Artykuł metodologiczny

Bezznacznikowa optyka nieliniowa do badania zależnych od tubuliny defektów w centralnej mielinie

DOI:

10.3791/63449

⸱

24 marca 2023

 ,  ,  ,  , 
1Centro de Investigaciones en Óptica A.C. (CIO), 2Division of Sciences and Engineering, Department of Chemical, Electronic, and Biomedical Engineering, Universidad de Guanajuato, 3Institute of Physiology, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 4Dirección General de Desarrollo Internacional, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiamy protokół wykrywania oligodendrocytów obciążonych mikrotubulami w modelu tubulinopatii za pomocą prostego, innowacyjnego podejścia do mikroskopii drugiej harmonicznej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zadowalająca wizualizacja składników cytoszkieletu w mózgu jest wyzwaniem. Wszechobecne rozmieszczenie sieci mikrotubul, mikrowłókien i włókien pośrednich we wszystkich tkankach nerwowych, wraz ze zmiennością wyników strategii fuzji białek fluorescencyjnych i ograniczoną możliwością zastosowania do dynamicznych badań przeciwciał i leków jako nośników chromoforów, sprawiają, że klasyczne podejścia optyczne nie są tak skuteczne, jak w przypadku innych białek. Gdy konieczne jest zbadanie tubuliny, wytwarzanie drugiej harmonicznej bez znaczników jest bardzo odpowiednią opcją ze względu na niecentryczną organizację cząsteczki. Technika ta, po sprzężeniu z mikroskopią, może jakościowo opisać wolumetryczny rozkład równoległych wiązek mikrotubul w próbkach biologicznych, z dodatkową zaletą pracy ze świeżymi tkankami, które są nieutrwalone i nieprzepuszczalne. W tej pracy opisano, w jaki sposób obrazować tubulinę za pomocą komercyjnego zestawu mikroskopowego drugiej generacji w celu uwydatnienia mikrotubul w strukturach oligodendrocytów wzbogaconych w tubulinę, jak w hipomielinizacji z zanikiem zwojów podstawy i tubulinopatii móżdżku (H-ABC), niedawno opisanym zaburzeniu mielinowym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie optyczne struktur cytoszkieletu w preparatach tkanek i narządów nie jest łatwym zadaniem. Włókna cytoszkieletu są wszechobecne, więc jeśli przeprowadza się ogólne barwienie, na przykład przeciwko alfa-tubulinie lub beta-aktynie lub potencjalnie keratynie w próbce nabłonka, sygnał będzie prawdopodobnie rozprowadzany dość jednorodnie w całej próbce. Aby ograniczyć barwienie do bardziej znaczącego podzbioru składników komórkowych, można użyć myszy transgenicznych z ukierunkowaną ekspresją1 lub zaplanować użycie przeciwciał specyficznych dla izoformy. Chociaż bardzo niewiele z tych ostatnich jest dostępnych na rynku (i bardzo niewiele w ogóle istnieje 2,3,4), transgeniczny model zwierzęcy może być dostępny. Musi być jednak nabyty przez laboratorium i odpowiednio przechowywany, ze wszystkimi wydatkami związanymi z tym procesem. Niektóre przeciwciała lub substancje chemiczne, na przykład leki sprzężone z fluoroforem, takie jak falloidyna lub paklitaksel, mogą być częściowo lub całkowicie niezgodne ze stosowaniem w żywych komórkach lub tkankach, ograniczając w ten sposób ich zastosowanie tylko do badań na ustalonych próbkach.

W przypadku tubuliny należy wziąć pod uwagę dodatkowy aspekt, jakim jest wrażliwość polimeru na utrwalanie. Konwencjonalne wiązanie chemiczne za pomocą formaldehydu jest znane z tego, że nie jest wystarczające do optymalnego zachowania integralności mikrotubul5. Ponadto niedawny raport potwierdza, że sieciowanie formaldehydu indukuje subtelne zmiany w ultrastrukturze mikrotubul, podobnie jak dzieje się to z wiązaniem niektórych leków lub cząsteczek fizjologicznych, takich jak GTP6.

