Strategie inokulacji w celu infekowania korzeni roślin mikroorganizmami przenoszonymi przez glebę

Naturalne gleby są zamieszkane przez zdumiewającą liczbę mikrobów, które mogą być neutralne, szkodliwe lub korzystne dla roślin¹. Wiele patogenów roślinnych jest przenoszonych przez glebę, otacza korzenie i atakuje podziemne narządy. Mikroorganizmy te należą do wielu różnych kladów: grzybów, lęgniowców, bakterii, nicieni, owadów i niektórych wirusów^1,2. Gdy warunki środowiskowe sprzyjają infekcji, podatne rośliny ulegną chorobie, a plony spadną. Skutki zmian klimatycznych, takie jak globalne ocieplenie i ekstremalne zjawiska pogodowe, zwiększą odsetek patogenów roślinnych przenoszonych przez glebę³. Dlatego coraz ważniejsze będzie badanie tych destrukcyjnych mikroorganizmów i ich wpływu na produkcję żywności i pasz, ale także na naturalne ekosystemy. Ponadto w glebie znajdują się mutualiści mikrobioliczni, którzy ściśle oddziałują z korzeniami i wspomagają wzrost, rozwój i odporność roślin. W konfrontacji z patogenami rośliny mogą aktywnie rekrutować określonych przeciwników w ryzosferze, którzy mogą wspierać przetrwanie gospodarza poprzez tłumienie patogenów^4,5,6,7. Jednak szczegóły mechanistyczne i szlaki zaangażowane w korzystne interakcje między korzeniami a mikroorganizmami są często nadal nieznane⁶.

Dlatego ważne jest, aby poszerzyć ogólne zrozumienie interakcji między korzeniami a mikroorganizmami. Wiarygodne metody inokulacji korzeni mikroorganizmami przenoszonymi przez glebę są niezbędne do przeprowadzenia badań modelowych i przeniesienia wyników do zastosowań rolniczych. Korzystne interakcje w glebie są badane, na przykład, z Serendipita indica (wcześniej znaną jako Piriformospora indica), wiążącymi azot Rhizobium spp. lub grzybami mikoryzowymi, podczas gdy znane patogeny roślin przenoszone przez glebę obejmują Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp. i Verticillium spp.¹. Dwa ostatnie są rodzajami grzybów, które są rozmieszczone na całym świecie i powodują choroby naczyniowe². Verticillium spp. (Ascomycota) może infekować setki gatunków roślin - głównie dwuliściennych, w tym jednoroczne rośliny zielne, byliny drzewiaste i wiele roślin uprawnych^2,8. Strzępki Verticillium wchodzą do korzenia i rosną zarówno międzykomórkowo, jak i wewnątrzkomórkowo w kierunku centralnego cylindra, aby skolonizować naczynia ksylemu^2,9. W tych naczyniach grzyb pozostaje przez większość swojego cyklu życia. Ponieważ sok ksylemu jest ubogi w składniki odżywcze i zawiera związki obronne roślin, grzyb musi przystosować się do tego wyjątkowego środowiska. Osiąga się to poprzez wydzielanie białek związanych z kolonizacją, które umożliwiają patogenowi przetrwanie w gospodarzu ^10,11. Po dotarciu do układu naczyniowego korzenia grzyb może rozprzestrzeniać się w naczyniach ksylemowych akropetalnie do liści, co prowadzi do ogólnoustrojowej kolonizacji gospodarza^9,12. W tym momencie roślina jest negatywnie dotknięta wzrostem^9,10,13. Na przykład występują karłowate zahamowanie wzrostu i żółte liście, a także przedwczesne starzenie się^13,14,15,16.

Jednym z przedstawicieli tego rodzaju jest Verticillium longisporum, który jest wysoce przystosowany do żywicieli kapustnych, takich jak agronomiczny rzepak, kalafior i roślina modelowa Arabidopsis thaliana¹². W kilku badaniach połączono V. longisporum i A. thaliana, aby uzyskać obszerny wgląd w choroby naczyniowe przenoszone przez glebę i wynikające z nich reakcje obronne korzeni^13,15,16,17. Proste badanie wrażliwości można przeprowadzić przy użyciu systemu modelowego V. longisporum / A. thaliana, a dla obu organizmów dostępne są dobrze ugruntowane zasoby genetyczne. Blisko spokrewniony z V. longisporum jest patogen Verticillium dahliae. Chociaż oba gatunki grzybów prowadzą podobny tryb życia naczyniowego i proces inwazji, ich wydajność rozmnażania od korzeni do liści i wywołane objawy chorobowe u A. thaliana są różne: podczas gdy V. longisporum zwykle wywołuje wczesne starzenie się, zakażenie V. dahliae powoduje więdnięcie¹⁸. Niedawno w podsumowaniu metodologicznym przedstawiono różne strategie inokulacji korzeni w celu zakażenia A. thaliana V. longisporum lub V. dahliae, pomagając w planowaniu konfiguracji eksperymentalnych¹⁹. Na polu V. longisporum czasami powoduje znaczne szkody w produkcji rzepaku¹², podczas gdy V. dahliae ma bardzo szeroki zakres żywicieli obejmujący kilka gatunków uprawnych, takich jak winorośl, ziemniak i pomidor⁸. To sprawia, że oba patogeny są interesującymi modelami do zbadania.

