Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie spektrometru cyklicznej ruchliwości jonów do eksperymentów z ruchliwością jonów w tandemie

4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63451

⸱

20 stycznia 2022

 ,  ,  , 
1INRAE, UR BIA, F-44316 Nantes, France, 2INRAE, BIBS Facility, F-44316 Nantes, France

W tym artykule

Podsumowanie

Spektrometria ruchliwości jonów (IMS) jest interesującym uzupełnieniem spektrometrii mas do charakterystyki biomolekuł, szczególnie dlatego, że jest wrażliwa na izomerię. Protokół ten opisuje tandemowy eksperyment IMS (IMS/IMS), który pozwala na izolację cząsteczki i wygenerowanie profili ruchliwości jej fragmentów.

Streszczenie

Dokładna charakterystyka struktur chemicznych jest ważna dla zrozumienia ich podstawowych mechanizmów biologicznych i właściwości funkcjonalnych. Spektrometria mas (MS) jest popularnym narzędziem, ale nie zawsze wystarcza do całkowitego ujawnienia wszystkich cech strukturalnych. Na przykład, chociaż węglowodany są biologicznie istotne, ich charakterystykę komplikuje wiele poziomów izomerii. Spektrometria ruchliwości jonów (IMS) jest interesującym uzupełnieniem, ponieważ jest wrażliwa na konformacje jonów, a tym samym na izomerię.

Ponadto, ostatnie osiągnięcia znacznie poprawiły tę technikę: ostatnia generacja instrumentów Cyclic IMS oferuje dodatkowe możliwości w porównaniu do liniowych instrumentów IMS, takie jak zwiększona zdolność rozdzielcza czy możliwość przeprowadzania eksperymentów z tandemową mobilnością jonów (IMS/IMS). Podczas IMS/IMS jon jest wybierany na podstawie jego ruchliwości jonów, fragmentowany i ponownie analizowany w celu uzyskania informacji o ruchliwości jonów o jego fragmentach. Niedawne prace wykazały, że profile mobilności fragmentów zawartych w takich danych IMS/IMS mogą działać jak odcisk palca konkretnego glikanu i mogą być wykorzystywane w strategii sieci molekularnej w celu organizowania zbiorów danych glikomicznych w sposób strukturalnie istotny.

Celem tego protokołu jest więc opisanie sposobu generowania danych IMS/IMS, od przygotowania próbki do końcowej kalibracji przekroju poprzecznego kolizji (CCS) wymiaru ruchliwości jonów, która daje powtarzalne widma. Biorąc pod uwagę przykład jednego reprezentatywnego glikanu, protokół ten pokaże, jak zbudować sekwencję kontrolną IMS/IMS na cyklicznym instrumencie IMS, jak uwzględnić tę sekwencję kontrolną, aby przetłumaczyć czas przybycia IMS na czas dryfu (tj. efektywny czas separacji zastosowany do jonów) oraz jak wyodrębnić odpowiednie informacje o mobilności z surowych danych. Protokół ten został zaprojektowany, aby jasno wyjaśnić punkty krytyczne eksperymentu IMS/IMS, a tym samym pomóc nowym użytkownikom Cyclic IMS w wykonywaniu prostych i powtarzalnych akwizycji.

Wprowadzenie

Pełna charakterystyka chemiczna biomolekuł jest kluczem do zrozumienia ich podstawowych właściwości biologicznych i funkcjonalnych. W tym celu w ostatnich latach rozwinęły się nauki "omiczne", mające na celu scharakteryzowanie na dużą skalę struktur chemicznych w stężeniach biologicznych. W proteomice i metabolomice stwardnienie rozsiane stało się podstawowym narzędziem do odkrywania strukturalnej heterogeniczności występującej w podłożach biologicznych - w szczególności dzięki swojej czułości i zdolności do dostarczania informacji strukturalnych za pośrednictwem tandemowego MS (MS/MS). W strategiach MS/MS jon jest wybierany zgodnie z jego masą, następnie fragmentowany, a na końcu masy jego fragmentów są pozyskiwane w celu ustalenia odcisku palca cząsteczki. Widma MS/MS mogą być w szczególności używane do dopasowywania spektralnych baz danych1,2, lub wstępnie zrekonstruować struktury nadrzędne3,4. Przy założeniu, że podobne widma należą do podobnych związków, dane MS/MS mogą być również wykorzystane do budowy sieci molekularnych (MN) łączących pokrewne gatunki poprzez wynik podobieństwa5,6.

Jednakże, ze względu na wrodzoną właściwość MS do wykrywania stosunku masy do ładunku (m/z) jonów, technika ta jest ślepa na szereg cech strukturalnych, które mieszczą się w zakresie (stereo)izomerii. Na przykład węglowodany składają się z kilku podjednostek monosacharydowych, z których wiele to stereoizomery, a nawet epimery (np. Glc vs. Gal lub Glc vs. Man). Podjednostki te są połączone wiązaniami glikozydowymi, które mogą różnić się położeniem wiązania (regioizomeryzm) i konfiguracją steryczną anomerycznego węgla (anomeryzm). Te cechy utrudniają samodzielnemu MS rozróżnienie izomerów węglowodanowych7, a tylko regioisomerism może być rozwiązany za pomocą metod aktywacji o wysokiej energii8,9,10. Chociaż derywatyzacja jest opcją pozwalającą na zakłócenie równoważności grup stereoizomerycznych11, wymaga ona intensywnego przygotowania próbki. Inną, prostszą opcją jest sprzężenie MS z wymiarem analitycznym wrażliwym na izomerię, takim jak IMS.

Ponieważ ten protokół jest przeznaczony dla użytkowników, którzy są już zaznajomieni z podstawowymi pojęciami IMS, a szczegółowe recenzje są dostępne gdzie indziej12,13, tutaj znajduje się tylko krótki przegląd zasad IMS. IMS to metoda separacji faz gazowych, która opiera się na oddziaływaniu jonów z gazem buforowym i polem elektrycznym, ostatecznie rozdzielając jony zgodnie z ich konformacjami w fazie gazowej. Różne zasady działania IMS sprzężonego z MS można znaleźć w instrumentach komercyjnych: niektóre działają przy naprzemiennych wysokich i niskich polach elektrycznych (asymetryczne pole IMS, FAIMS), podczas gdy większość działa w dolnej granicy pola - w szczególności IMS z rurką dryfującą (DTIMS, liniowo malejące pole elektryczne), IMS z falą biegnącą (TWIMS, symetryczne fale potencjału) i uwięziony IMS (TIMS, wysoki przepływ jonów zatrzymujących gaz buforowy w polach elektrycznych)13. Metody niskopolowe umożliwiają dostęp do tak zwanego CCS, właściwości pary jon-gaz, która reprezentuje powierzchnię (wA2 lub nm2) jonu, który oddziałuje z gazem buforowym podczas separacji. CCS jest teoretycznie niezależny od instrumentu, dlatego jest przydatny do generowania danych, które mogą być odtwarzane między różnymi laboratoriami14. Na separację ruchliwości jonów mogą mieć wpływ różne parametry, a w szczególności wahania ciśnienia i temperatury gazu w komórce ruchliwości. Kalibracja CCS jest sposobem na zaradzenie temu, ponieważ zarówno kalibert, jak i gatunek będący przedmiotem zainteresowania zostaną podobnie dotknięte13. Jednak obowiązkowe jest zainstalowanie przyrządu w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i posiadanie niezawodnego systemu kontroli ciśnienia gazu.

