Wykorzystanie spektrometru cyklicznej ruchliwości jonów do eksperymentów z ruchliwością jonów w tandemie

Summary

Spektrometria ruchliwości jonów (IMS) jest interesującym uzupełnieniem spektrometrii mas do charakterystyki biomolekuł, szczególnie dlatego, że jest wrażliwa na izomerię. Protokół ten opisuje tandemowy eksperyment IMS (IMS/IMS), który pozwala na izolację cząsteczki i wygenerowanie profili ruchliwości jej fragmentów.

Abstract

Dokładna charakterystyka struktur chemicznych jest ważna dla zrozumienia ich podstawowych mechanizmów biologicznych i właściwości funkcjonalnych. Spektrometria mas (MS) jest popularnym narzędziem, ale nie zawsze wystarcza do całkowitego ujawnienia wszystkich cech strukturalnych. Na przykład, chociaż węglowodany są biologicznie istotne, ich charakterystykę komplikuje wiele poziomów izomerii. Spektrometria ruchliwości jonów (IMS) jest interesującym uzupełnieniem, ponieważ jest wrażliwa na konformacje jonów, a tym samym na izomerię.

Ponadto, ostatnie osiągnięcia znacznie poprawiły tę technikę: ostatnia generacja instrumentów Cyclic IMS oferuje dodatkowe możliwości w porównaniu do liniowych instrumentów IMS, takie jak zwiększona zdolność rozdzielcza czy możliwość przeprowadzania eksperymentów z tandemową mobilnością jonów (IMS/IMS). Podczas IMS/IMS jon jest wybierany na podstawie jego ruchliwości jonów, fragmentowany i ponownie analizowany w celu uzyskania informacji o ruchliwości jonów o jego fragmentach. Niedawne prace wykazały, że profile mobilności fragmentów zawartych w takich danych IMS/IMS mogą działać jak odcisk palca konkretnego glikanu i mogą być wykorzystywane w strategii sieci molekularnej w celu organizowania zbiorów danych glikomicznych w sposób strukturalnie istotny.

Celem tego protokołu jest więc opisanie sposobu generowania danych IMS/IMS, od przygotowania próbki do końcowej kalibracji przekroju poprzecznego kolizji (CCS) wymiaru ruchliwości jonów, która daje powtarzalne widma. Biorąc pod uwagę przykład jednego reprezentatywnego glikanu, protokół ten pokaże, jak zbudować sekwencję kontrolną IMS/IMS na cyklicznym instrumencie IMS, jak uwzględnić tę sekwencję kontrolną, aby przetłumaczyć czas przybycia IMS na czas dryfu (tj. efektywny czas separacji zastosowany do jonów) oraz jak wyodrębnić odpowiednie informacje o mobilności z surowych danych. Protokół ten został zaprojektowany, aby jasno wyjaśnić punkty krytyczne eksperymentu IMS/IMS, a tym samym pomóc nowym użytkownikom Cyclic IMS w wykonywaniu prostych i powtarzalnych akwizycji.

Introduction

Pełna charakterystyka chemiczna biomolekuł jest kluczem do zrozumienia ich podstawowych właściwości biologicznych i funkcjonalnych. W tym celu w ostatnich latach rozwinęły się nauki "omiczne", mające na celu scharakteryzowanie na dużą skalę struktur chemicznych w stężeniach biologicznych. W proteomice i metabolomice stwardnienie rozsiane stało się podstawowym narzędziem do odkrywania strukturalnej heterogeniczności występującej w podłożach biologicznych - w szczególności dzięki swojej czułości i zdolności do dostarczania informacji strukturalnych za pośrednictwem tandemowego MS (MS/MS). W strategiach MS/MS jon jest wybierany zgodnie z jego masą, następnie fragmentowany, a na końcu masy jego fragmentów są pozyskiwane w celu ustalenia odcisku palca cząsteczki. Widma MS/MS mogą być w szczególności używane do dopasowywania spektralnych baz danych^1,2, lub wstępnie zrekonstruować struktury nadrzędne^3,4. Przy założeniu, że podobne widma należą do podobnych związków, dane MS/MS mogą być również wykorzystane do budowy sieci molekularnych (MN) łączących pokrewne gatunki poprzez wynik podobieństwa^5,6.

Jednakże, ze względu na wrodzoną właściwość MS do wykrywania stosunku masy do ładunku (m/z) jonów, technika ta jest ślepa na szereg cech strukturalnych, które mieszczą się w zakresie (stereo)izomerii. Na przykład węglowodany składają się z kilku podjednostek monosacharydowych, z których wiele to stereoizomery, a nawet epimery (np. Glc vs. Gal lub Glc vs. Man). Podjednostki te są połączone wiązaniami glikozydowymi, które mogą różnić się położeniem wiązania (regioizomeryzm) i konfiguracją steryczną anomerycznego węgla (anomeryzm). Te cechy utrudniają samodzielnemu MS rozróżnienie izomerów węglowodanowych⁷, a tylko regioisomerism może być rozwiązany za pomocą metod aktywacji o wysokiej energii8^,9,10. Chociaż derywatyzacja jest opcją pozwalającą na zakłócenie równoważności grup stereoizomerycznych¹¹, wymaga ona intensywnego przygotowania próbki. Inną, prostszą opcją jest sprzężenie MS z wymiarem analitycznym wrażliwym na izomerię, takim jak IMS.