Tak więc, poniższe protokoły używają zarówno V. longisporum jak i V. dahliae jako modelowych patogenów korzeniowych, aby zilustrować możliwe podejścia do inokulacji korzeni. Jako żywicieli modelowych wybrano rzodkiewnik pospolity (Arabidopsis thaliana), rzepak (Brassica napus) i pomidor (Solanum lycopersicum). Szczegółowe opisy metodyk można znaleźć w poniższym tekście oraz w towarzyszącym mu filmie. Omówiono zalety i wady każdego systemu inokulacji. Podsumowując, ten zbiór protokołów może pomóc w zidentyfikowaniu odpowiedniej metody dla konkretnych pytań badawczych w kontekście interakcji między korzeniami a drobnoustrojami.

1. Pożywki do kultur grzybów i systemów inokulacji roślin

1. Płynny bulion ziemniaczany i dekstroza (PDB): Przygotować 21 g/l PDB w ultraczystej wodzie w termostabilnej kolbie.
2. Płynny bulion dekstrozowy Czapek (CDB): Przygotować 42 g/l CDB w ultraczystej wodzie w kolbie stabilnej termicznie.
3. Pożywka do systemu inokulacji na szalce Petriego: Przygotować termostabilną kolbę z 1,5 g/l pożywki Murashige i Skooga (MS) i 8 g/l agaru w ultraczystej wodzie.
   UWAGA: Unikaj cukru w tej pożywce, ponieważ doprowadzi to do nadmiernego wzrostu grzybów po zaszczepieniu.
4. Pożywka do systemu inokulacji opartego na plastikowym kubku: Przygotować termostabilną kolbę z 4,4 g/l MS, 0,2 g/l MgSO₄, 1 g/l KNO₃, 0,5 g/L kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) i 6,0 g/l agaru w ultraczystej wodzie i dostosować pH do 5,7 za pomocą 5 M KOH.
   UWAGA: Unikaj cukru w tej pożywce, ponieważ doprowadzi to do nadmiernego wzrostu grzybów po zaszczepieniu.
5. 1/4 MS podłoża: Przygotować 1,2 g/L MS w ultraczystej wodzie.
6. Użyj autoklawu do sterylizacji wszystkich powyższych roztworów. Szklane kolby włożyć do kosza, zamknąć pokrywkę i sterylizować przez 15 minut w temperaturze 121 °C i 98,9 kPa.

2. Sterylizacja powierzchni nasion roślin

UWAGA: Zawsze używaj poniższego protokołu do sterylizacji powierzchni nasion rzodkiewnika, rzepaku i pomidora przed siewem.

1. Przenieś nasiona do probówki reakcyjnej o pojemności 2 ml. Umieść rurkę w eksykatorze o wewnętrznej pojemności 5,8 l.
2. Wytworzyć chlor gazowy w eksykatorze, dodając 6 ml 33% kwasu solnego (HCl) do 100 ml 12% wodnego roztworu podchlorynu sodu (NaClO).
3. Natychmiast zamknij pokrywę eksykatora i inkubuj nasiona przez 3 godziny w gazie.

3. Przygotowanie inokulum z zarodnikami Verticillium (konidia pochodzące bezpłciowo)

UWAGA: Uprawiaj V. dahliae (szczep JR2) w taki sam sposób jak V. longisporum (szczep Vl43)^17,18,19. Upewnij się, że wszystkie urządzenia i podłoża są wolne od zarazków i że wszystkie kroki są wykonywane w okapie z przepływem laminarnym, aby utrzymać inokulum.

