Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Strategie inokulacji w celu infekowania korzeni roślin mikroorganizmami przenoszonymi przez glebę

7.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63446

⸱

1 marca 2022

 , 
1Department of Pharmaceutical Biology, Julius-von-Sachs-Institute, Julius-Maximilians-Universität Würzburg

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia szczegółowe podsumowanie strategii inokulacji korzeni roślin mikrobami przenoszonymi przez glebę. Na przykładzie grzybów Verticillium longisporum i Verticillium dahliae opisano trzy różne systemy infekcji korzeni. Przedstawiono potencjalne zastosowania i możliwe dalsze analizy, a także omówiono zalety i wady każdego systemu.

Streszczenie

Ryzosfera kryje w sobie bardzo złożoną społeczność mikroorganizmów, w której korzenie roślin są nieustannie zagrożone. Korzenie mają bliski kontakt z wieloma różnymi mikroorganizmami, ale badania nad interakcjami przenoszonymi przez glebę wciąż pozostają w tyle za tymi przeprowadzanymi na narządach nadziemnych. Chociaż w literaturze opisano niektóre strategie inokulacji roślin modelowych za pomocą modelowych patogenów korzeni, nadal trudno jest uzyskać kompleksowy przegląd metodologiczny. Aby rozwiązać ten problem, dokładnie opisano trzy różne systemy inokulacji korzeni, które można zastosować w celu uzyskania wglądu w biologię interakcji między korzeniami a drobnoustrojami. Dla ilustracji, gatunki Verticillium (a mianowicie V. longisporum i V. dahliae) zostały wykorzystane jako modelowe patogeny atakujące korzenie. Metody te można jednak łatwo dostosować do innych drobnoustrojów kolonizujących korzenie - zarówno chorobotwórczych, jak i korzystnych. Poprzez kolonizację rośliny ksylemu, naczyniowe grzyby przenoszone przez glebę, takie jak Verticillium spp., wykazują unikalny styl życia. Po inwazji korzeni rozprzestrzeniają się przez naczynia ksylemu akropetalnie, docierają do pędu i wywołują objawy chorobowe. Jako żywicieli modelowych wybrano trzy reprezentatywne gatunki roślin: rzodkiewnik pospolity (Arabidopsis thaliana), rzepak o znaczeniu gospodarczym (Brassica napus) i pomidor (Solanum lycopersicum). Podano protokoły krok po kroku. Przedstawiono reprezentatywne wyniki testów patogenności, analiz transkrypcyjnych genów markerowych oraz niezależnych potwierdzeń za pomocą konstruktów reporterowych. Ponadto dokładnie omówiono zalety i wady każdego systemu inokulacji. Te sprawdzone protokoły mogą pomóc w dostarczeniu podejść do pytań badawczych dotyczących interakcji między korzeniami a drobnoustrojami. Wiedza o tym, jak rośliny radzą sobie z mikroorganizmami w glebie, ma kluczowe znaczenie dla opracowania nowych strategii usprawnienia rolnictwa.

Wprowadzenie

Naturalne gleby są zamieszkane przez zdumiewającą liczbę mikrobów, które mogą być neutralne, szkodliwe lub korzystne dla roślin1. Wiele patogenów roślinnych jest przenoszonych przez glebę, otacza korzenie i atakuje podziemne narządy. Mikroorganizmy te należą do wielu różnych kladów: grzybów, lęgniowców, bakterii, nicieni, owadów i niektórych wirusów1,2. Gdy warunki środowiskowe sprzyjają infekcji, podatne rośliny ulegną chorobie, a plony spadną. Skutki zmian klimatycznych, takie jak globalne ocieplenie i ekstremalne zjawiska pogodowe, zwiększą odsetek patogenów roślinnych przenoszonych przez glebę3. Dlatego coraz ważniejsze będzie badanie tych destrukcyjnych mikroorganizmów i ich wpływu na produkcję żywności i pasz, ale także na naturalne ekosystemy. Ponadto w glebie znajdują się mutualiści mikrobioliczni, którzy ściśle oddziałują z korzeniami i wspomagają wzrost, rozwój i odporność roślin. W konfrontacji z patogenami rośliny mogą aktywnie rekrutować określonych przeciwników w ryzosferze, którzy mogą wspierać przetrwanie gospodarza poprzez tłumienie patogenów4,5,6,7. Jednak szczegóły mechanistyczne i szlaki zaangażowane w korzystne interakcje między korzeniami a mikroorganizmami są często nadal nieznane6.

Dlatego ważne jest, aby poszerzyć ogólne zrozumienie interakcji między korzeniami a mikroorganizmami. Wiarygodne metody inokulacji korzeni mikroorganizmami przenoszonymi przez glebę są niezbędne do przeprowadzenia badań modelowych i przeniesienia wyników do zastosowań rolniczych. Korzystne interakcje w glebie są badane, na przykład, z Serendipita indica (wcześniej znaną jako Piriformospora indica), wiążącymi azot Rhizobium spp. lub grzybami mikoryzowymi, podczas gdy znane patogeny roślin przenoszone przez glebę obejmują Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp. i Verticillium spp.1. Dwa ostatnie są rodzajami grzybów, które są rozmieszczone na całym świecie i powodują choroby naczyniowe2. Verticillium spp. (Ascomycota) może infekować setki gatunków roślin - głównie dwuliściennych, w tym jednoroczne rośliny zielne, byliny drzewiaste i wiele roślin uprawnych2,8. Strzępki Verticillium wchodzą do korzenia i rosną zarówno międzykomórkowo, jak i wewnątrzkomórkowo w kierunku centralnego cylindra, aby skolonizować naczynia ksylemu2,9. W tych naczyniach grzyb pozostaje przez większość swojego cyklu życia. Ponieważ sok ksylemu jest ubogi w składniki odżywcze i zawiera związki obronne roślin, grzyb musi przystosować się do tego wyjątkowego środowiska. Osiąga się to poprzez wydzielanie białek związanych z kolonizacją, które umożliwiają patogenowi przetrwanie w gospodarzu 10,11. Po dotarciu do układu naczyniowego korzenia grzyb może rozprzestrzeniać się w naczyniach ksylemowych akropetalnie do liści, co prowadzi do ogólnoustrojowej kolonizacji gospodarza9,12. W tym momencie roślina jest negatywnie dotknięta wzrostem9,10,13. Na przykład występują karłowate zahamowanie wzrostu i żółte liście, a także przedwczesne starzenie się13,14,15,16.