Ponieważ ten protokół jest przeznaczony dla użytkowników, którzy są już zaznajomieni z podstawowymi pojęciami IMS, a szczegółowe recenzje są dostępne gdzie indziej^12,13, tutaj znajduje się tylko krótki przegląd zasad IMS. IMS to metoda separacji faz gazowych, która opiera się na oddziaływaniu jonów z gazem buforowym i polem elektrycznym, ostatecznie rozdzielając jony zgodnie z ich konformacjami w fazie gazowej. Różne zasady działania IMS sprzężonego z MS można znaleźć w instrumentach komercyjnych: niektóre działają przy naprzemiennych wysokich i niskich polach elektrycznych (asymetryczne pole IMS, FAIMS), podczas gdy większość działa w dolnej granicy pola - w szczególności IMS z rurką dryfującą (DTIMS, liniowo malejące pole elektryczne), IMS z falą biegnącą (TWIMS, symetryczne fale potencjału) i uwięziony IMS (TIMS, wysoki przepływ jonów zatrzymujących gaz buforowy w polach elektrycznych)¹³. Metody niskopolowe umożliwiają dostęp do tak zwanego CCS, właściwości pary jon-gaz, która reprezentuje powierzchnię (w^A2 lub nm²) jonu, który oddziałuje z gazem buforowym podczas separacji. CCS jest teoretycznie niezależny od instrumentu, dlatego jest przydatny do generowania danych, które mogą być odtwarzane między różnymi laboratoriami¹⁴. Na separację ruchliwości jonów mogą mieć wpływ różne parametry, a w szczególności wahania ciśnienia i temperatury gazu w komórce ruchliwości. Kalibracja CCS jest sposobem na zaradzenie temu, ponieważ zarówno kalibert, jak i gatunek będący przedmiotem zainteresowania zostaną podobnie dotknięte¹³. Jednak obowiązkowe jest zainstalowanie przyrządu w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i posiadanie niezawodnego systemu kontroli ciśnienia gazu.

Ciekawą ewolucją IMS jest IMS/IMS, który został po raz pierwszy wprowadzony w 2006 roku przez grupę Clemmera jako odpowiednik MS/MS^15,16. W IMS/IMS jon będący przedmiotem zainteresowania jest selektywnie izolowany na podstawie jego ruchliwości jonów; następnie jest aktywowany (aż do możliwej fragmentacji) i wykonywana jest nowa analiza IMS aktywowanego jonu lub fragmentów. W pierwszym projekcie instrumentalnym dwie komórki IMS zostały umieszczone szeregowo, oddzielone lejkiem jonowym w miejscu, w którym znajdowała się aktywacja. Od tego czasu, chociaż zaproponowano szereg konfiguracji IMS/IMS (przegląd patrz Eldrid and Thalassinos¹⁷), pierwszy komercyjny spektrometr masowy z funkcją IMS/IMS stał się dostępny dopiero w 2019 roku¹⁸. Instrument ten znacznie udoskonalił pierwotną koncepcję, łącząc ją z innym przełomem technologicznym: cykliczną konstrukcją ogniwa IMS.

Cykliczna komórka IMS teoretycznie pozwala na niemal nieskończone zwiększanie długości ścieżki dryfu, a tym samym zdolności rozdzielczej instrumentu¹⁹. Udało się to osiągnąć dzięki szczególnej geometrii instrumentu, w której cykliczna komórka TWIMS jest umieszczona prostopadle do głównej osi optycznej jonu. Wielofunkcyjny obszar macierzy przy wejściu do komórki IMS umożliwia kontrolowanie kierunku ścieżki jonów: (i) wysyłanie jonów na boki w celu separacji IMS, (ii) do przodu w celu wykrycia MS lub (iii) wstecz od komórki IMS w celu przechowywania w komórce premacierzowej. Z tej komórki magazynującej prearray jony mogą być aktywowane, a fragmenty ponownie wstrzykiwane do komórki IMS w celu pomiaru ruchliwości jonów, podejścia, które zostało z powodzeniem wykorzystane do scharakteryzowania stereoizomerów²⁰. Ostatecznie zebrane dane zawierają informacje o ruchliwości jonów i m/z dla prekursora i jego fragmentów.

W niedawnej publikacji, w której użyto tego cyklicznego projektu do analiz glikanów (Ollivier et al.²¹), pokazaliśmy, że profil mobilności fragmentów zawartych w takich danych IMS/IMS działa jak odcisk palca biomolekuły, który może być wykorzystany w strategii sieci molekularnej. Powstała w ten sposób sieć, nazwana IM-MN, doprowadziła do uporządkowania zbiorów danych glikomicznych w sposób strukturalnie istotny, podczas gdy sieć zbudowana wyłącznie na podstawie danych MS/MS (MS-MN) ujawniła niewiele informacji. Aby uzupełnić tę publikację i pomóc użytkownikom Cyclic IMS w implementacji tego przepływu pracy, protokół ten zawiera pełny opis protokołu używanego do zbierania danych. Protokół ten skupia się tylko na generowaniu danych IMS/IMS, które użytkownicy mogą następnie wykorzystać do budowy sieci IM-MN (patrz²¹) — lub dla dowolnej innej wybranej przez siebie aplikacji. Budowa IM-MN nie będzie tutaj rozważana, ponieważ protokoły dla sieci molekularnych są już dostępne²². Podkreślono kluczowe punkty, których należy przestrzegać, aby generować wartościowe i powtarzalne przejęcia IMS/IMS. Weźmy przykład jednego z oligosacharydów badanych przez Olliviera i wsp.²¹, szczegółowo opisano następujące kroki: (i) przygotowanie próbki, (ii) strojenie instrumentu Cyklicznego IMS, (iii) automatyczne pobieranie danych w szczytach oraz (iv) kalibracja CCS.

Protocol

UWAGA: Przegląd protokołu znajduje się w Rysunek 1. Parametry użyte w eksperymentach opisanych w niniejszym protokole można znaleźć w tabeli uzupełniającej S1 i tabeli uzupełniającej S2.

1. Przygotowanie roztworu próbki

UWAGA: Protokół jest opisany przy użyciu arabinoksylanu pentasacharydu (23-α-L-arabinofuranozylo-ksylotetraozy lub XA 2 XX; zobacz Tabelę Materiałów) jako przykład.