1. Wlać 150 ml płynnego PDB (krok 1.1) do kolby szykanowej o pojemności 500 ml i uzupełnić pożywkę cefotaksymem o stężeniu 500 mg/l.
2. Dodać Verticillium conida z magazynu glicerolu do pożywki PDB. Zamknąć kolbę sterylnym korkiem piankowym.
3. Inkubować kulturę przez 7-10 dni w ciemnym pudełku w temperaturze pokojowej (RT) pod ciągłym, poziomym wstrząsaniem (wytrząsarka obrotowa; 60 obr./min). W ten sposób powstają małe, białe kulki grzybni.
4. Ostrożnie wyjąć i wyrzucić supernatant PDB. Większość grzybni powinna pozostać w kolbie.
5. Dodać 100 ml płynnego CDB (krok 1.2) na grzybnię w kolbie szykanowej i uzupełnić pożywkę cefotaksymem o stężeniu 500 mg/l.
6. Inkubować przez kolejne 4-5 dni w ciemnym pudełku w temperaturze pokojowej pod ciągłym, poziomym wytrząsaniem (wytrząsarka obrotowa, 60 obr./min) w celu wywołania zarodnikowania. Supernatant zmieni kolor na żółtawo-szarawy, gdy konidia zostaną uwolnione.
7. Przefiltrować porcję (5-10 ml) cieczy zawierającej konidia przez bibułę filtracyjną (poziom zatrzymywania cząstek 8-12 μm) do sterylnej probówki zbiorczej o pojemności 50 ml. To oddziela zarodniki od grzybni.
8. Określ stężenie zarodników za pomocą komory do liczenia komórek i mikroskopu. Rozcieńczyć pożywką wolną od zarazków 1/4 MS w ultraczystej wodzie, aż do uzyskania podanych poniżej stężeń zarodników.
   UWAGA: Pod mikroskopem konidia z V. longisporum są w większości długociągowe i mają rozmiar 7,1-8,8 μm, podczas gdy konidia V. dahliae są krótsze (3,5-5,5 μm) i raczej kuliste²⁰.
9. Użyj tych świeżo zebranych konidiów jako inokulum. Upewnij się, że eksperymenty przeprowadzasz zawsze ze świeżo zebranymi konidiami, a nie z zamrożonymi zapasami, ponieważ zamrażanie znacznie zmniejsza liczbę żywotnych zarodników¹⁹.
10. W przypadku długotrwałego przechowywania zarodniki należy zamrozić w postaci roztworu zarodników o wysokim stężeniu (około 1 x 10⁸ zarodników/ml) w 25% glicerolu w temperaturze -80 °C (można przechowywać do 1 roku). W następnych eksperymentach użyj tych zapasów glicerolu do zaszczepienia pożywki PDB w kroku 3.2.

4. Sterylny system inokulacji in vitro oparty na szalkach Petriego

UWAGA: Dla systemu szalek Petriego¹⁷, upewnij się, że wszystkie urządzenia i media są wolne od zarazków i że wszystkie kroki są wykonywane w okapie z przepływem laminarnym.

1. Po sterylizacji w autoklawie wlać pożywkę (patrz krok 1.3) na szalki Petriego.
2. Po utwardzeniu podłoża zapakuj szalki Petriego do sterylnej plastikowej torebki i przechowuj je do góry nogami przez noc w lodówce (4-10 °C). Schłodzone podłoże pomaga zapobiec przesuwaniu się podłoża w kolejnych krokach.
3. Przeciąć i usunąć kanał infekcyjny oraz górną trzecią część zestalonego podłoża za pomocą skalpela (Rysunek 1A). Unikaj dostania się cieczy lub powietrza pod podłoże agarowe podczas cięcia; W przeciwnym razie podłoże ześlizgnie się i zamknie kanał infekcji.