Jednym z przedstawicieli tego rodzaju jest Verticillium longisporum, który jest wysoce przystosowany do żywicieli kapustnych, takich jak agronomiczny rzepak, kalafior i roślina modelowa Arabidopsis thaliana12. W kilku badaniach połączono V. longisporum i A. thaliana, aby uzyskać obszerny wgląd w choroby naczyniowe przenoszone przez glebę i wynikające z nich reakcje obronne korzeni13,15,16,17. Proste badanie wrażliwości można przeprowadzić przy użyciu systemu modelowego V. longisporum / A. thaliana, a dla obu organizmów dostępne są dobrze ugruntowane zasoby genetyczne. Blisko spokrewniony z V. longisporum jest patogen Verticillium dahliae. Chociaż oba gatunki grzybów prowadzą podobny tryb życia naczyniowego i proces inwazji, ich wydajność rozmnażania od korzeni do liści i wywołane objawy chorobowe u A. thaliana są różne: podczas gdy V. longisporum zwykle wywołuje wczesne starzenie się, zakażenie V. dahliae powoduje więdnięcie18. Niedawno w podsumowaniu metodologicznym przedstawiono różne strategie inokulacji korzeni w celu zakażenia A. thaliana V. longisporum lub V. dahliae, pomagając w planowaniu konfiguracji eksperymentalnych19. Na polu V. longisporum czasami powoduje znaczne szkody w produkcji rzepaku12, podczas gdy V. dahliae ma bardzo szeroki zakres żywicieli obejmujący kilka gatunków uprawnych, takich jak winorośl, ziemniak i pomidor8. To sprawia, że oba patogeny są interesującymi modelami do zbadania.

Tak więc, poniższe protokoły używają zarówno V. longisporum jak i V. dahliae jako modelowych patogenów korzeniowych, aby zilustrować możliwe podejścia do inokulacji korzeni. Jako żywicieli modelowych wybrano rzodkiewnik pospolity (Arabidopsis thaliana), rzepak (Brassica napus) i pomidor (Solanum lycopersicum). Szczegółowe opisy metodyk można znaleźć w poniższym tekście oraz w towarzyszącym mu filmie. Omówiono zalety i wady każdego systemu inokulacji. Podsumowując, ten zbiór protokołów może pomóc w zidentyfikowaniu odpowiedniej metody dla konkretnych pytań badawczych w kontekście interakcji między korzeniami a drobnoustrojami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Pożywki do hodowli grzybów i systemy inokulacji roślin

  1. Płynna pożywka ziemniaczana z dekstrozą (PDB): Przygotować 21 g/L PDB w wodzie ultrapurej w kolbie odpornej na wysoką temperaturę.
  2. Płynna pożywka Czapek z dekstrozą (CDB): Przygotować 42 g/L CDB w wodzie ultrapurej w kolbie odpornej na wysoką temperaturę.
  3. Pożywka do systemu inokulacji na szalkach Petriego: Przygotować w kolbie odpornej na wysoką temperaturę 1,5 g/L pożywki Murashige i Skooga (MS) oraz 8 g/L agaru w wodzie ultrapurej.
    UWAGA: Należy unikać dodawania cukru do tej pożywki, ponieważ doprowadzi to do nadmiernego wzrostu grzybni po inokulacji.
  4. Pożywka do systemu inokulacji w kubkach plastikowych: Przygotować w kolbie odpornej na wysoką temperaturę 4,4 g/L MS, 0,2 g/L MgSO4, 1 g/L KNO3, 0,5 g/L kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) oraz 6,0 g/L agaru w wodzie ultrapurej, a następnie skorygować pH do 5,7 za pomocą 5 M KOH.
    UWAGA: Należy unikać dodawania cukru do tej pożywki, ponieważ doprowadzi to do nadmiernego wzrostu grzybni po inokulacji.
  5. Pożywka ¼ MS: Przygotować 1,2 g/L MS w wodzie ultrapurej.
  6. Wszystkie powyższe roztwory należy wysterylizować w autoklawie. Kolby szklane umieścić w koszyku, zamknąć pokrywę i sterylizować przez 15 min w temperaturze 121 °C i pod ciśnieniem 98,9 kPa.

2. Sterylizacja powierzchni nasion roślin

UWAGA: Zawsze stosuj poniższy protokół w celu sterylizacji powierzchni nasion Arabidopsis, rzepaku i pomidora przed wysiewem.

  1. Przenieś nasiona do probówki reakcyjnej o pojemności 2 mL. Umieść probówkę w eksykatorze o pojemności wewnętrznej 5,8 L.
  2. Wygeneruj chlor w eksykatorze, dodając 6 mL 33% kwasu solnego (HCl) do 100 mL 12% wodnego roztworu podchlorynu sodu (NaClO).
  3. Natychmiast zamknij pokrywę eksykatora i inkubuj nasiona w gazie przez 3 h.