Bezpośrednia wizualizacja mikrotubul w niebarwionych, nieutrwalonych próbkach jest zatem często pożądana. Aby to osiągnąć, jednym z rozwiązań technicznych jest mikroskopia drugiej harmonicznej (SHG)7, która opiera się na zdolności wiązek równoległych mikrotubul do działania jako harmonofory i emitowania światła o podwójnej częstotliwości, gdy są odpowiednio oświetlone intensywnym, pulsacyjnym laserem w podczerwieni. Chociaż silniejszy i bardziej stabilny sygnał drugiej harmonicznej może być generowany z kolagenu i miozyny, które są jedynymi pozostałymi materiałami biologicznymi, o których wiadomo, że są zdolne do podwajania częstotliwości, sygnał z tubuliny był do tej pory wykorzystywany głównie do badania przegrupowań wrzeciona mitotycznego 8,9,10 i morfologii mikrotubul aksonalnych 11,12,13.

W niniejszej pracy przedstawiamy nowatorskie zastosowanie mikroskopii SHG jako narzędzia diagnostycznego do odróżniania tkanek ośrodkowego układu nerwowego (OUN) dotkniętych tubulinopatią beta 4 A (TUBB4A) od ich zdrowych odpowiedników14. Niektóre mutacje zachodzące w tej głównie neuronalnej izoformie tubuliny, takie jak te powodujące hipomielinizację i atrofię zwojów podstawy i móżdżku (H-ABC), indukują przepełnienie mikrotubul w oligodendrocytach15,16; Zmiany cytoszkieletu z kolei są związane z dalszymi efektami, takimi jak dysmielinizacja, z głębokim upośledzeniem szlaków motorycznych i czuciowych 16,17,18,19. Mysi model taiep zastosowany w tej pracy pokazuje nieprawidłową zawartość mikrotubul w oligodendrocytach i podsumowuje większość objawów czuciowo-motorycznych pacjentów z H-ABC17. Protokół wyjaśnia, w jaki sposób obrazować struktury takie jak ciało modzelowate i móżdżek, które są zwykle silnie zmielinizowane i które są poważnie dotknięte u ludzi, a także u szczura taiep 19, aby podkreślić różnice w sygnałach SH między zdrowymi i zmutowanymi tkankami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane procedury zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami i kodeksami zatwierdzonymi w siódmym tytule Rozporządzenia Ogólnego Prawa Zdrowia dotyczącego Badań Zdrowotnych Rządu Meksyku (NOM-062-ZOO-1999) oraz zgodnie z zaleceniami Przewodnika Narodowych Instytutów Zdrowia dotyczącego Opieki i Wykorzystania Zwierząt Doświadczalnych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Bioetyki w Badaniach Naukowych Universidad de Guanajuato i Benemérita Universidad Autónoma de Puebla.

1. Ustawienia mikroskopu

  1. Włączyć system mikroskopowy.
  2. Włącz laser impulsowy, aby zagwarantować, że po ekstrakcji i przygotowaniu próbki będzie gotowy do laserowania na optymalnym i stałym poziomie mocy.
  3. Dostrój laser do długości fali 810 nm. Do badania mikrotubul tisularnych wykorzystuje się 10%-20% dostępnej mocy lasera, co w opisywanym systemie odpowiada 13-26 mW mierzonej w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu.
  4. Upewnij się, że mikroskop jest ustawiony zgodnie z Köhlerem (plik uzupełniający 1) z obiektywem, który będzie używany do obrazowania SHG.
    UWAGA: Jest to ważne, ponieważ w konfiguracji komercyjnej używanej w tej pracy detekcja odbywa się w trybie transmisji i przez kondensator.
  5. Usuń niechciane filtry ze ścieżki wykrywania optycznego (Rysunek 1A).
  6. Upewnij się, że membrana skraplacza jest całkowicie otwarta, aby upewnić się, że żadne światło nie zostanie niepotrzebnie zatrzymane na tym poziomie.
  7. Przygotuj obiektyw olejowy z aperturą numeryczną (NA) 25x/0,8 z niewielką kroplą olejku immersyjnego w obiektywie.
    UWAGA: Ten cel został użyty, aby jak najlepiej dopasować kondensator NA, który wynosił 0,55 (idealniewarunki NA≥ NAobj).

2. Wstępne kontrole pod mikroskopem

UWAGA: Wykonaj wstępne kontrole mikroskopu raz, chyba że konfiguracja zostanie zmodyfikowana.