4. Rozprowadź 50-100 wysterylizowanych powierzchniowo nasion Arabidopsis za pomocą sterylnej końcówki pipety na wyciętej górnej powierzchni. Umieść nasiona pod kątem, w którym przecięta powierzchnia agaru styka się ze ścianką szalki Petriego, tak aby korzenie mogły rosnąć między podłożem a ścianką szalki Petriego. Ułatwi to późniejsze zaszczepienie.
5. Zamknij szalki Petriego i uszczelnij je przepuszczalną taśmą klejącą, aby umożliwić wymianę gazową.
6. Po rozwarstwieniu przez 2 dni w ciemności w temperaturze 4 °C, umieścić płytki pionowo w odpowiednim stojaku i uprawiać rośliny w temperaturze 22 °C ± 1 °C w warunkach długiego dnia (16 godzin światła / 8 godzin ciemności) w komorze wzrostowej.
7. Gdy większość korzeni dotrze do kanału infekcyjnego (około 9-11-dniowych siewek), ułóż płytki poziomo, otwórz je i dodaj 500 μl świeżo zebranych konidiów Verticillium o stężeniu 4 x 10⁵ zarodników/ml bezpośrednio do kanału infekcyjnego, upewniając się, że płyn jest równomiernie rozprowadzony w kanale.
8. Podobnie, należy przygotować płytki kontrolne, dodając 500 μl roztworu makiety zamiast zarodników (pożywka wolna od zarazków 1/4 MS).
9. Inkubuj płytki poziomo przez kilka minut, aż płyn wsiąknie i nie będzie mógł wyciekać, gdy płytki zostaną ponownie ustawione pionowo. Następnie zamknij pokrywę i uszczelnij płytki taśmą klejącą przepuszczającą powietrze.
10. Inkubuj płytki pionowo w komorze wzrostowej. Opcjonalnie przykryj części korzeni czarnymi papierowymi pudełkami, aby przyciemnić korzenie i grzyby przenoszone przez glebę (patrz¹⁹).
11. Wykonaj analizy w preferowanych punktach czasowych po inokulacji, w zależności od pytania badawczego (zapoznaj się z legendami rycin, aby uzyskać dokładne punkty czasowe użyte tutaj). Oto kilka sugestii.
    1. Odetnij liście od korzeni i zbierz je osobno. Wyjmij paski agaru z szalek Petriego, aby łatwo uzyskać dostęp do korzeni i ostrożnie wyciągnij je z agaru za pomocą kleszczy. Natychmiast zamroź cały materiał roślinny w ciekłym azocie.
       1. Zmielić próbki w ciekłym azocie. Ekstrahować całkowite DNA ze 100 mg materiału liściowego, aby określić za pomocą ilościowego PCR (qPCR) ilość DNA grzybów w stosunku do DNA roślin (patrz¹⁹).
       2. Zmielić próbki w ciekłym azocie. Weź 100 mg materiału roślinnego i wyekstrahuj całkowite RNA. Przeprowadź ilościową reakcję PCR z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR), aby określić ekspresję genów roślinnych (lub genów grzybów) podczas inwazji (patrz¹⁹).
    2. Ostrożnie usuń korzenie z agaru, unikając obrażeń i zbadaj je pod mikroskopem fluorescencyjnym.
       1. Określ indukcję genów markerowych w roślinnych liniach reporterowych (np. lucyferaza, β-glukuronidaza lub reportery fluorescencyjne^17,19,21).
       2. Wizualizacja rozmnażania grzybów u nasady za pomocą linii reporterowych grzybów (np. V. longisporum konstytutywnie wyrażającego wzmocnione białko zielonej fluorescencji, Vl-sGFP⁹) lub technikami barwienia (np. za pomocą 5-bromo-4-chloro-3-indoksyl-N-acetylo-beta-d-glukozaminidu (X-beta-D-Glc-Nac)¹⁸).