3. Przygotowanie inokulum ze sporami Verticillium (konidiów aseksualnych)

UWAGA: Hodowlę V. dahliae (szczep JR2) prowadzić w ten sam sposób, co w przypadku V. longisporum (szczep Vl43)17,18,19. Należy upewnić się, że cały sprzęt i pożywki są sterylne, a wszystkie czynności wykonywane są w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby zachować akseniczność inokulum.

  1. Wlej 150 mL ciekłego PDB (krok 1.1) do kolby z b affluentem (chicanery flask) o pojemności 500 mL i uzupełnij pożywkę o 500 mg/L cefotaksymu.
  2. Dodaj konidia Verticillium z zapasów w glicerolu do pożywki PDB. Zamknij kolbę sterylnym korkiem z pianki.
  3. Inkubuj kulturę przez 7-10 dni w ciemnej skrzynce w temperaturze pokojowej (RT) przy ciągłym, poziomym wstrząsaniu (shaker rotacyjny; 60 rpm). Prowadzi to do powstania małych, białych sfer grzybni.
  4. Ostrożnie usuń i wylej nadsącz PDB. Większość grzybni powinna pozostać w kolbie.
  5. Wlej 100 mL ciekłego CDB (krok 1.2) na grzybnię w kolbie z b affluentem i uzupełnij pożywkę o 500 mg/L cefotaksymu.
  6. Inkubuj przez kolejne 4-5 dni w ciemnej skrzynce w RT przy ciągłym, poziomym wstrząsaniu (shaker rotacyjny, 60 rpm), aby zindukować sporulację. Nadsącz zmieni kolor na żółto-szary w miarę uwalniania konidiów.
  7. Przefiltruj część (5-10 mL) cieczy zawierającej konidia przez papier filtracyjny (stopień zatrzymywania cząstek 8-12 µm) do sterylnej probówki zbiorczej o pojemności 50 mL. Pozwala to oddzielić zarodniki od grzybni.
  8. Wyznacz stężenie zarodników, używając komory licznikowej i mikroskopu. Rozcieńcz sterylną pożywką ¼ MS w wodzie ultrapurej, aż do uzyskania podanych poniżej stężeń zarodników.
    UWAGA: Pod mikroskopem konidia V. longisporum są zazwyczaj wydłużone i mają rozmiar 7,1-8,8 µm, podczas gdy konidia V. dahliae są krótsze (3,5-5,5 µm) i raczej sferyczne20.
  9. Wykorzystaj te świeżo zebrane konidia jako inokulum. Należy zawsze przeprowadzać doświadczenia przy użyciu świeżo zebranych konidiów, a nie zapasów mrożonych, ponieważ zamrażanie znacznie zmniejsza liczbę żywych zarodników19.
  10. Do długoterminowego przechowywania zamroź zarodniki w formie wysokostężonego roztworu zarodników (około 1 x 108 zarodników/mL) w 25% glicerolu w temperaturze -80 °C (możliwość przechowywania do 1 roku). W kolejnych doświadczeniach użyj tych zapasów w glicerolu do zaszczepienia pożywki PDB w kroku 3.2.

4. Sterylny system inokulacji in vitro oparty na szalkach Petriego

UWAGA: W przypadku systemu z szalkami Petriego17 należy upewnić się, że cały sprzęt oraz pożywki są sterylne, a wszystkie etapy procedury są wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

  1. Po autoklawowaniu wlej pożywkę (patrz krok 1.3) do szalek Petriego.
  2. Po zestaleniu pożywki ponownie zapakuj szalki Petriego do sterylnej plastikowej torebki i przechowuj je odwrócone do góry dnem przez noc w lodówce (4-10 °C). Schłodzone medium zapobiega przesuwaniu się medium w kolejnych krokach.
  3. Wytnij i usuń skalpelem kanał infekcyjny oraz górną jedną trzecią zestalonej pożywki (Rycina 1A). Podczas wycinania należy unikać dostawania się cieczy lub powietrza pod podłoże agarowe; w przeciwnym razie podłoże może się przesunąć i zamknąć kanał infekcji.
  4. Za pomocą sterylnego końcówki pipety nanieś 50–100 zdezynfekowanych powierzchniowo nasion Arabidopsis na przeciętą górną powierzchnię. Umieść nasiona w zagłębieniu, w którym przecięta powierzchnia agaru styka się ze ścianką szalki Petriego, aby korzenie mogły rosnąć pomiędzy podłożem a ścianką szalki. Ułatwi to późniejszą inokulację.
  5. Zamknąć szalki Petriego i zabezpieczyć je przepuszczalną powietrzem taśmą klejącą, aby umożliwić wymianę gazową.
  6. Po 2 dniach stratyfikacji w ciemności w temperaturze 4 °Cumieścić płytki pionowo w odpowiednim stojaku i hodować rośliny w 22 °C ± 1 °C w warunkach długiego dnia (16 h światła / 8 h ciemności) w komorze wzrostowej.
  7. Gdy większość korzeni dotrze do kanału infekcji (sadzonki w wieku około 9–11 dni), należy ułożyć płytki poziomo, otworzyć je i dodać 500 µL ze świeżo zebranych Verticillium konidia o stężeniu 4 x 105 zarodników/ml bezpośrednio do kanału infekcyjnego, upewniając się, że ciecz jest równomiernie rozprowadzona w kanale.
  8. W analogiczny sposób przygotować płytki kontrolne, dodając 500 µL roztworu pozorowanego zamiast zarodników (pożywka MS pozbawiona drobnoustrojów).
  9. Inkubować płytki w pozycji poziomej przez kilka minut, aż ciecz zostanie wchłonięta i nie będzie wyciekać po ponownym ustawieniu płytek w pozycji pionowej. Następnie zamknąć pokrywę i uszczelnić płytki przepuszczalną dla powietrza taśmą klejącą.
  10. Inkubuj płytki pionowo w komorze wzrostu. Opcjonalnie przykryj części z korzeniami czarnymi papierowymi pudełkami, aby zacienić korzenie i grzyby glebowe (patrz19).
  11. Przeprowadź analizy w preferowanych punktach czasowych po inokulacji, w zależności od pytania badawczego (dokładne punkty czasowe zastosowane w niniejszym badaniu znajdują się w opisach rycin). Poniżej przedstawiono pewne sugestie.
    1. Odetnij liście od korzeni i zbierz obie części osobno. Wyjmij paski agaru z szalek Petriego, aby uzyskać łatwy dostęp do korzeni, a następnie ostrożnie wyciągnij je z agaru za pomocą pęsety. Cały materiał roślinny natychmiast zamroź w ciekłym azocie.
      1. Przetrzeć próbki w ciekłym azocie. Wyizolować całkowite DNA z 100 mg materiału liściowego w celu oznaczenia poprzez ilościowy PCR (qPCR) ilości DNA grzybów w stosunku do DNA roślin (patrz19).
      2. Rozetrzeć próbki w ciekłym azocie. Odważyć 100 mg materiału roślinnego i wyekstrahować całkowite RNA. Przeprowadzić ilościową reakcję polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR), aby określić ekspresję genów roślinnych (lub genów grzybowych) podczas infestacji (patrz19).
    2. Ostrożnie usuń korzenie z agaru, unikając ich uszkodzenia, a następnie zbadaj je pod mikroskopem fluorescencyjnym.
      1. Określanie indukcji genów markerowych w roślinnych liniach reporterowych (np. lucyferazy, β-glukuronidazy lub reporterów fluorescencyjnych)17,19,21).
      2. Wizualizacja propagacji grzybów w obrębie korzenia przy użyciu linii reporterowych grzybów (np. V. longisporum konstytutywnie wykazujących ekspresję ulepszonego zielonego białka fluorescencyjnego, Vl-sGFP9) lub za pomocą technik barwienia (np. przy użyciu 5-bromo-4-chloro-3-indoksylo-N-acetylo-beta-D-glukozaminidu (X-beta-D-Glc-Nac)18).