1. Przygotowanie rozpuszczalnika: 500 μM LiCl w 50:50 H₂O:MeOH (obj./obj.).
   1. Przygotować 100 mM roztwór podstawowy chlorku litu (LiCl) w_H2O, ważąc 212 mg LiCl i dodać 50 ml dejonizowanej wody o wysokiej czystości (_H2O) do 50 ml polipropylenowej probówki stożkowej. Wstrząsać aż do całkowitego rozpuszczenia.
      UWAGA: Rozpuszczalnik jest domieszkowany solą litu w celu pobudzenia tworzenia adduktów [M+Li]⁺ w źródle jonów spektrometru, ponieważ zwykle daje on lepszą jakość widm fragmentacji w porównaniu z innymi adduktami alkalicznymi. Stosowanie LiCl jest zalecane, ponieważ wcześniej stwierdzono, że kwasy organiczne (a tym samym ich sole) wpływają na profile IMS²³.
   2. W szklanej butelce rozcieńczyć roztwór podstawowy LiCl 200x: do 250 μl roztworu podstawowego, dodać 24,75 ml_H2O. Dodać 25 ml metanolu (MeOH), aby osiągnąć końcowe stężenie LiCl wynoszące 500 μM w 50:50 H₂O:MeOH (v/v). Sonikować przez 2 minuty w celu odgazowania rozpuszczalnika.
      UWAGA: MeOH stanowi zagrożenie dla zdrowia (H225, H301, H311, H331, H370); Manipuluj pod okapem kuchennym w fartuchu laboratoryjnym, rękawicach i okularach ochronnych. Proporcja 50:50 MeOH/H₂O (v/v) wydaje się być najlepszym rozpuszczalnikiem do jonizacji oligosacharydów; jednak w razie potrzeby MeOH można zastąpić acetonitrylem (ACN).
2. W probówce polipropylenowej o pojemności 1,5 ml odważ 1 mg węglowodanów. Rozpuścić w odpowiedniej objętości 500 μM LiCl do uzyskania stężenia 1 mg/ml. Rozcieńczyć do końcowego stężenia 10 μg/ml w 50:50 MeOH/H₂O + 500 μM LiCl. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Stężenie 10 μg/ml zostało wybrane w celu optymalizacji sygnału na wszystkich jonach fragmentacyjnych podczas IMS/IMS-MS (dotyczy to czystego związku; należy zwiększyć stężenie podczas pracy z mieszaninami). W celu uzyskania widm referencyjnych IMS/IMS nie należy dalej rozcieńczać próbki: oczekuje się nasycenia detektora MS przed fragmentacją, chociaż przyrząd oferuje opcje jego skorygowania (patrz krok 3.2.).

2. Strojenie cyklicznego spektrometru masowego IMS

UWAGA: Instrukcje związane z oprogramowaniem (okna, menu i polecenia) są wyróżnione pogrubioną czcionką.