  1. Obraz suchej skrobi kukurydzianej umieszczonej między szklanymi szkiełkami z parametrami SHG, aby wygenerować obrazy SHG, które ujawniają kierunek polaryzacji lasera. Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w pliku uzupełniającym 2, z wyjątkiem mocy lasera, która wynosi mniej niż 5% w przypadku skrobi kukurydzianej.
  2. Zrób jedno zdjęcie rzadkich ziaren skrobi kukurydzianej i zaznacz orientację zrazików SHG w płaszczyźnie x-y. Orientacja ta odpowiada orientacji lasera (rysunek 2A).
  3. Jako kontrolę wykonaj kolejny obraz tej samej próbki, umieszczając w torze optycznym płytkę półfalową (pozycja pokazana na rysunku 1A), aby zmienić kierunek oscylacji lasera. Uzyskany obraz przedstawia obrócone zraziki sygnałowe SHG (rysunek 2B, C).
  4. W przypadku korzystania z innego typu filtra pasmowoprzepustowego dla SHG, upewnij się, że ma on optymalne właściwości transmisji, porównując obrazy (Rysunek 2D, E) i intensywność sygnału piksel po pikselu wzdłuż skanowania liniowego (Rysunek 2F).

3. Ekstrakcja tkanek

UWAGA: Do wykonywania zabiegów chirurgicznych należy zawsze używać czystych narzędzi.

  1. Użyj 6-12 miesięcznych szczurów taiep i dopasowanych do wieku kontrolek Sprague-Dawley (WT).
  2. Znieczulić zwierzęta wstrzyknięciem dożylnie mieszaniny ketaminy-ksylazyny (0,125 mg/kg i 5 mg/kg) rozcieńczonej w 0,9% sterylnym roztworze NaCl.
    1. Sprawdź odruchy bólowe i kontynuuj tylko wtedy, gdy ich nie ma.
  3. Złóż zwierzę w ofierze poprzez ścięcie głowy.
  4. Po odizolowaniu głowy ostrożnie otwórz kości sklepienia czaszki wzdłuż linii środkowej, zaczynając od najbardziej ogonowego punktu u góry w kierunku nosa, od jam oczodołowych w kierunku linii środkowej, a następnie od najbardziej ogonowego punktu poniżej mózgu i móżdżku.
    UWAGA: Obcinacze do kości i Rongeurs pozwalają na prawidłowe usunięcie kości głowy bez uszkadzania struktur mózgu.
  5. Uwolnij mózg i móżdżek od kości. Obie półkule można było rozdzielić. Jeśli półkule są podzielone, użyj jednej połowy do obrazowania SHG, a drugą połowę utrwal w 3,7% paraformaldehydzie w buforowanej fosforanie soli fizjologicznej (PBS) na 20 minut w kapturze chemicznym w celu późniejszego przekrojenia i barwienia.

4. Sekcja wibratomu

  1. Przygotuj tacę buforową z wibratomem wypełnioną ciepłym (37 °C) zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS).
  2. Przymocuj mózg do płytki próbki za pomocą kleju cyjanoakrylowego za pomocą kawałka taśmy maskującej. Najbardziej ogonowa część/obszar styka się z klejem, dzięki czemu można przeciąć użyteczne odcinki koronalne z przeciwnej, rostralnej części.
    1. Odczekaj ~10 s, aby klej uległ polimeryzacji, aby uzyskać skuteczne przyleganie próbki.
      UWAGA: Najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy mózg jest zorientowany w taki sposób, że ostrze tnie "od góry do dołu", a nie "z boku na bok" (ryc. 1B).
  3. Przenieść płytkę próbki na jej wspornik magnetyczny wewnątrz tacki buforowej.
  4. Rozpocznij cięcie odcinków o grubości 300-500 μm, aż wytworzone plastry obejmą całą powierzchnię mózgu.
  5. W tym momencie zmniejsz grubość przekroju do 160 μm.
  6. Po przecięciu pełnego odcinka o wielkości 160 μm na poziomie ciała modzelowatego, odzyskaj go za pomocą zmodyfikowanej szklanej pipety Pasteura z dużym, płomieniowanym otworem (ryc. 1C).
  7. Przenieść go na czystą szalkę Petriego z nowym ciepłym HBSS lub bezpośrednio na szklany nośnik do mikroskopii (szkiełko nakrywkowe lub naczynie ze szklanym dnem).
    UWAGA: W opisanych warunkach eksperymentalnych dodanie szkiełka nakrywkowego powyżej próbki jest szkodliwe dla obrazowania.