Ciekawą ewolucją IMS jest IMS/IMS, który został po raz pierwszy wprowadzony w 2006 roku przez grupę Clemmera jako odpowiednik MS/MS15,16. W IMS/IMS jon będący przedmiotem zainteresowania jest selektywnie izolowany na podstawie jego ruchliwości jonów; następnie jest aktywowany (aż do możliwej fragmentacji) i wykonywana jest nowa analiza IMS aktywowanego jonu lub fragmentów. W pierwszym projekcie instrumentalnym dwie komórki IMS zostały umieszczone szeregowo, oddzielone lejkiem jonowym w miejscu, w którym znajdowała się aktywacja. Od tego czasu, chociaż zaproponowano szereg konfiguracji IMS/IMS (przegląd patrz Eldrid and Thalassinos17), pierwszy komercyjny spektrometr masowy z funkcją IMS/IMS stał się dostępny dopiero w 2019 roku18. Instrument ten znacznie udoskonalił pierwotną koncepcję, łącząc ją z innym przełomem technologicznym: cykliczną konstrukcją ogniwa IMS.

Cykliczna komórka IMS teoretycznie pozwala na niemal nieskończone zwiększanie długości ścieżki dryfu, a tym samym zdolności rozdzielczej instrumentu19. Udało się to osiągnąć dzięki szczególnej geometrii instrumentu, w której cykliczna komórka TWIMS jest umieszczona prostopadle do głównej osi optycznej jonu. Wielofunkcyjny obszar macierzy przy wejściu do komórki IMS umożliwia kontrolowanie kierunku ścieżki jonów: (i) wysyłanie jonów na boki w celu separacji IMS, (ii) do przodu w celu wykrycia MS lub (iii) wstecz od komórki IMS w celu przechowywania w komórce premacierzowej. Z tej komórki magazynującej prearray jony mogą być aktywowane, a fragmenty ponownie wstrzykiwane do komórki IMS w celu pomiaru ruchliwości jonów, podejścia, które zostało z powodzeniem wykorzystane do scharakteryzowania stereoizomerów20. Ostatecznie zebrane dane zawierają informacje o ruchliwości jonów i m/z dla prekursora i jego fragmentów.

W niedawnej publikacji, w której użyto tego cyklicznego projektu do analiz glikanów (Ollivier et al.21), pokazaliśmy, że profil mobilności fragmentów zawartych w takich danych IMS/IMS działa jak odcisk palca biomolekuły, który może być wykorzystany w strategii sieci molekularnej. Powstała w ten sposób sieć, nazwana IM-MN, doprowadziła do uporządkowania zbiorów danych glikomicznych w sposób strukturalnie istotny, podczas gdy sieć zbudowana wyłącznie na podstawie danych MS/MS (MS-MN) ujawniła niewiele informacji. Aby uzupełnić tę publikację i pomóc użytkownikom Cyclic IMS w implementacji tego przepływu pracy, protokół ten zawiera pełny opis protokołu używanego do zbierania danych. Protokół ten skupia się tylko na generowaniu danych IMS/IMS, które użytkownicy mogą następnie wykorzystać do budowy sieci IM-MN (patrz21) — lub dla dowolnej innej wybranej przez siebie aplikacji. Budowa IM-MN nie będzie tutaj rozważana, ponieważ protokoły dla sieci molekularnych są już dostępne22. Podkreślono kluczowe punkty, których należy przestrzegać, aby generować wartościowe i powtarzalne przejęcia IMS/IMS. Weźmy przykład jednego z oligosacharydów badanych przez Olliviera i wsp.21, szczegółowo opisano następujące kroki: (i) przygotowanie próbki, (ii) strojenie instrumentu Cyklicznego IMS, (iii) automatyczne pobieranie danych w szczytach oraz (iv) kalibracja CCS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Przegląd protokołu znajduje się w Rycina 1Parametry wykorzystane w doświadczeniach opisanych w niniejszym protokole znajdują się w Tabela uzupełniająca S1 i Tabela uzupełniająca S2.

1. Przygotowanie roztworu próbki

UWAGA: Protokół został opisany na przykładzie pentasacharydu arabinoksylanowego (23-α-L-arabinofuranozylotetraksozy lub XA2XX; patrz Tabela materiałów).

  1. Przygotowanie rozpuszczalnika: 500 µM LiCl w 50:50 H2O:MeOH (obj./obj.).
    1. Przygotować 100 mM roztwór zapasowy chlorku litu (LiCl) w H2O, odważając 212 mg LiCl i dodając 50 mL wysokiej czystości wody dejonizowanej (H2O) do 50 mL polipropylenowej probówki stożkowej. Wstrząsać do całkowitego rozpuszczenia.
      UWAGA: Rozpuszczalnik jest domieszkowany solą litu w celu promowania tworzenia adduktów [M+Li]+ w źródle jonów spektrometru, ponieważ zazwyczaj pozwala to uzyskać widma fragmentacji lepszej jakości w porównaniu do innych adduktów alkaliów. Zaleca się stosowanie LiCl, ponieważ wcześniej wykazano, że kwasy organiczne (a tym samym ich sole) wpływają na profile IMS23.
    2. W szklanej butelce rozcieńczyć 200-krotnie roztwór zapasowy LiCl: do 250 µL roztworu zapasowego dodać 24,75 mL H2O. Dodać 25 mL metanolu (MeOH), aby osiągnąć końcowe stężenie LiCl wynoszące 500 µM w 50:50 H2O:MeOH (v/v). Poddać sonikacji przez 2 min w celu odgazowania rozpuszczalnika.
      UWAGA: MeOH stanowi zagrożenie dla zdrowia (H225, H301, H311, H331, H370); manipulować pod wyciągiem, nosząc fartuch laboratoryjny, rękawiczki i ochronę oczu. Proporcja 50:50 MeOH/H2O (v/v) wydaje się być najlepszym rozpuszczalnikiem do jonizacji oligosacharydów; jednak w razie potrzeby MeOH można zastąpić acetonitylem (ACN).
  2. W polipropylenowej probówce o pojemności 1,5 mL odważyć 1 mg węglowodanów. Rozpuścić w odpowiedniej objętości 500 µM LiCl, aby osiągnąć stężenie 1 mg/mL. Rozcieńczyć do końcowego stężenia 10 µg/mL w 50:50 MeOH/H2O + 500 µM LiCl. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Stężenie 10 µg/mL wybrano w celu optymalizacji sygnału wszystkich jonów fragmentacyjnych podczas IMS/IMS-MS (dotyczy to czystego związku; zwiększyć stężenie podczas pracy z mieszaninami). Podczas akwizycji referencyjnych widm IMS/IMS nie rozcieńczać próbki dalej: spodziewane jest nasycenie detektora MS przed fragmentacją, choć instrument oferuje opcje korekcji tego zjawiska (patrz krok 3.2.).