1. Otwórz konsolę przyrządów z oprogramowania sterującego przyrządem (strona strojenia MS, szczegóły oprogramowania znajdują się w Tabeli materiałów) i przełącz przyrząd w tryb pracy. Odczekaj co najmniej 3 godziny, aż wysokie napięcia ustabilizują się w ogniwie IMS.
   UWAGA: Aby uzyskać najlepszą powtarzalność, napięcia w ogniwie IMS muszą być całkowicie ustabilizowane. Włącz wysokie napięcia i pozwól instrumentowi ustabilizować się przez noc przed jakąkolwiek cykliczną analizą IMS. Ponadto ciśnienie i temperatura w komorze ruchliwości jonów muszą być utrzymywane na jak najbardziej stałym poziomie. Chociaż odczyt ciśnienia jest dostępny na karcie Próżnia, nie jest dostępny odczyt dla temperatury. Przechowuj przyrząd w laboratorium z termostatem. Przyrząd użyty w tej pracy działa przy ciśnieniu 1,75 mbar w laboratorium termostatowanym na 20 °C.
2. Cykliczna konfiguracja przyrządu IMS
   UWAGA: Roztwory wzorcowe muszą być podawane w infuzji za pomocą wbudowanego systemu fluidyki do konfiguracji urządzenia.
   1. Umieścić pojemniki fluidyki wypełnione odpowiednimi wzorcami dostarczonymi przez producenta w układzie fluidyki: Zbiornik B ("Lockmass"): 10 pg/μL enkefaliny leucyny (LEU ENK) w 50:50 ACN/H₂O + 0,1% kwasu mrówkowego; Zbiornik C ("Calibrant"): MajorMix.
      UWAGA: W tym protokole roztwór kalibracyjny MajorMix będzie używany do kalibracji zarówno wymiarów m/z, jak i CCS. Ze względów praktycznych zostanie przeprowadzona zewnętrzna kalibracja CCS (patrz krok 5 protokołu); w związku z tym możliwe jest również użycie własnej mieszaniny kalibru dla CCS i innej mieszanki kalibru dla m/z (np. mrówczanu sodu lub jodku sodu).
   2. Na stronie Tune konsoli Quartz przejdź do zakładki Fluidics. Ustaw płyny próbki na zbiornik C, a płyny odniesienia na zbiornik B. Wlej kolejno oba roztwory do źródła jonów, aby sprawdzić sygnał MS.
   3. Wykonaj konfigurację ADC, konfigurację detektora (za pomocą LEU ENK) i kalibrację masy (patrz Tabela materiałów dla roztworu kalibracyjnego) ze strony Konfiguracja przyrządu zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Zapisz akwizycję roztworu kalibracyjnego IMS z separacją jednoprzebiegową (użyj tej opcji do kalibracji zewnętrznego IMS).
   UWAGA: Źródło jonów i parametry fali biegnącej (TW) (wysokość fali statycznej i prędkość fali) muszą być utrzymywane na stałym poziomie podczas wszystkich akwizycji (kalibracji i akwizycji). Jeżeli użytkownik nie posiada wcześniejszej wiedzy na temat optymalnych parametrów dla swojej próbki, krok ten można wykonać po kroku 3 protokołu (dla adduktów [M+Li]⁺ obojętnych oligosacharydów w reprezentatywnych wynikach przyjmuje się wysokość TW 16 V i prędkość TW 350 m/s, które dają najlepsze wyniki).
   1. Na karcie Fluidics (Fluidics) wybierz pozycję przegrody Sample (Próbka) i wlej kalibert (patrz Tabela materiałów) do źródła jonów (za pomocą wbudowanego systemu fluidics) przez sondę "Próbka" przy natężeniu przepływu 10 μL/min.
   2. Skonfiguruj jednoprzebiegową sekwencję IMS. Na stronie Tune (Dostrojenie) przełącz instrument w tryb mobilności i otwórz okno Cyclic Sequence Control (Cykliczna kontrola sekwencji). Wybierz tryb zaawansowany. Na karcie Funkcje cykliczne w tym nowym oknie wybierz Dodaj pakiet, a następnie Pojedynczy/wieloprzebiegowy. Poczekaj, aż sekwencja zdarzeń mobilności pojawi się na karcie Sekwencja w tym samym oknie.
      UWAGA: Aby aktywować wyświetlanie w czasie rzeczywistym, użytkownik musi zastosować parametry instrumentu: kliknij Tune w trybie TOF lub Run in Mobility mode. Przed przełączeniem instrumentu między trybami TOF i Mobility należy przerwać wszelkie uruchomione akwizycje (w tym wyświetlanie strony Tune). Względna obfitość jonów może się różnić między trybem TOF a trybem mobilności ze względu na zmiany parametrów transmisji jonów.
   3. Dostosuj sekwencję tak, aby wszystkie jony kalibru wykonały jeden przejazd wokół cyklicznego toru wyścigowego IMS. Nie zmieniaj czasu wstrzykiwania ani czasu wysuwania i uzyskiwania czasu; należy jednak skrócić czas Oddzielny do 1 ms (w zakładce Sekwencja). Jeśli niektóre jony mieszaniny kalibracyjnej nie mieszczą się w wyświetlanym oknie czasu przybycia, zmień synchronizację IMS z popychaczem analizatora TOF przyspieszenia ortogonalnego, zwiększając liczbę wypchnięć na pojemnik w zakładce Ustawienia ADC.
      UWAGA: Czasy w sekwencji sterującej sterują tylko układem wielofunkcyjnym do bramkowania jonowego. Tak długo, jak jony są zaangażowane w swoje pierwsze (lub^n-te) przejście wokół toru wyścigowego, zakończą to przejście, nawet jeśli kierunek TW zmienił się w międzyczasie w układzie. Obniżenie czasu separacji do 1 ms oznacza, że macierz przełączy się w tryb wysuwania po 1 ms. Gwarantuje to, że szybsze jony nie będą miały wystarczająco dużo czasu, aby przejść przez matrycę i zaangażować się w drugie przejście, zanim wolniejsze jony zakończą swoje pierwsze przejście. W związku z tym wszystkie jony zostaną poddane tej samej liczbie przejść (tj. jednemu przejściu), co jest niezbędne do przeprowadzenia kalibracji IMS.
   4. Nagraj 2-minutową akwizycję. W oknie Cykliczna kontrola sekwencji kliknij Pobierz, aby otworzyć wyskakujące okienko Ustawienia akwizycji. Wprowadź nazwę pliku, opis i długość pobierania (w minutach), a następnie kliknij przycisk Zapisz.
4. Zapisz kolejne 2 minuty pobierania roztworu kalibracyjnego w tych samych warunkach, co w kroku 2.3 (użyj tego w celu sprawdzenia jakości kalibracji CCS). W oknie Cykliczna kontrola sekwencji kliknij Pobierz, aby otworzyć wyskakujące okienko Ustawienia akwizycji. Wprowadź nazwę pliku, opis i długość pobierania (w minutach), a następnie kliknij przycisk Zapisz.
5. Dokładnie umyj układ fluidyczny za pomocą 50:50 H₂O/ACN, aby uniknąć krystalizacji kalibru w rurkach peek.