5. Przeniesienie do mikroskopu

  1. Jeśli mikroskop znajduje się w innym pomieszczeniu, przygotuj izolowane pudełko z ocieplonymi okładami żelowymi do przenoszenia skrawków tkanki przy zachowaniu temperatury. Pudełko służy również do utrzymywania sekcji w cieple do momentu ich zobrazowania.
  2. Umieść próbkę pod mikroskopem i upewnij się, że jest prawidłowo umieszczona pod obiektywem, prowadząc bezpośrednią obserwację przez okulary ze światłem przechodzącym.
    UWAGA: Celem jest dostosowanie przewidywanych struktur emitujących do kierunku oscylacji lasera, aby zmaksymalizować emitowany (a tym samym wykryty) sygnał SHG.
  3. Usunąć nadmiar HBSS tak, aby cienka warstwa cieczy pokryła całą próbkę. Co kilka minut należy sprawdzać wzrokowo film cieczy, aby uniknąć nadmiernego parowania i wysuszenia próbki.
    UWAGA: W opisanych warunkach sekcja jest używana nie dłużej niż 20 minut. Wysuszenie próbki powoduje drastyczne efekty sztuczne (rysunek uzupełniający 1A). Zamiast dodawać więcej HBSS, zaleca się okresowe moczenie przekroju w ciepłym, świeżym podłożu, jeśli potrzebne jest dłuższe czasy obrazowania. Stosowanie komór perfuzyjnych i kleju lub niskotopliwej agarozy do unieruchomienia tkanki jest również zalecane, gdy mają być wykonywane dłuższe eksperymenty.
  4. Przygotuj stolik mikroskopowy do obrazowania bez deskanowania, które może obejmować zamknięcie wszystkich drzwi ciemnej komory inkubacyjnej lub przykrycie komory inkubacyjnej czarną nylonową tkaniną pokrytą poliuretanem.

6. Obrazowanie

  1. Wybierz tryb obrazowania "bez deskryptacji" wzdłuż ścieżki transmisji. W ten sposób wychwytywanie słabego sygnału SH tubuliny zostanie zoptymalizowane.
  2. Wybierz obiektyw LCI Plan-Neofluar 25x/0,8 NA.
  3. Ustaw moc lasera w zakresie od 13 mW do 26 mW, z czasem przebywania pikseli 12,6 μs. Rób zdjęcia nie większe niż 512 x 512 pikseli, z prędkością 5 i średnią 2, przez średni czas akwizycji około 15 s.
    UWAGA: Używanie większych mocy lasera i/lub dłuższych czasów przebywania może spowodować uszkodzenie próbki (rysunek uzupełniający 1B).
  4. Najpierw zrób zdjęcia za pomocą filtra krótkoprzepustowego 485 nm (SP485), a w drugim kroku dodaj ostry filtr pasmowoprzepustowy 405 nm (BP405; Rysunek 3). Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w pliku uzupełniającym 2.
    UWAGA: Obrazy pseudo-jasnego pola mogą być wykonywane przez ten sam detektor przy użyciu szczątkowego światła laserowego linii widzialnej (najlepiej sprawdzają się lasery 405 nm lub 488 nm).

7. Przetwarzanie móżdżku

  1. Najpierw przetnij móżdżek skalpelem na dwie półkule, a następnie przyklej je do podpory wibratomu za środkową część (płaską część uzyskaną po cięciu).
  2. Przekrój i zobrazuj móżdżek w taki sam sposób, jak opisano dla mózgu (sekcje 160 μm, te same ustawienia wibratomu, ta sama łopatka, te same ustawienia mikroskopu itp.).
    UWAGA: Ze względu na anatomię móżdżku jego orientacja w momencie cięcia nie jest krytyczna; W większości plastrów wytworzonych z dala od powierzchni będą liście dobrze pocięte w istocie białej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazy uzyskane za pomocą tej metodyki mają wewnętrznie niski poziom tła ze względu na bardzo ograniczoną liczbę harmonoforów obecnych w tkankach biologicznych, co jest jedną z istotnych zalet metody.

Kiedy włókna ciała modzelowatego są obrazowane, krótkie struktury przypominające włókna i zaokrąglone elementy można konsekwentnie znaleźć w mózgu tajenia (ryc. 3B), podczas gdy ciało modzelowate mózgu kontrolnego wykazuje znacznie bardziej niejednorodny i i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia SHG należy do grupy technik optyki nieliniowej, która obejmuje mikroskopię wzbudzenia dwufotonowego, mikroskopię trzeciej generacji i koherentną mikroskopię rozpraszania Ramana anty-Stokesa, które przyczyniły się do rozszerzenia zakresu zastosowań konwencjonalnej mikroskopii optycznej na nauki przyrodnicze20.