2. Strojenie spektrometru mas z cykliczną spektrometrią mobilności jonów (IMS)

UWAGA: Instrukcje dotyczące oprogramowania (okna, menu i polecenia) zostały wyróżnione pogrubieniem.

  1. Otwórz konsolę urządzenia w oprogramowaniu sterującym urządzeniem (strojenie MS strona, szczegóły dotyczące oprogramowania znajdują się w Tabela materiałów), a następnie umieścić urządzenie w Obsłużyć tryb. Odczekać co najmniej 3 h do czasu stabilizacji wysokich napięć w komorze IMS.
    UWAGA: Aby zapewnić najlepszą powtarzalność, napięcia w komórce IMS muszą zostać całkowicie ustabilizowane. Włącz wysokie napięcia i pozostaw instrument do stabilizacji przez noc przed przeprowadzeniem jakiejkolwiek cyklicznej analizy IMS. Ponadto ciśnienie i temperatura w komórce mobilności jonowej muszą być utrzymywane na jak najbardziej stałym poziomie. Chociaż dostępny jest odczyt ciśnienia w Próżnia zakładka, nie ma możliwości odczytu temperatury. Instrument należy przechowywać w laboratorium z termostatem. Instrument użyty w tej pracy pracuje przy ciśnieniu 1,75 mbar w laboratorium termostatowanym w temperaturze 20 °C.
  2. Konfiguracja urządzenia do cyklicznej spektrometrii mobilności jonów (IMS)
    UWAGA: Roztwory wzorcowe muszą być podawane przy użyciu wbudowanego systemu mikroprzepływowego w celu konfiguracji instrumentu.
    1. Umieścić na systemie przepływowym pojemniki z odpowiednimi standardami dostarczonymi przez producenta: zbiornik B („Lockmass”): 10 pg/µL leucyna-enkefalina (LEU ENK) w mieszaninie ACN/H₂O 50:502O + 0,1% kwasu mrówkowego; zbiornik C („Kalibrant”): MajorMix.
      UWAGA: W niniejszym protokole roztwór kalibracyjny MajorMix zostanie użyty do kalibracji obu m/z oraz wymiary CCS. Z powodów praktycznych przeprowadzona zostanie zewnętrzna kalibracja CCS (patrz krok 5 protokołu); w związku z tym możliwe jest również zastosowanie wewnętrznej mieszaniny kalibracyjnej dla CCS oraz innego kalibratora dla m/z (np. mronian sodu lub jodek sodu).
    2. Na Dostroić stronie konsoli Quartz, przejdź do Fluidyka Ustaw układ płynowy próbki na zbiornik C, a układ płynowy referencyjny na zbiornik B. Wprowadź oba roztwory kolejno do źródła jonów, aby sprawdzić sygnał MS.
    3. Przeprowadzić konfigurację przetwornika ADC, konfigurację detektora (przy użyciu LEU ENK) oraz kalibrację masową (patrz w Tabela materiałów dla roztworu kalibracyjnego) z Konfiguracja urządzenia strona zgodnie z instrukcją producenta.
  3. Zarejestruj akwizycję IMS roztworu kalibracyjnego z separacją jednoprzepływową (użyj tego do zewnętrznej kalibracji IMS).
    UWAGA: Źródło jonów oraz parametry fali wędrującej (TW) (wysokość fali statycznej i prędkość fali) muszą pozostać stałe podczas wszystkich pomiarów (kalibracji i akwizycji). Jeśli użytkownik nie posiada wcześniejszej wiedzy na temat optymalnych parametrów dla swojej próbki, ten krok można wykonać po kroku 3 protokołu (dla [M+Li]+ addukty neutralnych oligosacharydów, reprezentatywne wyniki uzyskano przy zastosowaniu wysokości fali TW wynoszącej 16 V i prędkości TW 350 m/s, co pozwoliło na uzyskanie najlepszych rezultatów).
    1. Z Układy płynowe zakładka, wybór pozycji przegrody Próbka i wprowadzić kalibrant (patrz na Tabela materiałów) do źródła jonów (przy użyciu wbudowanego systemu mikroprzepływowego) za pomocą sondy „Sample” przy szybkości przepływu wynoszącej 10 µL/min.
    2. Skonfiguruj sekwencję IMS z pojedynczym przejściem. Z Dostroić strona, włóż instrument do Mobilność tryb i otwórz Sterowanie sekwencją cykliczną okno. Wybierz Zaawansowane tryb. Z Funkcje cykliczne zakładka tego nowego okna, wybierz Dodaj pakietnastępnie Pojedyncze/Wielokrotne przejścieNależy poczekać, aż w obszarze pojawi się sekwencja zdarzeń mobilności. Sekwencja karta tego samego okna.
      UWAGA: Aby aktywować wyświetlanie w czasie rzeczywistym, użytkownik musi wprowadzić parametry instrumentu: kliknij w Dostrojenie Wewnątrz TOF tryb lub Uruchom w Mobilność tryb. Przed przełączeniem instrumentu między TOF i Mobilność tryby, konieczne jest, aby Przerwij każda trwająca akwizycja (w tym Dostroić wyświetlanie strony). Względowa obfitość jonów może różnić się pomiędzy TOF (czas przelotu) tryb i Mobilność tryb ze względu na zmiany w parametrach transmisji jonów.
    3. Dostosuj sekwencję tak, aby wszystkie jony kalibracyjne wykonały jedno pełne okrążenie na kolistej ścieżce IMS. Nie zmieniaj Wstrzyknąć czas lub Wyrzuć i pobierz czas; jednakże obniżone Oddzielić czas do 1 ms (w Sekwencja tab). Jeśli niektóre jony mieszaniny kalibracyjnej nie mieszczą się w wyświetlanym oknie czasu przylotu, należy zmienić synchronizację IMS z wypychaczem ortogonalnego analizatora TOF, zwiększając liczbę Liczba wypchnięć na pojemnik w Ustawienia ADC tab.
      UWAGA: Czasy w sekwencji kontrolnej sterują wyłącznie macierzą wielofunkcyjną odpowiedzialną za bramkowanie jonów. Dopóki jony znajdują się w swojej pierwszej (lub n-tejth) przejdą przez tor wyścigowy, ukończą oni wspomniane przejście nawet jeśli kierunek fali podróżującej (TW) w macierzy uległ w międzyczasie zmianie. Skrócenie czasu separacji do 1 ms oznacza, że macierz przełączy się w tryb wyrzutu po 1 ms. Zapewnia to, że szybsze jony nie będą miały wystarczającej ilości czasu na przejście przez macierz i rozpoczęcie drugiego przejścia, zanim wolniejsze jony ukończą swoje pierwsze przejście. W związku z tym wszystkie jony zostaną poddane tej samej liczbie przejść (tj. jednemu przejściu), co jest niezbędne do przeprowadzenia kalibracji IMS.
    4. Nagraj 2-minutową akwizycję. W Kontrola sekwencji cyklicznej okno, kliknij w Pozyskać aby otworzyć Ustawienia akwizycji okno wyskakujące. Wprowadź Nazwa pliku, Opisi Czas akwizycji (min) i kliknij Zapisz.
  4. Wykonaj kolejny 2-minutowy pomiar roztworu kalibracyjnego w tych samych warunkach, co w kroku 2.3 (wykorzystaj go do sprawdzenia jakości kalibracji CCS). W Kontrola sekwencji cyklicznej okno, kliknij w Pozyskaj aby otworzyć Ustawienia akwizycji okno wyskakujące. Wprowadź Nazwa pliku, Opisi Czas akwizycji (min) i kliknij Zapisz.
  5. Dokładnie przemyć systemy płynne roztworem H w stosunku 50:502O/ACN, aby zapobiec krystalizacji kalibranta w rurkach PEEK.