3. Akwizycja IMS/IMS-MS

1. Za pomocą pompy strzykawkowej wprowadzić próbkę (domieszkowaną litem) w ilości 10 μg/ml przez sondę do pobierania próbek z natężeniem przepływu 10 μl/min.
2. Przełącz instrument w tryb TOF (ze strony strojenia MS), aby sprawdzić stabilność sygnału. Zapisać pełną akwizycję MS (1 minuta) próbki, która będzie przydatna do sprawdzenia wzorca izotopowego i obecności potencjalnych zanieczyszczeń.
   UWAGA: Ponieważ stężenie próbki jest wybierane tak, aby uzyskać dobry sygnał jonowy dla fragmentów, na tym etapie można zaobserwować nasycenie TOF. Nasycenie TOF można zidentyfikować za pomocą następujących artefaktów: (i) sztucznie zwiększona rozdzielczość MS, (ii) zmiana proporcji izotopów oraz (iii) mnogość pików o niskiej liczebności pomiędzy izotopami. Użyj soczewki DRE (Dynamic Range enhancement, Quad/MS Profile/DRE zakładka na głównej stronie Tune), aby osłabić transmisję jonów i odrzucić nasycenie w trybie TOF (Rysunek 2A,B).
3. Przełącz instrument w tryb MSMS (zakładka Quad/MS Profile na głównej stronie Tune) i wybierz masę docelowego jonu w polu masy MSMS do izolacji w kwadrupolu (w example: m/z 685.2, odpowiadający [M+Li]⁺ jonowym formom pentasacharydu arabinoksylanu). Nagraj 1-minutową akwizycję, aby sprawdzić izolację prekursora podczas przetwarzania danych.
   UWAGA: Addukty litu mają izotop o sile -1 Da piku monoizotopowego, który należy usunąć z okna wyboru MS/MS, aby nie kolidował z etapami przetwarzania. Można go usunąć poprzez zawężenie zakresu wyboru za pomocą parametrów LM Resolution i HM Resolution w zakładce Quad/MS Profile (Rysunek 2C).
4. Skonfiguruj sekwencję IMS "krojenia", aby przeprowadzić selekcję interesującego izomeru na podstawie mobilności.
   1. Przełącz instrument w tryb mobilności (patrz krok 2.3.2). W oknie Kontrolka sekwencji cyklicznej na karcie Funkcje cykliczne wybierz pozycję Dodaj pakiet, a następnie pozycję Fragmentowanie. Poczekaj, aż złożona sekwencja zdarzeń mobilności pojawi się w zakładce Sekwencja (Rysunek 3).
      UWAGA: Możliwe jest zobrazowanie każdego kroku procesu IMS/IMS: kliknij zdarzenie Eject and Acquire w zakładce Sequence. Po podświetleniu na czerwono przesuń go do odpowiedniej pozycji w sekwencji za pomocą przycisków w górę i w dół.
   2. Umieść zdarzenie Eject and Acquire zaraz po pierwszym zdarzeniu Separate (tj. przenieś je do wiersza 3 zamiast wiersza 8 w kolejności pokazanej na Rysunek 3), a następnie kliknij przycisk Uruchom. Szukaj wyników początkowej separacji, które będą wyświetlane w czasie rzeczywistym. Wydłużyć czas trwania pierwszego oddzielnego zdarzenia dla separacji wieloprzebiegowej, zmieniając wartość czasu dla tego zdarzenia w sekwencji, aż rozdzielczość szczytów IMS będzie zadowalająca. Nagraj 1-minutową akwizycję w celach informacyjnych.
      UWAGA: Zwróć uwagę na wartość ADC Start Delay w zakładce ADC Setup (Ustawienia ADC): przydatne będzie sprawdzenie jakości izolacji.
   3. Kliknij przycisk Wstrzymaj. Należy zauważyć, że wyświetlane są wyniki początkowej separacji, chociaż modyfikacje w sekwencji sterującej nie zostaną zastosowane, dopóki użytkownik nie kliknie ponownie przycisku Uruchom. Umieść zdarzenie Eject and Acquire poniżej zdarzeń Wysuń, Wysuń do wstępnego przechowywania oraz Wstrzymaj i Wysuń. Dostosuj czas trwania zdarzeń tak, aby docelowy szczyt znajdował się w regionie Wysuń do wcześniejszego przechowywania, a każdy inny jon znajdował się w obszarze Wysuń lub Przytrzymaj i wysuń.
      UWAGA: Czas trwania tych trzech zdarzeń w porównaniu z rozkładami czasu przybycia (ATD) można zobrazować za pomocą kolorowego paska poniżej spektrum mobilności w zakładce Mobilogram (Rysunek 3).
   4. Umieść zdarzenie Eject and Acquire na końcu sekwencji, poniżej zdarzenia Reinject from Pre-Store i drugiego zdarzenia Separate. Kliknij przycisk Uruchom, aby wyświetlić wybraną populację.
      UWAGA: Ponieważ wybrana populacja opuściła komórkę IMS, cała poprzednia separacja została utracona i powrócono do separacji jednoprzebiegowej (co jest pożądane).
   5. Sprawdź jakość izolacji. Aby sprawdzić, czy wybrano tylko interesujący nas pik, po ponownym wstrzyknięciu wykonaj taką samą separację, jak przed ponownym wstrzyknięciem (tj. ten sam oddzielny czas), jak pokazano na Rysunek 4. Nagraj 1-minutową akwizycję w celach informacyjnych.
      UWAGA: Zachęca się użytkowników do sprawdzenia wyrzuconej populacji; okno czasowe Wysuń do sklepu wstępnego powinno być na poziomie linii bazowej (Rysunek 4B). Aby to sprawdzić, ustaw opóźnienie startu ADC w trybie ręcznym na karcie ADC Settings (Ustawienia ADC) i wprowadź czas opóźnienia zanotowany w kroku 3.4.2. Nagraj 1-minutową akwizycję w celach informacyjnych.
   6. Na karcie Sekwencja, w kolumnie obok czasów zdarzeń zdefiniowanych przez użytkownika (kolumna Time Abs, podświetlona na czerwono), poszukaj zsumowanych czasów wszystkich zdarzeń. Zwróć uwagę na czas Abs znajdujący się na linii zdarzenia Reinject from Pre-Store w celu przeprowadzenia kalibracji CCS.
5. Fragmentuj docelowy pik między dwiema rundami IMS. Zmień napięcia kroku ponownego wtrysku, aby zwiększyć energię kinetyczną jonów i rozdrobnić je po zderzeniu z gazem ruchliwości jonów.
   1. Ustaw czas trwania oddzielnego zdarzenia bezpośrednio poprzedzającego wysunięcie i przejęcie na 1 ms (patrz wyjaśnienie w kroku 2.3.3).
   2. W wierszu Ponowne wstrzyknięcie z magazynu wstępnego zaznacz pole Włącz aktywację i zoptymalizuj fragmentację za pomocą wbudowanej kontrolki. Jeśli widmo jest zadowalające (np. pik podstawowy jest fragmentem), przejdź bezpośrednio do kroku 3.5.4.
      UWAGA: Po włączeniu aktywacji trzy napięcia na linii zmienią kolor na szary: są to napięcia, które użytkownik musi zmienić, jeśli wymagana jest ręczna optymalizacja napięć (patrz następny krok). Te trzy napięcia (Pre-Array Gradient, Pre-Array Bias i Array Offset) tworzą gradient używany do aktywacji jonów. Energia kinetyczna jonów będzie rosła wraz z nachyleniem między odchyleniem pre-array a przesunięciem tablicy (patrz Rysunek 5). Domyślne wartości Gradient → Bias → Offset to: bez aktywacji 85 → 70 → 45 V; maksymalna aktywacja wbudowanej funkcji 185 → 170 → -5 V (+150 V). Po fragmentacji nie zapomnij ponownie wyregulować transmisji jonów za pomocą soczewki DRE (zmniejsz tłumienie sygnału) (patrz krok 3.2.).
   3. Jeśli fragmentacja nie jest zadowalająca przy wbudowanym sterowaniu, odznacz pole Włącz aktywację i przystąp do ręcznej optymalizacji napięć ponownego wtrysku. Zwiększ napięcie gradientu układu wstępnego (napięcie odchylenia układu wstępnego musi być zawsze utrzymywane 15 V poniżej gradientu układu wstępnego) i obniż napięcie przesunięcia układu (które można ustawić jako ujemne), aż wyniki będą zadowalające.
      UWAGA: Podczas ręcznego dostrajania napięć w tablicy wielofunkcyjnej, użytkownik może przełączyć się z widoku "Mobilogram" na interaktywne schematy napięć zastosowanych w tablicy wielofunkcyjnej (schemat PE), aby lepiej zobrazować ustawienia napięcia (Rysunek 5A).
   4. Nagraj akwizycję w 2 minuty. W wyskakującym oknie akwizycji zaznacz opcję Zachowaj czas dryftu, aby wygenerować plik zawierający tylko czasy przybycia w funkcji m/z (czas akwizycji używany do analiz chromatograficznych - czas retencji - jest usuwany z pliku). Zauważ, że ten plik jest oznaczony jako *_dt. RAW.
      UWAGA: Jeśli użytkownik zapomni zaznaczyć opcję Zachowaj czas dryfu, nadal możliwe jest wyodrębnienie wymiaru IMS za pomocą oprogramowania Driftscope 2.9 (Plik | Eksport do MassLynx | Zachowaj czas dryfu).
6. Przełącz instrument z powrotem w tryb TOF na głównej stronie Tune i dokładnie przepłucz system za pomocą 50:50 MeOH/H₂O przed przystąpieniem do następnej próbki.