5. Sterylny system inokulacji in vitro zorganizowany za pomocą plastikowych kubków

UWAGA: Jak zauważono w pierwszym opisie tej techniki¹⁹, upewnij się, że wszystkie urządzenia i media są wolne od zarazków i że wszystkie kroki są wykonywane w okapie z przepływem laminarnym.

1. Użyj przezroczystych plastikowych kubków o łącznej objętości 500 ml i sterylizuj je w kąpieli etanolowej o zawartości 70%-75% przez co najmniej 20 minut. Wysuszyć kubki w okapie z przepływem laminarnym.
2. Wlej autoklawowane podłoże (patrz krok 1.4) do plastikowych kubków. Opcjonalnie dodać cefotaksym (końcowe stężenie 50 mg/l) do autoklawowanego podłoża, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu. Użyj 150 ml pożywki na filiżankę do eksperymentów z Arabidopsis lub więcej pożywki (250-300 ml na filiżankę) do eksperymentów z większymi gatunkami roślin (rzepak, pomidor).
3. Umieść warstwę tworzywa sztucznego (wcześniej wysterylizowaną przez inkubację w 70%-75% etanolu przez 20 minut) na pożywce, zanim zastygnie (Rysunek 1B).
   UWAGA: Ta plastikowa warstwa zawiera cztery prefabrykowane otwory w rogach do umieszczania nasion wysterylizowanych powierzchniowo. Dzięki temu nasiona mają dostęp do podłoża. Później ta warstwa oddzielająca zapobiega dotykaniu przez liście podłoża zawierającego grzyby, dzięki czemu drobnoustroje nie mogą bezpośrednio atakować liści i muszą przejąć ścieżkę korzeniową. Kolejny otwór znajduje się w środku, umożliwiając przecięcie kanału infekcji.
4. Gdy podłoże stwardnieje, przetnij agar skalpelem przez prefabrykowany otwór środkowy na głębokość około 1,5 cm. Usuń pocięty agar, aby utworzyć kanał infekcyjny, do którego można później dodać zarodniki grzybów.
5. Lekko podrap podłoże agarowe końcówką pipety w czterech mniejszych otworach, aby przerwać zestaloną skórkę (pozwala to nasionom wchłonąć wodę z wodnistego podłoża agarowego). Umieść nasiona za pomocą końcówki pipety w mniejszych otworach.
6. Zamknij plastikowy kubek drugim, odwróconym plastikowym kubkiem i zamknij przepuszczającą powietrze taśmą klejącą. Taśma musi umożliwiać wymianę gazową.
7. Po rozwarstwieniu przez 3 dni w ciemności w temperaturze 4 °C, inkubować systemy kielichowe w warunkach 12 h światła / 12 h ciemności (Arabidopsis, rzepak) lub 16 h światła / 8 h ciemności (pomidor) w komorach wzrostowych w stałej temperaturze 22 °C i wilgotności 60%.
8. Przestrzegaj zalecanego wieku roślin do inokulacji: 21 dni dla Arabidopsis, 5-7 dni dla rzepaku, 12 dni dla pomidora.
9. Zaszczepić sadzonki Verticillium, dodając 1 ml roztworu konidiów (zalecane stężenie: 4 x 10⁵ zarodników/ml) do kanału infekcyjnego. Aby przygotować próbki kontrolne, dodać 1 ml makiety roztworu bez zarodników (pożywka 1/4 MS wolna od zarazków) do kanału.
10. Wykonaj analizy w preferowanych punktach czasowych po inokulacji, w zależności od pytania badawczego (zapoznaj się z legendami rycin, aby uzyskać dokładne punkty czasowe użyte tutaj). Oto kilka sugestii.
    1. Rób zdjęcia roślin aparatem cyfrowym z góry, zachowując taką samą odległość dla każdego zdjęcia. Określ ilościowo powierzchnię liścia (np. za pomocą ImageJ²² lub BlattFlaeche^17,19; użyj długości miseczek, aby ustawić skalę) i porównaj grupy zakażone i kontrolne. Kategoryzuj rozwój objawów chorobowych (np. mniejsze, bardziej żółtawe lub nekrotyczne liście).
       UWAGA: Jeśli na Arabidopsis są jakieś łodygi, usuń je, aby uzyskać lepsze zdjęcia rozet.
    2. Usunąć korzenie i określić biomasę (świeżą masę) pędów z zakażonych i kontrolnych próbek poprzez zważenie. Określ względną świeżą wagę¹⁹.
    3. Pobrać próbki do analiz molekularnych w następujący sposób.
    4. Arabidopsis: Usuń łodygi, jeśli takie są. Wytnij rozety u podstawy od korzeni. Upewnij się, że wykluczyłeś cały materiał korzeniowy z próbki i zbierz całe rozety. Połącz 4-5 rozet z różnych roślin w jedną próbkę i zamroź materiał liści w ciekłym azocie.
    5. Ostrożnie wyciągnij korzenie z podłoża za pomocą kleszczy, dociśnij je i przetrzyj ręcznikiem papierowym, aby usunąć resztki agaru, a następnie połącz 4-5 korzeni z różnych roślin w jedną próbkę. Natychmiast zamrozić w ciekłym azocie.
    6. Rzepak/pomidor: Odetnij segmenty łodygi z hipokotylu (np. 1 cm długości; zawsze wybieraj ten sam obszar łodygi). Połącz materiał z 4-5 roślin w każdej próbce i zamroź w ciekłym azocie.
    7. Zmielić próbki w ciekłym azocie. Ekstrahuj całkowite DNA ze 100 mg materiału liścia lub łodygi, aby określić za pomocą qPCR ilość DNA grzybów w stosunku do DNA rośliny (patrz¹⁹).
    8. Zmielić próbki w ciekłym azocie, pobrać 100 mg materiału roślinnego i wyekstrahować całkowite RNA. Przeprowadź qRT-PCR, aby określić ekspresję genów roślinnych (lub genów grzybów) po inwazji (patrz¹⁹).