3. Akwizycja IMS/IMS-MS

  1. Za pomocą pompy strzykawkowej wprowadź próbkę (domieszkowaną litem) o stężeniu 10 µg/mL przez sondę do próbek z szybkością przepływu 10 µL/min.
  2. Przełącz instrument w tryb TOF (na stronie MS tune), aby sprawdzić stabilność sygnału. Wykonaj pełny pomiar MS (1 min) próbki, co pozwoli na sprawdzenie rozkładu izotopowego oraz obecności potencjalnych zanieczyszczeń.
    UWAGA: Ponieważ stężenie próbki dobrano tak, aby uzyskać dobry sygnał jonowy dla fragmentów, na tym etapie może wystąpić nasycenie TOF. Nasycenie TOF można zidentyfikować po następujących artefaktach: (i) sztucznie zwiększonej rozdzielczości MS, (ii) zmianie stosunków izotopowych oraz (iii) licznych pikach o niskiej intensywności pomiędzy izotopami. Użyj soczewki DRE Lens (Dynamic Range enhancement, karta Quad/MS Profile/DRE na głównej stronie Tune), aby osłabić transmisję jonów i wyeliminować nasycenie w trybie TOF (Rysunek 2A,B).
  3. Przełącz instrument w tryb MSMS (karta Quad/MS Profile na głównej stronie Tune) i w polu MSMS Mass wybierz masę docelowego jonu do izolacji w kwadrupolu (w przykładzie: m/z 685,2, odpowiadające gatunkowi jonowemu [M+Li]+ pentasacharydu arabinoksylanu). Wykonaj 1-minutowy pomiar, aby sprawdzić izolację prekursora podczas przetwarzania danych.
    UWAGA: Addukty litu posiadają izotop o masie -1 Da względem piku monoizotopowego, który musi zostać usunięty z okna selekcji MS/MS, aby nie zakłócał etapów przetwarzania. Można go usunąć, zawężając zakres selekcji za pomocą parametrów LM Resolution oraz HM Resolution w karcie Quad/MS Profile (Rysunek 2C).
  4. Skonfiguruj sekwencję IMS typu „slicing”, aby przeprowadzić selekcję interesującego izomeru w oparciu o mobilność.
    1. Przełącz instrument w tryb Mobility (patrz krok 2.3.2). W oknie Cyclic Sequence Control, na karcie Cyclic Functions, wybierz Add bundle, a następnie Slicing. Poczekaj, aż w karcie Sequence pojawi się złożona sekwencja zdarzeń mobilności (Rysunek 3).
      UWAGA: Możliwa jest wizualizacja każdego kroku procesu IMS/IMS: kliknij zdarzenie Eject and Acquire w karcie Sequence. Po podświetleniu na czerwono przenieś je w odpowiednie miejsce w sekwencji, korzystając z przycisków Up oraz Down.
    2. Umieść zdarzenie Eject and Acquire bezpośrednio po pierwszym zdarzeniu Separate (tj. przenieś je do wiersza 3 zamiast wiersza 8 w sekwencji pokazanej na Rysunku 3), a następnie kliknij Run. Obserwuj wyniki początkowej separacji wyświetlane w czasie rzeczywistym. Zwiększ czas trwania pierwszego zdarzenia Separate dla separacji wieloprzepływowej, zmieniając wartość czasu dla tego zdarzenia w sekwencji, aż rozdzielczość pików IMS będzie satysfakcjonująca. Wykonaj 1-minutowy pomiar referencyjny.
      UWAGA: Zwróć uwagę na wartość ADC Start Delay w karcie ADC Setup: będzie ona przydatna do sprawdzenia jakości izolacji.
    3. Kliknij Pause. Zauważ, że wyniki początkowej separacji są wyświetlane, choć modyfikacje w sekwencji sterującej nie zostaną zastosowane, dopóki użytkownik ponownie nie kliknie Run. Umieść zdarzenie Eject and Acquire poniżej zdarzeń Eject, Eject to Pre-Store oraz Hold and Eject. Dostosuj czas trwania zdarzeń tak, aby docelowy pik znajdował się w regionie Eject to Pre-Store, a każdy inny jon znajdował się w regionie Eject lub Hold and Eject.
      UWAGA: Czas trwania tych trzech zdarzeń w porównaniu do rozkładów czasu przylotu (ATD) można zwizualizować za pomocą kolorowego paska pod widmem mobilności w karcie Mobilogram (Rysunek 3).
    4. Umieść zdarzenie Eject and Acquire na końcu sekwencji, poniżej zdarzeń Reinject from Pre-Store i drugiego zdarzenia Separate. Kliknij Run, aby wyświetlić wyselekcjonowaną populację.
      UWAGA: Ponieważ wybrana populacja opuściła komórkę IMS, cała poprzednia separacja została utracona i powrócono do separacji jednoprzepływowej (co jest zamierzone).
    5. Sprawdź jakość izolacji. Aby zweryfikować, czy wyselekcjonowano tylko interesujący pik, przeprowadź tę samą separację po reiniekcji co przed reiniekcją (tj. ten sam czas Separate), jak pokazano na Rysunku 4. Wykonaj 1-minutowy pomiar referencyjny.
      UWAGA: Zaleca się sprawdzenie populacji wyrzuconej; okno czasowe Eject to Pre-Store powinno znajdować się na poziomie linii bazowej (Rysunek 4B). Aby to sprawdzić, ustaw ADC Start Delay w tryb Manual w karcie ADC Settings i wprowadź czas opóźnienia zanotowany w kroku 3.4.2. Wykonaj 1-minutowy pomiar referencyjny.
    6. W karcie Sequence, w kolumnie obok zdefiniowanych przez użytkownika czasów zdarzeń (kolumna Time Abs, podświetlona na czerwono), znajdź sumaryczne czasy wszystkich zdarzeń. Zanotuj wartość Time Abs przypisaną do zdarzenia Reinject from Pre-Store w celu przeprowadzenia kalibracji CCS.
  5. Fragmentuj docelowy pik pomiędzy dwiema rundami IMS. Zmień napięcia w kroku reiniekcji, aby zwiększyć energię kinetyczną jonów i doprowadzić do ich fragmentacji podczas kolizji z gazem do mobilności jonowej.
    1. Ustaw czas trwania zdarzenia Separate bezpośrednio poprzedzającego Eject and Acquire na 1 ms (patrz wyjaśnienie w kroku 2.3.3).
    2. W wierszu Reinject from Pre-Store zaznacz pole Enable Activation i zoptymalizuj fragmentację za pomocą wbudowanego sterowania. Jeśli widmo jest satysfakcjonujące (np. pikiem bazowym jest fragment), przejdź bezpośrednio do kroku 3.5.4.
      UWAGA: Po włączeniu aktywacji trzy napięcia w wierszu zmienią kolor na szary: są to napięcia, które użytkownik musi zmienić w przypadku konieczności ręcznej optymalizacji (patrz następny krok). Te trzy napięcia (Pre-Array Gradient, Pre-Array Bias oraz Array Offset) tworzą gradient służący do aktywacji jonów. Energia kinetyczna jonów będzie rosnąć wraz ze nachyleniem między Pre-Array Bias a Array Offset (patrz Rysunek 5). Domyślne wartości Gradient → Bias → Offset wynoszą: bez aktywacji 85 → 70 → 45 V; maksymalna aktywacja funkcji wbudowanej 185 → 170 → -5 V (+150 V). Po fragmentacji nie zapomnij ponownie dostosować transmisji jonów za pomocą soczewki DRE lens (zmniejsz tłumienie sygnału) (patrz krok 3.2.).
    3. Jeśli fragmentacja przy użyciu wbudowanego sterowania nie jest satysfakcjonująca, odznacz pole Enable Activation i przejdź do ręcznej optymalizacji napięć reiniekcji. Zwiększ napięcie Pre-Array Gradient (napięcie Pre-Array Bias musi być zawsze utrzymywane o 15 V niżej niż Pre-Array Gradient) i obniżaj napięcie Array Offset (które może być ustawione jako ujemne), aż wyniki będą satysfakcjonujące.
      UWAGA: Podczas ręcznego strojenia napięć macierzy wielofunkcyjnej użytkownik może przełączyć widok z „Mobilogram” na interaktywne schematy napięć przyłożonych w macierzy wielofunkcyjnej (diagram PE), aby lepiej zwizualizować ustawienia napięć (Rysunek 5A).
    4. Wykonaj 2-minutowy pomiar. W wyskakującym oknie akwizycji zaznacz opcję Retain Drift Time, aby wygenerować plik zawierający wyłącznie czasy przylotu względem m/z (czas akwizycji stosowany w analizach chromatograficznych – czas retencji – zostaje usunięty z pliku). Zauważ, że plik ten jest oznaczony jako *_dt.RAW.
      UWAGA: Jeśli użytkownik zapomni zaznaczyć opcji Retain Drift Time, nadal można wyodrębnić wymiar IMS za pomocą oprogramowania Driftscope 2.9 (File | Export to MassLynx | Retain Drift Time).
  6. Przełącz instrument z powrotem w tryb TOF na głównej stronie Tune i dokładnie wypłucz system mieszaniną MeOH/H2O 50:50 przed przejściem do następnej próbki.