4. Przetwarzanie IMS/IMS-MS za pomocą MZmine 2²⁴

UWAGA: MZmine 2 jest dostępny pod adresem URL podanym w Tabeli Materiałów. Zaleca się stosowanie MZmine 2.51. W momencie przygotowywania tego manuskryptu, późniejsze wersje nie mogą otwierać plików RAW z instrumentów Cyclic IMS ze względu na zmianę funkcji importu.

1. Zaimportuj nieprzetworzone pliki, które zawierają tylko wymiary IMS i m/z (*_dt. RAW) przy użyciu metod danych surowych | Import surowych danych.
   UWAGA: Pliki RAW pojawią się po lewej stronie głównego okna MZmine. Nie importuj oryginału *. Pliki RAW, które nadal zawierają wymiar czasu przechowywania. MZmine nie rozróżnia czasu przechowywania od czasu nadejścia IMS, a punkty danych obu wymiarów nakładałyby się na siebie.
2. Zoptymalizuj parametry przepływu pracy dla reprezentatywnego pliku, wybierając go z listy Pliki danych pierwotnych.
   1. Oceń poziom szumu w danych. Kliknij prawym przyciskiem myszy plik na liście Pliki danych pierwotnych, wybierz Pokaż TIC i wyświetl "chromatogram" piku bazowego (BPC). Kliknij dwukrotnie najmniejszy pik widoczny gołym okiem, aby wyświetlić jego widmo masowe. Należy wziąć pod uwagę, że poziom szumu w danych jest zbliżony do poziomu drugiego izotopu piku podstawowego w tym widmie i należy użyć tej samej wartości dla wszystkich progów intensywności w następujących krokach przetwarzania.
      UWAGA: Dane zostały pozyskane przy użyciu izolacji kwadrupolowej i dlatego są uważane przez MZmine za MS/MS. Podczas całego przetwarzania MZmine należy upewnić się, że pracujesz na poziomie MS = 2.
   2. Wykonywanie masowej detekcji przy użyciu metod danych surowych | Wykrywanie funkcji | Masowa detekcja. W przypadku danych uzyskanych w trybie profilu należy użyć algorytmu transformacji falkowej. Aby ustawić parametry algorytmów w MZmine, kliknij przycisk [...] obok algorytmu i skorzystaj z opcji Pokaż podgląd, aby wyświetlić dane podczas optymalizacji parametrów.
      UWAGA: Na tym etapie wybrane przez algorytm piki pojawią się na czerwono w oknie podglądu. Podczas korzystania z algorytmu transformacji falkowej na zastrzeżonych plikach RAW, MZmine czasami myli punkty danych profilu z centroidalnymi pikami. Oprogramowanie wyświetli komunikat informujący, że użytkownik uruchamia algorytm profilu na widmach centroidalnych: zignoruj ten komunikat i kliknij OK.
   3. Rekonstrukcja wyekstrahowanych widm ruchliwości jonów (EIM) dla każdej masy fragmentu przy użyciu metod danych surowych | Wykrywanie funkcji | Konstruktor chromatogramu ADAP na liście mas 'masowych' wygenerowanej w poprzednim kroku. Ponieważ wejściowa tolerancja m/z na tym etapie jest tolerancją skanowania do skanowania, należy pamiętać, aby była co najmniej 3-4 razy wyższa niż ogólna oczekiwana dokładność.
   4. Ponieważ poprzedni krok nie ma opcji podglądu, sprawdź jakość pikowania bezpośrednio za pomocą listy funkcji, która pojawiła się w prawym panelu głównego okna MZmine. Otwórz listę funkcji, zaznacz wszystkie wiersze, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie Pokaż/XIC (okno dialogowe). Kliknij przycisk Wszystkie, aby wyświetlić wszystkie jony w widmie ruchliwości. Sprawdź wybrane szczyty, które są wyświetlane w kolorze, aby upewnić się, że nie ma oczywistych pominiętych pików.
   5. Zdekonwolucjonizuj EIM-y, aby podzielić m/z, które zawierają różne piki w wielu obiektach. Korzystanie z metod listy funkcji | Wykrywanie funkcji | Dekonwolucja chromatogramu i wybierz algorytm falek (ADAP). Zoptymalizuj algorytm dla danych, korzystając z opcji Pokaż podgląd i następujących kluczowych parametrów: próg S/N, próg współczynnika/obszaru i zakres falek RT.
      UWAGA: Zaleca się sprawdzenie aspektu widma zdekonwoluowanego. Użyj narzędzia do wizualizacji chromatogramu, jak opisano w kroku 4.2.4. Zdekonwolucjonizowane piki pojawią się w kolorze, a piki o tej samej masie powinny zostać podzielone, jak pokazano w Rysunek 6A.
   6. Deizotopowanie zdekonwoluowanych EIM-ów za pomocą metod listy funkcji | Izotopy | Piki izotopowe grouper. Użyj oczekiwanej dokładności przyrządu dla wartości tolerancji m/z i ustaw tolerancję czasu przybycia na 0,1 ms (wyświetlaną w MZmine jako Tolerancja czasu retencji 0,1 min), ponieważ izotopy nie są rozpuszczane podczas separacji IMS. Sprawdź listę funkcji: jeśli pozostaną jakieś izotopy, zwiększ wartości tolerancji.
      UWAGA: Chociaż deizotopowanie można teoretycznie przeprowadzić w dowolnym momencie przetwarzania listy funkcji, ważne jest, aby zrobić to na końcu, aby można było wyeksportować wartości ładunku (algorytmy używane w innych krokach czasami usuwają informacje o stanie naładowania).
3. W przypadku przetwarzania wielu widm IMS/IMS-MS należy powtórzyć przetwarzanie z tymi zoptymalizowanymi parametrami. Zachowaj te same parametry dla wszystkich widm.
4. W przypadku wielu widm, zgrupuj je w jednej tabeli, aby je wyeksportować; jeśli nie, przejdź bezpośrednio do kroku 4.5. Aby pogrupować widma, użyj opcji Metody listy cech | Wyrównanie | Dołącz do nakładek. Ponieważ celem nie jest faktyczne wyrównanie pików, należy stosować restrykcyjne wartości tolerancji zarówno dla m/z, jak i czasu przybycia. Nadaj taką samą wagę obu wymiarom.
5. Wyeksportuj ostateczną listę funkcji do pliku *.csv. Korzystanie z metod listy funkcji | Eksport/Import | Eksportuj do pliku CSV i eksportuj następujące wartości: Eksportuj wiersz m/z, Eksportuj czas przechowywania wiersza (rzeczywisty czas przybycia IMS), Szczyt m/z i Wysokość szczytu. Użyj przecinka jako separatora pól.