6. System inokulacji w doniczkach oparty na glebie

1. Dokładnie wymieszaj ziemię i piasek w stosunku objętościowym 3:1 (gleba do piasku), aby ułatwić zmywanie podłoża z korzeni. Wlej mieszaninę do worka autoklawu. Jeśli mieszanina jest zbyt sucha, dodaj odpowiednią ilość wody i wymieszaj ją z podłożem. Gotować na parze w temperaturze 80 °C przez 20 minut w autoklawie, aby zminimalizować zanieczyszczenie mikrobiologiczne.
   UWAGA: Unikaj podgrzewania do temperatury powyżej 80 °C, ponieważ może to wpłynąć na organiczne składniki odżywcze gleby.
2. Napełnij doniczki mieszanką gleby i piasku i przenieś je na tace. Wlej wodę do tac około 1/3 wysokości doniczki, aby mieszanina ziemi i piasku dokładnie nasiąknęła wodą. Dodatkowo spryskaj podłoże wodą za pomocą butelki z rozpylaczem, aby zapewnić mokre warunki rozruchu.
3. Zasiej 3-4 nasiona w każdej doniczce (Rysunek 1C), upewniając się, że nasiona są wystarczająco oddalone od siebie. Przechowuj je przez 3 dni w ciemności w temperaturze 4 °C w celu rozwarstwienia w celu zsynchronizowania kiełkowania.
   UWAGA: Wstępnie uprawiaj nadmiar roślin, co umożliwia wybór roślin o podobnej wielkości do eksperymentów z inokulacją i zmniejsza odchylenia wynikające z różnic indywidualnych.
4. Pozwól sadzonkom rosnąć w warunkach długiego dnia (16 h światła / 8 h ciemności; stała temperatura 22 °C; 60% wilgotności) przy regularnym podlewaniu.
5. Przestrzegaj zalecanego wieku roślin do inokulacji: 21 dni dla Arabidopsis, 7 dni dla rzepaku i 10 dni dla pomidora. Wybierz rośliny o podobnej wielkości, aby przeprowadzić "szczepienie zanurzeniem korzeniowym"^15,17,23,24. Wyjmij ziemię z doniczek i ostrożnie wykop korzenie.
6. Delikatnie umyj tylko korzenie w pojemniku na wodę i trzymaj rozety z dala od wody. Inkubować umyte korzenie przez 60 minut na szalce Petriego zawierającej roztwór zarodników Verticillium (zalecane stężenie: 2 x 10⁶ zarodników/ml). W przypadku niezakażonej grupy kontrolnej inkubować korzenie przez 60 minut w pozorowanym roztworze bez zarodników (pożywka wolna od zarazków 1/4 MS).
7. Przygotuj nowe doniczki z wilgotną, wysterylizowaną parą glebową (80 °C przez 20 min) bez piasku. Użyj końcówki pipety, aby zrobić jeden otwór w środku gleby w każdej doniczce.
8. Bezpośrednio umieść korzenie w dołku (przenieś tylko jedną roślinę na doniczkę). Po włożeniu korzeni należy ostrożnie wypełnić otwory ziemią. Unikaj naciskania gleby, w przeciwnym razie przesadzanie może powodować objawy stresu, takie jak fioletowe liście.
9. Uprawiaj grupy zakażone i kontrolne w warunkach długiego dnia (16 h światła / 8 h ciemności; stała temperatura 22 °C; 60% wilgotności) z regularnym podlewaniem.
10. Wykonaj analizy w preferowanych punktach czasowych po inokulacji, w zależności od pytania badawczego (zapoznaj się z legendami rycin, aby uzyskać dokładne punkty czasowe użyte tutaj). Oto kilka sugestii.
    1. Rób zdjęcia roślin aparatem cyfrowym z góry, zachowując taką samą odległość dla każdego zdjęcia. Określ ilościowo powierzchnię liścia (np. za pomocą ImageJ²² lub BlattFlaeche^17,19; użyj średnicy doniczek, aby ustawić skalę) i porównaj grupy zakażone i kontrolne. Kategoryzuj rozwój objawów chorobowych (np. mniejsze, bardziej żółtawe lub nekrotyczne liście)¹³.
       UWAGA: Usunięcie łodyg Arabidopsis ułatwia robienie zdjęć rozet.
    2. Usunąć korzenie i określić biomasę (świeżą masę) pędów z zakażonych i kontrolnych próbek poprzez zważenie. Określ względną świeżą wagę¹⁹.
    3. Alternatywnie, zmierz wysokość rośliny lub skategoryzuj wyrost grzybów z segmentów łodygi, aby ocenić nasilenie choroby¹³.
    4. Pobrać próbki do analiz molekularnych w następujący sposób.
    5. Arabidopsis: Usuń łodygi. Wytnij rozety w koronie korzenia. Połącz 4-5 rozet z różnych roślin w jedną próbkę. Zamrozić materiał liści w ciekłym azocie.
       UWAGA: W przypadku korzeni trudno jest je wystarczająco oczyścić z gleby bez przeprogramowania ekspresji genów poprzez mycie.
    6. Rzepak/pomidor: Odetnij segmenty łodygi z hipokotylu (np. 1 cm długości; zawsze wybieraj ten sam obszar łodygi). Połącz materiał z 4-5 roślin w jedną próbkę i zamroź go w ciekłym azocie.
    7. Zmielić próbki w ciekłym azocie. Ekstrahuj całkowite DNA ze 100 mg materiału liściowego lub łodygowego, aby określić za pomocą qPCR ilość DNA grzybów w stosunku do DNA roślin (patrz¹⁹).
    8. Zmielić próbki w ciekłym azocie, pobrać 100 mg materiału roślinnego i wyekstrahować całkowite RNA. Przeprowadź qRT-PCR, aby określić ekspresję genów roślinnych (lub genów grzybów) po inwazji (patrz¹⁹).

7. Analiza danych

1. Obliczyć średnią i odchylenie standardowe (± SD) na podstawie kontrprób biologicznych.
2. Oblicz wartości względne, dzieląc wszystkie wyniki z grupy zakażonej przez wynik kontroli. Wyświetlaj średnią jako, na przykład, "względny do makiety" lub "względny do dzikiego".
3. Określ istotność statystyczną między grupami.