4. Przetwarzanie IMS/IMS-MS za pomocą MZmine 224

UWAGA: Program MZmine 2 jest dostępny pod adresem URL podanym w Tabela materiałówZaleca się stosowanie programu MZmine 2.51. W momencie przygotowywania niniejszego tekstu nowsze wersje programu nie umożliwiają otwierania plików RAW z instrumentów Cyclic IMS ze względu na zmianę w funkcji importu.

  1. Zaimportuj surowe pliki zawierające wyłącznie wymiary IMS oraz m/z (*_dt.RAW), korzystając z opcji Raw data methods | Raw data import.
    UWAGA: Surowe pliki pojawią się po lewej stronie głównego okna MZmine. Nie importuj oryginalnych plików *.RAW, które nadal zawierają wymiar czasu retencji. MZmine nie odróżnia czasu retencji od czasu dotarcia IMS, co spowodowałoby nałożenie się punktów danych obu tych wymiarów.
  2. Zoptymalizuj parametry przepływu pracy na reprezentatywnym pliku, wybierając go z listy Raw data files.
    1. Oceń poziom szumu w danych. Kliknij prawym przyciskiem myszy plik na liście Raw data files, wybierz Show TIC i wyświetl „chromatogram” piku bazowego (BPC). Kliknij dwukrotnie najmniejszy pik widoczny gołym okiem, aby wyświetlić jego widmo masowe. Przyjmij, że poziom szumu w danych znajduje się na poziomie drugiego izotopu piku bazowego w tym widmie i użyj tej samej wartości dla wszystkich progów intensywności w kolejnych krokach przetwarzania.
      UWAGA: Dane zostały pozyskane przy użyciu izolacji kwadrupolowej i są zatem traktowane przez MZmine jako MS/MS. Przez cały proces przetwarzania w MZmine należy upewnić się, że pracujesz na poziomie MS level = 2.
    2. Wykonaj detekcję mas korzystając z Raw data methods | Feature detection | Mass detection. Dla danych pozyskanych w trybie profilowym użyj algorytmu Wavelet transform. Aby ustawić parametry algorytmów w MZmine, kliknij przycisk [...] obok algorytmu i użyj opcji Show preview, aby wizualizować dane podczas optymalizacji parametrów.
      UWAGA: Na tym etapie piki wybrane przez algorytm pojawią się na czerwono w oknie podglądu. Podczas stosowania algorytmu wavelet transform do własnościowych plików RAW, MZmine może czasami pomylić punkty danych profilowych z pikami centroidowymi. Oprogramowanie wyświetli komunikat informujący, że użytkownik uruchamia algorytm profilowy na widmach centroidowych: zignoruj ten komunikat i kliknij OK.
    3. Zrekonstruuj wyekstrahowane widma mobilności jonowej (EIM) dla każdej masy fragmentu, korzystając z Raw data methods | Feature detection | ADAP Chromatogram builder na liście mas „masses” wygenerowanej w poprzednim kroku. Ponieważ wprowadzana na tym etapie m/z tolerance jest tolerancją skan-do-skanu, upewnij się, że jest ona co najmniej 3-4 razy wyższa niż całkowita oczekiwana dokładność.
    4. Ponieważ poprzedni krok nie posiada opcji podglądu, sprawdź jakość wyboru pików bezpośrednio za pomocą Feature list, która pojawiła się w prawym panelu głównego okna MZmine. Otwórz Feature list, zaznacz wszystkie wiersze, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Show/XIC (dialog). Kliknij All, aby wyświetlić wszystkie jony na widmie mobilności. Przejrzyj wybrane piki, które pojawiają się w kolorze, aby upewnić się, że nie pominięto żadnych oczywistych pików.
    5. Dokonaj dekonwolucji EIM, aby rozdzielić wartości m/z, które zawierają różne piki w wielu cechach. Użyj Feature list methods | Feature detection | Chromatogram deconvolution i wybierz algorytm Wavelets (ADAP). Zoptymalizuj algorytm dla danych, korzystając z opcji Show preview oraz następujących kluczowych parametrów: S/N threshold, coefficient/area threshold oraz RT wavelet range.
      UWAGA: Zaleca się sprawdzenie wyglądu zdekonwolwowanego widma. Użyj narzędzia do wizualizacji chromatogramów, zgodnie z opisem w kroku 4.2.4. Zdekonwolwowane piki pojawią się w kolorze, a piki o tej samej masie powinny zostać rozdzielone, jak przedstawiono na Ryc. 6A.
    6. Usuń izotopy ze zdekonwolwowanych EIM, korzystając z Feature list methods | Isotopes | Isotopic peaks grouper. Jako wartość tolerancji m/z przyjmij oczekiwaną dokładność instrumentu, a tolerancję czasu dotarcia ustaw na 0,1 ms (wyświetlaną w MZmine jako Retention time tolerance 0.1 min), ponieważ izotopy nie są rozdzielane podczas separacji IMS. Sprawdź listę cech: jeśli pozostały jakieś izotopy, zwiększ wartości tolerancji.
      UWAGA: Chociaż usuwanie izotopów teoretycznie może być wykonane w dowolnym momencie przetwarzania listy cech, ważne jest, aby zrobić to na końcu, tak aby można było wyeksportować wartości ładunku (algorytmy używane w innych krokach mogą czasami usuwać informacje o stanie ładunkowym).
  3. Jeśli przetwarzasz wiele widm IMS/IMS-MS, powtórz proces z tymi zoptymalizowanymi parametrami. Zachowaj te same parametry dla wszystkich widm.
  4. W przypadku wielu widm pogrupuj je w jednej tabeli w celu eksportu; jeśli nie, przejdź bezpośrednio do kroku 4.5. Aby pogrupować widma, użyj Feature list methods | Alignment | Join aligner. Ponieważ celem nie jest faktyczne wyrównanie pików, użyj rygorystycznych wartości tolerancji zarówno dla m/z, jak i czasu dotarcia. Przypisz taką samą wagę obu wymiarom.
  5. Wyeksportuj końcową listę cech do pliku *.csv. Użyj Feature list methods | Export/Import | Export to CSV file i wyeksportuj następujące wartości: Export row m/z, Export row retention time (rzeczywisty czas dotarcia IMS), Peak m/z oraz Peak height. Jako separator pól użyj przecinka.