5. ^TWCCS_N2 z centroidalnych widm IMS/IMS

UWAGA: W tym protokole zostanie użyta logarytmiczna kalibracja dopasowania^25,26, która zwykle daje lepsze wyniki niż kalibracja liniowa i jest łatwa do zaimplementowania w arkuszu kalkulacyjnym lub wewnętrznym skrypcie przetwarzania. Autorski skrypt (napisany w języku R) jest dostępny pod adresem URL podanym w Tabeli Materiałów.

1. Wybierz referencyjne wartości czasu przybycia z akwizycji calibrant (patrz krok 2.3). Zrób to ręcznie za pomocą oprogramowania konstruktora (patrz Tabela materiałów), aby sprawdzić aspekt wszystkich pików kalibru IMS.
   1. W oknie Chromatogram otwórz plik *_dt. RAW odpowiadający kalibrowi.
   2. Dla każdego punktu kalibracji wygeneruj EIM za pomocą punktu menu Wyświetlacz | Opcja masowa.
   3. Sprawdź profil EIM-ów. Jeśli niektóre są słabo zdefiniowane, wygładź je za pomocą punktu menu Proces | Opcja gładka (ponieważ najlepsze wyniki uzyskuje się zwykle za pomocą algorytmu Savitzky'ego-Golaya, płynna 2 razy w 3 przedziałach). Raportowanie wartości wierzchołkowych w arkuszu kalkulacyjnym.
      UWAGA: Ponieważ punkty odniesienia są zazwyczaj uzyskiwane za pomocą urządzeń DTIMS o niskiej rozdzielczości, niektóre rozkłady multimodalne mogą pojawiać się w cyklicznym IMS w zależności od kalibrów. Z wykazu kalibracyjnego należy usunąć wszystkie piki przedstawiające taki rozkład.
2. Oblicz logarytmiczne parametry dopasowania na podstawie kalibrów.
   1. Dla wszystkich punktów kalibracji oblicz następujące elementy.
      1. Oblicz czas dryftu za pomocą korektora (1):
         (1)
         gdzie t_d oznacza czas dryftu, t_A zmierzony czas przybycia, a t_inj czas wstrzyknięcia do komory IMS (wszystko w ms).
         UWAGA: W przypadku małych cząsteczek, takich jak fragmenty oligosacharydów, czas martwy (czas lotu między wyjściem z komórki IMS a detektorem) zmienność między różnymi masami mieści się w zakresie błędu kalibracji CCS i może być ignorowana.
      2. Obliczyć neutralną masę jonów za pomocą równania (2):
         (2)
         gdzie z jest stanem naładowania jonu, a _jon m masą przeciwjonu (w Da). Używaj dokładnych mas, aby uniknąć wprowadzania niepewności. Jeśli zamiast przeciwjonu występuje utrata atomu, należy użyć ujemnych wartości _jonów m (np. dla [M-H]^- m_neutralny = (m/z) * |z| - (- 1,007276) = (m/z) * |z| + 1,007276).
      3. Obliczyć parametr CCS za pomocą korektora (3):
         (3)
         przy CCS wartość ^{referencyjnej}rurki dryfującej DT CCS_N2 (w nm²), a m_gaz – masę gazu dryfującego (w Da; np. dla azotu: m_gaz = 28,01 Da).
      4. Oblicz parametr t_d' za pomocą równania (4):
         (4)
         Z d opóźnienie startu detektora używane eksperymentalnie do korygowania czasu martwego (zwykle ~1,5 ms).
      5. Oblicz logarytm powyższych parametrów:
         ln (CCS') i ln (t'_d)
   2. Wykonaj regresję liniową, aby określić współczynnik R² oraz parametry x i y dopasowania logarytmicznego (gdzie x oznacza nachylenie, a ln(y) punkt przecięcia) za pomocą równania (5):
      (5)
      UWAGA: Użytkownik może wykreślić wartości ln(CCS') vs ln(t_d'), aby wizualnie sprawdzić wyniki kalibracji, chociaż jest to opcjonalne.
3. Zastosuj kalibrację do danych eksperymentalnych, aby skalibrować piki wybrane przez MZmine dla każdego widma IMS/IMS wyeksportowanego do pliku *.csv. Dla każdego punktu oblicz następujące elementy.
   1. Oblicz czas dryftu za pomocą korektora (6):
      (6)
      przy czym t_oznacza czas poprzedzający końcowe rozdzielenie IMS (wartość "Time Abs" zanotowaną w kroku 3.4.6).
      UWAGA: W przypadku kalibracji wielu widm IMS/IMS uzyskanych w różnych sekwencjach, należy dokładnie sprawdzić wartości _sekwencji.
   2. Obliczyć neutralną masę jonów za pomocą równania (7):
      (7)
   3. Obliczyć parametry_{t d}' i t_d'' za pomocą korektora (8) i równania (9):
      (8)
      (9)
   4. Obliczyć końcowe skalibrowane wartości CCS (^TWCCS_N2 w nm²) za pomocą korektora (10):
      (10)
      UWAGA: Chociaż krok 5.2.2. daje ln(y) jako punkt przecięcia, y musi być użyte do uzyskania końcowej wartości CCS. Nie zapomnij zastosować funkcji wykładniczej.
4. Sprawdź dokładność kalibracji, stosując kalibrację do drugiego pobrania roztworu kalibracyjnego uzyskanego w kroku 2.4.
   UWAGA: Kalibracja powinna dać wyniki z błędem ~1-2%.