Rysunek 1: Zestawienie trzech systemów inokulacji i poszczególnych kroków w protokołach. Rysunki te ilustrują systemy z modelową rośliną Arabidopsis thaliana. W przypadku innych gatunków roślin czas ten należy dostosować. Pomarańczowe pola są podświetlone, dla których późniejsze analizy są najbardziej zalecane z danym systemem. (A) Dla systemu zaszczepiania na szalkach Petriego¹⁷, wlej pożywkę i pozwól jej zastygnąć. Przechowuj talerze w lodówce przez noc. Następnie odetnij i usuń górną trzecią część, a także kanał infekcyjny (IC) za pomocą skalpela (białe obszary na ilustracji zostały usunięte z agaru, podczas gdy niebieskawe obszary reprezentują agar). Umieść nasiona na powierzchni cięcia i zamknij szalki Petriego. Po rozwarstwieniu umieść płytki pionowo i pozwól roślinom rosnąć. Gdy większość korzeni dotrze do kanału infekcji, dodaj roztwór zarodników za pomocą pipety bezpośrednio do kanału. Upewnij się, że roztwór jest równomiernie rozprowadzony. Zamknij szalki Petriego i inkubuj je pionowo w komorze wzrostowej. Podejścia, które mogą nastąpić, to analiza ekspresyjna z ilościową odwrotną transkrypcją PCR (qRT-PCR), mikroskopia z liniami reporterowymi i kwantyfikacja DNA drobnoustrojów. (B) Dla systemu inokulacji w plastikowych kubkach¹⁹, wlej pożywkę i przenieś oddzielającą warstwę plastiku za pomocą prefabrykowanych otworów (cztery małe otwory w rogach do umieszczenia nasion i jeden duży otwór w środku dla kanału infekcyjnego). Niech podłoże stężeje. Wytnij i usuń podłoże agarowe w środkowym otworze za pomocą skalpela, aby uzyskać kanał infekcyjny (IC). Zdrap podłoże w mniejszych otworach i przenieś nasiona. Zamknij kubek odwróconym kubkiem i uszczelnij taśmą przepuszczającą powietrze (oznaczoną kolorem żółtym). Pozwól roślinom rosnąć. W celu zaszczepienia należy dodać roztwór zarodników za pomocą pipety bezpośrednio do kanału infekcyjnego. Zamknij system i kontynuuj uprawę w komorze wzrostowej. Podejścia, które mogą nastąpić, to analiza ekspresyjna za pomocą qRT-PCR, kwantyfikacja DNA drobnoustrojów oraz określenie świeżej masy, powierzchni liści lub innych cech choroby. (C) "Szczepienie zanurzeniowe korzeni"^15,17,23,24: dla systemu inokulacji opartego na glebie, napełnij doniczki mieszanką gleby:piasku. Przenieś nasiona i pozwól sadzonkom rosnąć. Wykop rośliny o podobnej wielkości i umyj korzenie w wodzie. Umieść umyte korzenie na szalce Petriego, trzymając roztwór z zarodnikami. Po inkubacji włóż pojedyncze rośliny do doniczek z ziemią. Podejścia, które mogą nastąpić, to analiza ekspresyjna liści za pomocą qRT-PCR, kwantyfikacja DNA drobnoustrojów oraz określenie świeżej masy, powierzchni liści lub innych cech choroby. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zgodnie z protokołem, rośliny były uprawiane i inokulowane V. longisporum (szczep Vl4325) lub V. dahliae (izolat JR218). Opracowano różne scenariusze, aby udowodnić skuteczność i podkreślić niektóre możliwości danych protokołów. Pokazane są reprezentatywne wyniki.

Ekspresyjna indukcja genów biorących udział w biosyntezie indolowo-glukozynolanu (IG) jest wiarygodnym wskaźnikiem do oceny infekcji Verticillium17,19,26. U rzodkiewnika MYB51 (białko domeny MYB 51; AT1G18570) koduje czynnik transkrypcyjny biorący udział w aktywacji genów niezbędnych do biosyntezy IG27. MYB51 może służyć jako gen markerowy, który wskazuje na udaną inwazję, ponieważ jest konsekwentnie indukowany w korzeniach przez V. longisporum26 lub inne grzyby przenoszone przez glebę, takie jak Phytophthora parasitica26 i Fusarium oxysporum21. Dwa dni po inokulacji (2 dpi) w systemie opartym na szalce Petriego, indukcję MYB51 uwidoczniono w korzeniach Arabidopsis. Linia roślin reporterowych PromMYB51::YFP21 ujawniła aktywację promotora, a analiza qRT-PCR potwierdziła znaczącą indukcję transkrypcji tego genu (Figura 2A-B). Takie eksperymenty mają na celu określenie zmian ekspresyjnych w korzeniach podczas infekcji.