5. TWCCSN2 wycentrowanych widm IMS/IMS

UWAGA: W niniejszym protokole zastosowano kalibrację z dopasowaniem logarytmicznym25,26, która zazwyczaj daje lepsze wyniki niż kalibracja liniowa i jest łatwa do zaimplementowania w arkuszu kalkulacyjnym lub wewnętrznym skrypcie przetwarzającym. Wewnętrzny skrypt (napisany w języku R) jest dostępny pod adresem URL podanym w Tabeli materiałów.

  1. Wybierz referencyjne wartości czasu dotarcia z akwizycji kalibratora (patrz krok 2.3). Wykonaj to ręcznie za pomocą oprogramowania konstruktora (patrz Tabela Materiałów), aby sprawdzić kształt wszystkich pików kalibratora IMS.
    1. W oknie Chromatogram otwórz plik *_dt.RAW odpowiadający kalibratorowi.
    2. Dla każdego punktu kalibracyjnego wygeneruj EIM, korzystając z opcji Display | Mass .
    3. Sprawdź profil EIM-ów. Jeśli niektóre z nich są słabo zdefiniowane, wygładź je za pomocą opcji Process | Smooth (najlepsze wyniki uzyskuje się zazwyczaj z algorytmem Savitzky-Golay, wygładzając 2 razy przez 3 koszyki). Zapisz wartości wierzchołków w arkuszu kalkulacyjnym.
      UWAGA: Ponieważ punkty referencyjne są zazwyczaj pozyskiwane za pomocą urządzeń DTIMS o niskiej rozdzielczości, w Cyclic IMS mogą pojawić się rozkłady multimodalne w zależności od kalibratorów. Usuń z listy kalibracyjnej każdy pik wykazujący taki rozkład.
  2. Oblicz parametry dopasowania logarytmicznego z kalibratorów.
    1. Dla wszystkich punktów kalibracyjnych oblicz następujące wartości:
      1. Oblicz czas dryfu korzystając z równania (1):
        Równanie statycznej równowagi \(t_d = t_A - t_{inj}\), ilustrujące wyrażenie matematyczne. (1)
        gdzie td to czas dryfu, tA zmierzony czas dotarcia, a tinj czas wstrzyknięcia do komórki IMS (wszystkie w ms).
        UWAGA: W przypadku małych cząsteczek, takich jak fragmenty oligosacharydów, zmienność czasu martwego (czas przelotu między wyjściem z komórki IMS a detektorem) między różnymi masami mieści się w zakresie błędu kalibracji CCS i może zostać pominięta.
      2. Oblicz masę neutralną jonów korzystając z równania (2):
        Wzór statycznej równowagi: m_neutral=(m/z)×|z|-m_ion; równanie związane ze spektrometrią mas. (2)
        gdzie z to stan ładunku jonu, a mion masa przeciwjonu (w Da). Używaj mas dokładnych, aby uniknąć wprowadzania niepewności. Jeśli zamiast przeciwjonu następuje utrata atomu, użyj ujemnych wartości mion (np. dla [M-H]- mneutral = (m/z) * |z| - (- 1.007276) = (m/z) * |z| + 1.007276).
      3. Oblicz parametr CCS' korzystając z równania (3):
        Wzór statycznej równowagi, schemat obliczania CCS' dla analizy spektrometrii mas. (3)
        gdzie CCS to referencyjna wartość rury dryfu DTCCSN2 (w nm2), a mgas masa gazu dryfu (w Da; np. dla azotu: mgas = 28.01 Da).
      4. Oblicz parametr td' korzystając z równania (4):
        Równanie do obliczania czasu dryfu jonów w spektrometrii mas. (4)
        gdzie d to opóźnienie startu detektora użyte eksperymentalnie do korekty czasu martwego (zazwyczaj ~1.5 ms).
      5. Oblicz logarytm powyższych parametrów:
        ln (CCS') oraz ln (t'd)
    2. Wykonaj regresję liniową, aby wyznaczyć współczynnik R2 oraz parametry x i y dopasowania logarytmicznego (gdzie x jest nachyleniem, a ln(y) punktem przecięcia) korzystając z równania (5):
      Równanie statycznej równowagi, ln(CCS') = x×ln(t₀ᵈ) + ln(y), reprezentacja wzoru. (5)
      UWAGA: Użytkownik może wykreślić wartości ln(CCS') w funkcji ln(td'), aby wizualnie sprawdzić wyniki kalibracji, choć jest to opcjonalne.
  3. Zastosuj kalibrację do danych eksperymentalnych, aby skalibrować piki wybrane przez MZmine dla każdego widma IMS/IMS wyeksportowanego do pliku *.csv. Dla każdego punktu oblicz następujące wartości:
    1. Oblicz czas dryfu korzystając z równania (6):
      Równanie dla opóźnienia akwizycji danych: \( t_d = t_A - t_{seq} \). (6)
      gdzie tseq to czas poprzedzający końcową separację IMS (wartość 'Time Abs' odnotowana w kroku 3.4.6).
      UWAGA: Podczas kalibracji wielu widm IMS/IMS pozyskanych za pomocą różnych sekwencji, należy dokładnie sprawdzić wartości tseq.
    2. Oblicz masę neutralną jonów korzystając z równania (7):
      Wzór spektrometrii mas, \(m_{neutral} = (m/z) \times |z| - m_{ion}\), analiza chemiczna. (7)
    3. Oblicz parametry td' i td'' korzystając z równania (8) i równania (9):
      Równanie ilustrujące korektę czasu w spektrometrii mas; wzór: t'_d = t_d - 0.001 × d × (m/z)^0.5. (8)
      Równanie spektrometrii mas; wzór dla właściwości transportu jonów; analiza metody spektroskopowej. (9)
    4. Oblicz końcowe skalibrowane wartości CCS (TWCCSN2 w nm2) korzystając z równania (10):
      Wzór statycznej równowagi, TWCC_S_N2 = t'_d × y; równanie matematyczne dla analizy naukowej. (10)
      UWAGA: Chociaż krok 5.2.2. podaje ln(y) jako punkt przecięcia, do uzyskania końcowej wartości CCS należy użyć y. Nie zapomnij zastosować funkcji wykładniczej.
  4. Sprawdź dokładność kalibracji, stosując ją do drugiej akwizycji roztworu kalibracyjnego wykonanej w kroku 2.4.
    UWAGA: Kalibracja powinna dać wyniki z błędem rzędu ~1-2%.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jako przykład do zilustrowania tego protokołu wybrano pentasacharyd arabinoksylanowy, XA2XX. Związek ten jest dostępny w sprzedaży, jednak jedynie jako mieszanina z innym pentasacharydem arabinoksylanowym, XA3XX (czysty XA3XX jest również dostępny komercyjnie). Struktury XA2XX oraz XA3XX przedstawiono na Rysunku dodatkowym S1. Ponieważ stosunek XA2XX do XA3XX w mieszaninie handlowej wynosi ~50:50, przygotowano roztwór tej miesza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