5. Sterylny system inokulacji in vitro zorganizowany przy użyciu plastikowych kubków

UWAGA: Jak zaznaczono w pierwszym opisie tej techniki19, należy upewnić się, że cały sprzęt i podłoża są wolne od drobnoustrojów, a wszystkie etapy są wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

  1. Należy wykorzystać przezroczyste plastikowe kubki o pojemności całkowitej 500 mL i wysterylizować je w kąpieli z 70%-75% etanolu przez co najmniej 20 min. Kubki należy wysuszyć w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
  2. Do plastikowych kubków wlać autoklawowaną pożywkę (patrz krok 1.4). Opcjonalnie, do autoklawowanej pożywki można dodać cefotaksym (stężenie końcowe 50 mg/L), aby zapobiec kontaminacjom bakteryjnym. W eksperymentach z Arabidopsis należy użyć 150 mL pożywki na kubek, a w eksperymentach z większymi gatunkami roślin (rzepak, pomidor) większej ilości pożywki (250-300 mL na kubek).
  3. Przed zastygnięciem pożywki na jej powierzchni należy umieścić warstwę plastiku (wcześniej wysterylizowaną poprzez inkubację w 70%-75% etanolu przez 20 min) (Rycina 1B).
    UWAGA: Ta plastikowa warstwa zawiera cztery prefabrykowane otwory w narożnikach do umieszczenia sterylizowanych powierzchniowo nasion. Pozwala to nasionom na dostęp do pożywki. W dalszej kolejności ta warstwa separacyjna zapobiega dotykaniu liści przez pożywkę zawierającą grzyba, dzięki czemu mikroby nie mogą atakować liści bezpośrednio i muszą przenikać drogą korzeniową. Kolejny otwór znajduje się w centrum, co umożliwia wycięcie kanału infekcji.
  4. Po zastygnięciu pożywki należy wyciąć w agarze skalpelem przez prefabrykowany otwór centralny kanał o głębokości około 1.5 cm. Wycięty agar należy usunąć, aby stworzyć kanał infekcji, do którego później będzie można dodać zarodniki grzyba.
  5. W czterech mniejszych otworach należy lekko zadrapać pożywkę agarową końcówką pipety, aby przerwać zastygłą błonę (pozwala to nasionom wchłaniać wodę z wodnistej pożywki agarowej). Za pomocą końcówki pipety należy umieścić nasiona w mniejszych otworach.
  6. Plastikowy kubek należy zamknąć drugim, odwróconym plastikowym kubkiem i uszczelnić przepuszczalną dla powietrza taśmą klejącą. Taśma musi umożliwiać wymianę gazową.
  7. Po stratyfikacji przez 3 dni w ciemności w temperaturze 4 °C, systemy w kubkach należy inkubować w warunkach 12 h światła / 12 h ciemności (Arabidopsis, rzepak) lub 16 h światła / 8 h ciemności (pomidor) w komorach wzrostowych przy stałej temperaturze 22 °C i wilgotności 60%.
  8. Należy przestrzegać zalecanego wieku roślin w momencie inokulacji: 21 dni dla Arabidopsis; 5-7 dni dla rzepaka; 12 dni dla pomidora.
  9. Siewki należy inokulować Verticillium, dodając 1 mL roztworu konidiów (zalecane stężenie: 4 x 105 zarodników/mL) do kanału infekcji. W celu przygotowania próbek kontrolnych do kanału należy dodać 1 mL roztworu pozorowanego bez zarodników (jałowa pożywka ¼ MS).
  10. Analizy należy przeprowadzić w preferowanych punktach czasowych po inokulacji, w zależności od pytania badawczego (dokładne punkty czasowe użyte w tym opracowaniu znajdują się w podpisach do rycin). Poniżej przedstawiono kilka sugestii.
    1. Należy wykonać zdjęcia roślin cyfrowym aparatem fotograficznym z góry, zachowując taką samą odległość dla każdego zdjęcia. Należy określić pole powierzchni liści (np. za pomocą ImageJ22 lub BlattFlaeche17,19; do ustawienia skali należy użyć wysokości kubków) i porównać grupy zainfekowane i kontrolne. Należy skategoryzować rozwój objawów choroby (np. mniejsze, bardziej żółte lub nekrotyczne liście).
      UWAGA: Jeśli u Arabidopsis pojawiły się łodygi, należy je usunąć, aby uzyskać lepsze zdjęcia rozet.
    2. Należy usunąć korzenie i określić biomasę (masę świeżą) pędów z próbek zainfekowanych i kontrolnych poprzez ważenie. Następnie należy wyznaczyć względną masę świeżą19.
    3. Próbki do analiz molekularnych należy pobrać w następujący sposób.
    4. Arabidopsis: Usunąć łodygi, jeśli są obecne. Odciąć rozety u nasady od korzeni. Należy upewnić się, że z próbki wykluczono cały materiał korzeniowy i pobrano całe rozety. Połączyć 4-5 rozet z różnych roślin w jedną próbkę i zamrozić materiał liściowy w ciekłym azocie.
    5. Korzenie należy ostrożnie wyciągnąć z pożywki pęsetą, docisnąć i osuszyć ręcznikiem papierowym, aby usunąć pozostałości agaru, a następnie połączyć 4-5 korzeni z różnych roślin w jedną próbkę. Natychmiast zamrozić w ciekłym azocie.
    6. Rzepak/pomidor: Wyciąć segmenty łodygi z hipokotylu (np. o długości 1 cm; zawsze pobierać ten sam region łodygi). Połączyć materiał z 4-5 roślin w każdą próbkę i zamrozić w ciekłym azocie.
    7. Próbki należy rozdrobnić w ciekłym azocie. Wyekstrahować całkowite DNA z 100 mg materiału liściowego lub łodygowego, aby określić via qPCR ilość DNA grzyba w stosunku do DNA rośliny (patrz19).
    8. Próbki należy rozdrobnić w ciekłym azocie, pobrać 100 mg materiału roślinnego i wyekstrahować całkowite RNA. Przeprowadzić qRT-PCR w celu określenia ekspresji genów roślinnych (lub genów grzyba) po infekcji (patrz19).