W szczególności główne mocne i słabe strony mikroskopii SHG odnoszą się do tego samego warunku: generator sygnału jest niecentryczny2...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) poprzez następujące granty: infraestructura 226450 dla VP-CIO, infraestructura 255277 dla V.P. oraz FORDECYT-PRONACES/194171/2020 dla V.H. Dziękujemy za wsparcie Juvenala Hernándeza Guevary z działu informatyki w tworzeniu filmów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Jednozakresowy filtr pasmowo-przepustowy BrightLine(R) 405/10 nm SemrockFF01-405/10-25Średnica 32 mm, z pierścieniem obudowy
nylon, tkanina powlekana poliuretanemTholabs powiedział:Zobacz materiał BK5Grubość 5' x 9' (1,5 m x 2,7 m) x 0,005" (0,12 mm) 
Ostrza do wibratomuwszelkie komercyjne; np. miecz Wilkinsona  Klasyczne żyletki z podwójnymi krawędziami ze stali nierdzewnej
Szalki do hodowli komórkowych, 35 mmwszelkie komercyjne; np. Sokół351008
Mikroskop konfokalnyZeissLSM710NLO AxioObserver Z1Mikroskop odwrócony, zastosowany obiektyw to LCI Plan-Neofluar 25x/0,8 NA 
Chłodnicawszelkie komercyjneKażde izolowane pudełko z polistyrenu może działać, aby utrzymać próbkę na poziomie około 37 stopni; C
Stojak na kukurydzęnp. MaizenaZ supermarketu
Szkiełka nakrywkowe #1.5wszelkie komercyjneProstokątny
Klej cyjanoakrylowynp. LoctiteAby przykleić mózg do taśmy maskującej
Cienkie kleszczeNarzędzia do nauki precyzyjnej11412-11Manipulowanie skrawkami tkanek poprzez obchodzenie się z oponami mózgowymi
Cienkie nożyczkiNarzędzia do nauki precyzyjnej14370-22Aby przeciąć skórę 
Cienkie nożyczki z zakrzywioną końcówkąNarzędzia do nauki precyzyjnej14061-09Aby ciąć wzdłuż linii środkowej
Formaldehyd 37%Sigma-Aldrich252549Aby rozcieńczyć 1:10 w PBS
Friedman RongeurNarzędzia do nauki precyzyjnej16000-14Aby przeciąć kość
Wkłady żelowewszelkie komercyjneRozgrzany do 37 stopni Celsjusza; C, aby pomóc w utrzymaniu temperatury wewnątrz chłodnicy
Szklana pipeta Pasteura, modyfikowanawszelkie komercyjneAby przenieść wycinek tkanki
Hanks′ Zrównoważony roztwór soli (HBSS)Gibco (firma Gibco)14025-076Może być przygotowany z proszków
Hemostatyki Kelly'egoNarzędzia do nauki precyzyjnej13018-14Aby oddzielić kość 
Taśma maskującawszelkie komercyjneAby chronić powierzchnię płytki próbki
Moduł NDD, typ CZeiss000000-1410-101Aby wykryć sygnał, zmniejszając straty światła. Obudowa zestawu filtrów 000000-1935-163 z SP485
Obcęgi do kości z offsetemNarzędzia do nauki precyzyjnej16101-10Aby przeciąć kość
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco (firma Gibco)10010-031Może być przygotowany z proszków lub tabletek
Laser impulsowySpójneKameleon Vision II680– Laser przestrajalny 1080 nm
Skalpelwszelkie komercyjneOstrze proste z ostrym zakończeniem
Kleszcze o standardowym wzorzeNarzędzia do nauki precyzyjnej11000-18
Nożyczki sprężynowe VannasNarzędzia do nauki precyzyjnej15018-10Do cięcia opon mózgowych, które pozostają połączone zarówno z plastrem uzyskanym z cięcia wibratomowego, jak i z sekcją przyklejoną do płytki próbki.
Wibratomizmwszelkie komercyjne; np. LeicaZobacz materiał VT1200