SELECT SERIES Cyclic IMS to potężne narzędzie, które umożliwia wybór zdefiniowanej populacji jonów — o danym m/z i ruchliwości jonów — bez konieczności przeprowadzania wcześniejszej separacji chromatograficznej. Instrument daje możliwość wygenerowania dwuwymiarowej mapy fragmentacji tej populacji jonów, z której można wyodrębnić zarówno widma MS/MS, jak i IMS/IMS. Użytkownik musi jednak zwrócić uwagę na kilka krytycznych punktów, które wymagają uwagi podczas procesu eksperymentalnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Podziękowania

S.O. jest wdzięczny Francuskiej Narodowej Agencji Badawczej za sfinansowanie jego doktoratu (grant ANR-18-CE29-0006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mieszanina 33-&alfa;-L- plus 23-&alfa;-L-Arabinofuranozylo-ksylotetraoza (XA3XX/XA2XX)Megazyme Ltd., Wicklow, IrlandiaO-XAXXMIXXA2XX + XA3XX
33-α-L-Arabinofuranozylo-ksylotetraoza (XA3XX)Megazyme Ltd., Wicklow, IrlandiaO-XA3XXPure XA3XX standard
Probówki Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mL, Eppendorf Quality, bezbarwne, 1 000 probówekEppendorf, Hamburg, Niemcy0030120086Służy do przygotowania roztworu podstawowego węglowodanów i rozcieńczania
FALCON 50 mL Probówka stożkowa polipropylenowa 30 x 115 mmCorning Science Mé xico S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Meksyk352070Służy do przygotowania wodnego roztworu podstawowego 100 mM
LiCl chlorku litu (odczynnik ACS, ≥ 99%)Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, Francja310468 Służy do domieszkowania próbki zestawem
kalibracyjnym IMS/Tof Major MixWaters Corp., Wilmslow, Wielka Brytania186008113Roztwór do kalibracji dla MS i IMS
MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6 (Waters Embedded Analyser Platform for Cyclic IMS 2.9.1 Release 9)Waters Corp., Wilmslow, Wielka Brytania721022377Cykliczne oprogramowanie IMS do sterowania urządzeniami i przetwarzania danych
Metanol do HPLC PLUS Gradient klasyCarlo-Erba Odczynniki, Val de Reuil, Francja412383Rozpuszczalnik o wysokiej czystości
MS Leucine Enkephaline KitWaters Corp., Wilmslow, Wielka Brytania700002456Związek referencyjny stosowany do strojenia spektrometru mas
SCHOTT DURAN 100 ml butelka ze szkła borokrzemianowegoVWR INTERNATIONAL, Radnor, Pensylwania, US218012458Służy do przygotowania roztworu 500 &mikro; M LiCl w 50:50 MeOH/Woda
SELECT SERIES Cykliczny IMSWaters Corp., Wilmslow, Wielka Brytania186009432Spektrometr masowy ruchliwości jonów wyposażony w cykliczne ogniwo IMS
Strona internetowa: http://mzmine.github.io/MZmine DevelopmentTeam-Linkdo pobrania oprogramowania MZmine
Strona internetowa: https://github.com/siollivier/IM-MNINRAE, UR BIA, BIBS Facility, Nantes, Francja-Łącze do wewnętrznego skryptu języka R zawierającego funkcję kalibracji CCS