6. System inokulacji w glebie w doniczkach

  1. Dokładnie wymieszaj ziemię z piaskiem w stosunku objętościowym 3:1 (ziemia:piasek), aby ułatwić usuwanie podłoża z korzeni. Wsyp mieszaninę do worka autoklawizacyjnego. Jeśli mieszanina jest zbyt sucha, dodaj odpowiednią ilość wody i wymieszaj z podłożem. Sterylizuj parą w 80 °C przez 20 min w autoklawie, aby zminimalizować zanieczyszczenia mikrobiologiczne.
    UWAGA: Należy unikać podgrzewania powyżej 80 °C, ponieważ może to wpłynąć na organiczne składniki odżywcze gleby.
  2. Wypełnić doniczki mieszanką ziemi i piasku, a następnie umieścić je w tackach. Wlać do tacek wodę do wysokości około 1/3 doniczki, tak aby mieszanka ziemi i piasku została całkowicie nasączona wodą. Dodatkowo spryskać podłoże wodą z butelki z atomizerem, aby zapewnić wilgotne warunki początkowe.
  3. Wysiej 3-4 nasiona do każdej doniczki (Rycina 1C) zapewniając odpowiednie odstępy między nasionami. Przechowywać je przez 3 dni w ciemności w temperaturze 4 °C do stratyfikacji w celu synchronizacji kiełkowania.
    UWAGA: Należy uprzednio wyhodować nadwyżkę roślin, co umożliwi wybór osobników o podobnej wielkości do eksperymentów z inokulacją i ograniczy odchylenia wynikające z różnic indywidualnych.
  4. Pozostawić siewki do wzrostu w warunkach długiego dnia (16 h światła / 8 h ciemności; stała temperatura wynosząca 22 °C; 60% wilgotności) przy regularnym podlewaniu.
  5. Należy przestrzegać zalecanego wieku roślin w momencie inokulacji: 21 dni dla Arabidopsis, 7 dni dla rzepaku i 10 dni dla pomidora. Do wykonania „inokulacji metodą zanurzenia korzeni” należy wybrać rośliny o podobnej wielkości.15,17,23,24Wyjąć glebę z doniczek i ostrożnie odkopać korzenie.
  6. Ostrożnie opłucz same korzenie w pojemniku z wodą, nie zanurzając w niej rozet. Umyte korzenie inkubuj przez 60 min w czarce Petri zawierającej Verticillium roztwór zarodników (zalecane stężenie: 2 x 106 zarodników/ml). W przypadku kontrolnej grupy niezinfekowanej korzenie należy inkubować przez 60 min w roztworze pozornym bez zarodników (sterylna pożywka ¼ MS).
  7. Przygotować nowe doniczki z wilgotną, wysterylizowaną parą wodną ziemią (80 °C przez 20 min) bez piasku. Za pomocą końcówki pipety należy wykonać jeden otwór w centrum gleby w każdej doniczce.
  8. Umieść korzenie bezpośrednio w otworze (przesadzaj tylko jedną roślinę do jednej doniczki). Po włożeniu korzeni należy starannie uzupełnić otwory ziemią. Unikaj ugniatania ziemi, w przeciwnym razie przesadzanie może wywołać objawy stresu, takie jak fioletowe liście.
  9. Hodować grupy zainfekowane i kontrolne w warunkach długiego dnia (16 h światła / 8 h ciemności; stała temperatura wynosząca 22 °C; 60% wilgotności) z regularnym podlewaniem.
  10. Przeprowadź analizy w preferowanych punktach czasowych po inokulacji, w zależności od pytania badawczego (dokładne punkty czasowe zastosowane w niniejszej procedurze podano w podpisach do rycin). Poniżej przedstawiono kilka sugestii.
    1. Wykonaj zdjęcia roślin cyfrowym aparatem fotograficznym z góry, zachowując taką samą odległość dla każdego zdjęcia. Ilościowo określ powierzchnię liści (np. za pomocą ImageJ22 lub powierzchnia liścia17,19; należy wykorzystać średnicę doniczek do ustawienia skali) i porównać grupy zainfekowaną oraz kontrolną. Skategoryzować rozwój objawów choroby (np. mniejsze, bardziej żółte lub nekrotyczne liście)13.
      UWAGA: Usunięcie łodyg Arabidopsis ułatwia fotografowanie rozet.
    2. Usunąć korzenie i określić biomasę (masę świeżą) pędów z próbek zainfekowanych i kontrolnych poprzez ważenie. Wyznaczyć względną masę świeżą.19.
    3. Alternatywnie można zmierzyć wysokość rośliny lub skategoryzować wzrost grzyba z segmentów łodygi w celu oceny stopnia nasilenia choroby13.
    4. Pobieranie próbek do analiz molekularnych należy przeprowadzić w następujący sposób.
    5. Arabidopsis: Usuń łodygi. Odetnij rozety na poziomie szyjki korzeniowej. Połącz 4–5 rozet z różnych roślin w jedną próbkę. Zamroź materiał liściowy w ciekłym azocie.
      UWAGA: W przypadku korzeni trudno jest je dostatecznie oczyścić z gleby bez wywoływania zmiany ekspresji genów poprzez płukanie.
    6. Rzepak/pomidor: Wyciąć fragmenty łodygi z podsadki (np. o długości 1 cm; zawsze pobierać materiał z tego samego regionu łodygi). Połączyć materiał z 4–5 roślin w jedną próbkę i zamrozić w ciekłym azocie.
    7. Przetrzeć próbki w ciekłym azocie. Wyekstrahować całkowite DNA z 100 mg materiału z liści lub łodygi w celu oznaczenia poprzez ilość DNA grzybów w stosunku do DNA rośliny metodą qPCR (patrz19).
    8. Rozetrzeć próbki w ciekłym azocie, odważyć 100 mg materiału roślinnego i wyekstrahować całkowite RNA. Przeprowadzić analizę qRT-PCR w celu określenia ekspresji genów roślinnych (lub grzybowych) po infekcji (patrz19).

