Method Article

Matryca optrodowa do jednoczesnej modulacji optogenetycznej i elektrycznego zapisu neuronowego

DOI:

10.3791/63460

⸱

September 1st, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electronic and Electrical Engineering, Ewha Womans University, 2Graduate Program in Smart Factory, Ewha Womans University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Seoul National University, 4Graduate School of Engineering Practice, Seoul National University, 5Department of Brain and Cognitive Sciences, Ewha Womans University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy metodę wytwarzania systemu optycznego ze światłowodami do dostarczania światła i matrycą elektrod do rejestracji neuronowej. Eksperymenty in vivo na transgenicznych myszach z ekspresją rodopsyny-2 pokazują wykonalność systemu do jednoczesnej stymulacji optogenetycznej i zapisu elektrofizjologicznego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatniej dekady, optogenetyka stała się podstawowym narzędziem do badania sygnalizacji neuronalnej ze względu na jej unikalną zdolność do selektywnej modulacji lub monitorowania neuronów. Ponieważ określone typy komórek neuronalnych mogą być genetycznie modyfikowane w celu ekspresji białek opsyny, optogenetyka umożliwia stymulację optyczną lub hamowanie wybranych neuronów. W systemie optycznym dla optogenetyki dokonano kilku postępów technologicznych. Niedawno zaproponowano połączenie falowodu optycznego do dostarczania światła z zapisem elektrofizjologicznym w celu jednoczesnego monitorowania reakcji neuronalnych na stymulację lub hamowanie optogenetyczne. W tym badaniu opracowano wszczepialną matrycę optrodową (światłowody 2x2) z wbudowanymi elektrodami wielokanałowymi.

Jako źródło światła zastosowano diodę elektroluminescencyjną (LED), a mikrofabrykowany układ mikrosoczewek został zintegrowany, aby zapewnić wystarczającą moc światła na końcu światłowodów. System optrode array składa się z części jednorazowego użytku i części wielokrotnego użytku. Część jednorazowa posiada światłowody i elektrody, natomiast część wielokrotnego użytku posiada diodę LED i obwody elektroniczne do sterowania światłem i przetwarzania sygnałów neuronowych. Nowatorski projekt wszczepialnego systemu matrycy optycznej został przedstawiony w dołączonym filmie jako dodatek do procedury operacji implantacji optrodowej, optogenetycznej stymulacji światłem i elektrofizjologicznego zapisu neuronowego. Wyniki eksperymentów in vivo z powodzeniem wykazały zablokowane w czasie skoki nerwowe wywołane przez bodźce świetlne z neuronów pobudzających hipokampa myszy.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rejestrowanie i kontrolowanie aktywności neuronalnej jest niezbędne do zrozumienia, jak funkcjonuje mózg w sieci neuronowej i na poziomie komórkowym. Konwencjonalne metody zapisu elektrofizjologicznego obejmują zacisk krosowy1,2,3,4 za pomocą mikropipety i zapis zewnątrzkomórkowy za pomocą elektrod mikroneuronowych5,6,7,8. Jako metoda neuromodulacji, stymulacja elektryczna jest często stosowana do bezpośredniej stymulacji ogniskowego obszaru mózgu poprzez bezpośrednią lub pośrednią depolaryzację komórek neuronalnych. Jednak metoda elektryczna nie jest w stanie rozróżnić typów komórek neuronalnych do rejestracji lub stymulacji, ponieważ prądy elektryczne rozchodzą się we wszystkich kierunkach.

Jako rozwijająca się technologia, optogenetyka zapoczątkowała nową erę w zrozumieniu, jak działa układ nerwowy9,10,11,12,13,14,15,16. Istotą technik optogenetycznych jest wykorzystanie światła do kontrolowania aktywności wrażliwych na światło białek opsyny ulegających ekspresji w genetycznie zmodyfikowanych komórkach. W ten sposób optogenetyka umożliwia zaawansowaną modulację lub monitorowanie genetycznie wybranych komórek w skomplikowanych obwodach neuronowych14,17. Szersze zastosowanie podejścia optogenetycznego wymusiło jednoczesną rejestrację neuronalną w celu bezpośredniego potwierdzenia neuromodulacji optycznej. Dlatego niezwykle cenne byłoby zintegrowane urządzenie z funkcjami sterowania oświetleniem i nagrywania16,18,19,20,21,22,23,24,25.

Istnieją ograniczenia tradycyjnej, laserowej stymulacji optogenetycznej, która wymaga nieporęcznego i drogiego systemu dostarczania światła26,27,28,29,30. W związku z tym niektóre grupy badawcze zastosowały sondy krzemowe oparte na μLED, aby zminimalizować rozmiar systemu dostarczania światła31,32,33,34. Istnieje jednak ryzyko termicznego uszkodzenia mózgu spowodowanego bezpośrednim kontaktem z diodami μLED ze względu na niską wydajność konwersji energii diod LED. Falowody świetlne, takie jak światłowody, SU-8 i tlenoazotek krzemu (SiON), zostały zastosowane w celu uniknięcia uszkodzeń termicznych30,35,36,37,38,39. Jednak ta strategia ma również wadę ze względu na niską wydajność sprzężenia między źródłami światła a falowodami.

Matryca mikrosoczewek została wcześniej wprowadzona w celu zwiększenia efektywności sprzężenia światła między diodami LED a światłowodami40. W oparciu o technologie systemów mikroelektromechanicznych (MEMS) do stymulacji optycznej i rejestracji elektrycznej w mikroskali opracowano system optrodowy40. Układ mikrosoczewek pomiędzy diodą LED a światłowodami zwiększył wydajność świetlną o 3,13 dB. Jak pokazano na rysunku Rysunek 1, układ światłowodów 2x2 jest wyrównany na układzie mikrosoczewek 4x4, a dioda LED jest umieszczona poniżej układu mikrosoczewek. Światłowody 2x2 są montowane zamiast 4x4, aby zmniejszyć uszkodzenia mózgu. Układ elektrod wolframowych jest umieszczony w sąsiedztwie układu optrodowego za pomocą krzemu przez otwory do zapisu elektrofizjologicznego (Rysunek 1B).