Bibliografia

  1. Allard, P. -M., et al. Integration of molecular networking and in-silico MS/MS fragmentation for natural products dereplication. Analytical Chemistry. 88 (6), 3317-3323 (2016).
  2. Wang, M., et al. Mass spectrometry searches using MASST. Nature Biotechnology. 38 (1), 23-26 (2020).
  3. David, M., Fertin, G., Rogniaux, H., Tessier, D. SpecOMS: a full open modification search method performing all-to-all spectra comparisons within minutes. Journal of Proteome Research. 16 (8), 3030-3038 (2017).
  4. Dührkop, K., et al. SIRIUS 4: a rapid tool for turning tandem mass spectra into metabolite structure information. Nature Methods. 16 (4), 299-302 (2019).
  5. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  6. Nothias, L. -F., et al. Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment. Nature Methods. 17 (9), 905-908 (2020).
  7. Gray, C. J., et al. Advancing solutions to the Carbohydrate Sequencing Challenge. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14463-14479 (2019).
  8. Ropartz, D., et al. Online coupling of high-resolution chromatography with extreme UV photon activation tandem mass spectrometry: Application to the structural investigation of complex glycans by dissociative photoionization. Analytica Chimica Acta. 933, 1-9 (2016).
  9. Wolff, J. J., et al. Negative electron transfer dissociation of glycosaminoglycans. Analytical Chemistry. 82 (9), 3460-3466 (2010).
  10. Ropartz, D., et al. Charge transfer dissociation of complex oligosaccharides: comparison with collision-induced dissociation and extreme ultraviolet dissociative photoionization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (10), 1614-1619 (2016).
  11. Morelle, W., et al. Fragmentation characteristics of permethylated oligosaccharides using a matrix-assisted laser desorption/ionization two-stage time-of-flight (TOF/TOF) tandem mass spectrometer. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 18 (22), 2637-2649 (2004).
  12. Gabelica, V., Marklund, E. Fundamentals of ion mobility spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 42, 51-59 (2018).
  13. Gabelica, V., et al. Recommendations for reporting ion mobility mass spectrometry measurements. Mass Spectrometry Reviews. 38 (3), 291-320 (2019).
  14. Hernandez-Mesa, M., et al. Interlaboratory and interplatform study of steroids collision cross section by traveling wave ion mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (7), 5013-5022 (2020).
  15. Koeniger, S. L., et al. An IMS-IMS analogue of MS-MS. Analytical Chemistry. 78 (12), 4161-4174 (2006).
  16. Merenbloom, S. I., Koeniger, S. L., Valentine, S. J., Plasencia, M. D., Clemmer, D. E. IMS−IMS and IMS−IMS−IMS/MS for separating peptide and protein fragment ions. Analytical Chemistry. 78 (8), 2802-2809 (2006).
  17. Eldrid, C., Thalassinos, K. Developments in tandem ion mobility mass spectrometry. Biochemical Society Transactions. 48 (6), 2457-2466 (2020).
  18. Giles, K., et al. A cyclic ion mobility-mass spectrometry system. Analytical Chemistry. 91 (13), 8564-8573 (2019).
  19. Merenbloom, S. I., Glaskin, R. S., Henson, Z. B., Clemmer, D. E. High-resolution ion cyclotron mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (4), 1482-1487 (2009).
  20. Ollivier, S., et al. Anomeric retention of carbohydrates in multistage cyclic ion mobility (IMSn): de novo structural elucidation of enzymatically produced mannosides. Analytical Chemistry. 93 (15), 6254-6261 (2021).
  21. Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux, H., Ropartz, D. Molecular networking of high-resolution tandem ion mobility spectra: a structurally relevant way of organizing data in glycomics. Analytical Chemistry. 93 (31), 10871-10878 (2021).
  22. Aron, A. T., et al. Reproducible molecular networking of untargeted mass spectrometry data using GNPS. Nature Protocols. 15 (6), 1954-1991 (2020).
  23. McKenna, K. R., Li, L., Krishnamurthy, R., Liotta, C. L., Fernández, F. M. Organic acid shift reagents for the discrimination of carbohydrate isobars by ion mobility-mass spectrometry. The Analyst. 145 (24), 8008-8015 (2021).
  24. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395(2010).
  25. Ruotolo, B. T., Benesch, J. L. P., Sandercock, A. M., Hyung, S. -J., Robinson, C. V. Ion mobility-mass spectrometry analysis of large protein complexes. Nature Protocols. 3 (7), 1139-1152 (2008).
  26. Bush, M. F., Hall, Z., Giles, K., Hoyes, J., Robinson, C. V., Ruotolo, B. T. Collision cross sections of proteins and their complexes: a calibration framework and database for gas-phase structural biology. Analytical Chemistry. 82 (22), 9557-9565 (2010).
  27. Ropartz, D., et al. Structure determination of large isomeric oligosaccharides of natural origin through multipass and multistage cyclic traveling-wave ion mobility mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (18), 12030-12037 (2019).
  28. Tolmachev, A. V., et al. Characterization of ion dynamics in structures for lossless ion manipulations. Analytical Chemistry. 86 (18), 9162-9168 (2014).
  29. Arndt, J. R., et al. High-resolution ion-mobility-enabled peptide mapping for high-throughput critical quality attribute monitoring. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (8), 2019-2032 (2021).
  30. Le Fèvre, A., Dugourd, P., Chirot, F. Exploring conformational landscapes using trap and release tandem ion mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (9), 4183-4190 (2021).
  31. Ohshimo, K., He, X., Ito, R., Misaizu, F. Conformer separation of dibenzo-crown-ether complexes with Na+ and K+ ions studied by cryogenic ion mobility-mass spectrometry. The Journal of Physical Chemistry A. 125 (17), 3718-3725 (2021).
  32. Purves, R. W., Barnett, D. A., Ells, B., Guevremont, R. Gas-phase conformers of the [M + 2H]2+ ion of bradykinin investigated by combining high-field asymmetric waveform ion mobility spectrometry, hydrogen/deuterium exchange, and energy-loss measurements. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 15 (16), 1453-1456 (2001).
  33. Ujma, J., et al. Cyclic ion mobility mass spectrometry distinguishes anomers and open-ring forms of pentasaccharides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (6), 1028-1037 (2019).
  34. Warnke, S., Faleh, A. B., Scutelnic, V., Rizzo, T. R. Separation and identification of glycan anomers using ultrahigh-resolution ion-mobility spectrometry and cryogenic ion spectroscopy. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 30 (11), 2204-2211 (2019).
  35. Williamson, D. L., Bergman, A. E., Nagy, G. Investigating the structure of α/β carbohydrate linkage isomers as a function of group I metal adduction and degree of polymerization as revealed by cyclic ion mobility separations. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (10), 2573-2582 (2021).
  36. Myers, O. D., Sumner, S. J., Li, S., Barnes, S., Du, X. One step forward for reducing false positive and false negative compound identifications from mass spectrometry metabolomics data: new algorithms for constructing extracted ion chromatograms and detecting chromatographic peaks. Analytical Chemistry. 89 (17), 8696-8703 (2017).
  37. Marchand, A., Livet, S., Rosu, F., Gabelica, V. Drift tube ion mobility: how to reconstruct collision cross section distributions from arrival time distributions. Analytical Chemistry. 89 (23), 12674-12681 (2017).
  38. Davis, D. M., et al. Analysis of ion mobility spectra for mixed vapors using Gaussian deconvolution. Analytica Chimica Acta. 289 (3), 263-272 (1994).
  39. Polasky, D. A., Dixit, S. M., Fantin, S. M., Ruotolo, B. T. CIUSuite 2: next-generation software for the analysis of gas-phase protein unfolding data. Analytical Chemistry. 91 (4), 3147-3155 (2019).
  40. Salbo, R., et al. Traveling-wave ion mobility mass spectrometry of protein complexes: accurate calibrated collision cross-sections of human insulin oligomers. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1181-1193 (2012).
  41. Gelb, A. S., Jarratt, R. E., Huang, Y., Dodds, E. D. A study of calibrant selection in measurement of carbohydrate and peptide ion-neutral collision cross sections by traveling wave ion mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (22), 11396-11402 (2014).
  42. Richardson, K., Langridge, D., Dixit, S. M., Ruotolo, B. T. An improved calibration approach for traveling wave ion mobility spectrometry: robust, high-precision collision cross sections. Analytical Chemistry. 93 (7), 3542-3550 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Spektrometria mobilności jonowejspektrometria masanaliza glikanówrozdział izomerówprzekrój czynny zderzeńsieciowanie molekularneprofilowanie jonów fragmentacyjnychkalibracja czasu dryfu
Wykorzystanie spektrometru cyklicznej ruchliwości jonów do eksperymentów z ruchliwością jonów w tandemie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.