7. Analiza danych

  1. Oblicz średnią oraz odchylenie standardowe (± SD) na podstawie powtórzeń biologicznych.
  2. Oblicz wartości względne, dzieląc wszystkie wyniki z grupy zainfekowanej przez wynik grupy kontrolnej. Przedstaw średnią, na przykład jako „względnie do mock” lub „względnie do typu dzikiego”.
  3. Określ istotność statystyczną pomiędzy grupami.

Metody inokulacji patogenów roślin; schemat układów doświadczalnych A, B, C wraz z wynikami qRT-PCR.
Rycina 1: Zestawienie trzech systemów inokulacji oraz poszczególnych kroków w protokołach. Ryciny te ilustrują systemy z wykorzystaniem rośliny modelowej Arabidopsis thaliana. W przypadku innych gatunków roślin czas trwania poszczególnych etapów musi zostać dostosowany. Pomarańczowe pola wskazują, które analizy następcze są najbardziej zalecane dla danego systemu. (A) W przypadku systemu inokulacji w szalkach Petriego17, wlej podłoże i poczekaj, aż stwardnieje. Przechowuj szalki w lodówce przez noc. Następnie skalpelem wytnij i usuń górną jedną trzecią oraz kanał infekcji (IC) (obszary białe na ilustracji zostały usunięte z agaru, natomiast obszary niebieskawe reprezentują agar). Umieść nasiona na powierzchni cięcia i zamknij szalki Petriego. Po stratyfikacji ustaw szalki pionowo i pozwól roślinom rosnąć. Gdy większość korzeni dotrze do kanału infekcji, dodaj za pomocą pipety roztwór zarodników bezpośrednio do kanału. Upewnij się, że roztwór jest równomiernie rozprowadzony. Zamknij szalki Petriego i inkubuj je w pozycji pionowej w komorze wzrostowej. Możliwymi dalszymi etapami są analiza ekspresji za pomocą ilościowej odwrotnej transkrypcji PCR (qRT-PCR), mikroskopia z użyciem linii reporterowych oraz kwantyfikacja mikrobiologicznego DNA. (B) W przypadku systemu inokulacji w plastikowych kubkach19, wlej podłoże i przenieś oddzielającą plastikową warstwę z prefabrykowanymi otworami (cztery małe otwory w narożnikach do umieszczenia nasion i jeden duży otwór w centrum na kanał infekcji). Pozostaw podłoże do stwardnienia. Wytnij skalpelem i usuń podłoże agarowe w centralnym otworze, aby uzyskać kanał infekcji (IC). Przeciągnij podłoże w mniejszych otworach i przenieś nasiona. Zamknij kubek odwróconym kubkiem i zabezpiecz przepuszczalną powietrzem taśmą (oznaczoną na żółto). Pozostaw rośliny do wzrostu. W celu inokulacji dodaj za pomocą pipety roztwór zarodników bezpośrednio do kanału infekcji. Zamknij system i kontynuuj uprawę w komorze wzrostowej. Możliwymi dalszymi etapami są analiza ekspresji za pomocą qRT-PCR, kwantyfikacja mikrobiologicznego DNA oraz wyznaczenie masy świeżej, powierzchni liści lub innych cech chorobowych. (C) „Inokulacja przez zanurzenie korzeni”15,17,23,24: w przypadku systemu inokulacji w glebie, wypełnij doniczki mieszanką ziemi i piasku. Przenieś nasiona i pozwól siewkom rosnąć. Wykop rośliny o podobnej wielkości i opłucz korzenie w wodzie. Umieść opłukane korzenie w szalce Petriego zawierającej roztwór z zarodnikami. Po inkubacji wsadź pojedyncze rośliny do doniczek z ziemią. Możliwymi dalszymi etapami są analiza ekspresji w liściach za pomocą qRT-PCR, kwantyfikacja mikrobiologicznego DNA oraz wyznaczenie masy świeżej, powierzchni liści lub innych cech chorobowych. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zgodnie z protokołem rośliny hodowano i inokulowano V. longisporum (szczep Vl4325) lub V. dahliae (izolat JR218). Zaprojektowano różne scenariusze, aby udowodnić skuteczność i podkreślić pewne możliwości zastosowanych protokołów. Przedstawiono reprezentatywne wyniki.