Ponieważ gatunki Verticillium użyte w tym badaniu prowadzą tryb życia naczyniowego i rozprzestrzeniają się od korzenia do pędu przez naczynia ksylemu, ilość DNA grzyba w liściach może być określona jako parametr stopnia rozprzestrzeniania się grzyba. Arabidopsis zaszczepiono korzeniowo w systemie in vitro w plastikowych kubkach, a rozety zebrano 12 dni później. W porównaniu z wartością tła wykrytą w próbie kontroli, znaczne ilości DNA grzybów znaleziono w liściach zakażonych roślin (Rysunek 2C). Świadczy to o tym, że infekcja przebiegła pomyślnie. W celu dalszych badań można określić ilościowo ilość DNA grzybów w różnych genotypach roślin, aby uzyskać wgląd w reakcje obronne korzeni. Ponadto w tym momencie pobrano korzenie, aby przetestować indukcję genu markerowego za pomocą qRT-PCR. Obfitość transkryptu MYB51 została znacznie wzbogacona (Rysunek 2D). Pokazuje to, że testy wrażliwości i analizy ekspresyjne mogą być łatwo wykonywane równolegle z systemem kubków, co podkreśla ogromną zaletę tej procedury.

Aby dołączyć dowody na to, że inne modelowe gatunki roślin również mogą być wprowadzane, rzepak został zainfekowany V. longisporum, a pomidor V. dahliae w systemie w plastikowych kubkach. W 12 dniu po inokulacji u korzeni, ilość DNA grzyba została określona ilościowo w segmentach łodygi wyciętych u podstawy sadzonek (Rysunek 2E-F). DNA grzybów było wykrywalne w obu gatunkach roślin, co wskazuje na rozprzestrzenianie się patogenów w roślinie. Ponownie, różne genotypy roślin mogą być testowane w celu uzyskania wiedzy na temat mechanizmów obronnych.

Jeśli interesujący nas mikrob kolonizujący korzenie nie rozprzestrzenia się z korzeni na liście, nie jest możliwe ilościowe określenie ilości mikrobiologicznego DNA w liściach jako parametru ciężkości choroby. Inną opcją pomiaru ciężkości choroby jest ocena i ekstrapolacja objawów u gospodarza. Aby to zilustrować, rzodkiewnik zaszczepiono V. dahliae w systemie glebowym i oceniono obszar zielonych liści (Rysunek 2G-H). Podczas gdy rozety roślin potraktowanych sztucznie wyglądały zdrowo i zielono, rośliny zakażone patogenami miały zmniejszony rozmiar liści i żółtawe lub nawet nekrotyczne liście. W ten sposób można przeanalizować i potwierdzić podatność różnych genotypów roślin, na przykład poprzez ilościowe określenie świeżej masy.

Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki uzyskane dzięki przestrzeganiu protokołów. (A,B) Korzenie rzodkiewnika zostały zaszczepione V. longisporum w systemie szalek Petriego. Linia reporterska PromMYB51::YFP21 ujawniła silną aktywację promotora MYB51 w zainfekowanych korzeniach w porównaniu z próbą kontrolną (mikroskopia w 2 dpi; pasek skali: 50 μm). Indukcja transkrypcji MYB51 w korzeniach typu dzikiego (WT) została dodatkowo potwierdzona analizą qRT-PCR (2 dpi). Wartości zakażonych próbek są podawane w odniesieniu do próbek próbnych (ustawionych na 1) (n = 5; ± SD). (C) Kolonizacja ogólnoustrojowa przez V. longisporum: Po zaszczepieniu korzeni Arabidopsis w systemie kubków, względną ilość DNA grzyba określono w liściach za pomocą ilościowego PCR (qPCR; 12 dpi). Wartości zakażonych próbek są podawane w stosunku do poziomu tła w próbkach próbnych (ustawionych na 1) (n = 3; ± SD). (D) Korzenie zakażone V. longisporum i potraktowane próbą pobrano z systemu kubków i przeprowadzono analizę qRT-PCR. Wartości zakażonych próbek są podawane w odniesieniu do próbek próbnych (ustawionych na 1) (n = 3; ± SD). Stwierdzono, że MYB51 jest indukowany transkrypcją (12 dpi). (E) Rzepak oleisty inokulowano w systemie kubkowym V. longisporum, a względną ilość DNA grzyba określono ilościowo za pomocą qPCR w segmentach łodygi (12 dpi). Wartości zakażonych próbek są podawane w stosunku do poziomu tła w próbkach próbnych (ustawionych na 1) (n = 3; ± SD). (F) Pomidor zaszczepiono w systemie kubków V. dahliae, a względną ilość DNA grzyba określono ilościowo za pomocą qPCR w segmentach łodygi (12 dpi). Wartości zakażonych próbek są podawane w stosunku do poziomu tła w próbkach próbnych (ustawionych na 1) (n = 5; ± SD). (G,H) Arabidopsis zaszczepiono zanurzeniem w korzeniach V. dahliae w systemie glebowym i pokazano reprezentatywne zdjęcia roślin zakażonych i pozorowanych (21 dpi). Zbadano obszar zielonych liści. W stosunku do makiety (ustawionej na 1), zainfekowane rośliny miały mniejszą powierzchnię zielonych liści (n = 5; ± SD). (B-F,H) Dla par starterów zobacz19; Statystyki: Test T Studenta względem próby, * p≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.