Results

Pentasacharyd arabinoksylanu, XA²XX, został wybrany jako przykład do zilustrowania tego protokołu. Związek ten jest dostępny w handlu, ale tylko w postaci mieszaniny z innym pentasacharydem arabinoksylanu, XA³XX (czysty XA³XX jest również dostępny w handlu). Struktury XA²XX i XA³XX przedstawiono na rysunku uzupełniającym S1. Ponieważ stosunek XA²XX i XA³XX w mieszaninie handlowej wynosi ~50:50, przygotowano roztwór o stężeniu 20...

Discussion

SELECT SERIES Cyclic IMS to potężne narzędzie, które umożliwia wybór zdefiniowanej populacji jonów — o danym m/z i ruchliwości jonów — bez konieczności przeprowadzania wcześniejszej separacji chromatograficznej. Instrument daje możliwość wygenerowania dwuwymiarowej mapy fragmentacji tej populacji jonów, z której można wyodrębnić zarówno widma MS/MS, jak i IMS/IMS. Użytkownik musi jednak zwrócić uwagę na kilka krytycznych punktów, które wymagają uwagi podczas procesu eksperymentalnego.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mieszanina 33-&alfa;-L- plus 23-&alfa;-L-Arabinofuranozylo-ksylotetraoza (XA3XX/XA2XX)	Megazyme Ltd., Wicklow, Irlandia	O-XAXXMIX	XA2XX + XA3XX
33-α-L-Arabinofuranozylo-ksylotetraoza (XA3XX)	Megazyme Ltd., Wicklow, Irlandia	O-XA3XX	Pure XA3XX standard
Probówki Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mL, Eppendorf Quality, bezbarwne, 1 000 probówek	Eppendorf, Hamburg, Niemcy	0030120086	Służy do przygotowania roztworu podstawowego węglowodanów i rozcieńczania
FALCON 50 mL Probówka stożkowa polipropylenowa 30 x 115 mm	Corning Science Mé xico S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Meksyk	352070	Służy do przygotowania wodnego roztworu podstawowego 100 mM
LiCl chlorku litu (odczynnik ACS, ≥ 99%)	Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, Francja		310468 Służy do domieszkowania próbki zestawem
kalibracyjnym IMS/Tof Major Mix	Waters Corp., Wilmslow, Wielka Brytania	186008113	Roztwór do kalibracji dla MS i IMS
MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6 (Waters Embedded Analyser Platform for Cyclic IMS 2.9.1 Release 9)	Waters Corp., Wilmslow, Wielka Brytania	721022377	Cykliczne oprogramowanie IMS do sterowania urządzeniami i przetwarzania danych
Metanol do HPLC PLUS Gradient klasy	Carlo-Erba Odczynniki, Val de Reuil, Francja	412383	Rozpuszczalnik o wysokiej czystości
MS Leucine Enkephaline Kit	Waters Corp., Wilmslow, Wielka Brytania	700002456	Związek referencyjny stosowany do strojenia spektrometru mas
SCHOTT DURAN 100 ml butelka ze szkła borokrzemianowego	VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pensylwania, US	218012458	Służy do przygotowania roztworu 500 &mikro; M LiCl w 50:50 MeOH/Woda
SELECT SERIES Cykliczny IMS	Waters Corp., Wilmslow, Wielka Brytania	186009432	Spektrometr masowy ruchliwości jonów wyposażony w cykliczne ogniwo IMS
Strona internetowa: http://mzmine.github.io/	MZmine Development	Team-Link	do pobrania oprogramowania MZmine
Strona internetowa: https://github.com/siollivier/IM-MN	INRAE, UR BIA, BIBS Facility, Nantes, Francja	-	Łącze do wewnętrznego skryptu języka R zawierającego funkcję kalibracji CCS