Indukcja ekspresji genów zaangażowanych w biosyntezę przeciwgrzybicznych glukozynolanów indolowych (IG) jest wiarygodnym wskaźnikiem do oceny infekcji ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ze względu na ogromne straty w plonach spowodowane przez fitopatogeny przenoszone przez glebę1 konieczne jest ulepszenie strategii rolniczych lub odmian roślin uprawnych. Ograniczony wgląd w patogenezę chorób przenoszonych przez glebę utrudnia rozwój bardziej odpornych roślin. Należy zbadać podstawowe patomechanizmy, do czego potrzebna jest solidna platforma metodologiczna. Opisane procedury inokulacji wykazały, że wieloczynnikowe zdarzenia w interakcjach między korzeniami a drobnoustrojami można ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Timowi Ivenowi i Jaqueline Komorek za wcześniejszą pracę nad tymi metodami, grupie Wolfganga Dröge-Lasera (Wydział Biologii Farmaceutycznej, Uniwersytet w Würzburgu, Niemcy) za dostarczenie sprzętu i zasobów potrzebnych do tej pracy, oraz Wolfgangowi Dröge-Laserowi i Philippowi Kreisz (obaj Uniwersytet w Würzburgu) za krytyczną korektę rękopisu. Badanie to zostało wsparte przez "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG, DR273/15-1,2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agar (Gelrite)Carl RothNr. 0039wszystkie opisane systemy wymagają oprogramowania Gelrite
Arabidopsis thaliana WildtypeNASCCol-0 (N1092)
AutoclaveSystecVE-100
BlattFlaecheDatinf GmbHBlattFlaechesoftware do określania powierzchni liści
Brassica napus typ dzikipatrz Floerl et al., 2008szybki cykl genomu rzepakuACaacc
Cefotaksym soduDuchefaC0111
Kolba szykanowa 500 mlDuran Group / neoLabE-1090Kolba Erlenmeyera z czterema przegrodami
Probówki zbiorcze 50 mlSarstedt62.547.254114 x 28 mm
Bulion dekstrozowy Czapek średniDuchefaC1714
Aparat cyfrowyNikonD3100 18-55 VR
Eksykator (eksykator )Duran Group200 DN, 5,8 LUszczelka z pokrywką do przechowywania chloru
gazowego Mikroskop fluorescencyjnyLeica LeicaTCS SP5 II
HClCarl RothP074.3
KNO3Carl RothP021.1≥ 99 %
KOHCarl Roth6751
LeukoporBSN medical GmbH2454-00 APTaśma włókninowa 2,5 cm x 9,2 m
MES (kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy)CarlRoth4256.2Pufferan ≥ 99 %
MgSO4Carl RothT888.1Siarczan magnezu siedmiowodny
Murashige & Skoog medium (MS)DuchefaM0222MS wraz z witaminami
NaClOCarl Roth9062.1
Komory wzrostowe PercivalCLF Plant Climatics GmbHAR-66L2
Szalki PetriegoSarstedt82.1473.001rozmiar i Oslash; xH: 92 i razy; 16 mm
Kubki plastikowe (500 mL, przezroczyste)Pro-pac, salaterkax5070rozmiar: 108 × 81 × 102 mm
Plisowany filtr celulozowyHartensteinFF12poziom zatrzymywania cząstek 8– 12 μ m
poly klima komora uprawowapoly klima GmbHPK 520 WLED
Bulion ziemniaczany dekstroza pożywkaSIGMA AldrichP6685do mikrobiologii
DoniczkiPö ppelmann GmbHTO 7 D lub TO 9,5 DØ 7 cm lub Oslash; 9,5 cm
PromMYB51::YFPpatrz Poncini et al., 2017MYB51 linia reporterskaYFP (tj. 3xmVenus z NLS)
Probówki reakcyjne 2 mLSarstedt72.695.400PCR Testowane pod kątem wydajności
Wytrząsarka obrotowa (orbitalna)Edmund Bü hlerSM 30 C control
Piasek (ptasi piasek)Pet Bistro, Mü ller Holding786157
SoilEinheitserde spezialSP Pikier (SP ED 63 P)
Solanum lycopersicum typ dzikipatrz Chavarro-Carrero et al., 2021Typ: Moneymaker
Thoma komora zliczania komórekMarienfeld642710głębokość 0,020 mm; 0,0025 mm2
Ultraczysta woda (Milli-Q woda oczyszczona)MERKIQ 7003/7005woda uzyskana po oczyszczeniu
Verticillium dahliaepatrz Reusche et al., 2014izolat JR2
Verticillium longisporumZeise i von Tiedemann, 2002szczep Vl43

