolowych (IG) jest wiarygodnym wskaźnikiem do oceny infekcji .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ze względu na ogromne straty w plonach spowodowane przez fitopatogeny przenoszone przez glebę1 konieczne jest ulepszenie strategii rolniczych lub odmian roślin uprawnych. Ograniczony wgląd w patogenezę chorób przenoszonych przez glebę utrudnia rozwój bardziej odpornych roślin. Należy zbadać podstawowe patomechanizmy, do czego potrzebna jest solidna platforma metodologiczna. Opisane procedury inokulacji wykazały, że wieloczynnikowe zdarzenia w interakcjach między korzeniami a drobnoustrojami można .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują Timowi Ivenowi i Jaqueline Komorek za wcześniejszą pracę nad tymi metodami, grupie Wolfganga Dröge-Lasera (Wydział Biologii Farmaceutycznej, Uniwersytet w Würzburgu, Niemcy) za dostarczenie sprzętu i zasobów potrzebnych do tej pracy, oraz Wolfgangowi Dröge-Laserowi i Philippowi Kreisz (obaj Uniwersytet w Würzburgu) za krytyczną korektę rękopisu. Badanie to zostało wsparte przez "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG, DR273/15-1,2).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agar (Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | wszystkie opisane systemy wymagają oprogramowania Gelrite |
| Arabidopsis thaliana Wildtype | NASC | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | software do określania powierzchni liści |
| Brassica napus typ dziki | patrz Floerl et al., 2008 | szybki cykl genomu rzepaku | ACaacc |
| Cefotaksym sodu | Duchefa | C0111 | |
| Kolba szykanowa 500 ml | Duran Group / neoLab | E-1090 | Kolba Erlenmeyera z czterema przegrodami |
| Probówki zbiorcze 50 ml | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Bulion dekstrozowy Czapek średni | Duchefa | C1714 | |
| Aparat cyfrowy | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Eksykator (eksykator ) | Duran Group | 200 DN, 5,8 L | Uszczelka z pokrywką do przechowywania chloru |
| gazowego Mikroskop fluorescencyjny | Leica Leica | TCS SP5 II | |
| HCl | Carl Roth | P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | Taśma włókninowa 2,5 cm x 9,2 m |
| MES (kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy)Carl | Roth | 4256.2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | Siarczan magnezu siedmiowodny |
| Murashige & Skoog medium (MS) | Duchefa | M0222 | MS wraz z witaminami |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| Komory wzrostowe Percival | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Szalki Petriego | Sarstedt | 82.1473.001 | rozmiar i Oslash; xH: 92 i razy; 16 mm |
| Kubki plastikowe (500 mL, przezroczyste) | Pro-pac, salaterkax | 5070 | rozmiar: 108 × 81 × 102 mm |
| Plisowany filtr celulozowy | Hartenstein | FF12 | poziom zatrzymywania cząstek 8– 12 μ m |
| poly klima komora uprawowa | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| Bulion ziemniaczany dekstroza pożywka | SIGMA Aldrich | P6685 | do mikrobiologii |
| Doniczki | Pö ppelmann GmbH | TO 7 D lub TO 9,5 D | Ø 7 cm lub Oslash; 9,5 cm |
| PromMYB51::YFP | patrz Poncini et al., 2017 | MYB51 linia reporterska | YFP (tj. 3xmVenus z NLS) |
| Probówki reakcyjne 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR Testowane pod kątem wydajności |
| Wytrząsarka obrotowa (orbitalna) | Edmund Bü hler | SM 30 C control | |
| Piasek (ptasi piasek) | Pet Bistro, Mü ller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum typ dziki | patrz Chavarro-Carrero et al., 2021 | Typ: Moneymaker | |
| Thoma komora zliczania komórek | Marienfeld | 642710 | głębokość 0,020 mm; 0,0025 mm2 |
| Ultraczysta woda (Milli-Q woda oczyszczona) | MERK | IQ 7003/7005 | woda uzyskana po oczyszczeniu |
| Verticillium dahliae | patrz Reusche et al., 2014 | izolat JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise i von Tiedemann, 2002 | szczep Vl43 |
Bibliografia
- Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
- Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