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Palmiter, R. D., et al. Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene. Cell. 50 (3), 435-443 (1987).
  2. Banerjee, A., et al. A monoclonal antibody against the type II isotype of beta-tubulin. Preparation of isotypically altered tubulin. The Journal of Biological Chemistry. 263 (6), 3029-3034 (1988).
  3. Banerjee, A., Roach, M. C., Trcka, P., Luduena, R. F. Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin. Purification and assembly of alpha beta II, alpha beta III, and alpha beta IV tubulin dimers from bovine brain. The Journal of Biological Chemistry. 267 (8), 5625-5630 (1992).
  4. Banerjee, A., et al. Localization of βv tubulin in the cochlea and cultured cells with a novel monoclonal antibody. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 505-514 (2008).
  5. Cross, A. R., Williams, R. C. Kinky microtubules: Bending and breaking induced by fixation in vitro with glutaraldehyde and formaldehyde. Cell Motility and the Cytoskeleton. 20 (4), 272-278 (1991).
  6. Van Steenbergen, V., et al. Molecular understanding of label-free second harmonic imaging of microtubules. Nature Communications. 10 (1), 3530(2019).
  7. Campagnola, P. J., Clark, H. A., Mohler, W. A., Lewis, A., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy of living cells. Journal of Biomedical Optics. 6 (3), 277(2001).
  8. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
  9. Yu, C. -H., et al. Measuring microtubule polarity in spindles with second-harmonic generation. Biophysical Journal. 106 (8), 1578-1587 (2014).
  10. Bancelin, S., et al. Probing microtubules polarity in mitotic spindles in situ using Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy. Scientific Reports. 7, 6758(2017).
  11. Dombeck, D. A., et al. Uniform polarity microtubule assemblies imaged in native brain tissue by second-harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7081-7086 (2003).
  12. Psilodimitrakopoulos, S., et al. Estimation of the effective orientation of the SHG source in primary cortical neurons. Optics Express. 17 (16), 14418(2009).
  13. Sharoukhov, D., Bucinca-Cupallari, F., Lim, H. Microtubule imaging reveals cytoskeletal deficit predisposing the retinal ganglion cell axons to atrophy in DBA/2J. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (13), 5292(2018).
  14. Alata, M., Piazza, V., Eguibar, J. R., Cortes, C., Hernandez, V. H. H-ABC tubulinopathy revealed by label-free second harmonic generation microscopy. Scientific Reports. 12, 14417(2022).
  15. Duncan, I. D., Lunn, K. F., Holmgren, B., Urba-Holmgren, R., Brignolo-Holmes, L. The taiep rat: A myelin mutant with an associated oligodendrocyte microtubular defect. Journal of Neurocytology. 21 (12), 870-884 (1992).
  16. Duncan, I. D., et al. A mutation in the Tubb4a gene leads to microtubule accumulation with hypomyelination and demyelination: Tubb4a Mutation. Annals of Neurology. 81 (5), 690-702 (2017).
  17. Garduno-Robles, A., et al. MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy. Frontiers in Neuroscience. 14, 555(2020).
  18. Lopez-Juarez, A., et al. Auditory impairment in H-ABC tubulinopathy. Journal of Comparative Neurology. 529 (5), 957-968 (2021).
  19. Alata, M., et al. Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model. Frontiers in Neurology. 12, 702039(2021).
  20. Parodi, V., et al. Nonlinear optical microscopy: From fundamentals to applications in live bioimaging. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 585363(2020).
  21. Lefort, C. A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (42), 423001(2017).
  22. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  23. vander Knaap, M. S., et al. New syndrome characterized by hypomyelination with atrophy of the basal ganglia and cerebellum. American Journal of Neuroradiology. 23 (9), 1466(2002).
  24. Stoller, P., Kim, B. -M., Rubenchik, A. M., Reiser, K. M., Da Silva, L. B. Polarization-dependent optical second-harmonic imaging of a rat-tail tendon. Journal of Biomedical Optics. 7 (2), 205(2002).
  25. Brown, E. B., et al. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Medicine. 7 (7), 864-868 (2001).
  26. Chakraborti, S., Natarajan, K., Curiel, J., Janke, C., Liu, J. The emerging role of the tubulin code: From the tubulin molecule to neuronal function and disease. Cytoskeleton. 73 (10), 521-550 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Optyka nieliniowaobrazowanie bezznakowegenerowanie drugiej harmonicznejobrazowanie tubulinywizualizacja mikrotubulmikrotubule oligodendrocyt whipomielinizacjatubulinopatiamikroskopia wie ej tkanki

Powiązane artykuły