Bibliografia

  1. Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
  2. Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J. The xylem as battleground for plant hosts and vascular wilt pathogens. Frontiers in Plant Science. 4, 97(2013).
  3. Delgado-Baquerizo, M., et al. The proportion of soil-borne pathogens increases with warming at the global scale. Nature Climate Change. 10 (6), 550-554 (2020).
  4. Berendsen, R. L., et al. Disease-induced assemblage of a plant-beneficial bacterial consortium. The ISME Journal. 12 (6), 1496-1507 (2018).
  5. Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156(2018).
  6. Liu, H., et al. Evidence for the plant recruitment of beneficial microbes to suppress soil-borne pathogens. New Phytologist. 229 (5), 2873-2885 (2021).
  7. Wang, H., Liu, R., You, M. P., Barbetti, M. J., Chen, Y. Pathogen biocontrol using plant growth-promoting bacteria (PGPR): role of bacterial diversity. Microorganisms. 9 (9), 1988(2021).
  8. Inderbitzin, P., Subbarao, K. V. Verticillium systematics and evolution: how confusion impedes Verticillium wilt management and how to resolve it. Phytopathology. 104 (6), 564-574 (2014).
  9. Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlowsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum und V. dahliae with Brassica napus with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
  10. Floerl, S., et al. Defence reactions in the apoplastic proteome of oilseed rape (Brassica napus var. napus) attenuate Verticillium longisporum growth but not disease symptoms. BMC Plant Biology. 8, 129(2008).
  11. Leonard, M., et al. Verticillium longisporum elicits media-dependent secretome responses with capacity to distinguish between plant-related environments. Frontiers in Microbiology. 11, 1876(2020).
  12. Depotter, J. R. L., et al. Verticillium longisporum, the invisible threat to oilseed rape and other brassicaceous plant hosts. Molecular Plant Pathology. 17 (7), 1004-1016 (2016).
  13. Fröschel, C., et al. A gain-of-function screen reveals redundant ERF transcription factors providing opportunities for resistance breeding toward the vascular fungal pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1095-1109 (2019).
  14. Zhou, L., Hu, Q., Johansson, A., Dixelius, C. Verticillium longisporum and V. dahliae: infection and disease in Brassica napus. Plant Pathology. 55 (1), 137-144 (2006).
  15. Ralhan, A., et al. The vascular pathogen Verticillium longisporum requires a jasmonic acid-independent COI1 function in roots to elicit disease symptoms in Arabidopsis shoots. Plant Physiology. 159 (3), 1192-1203 (2012).
  16. Reusche, M., et al. Stabilization of cytokinin levels enhances Arabidopsis resistance against Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 850-860 (2013).
  17. Iven, T., et al. Transcriptional activation and production of tryptophan-derived secondary metabolites in Arabidopsis roots contributes to the defense against the fungal vascular pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant. 5 (6), 1389-1402 (2012).
  18. Reusche, M., et al. Infections with the vascular pathogens Verticillium longisporum and Verticillium dahliae induce distinct disease symptoms and differentially affect drought stress tolerance of Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 108, 23-37 (2014).
  19. Fröschel, C. In-depth evaluation of root infection systems using the vascular fungus Verticillium longisporum as soil-borne model pathogen. Plant Methods. 17 (1), 57(2021).
  20. Karapapa, V. K., Bainbridge, B. W., Heale, J. B. Morphological and molecular characterization of Verticillium longisporum comb, nov., pathogenic to oilseed rape. Mycological Research. 101 (11), 1281-1294 (1997).
  21. Poncini, L., et al. In roots of Arabidopsis thaliana, the damage-associated molecular pattern AtPep1 is a stronger elicitor of immune signalling than flg22 or the chitin heptamer. PLoS One. 12 (10), 1-21 (2017).
  22. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  23. Fradin, E. F., et al. Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1. Plant Physiology. 150 (1), 320-332 (2009).
  24. Singh, S., et al. The plant host Brassica napus induces in the pathogen Verticillium longisporum the expression of functional catalase peroxidase which is required for the late phase of disease. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (4), 569-581 (2012).
  25. Zeise, K., von Tiedemann, A. Application of RAPD-PCR for virulence type analysis within Verticillium dahliae and Verticillium longisporum. Journal of Phytopathology. 150 (10), 557-563 (2002).
  26. Fröschel, C., et al. Plant roots employ cell-layer-specific programs to respond to pathogenic and beneficial microbes. Cell Host & Microbe. 29 (2), 299-310 (2021).
  27. Gigolashvili, T., et al. The transcription factor HIG1/MYB51 regulates indolic glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 50 (5), 886-901 (2007).
  28. Back, M. A., Haydock, P. P. J., Jenkinson, P. Disease complexes involving plant parasitic nematodes and soilborne pathogens. Plant Pathology. 51 (6), 683-697 (2002).
  29. Behrens, F. H., et al. Suppression of abscisic acid biosynthesis at the early infection stage of Verticillium longisporum in oilseed rape (Brassica napus). Molecular Plant Pathology. 20 (12), 1645-1661 (2019).
  30. Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. Establishing causality: opportunities of synthetic communities for plant microbiome research. Cell Host & Microbe. 22 (2), 142-155 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Inokulacja korzeniinfekcja korzeni roślinoddziaływania mikrobów korzeniowychgatunki Verticilliumtesty patogennościekspresja genów markerowychArabidopsis thalianasystem glebowyinokulacja metodą zanurzeniową korzeni
Strategie inokulacji w celu infekowania korzeni roślin mikroorganizmami przenoszonymi przez glebę
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.