System składa się z górnej części jednorazowej i odłączanej części dolnej. Górna jednorazowa część, która obejmuje matrycę światłowodową, matrycę mikrosoczewek i matrycę elektrod wolframowych, jest przeznaczona do trwałego wszczepienia do mózgu w celu eksperymentów in vivo. W dolnej części znajduje się źródło światła LED i zewnętrzna linia zasilająca, którą można łatwo zdemontować i ponownie wykorzystać do innego eksperymentu na zwierzętach. Dołączana plastikowa osłona chroni jednorazową część po wyjęciu zdejmowanej części.

Wykonalność systemu jest weryfikowana poprzez wszczepienie do mózgów transgenicznych myszy eksprymujących rodopsynę kanałową-2 (ChR2) w neuronach Ca2+/kinazy białkowej zależnej od kalmoduliny II-dodatnich (Mysz CaMKIIα::ChR2). Elektrody rejestrujące wykorzystano do rejestrowania aktywności neuronalnej poszczególnych neuronów podczas optycznej stymulacji neuronów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury opieki nad zwierzętami i zabiegi chirurgiczne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Ewha Womans (nr 20-029).

1. Przygotowanie tablicy optrodowej (Rysunek 1 i Rysunek 2)

  1. Podłącz światłowody do układu mikrosoczewek.
    1. Usuń powłokę pasywacyjną światłowodu i pokrój go na kawałki o długości 5 mm za pomocą precyzyjnego tasaka do światłowodu.
    2. Zanurz światłowód w przezroczystej żywicy UV i umieść światłowody na układzie mikrosoczewek.
    3. Utwardź żywicę za pomocą lampy UV.
    4. Przymocuj matrycę mikrosoczewek do obudowy wydrukowanej w 3D za pomocą żywicy epoksydowej.
  2. Wyrównaj druty wolframowe pokryte perfluoroalkoksylem (PFA).
    1. 4 kawałki drutów wolframowych PFA o długości 30 mm i 1 srebrny drut do 5-pinowego złącza żeńskiego o rastrze 1,27 mm. Użyj srebrnego drutu jako elektrody referencyjnej.
    2. Podłącz żeńskie złącze o rastrze 1,27 mm do przedwzmacniacza headstageamplifier.
    3. Ostrożnie przełóż druty wolframowe przez krzem przez otwory (Rysunek 1B), aby pomóc w precyzyjnym ustawieniu elektrod wolframowych.
    4. Przytnij wyrównane druty wolframowe o 1 mm krótsze niż długość światłowodu.
    5. Przymocuj złącze do obudowy wydrukowanej w 3D za pomocą żywicy epoksydowej.
  3. Rozmieszczenie diod LED
    1. Umieść diodę LED w obudowie wydrukowanej w 3D.
    2. Podłącz diodę LED do obwodu sterującego, który generuje modulację szerokości impulsu (PWM).
      UWAGA: Impuls PWM jest generowany przez mikrokontroler.
    3. Biorąc pod uwagę szum wywołany przez obwód sterujący LED, upewnij się, że elektrody rejestrujące są oddalone od obwodu sterowania LED o 50 mm.
    4. Zmierz natężenie światła na końcu końcówki światłowodu za pomocą fotodiody.
  4. Zanurz elektrody wolframowe i światłowody w alkoholu na 15 minut, a następnie zanurz system w sterylnej wodzie DI i sterylizuj gazowym tlenkiem etylenu.

2. Chirurgia implantacji (Rysunek 3 i Rysunek 4)

UWAGA: Podczas zabiegu należy przestrzegać sterylnej techniki.

  1. Przygotuj transgeniczne zwierzęta, które są genetycznie modyfikowane w celu ekspresji wrażliwych na światło białek opsyny w określonym typie komórek nerwowych.
    UWAGA: W tym badaniu wykorzystano samca, 2-miesięczną, transgeniczną mysz z ekspresją rodopsyny kanałowej-2 (ChR2) w neuronach Ca2+/kalmodulinowo-dodatnich kinazie białkowej II (mysz CaMKIIα::ChR2)41.
  2. Znieczulić mysz koktajlem ketaminy-ksylazyny - mieszaniną ketaminy (100 mg / kg) i ksylazyny (10 mg / kg) - przez podanie dootrzewnowe.
    1. Sprawdzaj znieczulone zwierzę co 30 minut, monitorując ruch wąsów i reakcję na uszczypnięcie łapy.
    2. Koktajl ketaminowo-ksylazynowy należy wstrzyknąć w połowie dawki początkowej, jeśli potrzebne jest dodatkowe znieczulenie.
  3. Ogol skórę głowy i umieść znieczuloną mysz w ramce stereotaktycznej.
    UWAGA: Wykonaj chirurgiczne przygotowanie skóry i udrapuj zwierzę. Przygotowanie skóry polega na depilacji, a następnie oczyszczeniu skóry środkami przeciwdrobnoustrojowymi.
    1. Umieść głowę w ramie stereotaktycznej i włóż nauszniki do ujścia.
    2. Wyśrodkuj głowę myszy w ramce stereotaktycznej, kilkakrotnie poluzowując i dokręcając nauszniki w celu dokładnego ustawienia.
    3. Umieść siekacz tak, aby górne siekacze zaczepiały się o przednią krawędź wewnętrzną.
    4. Wyreguluj siekacz, aby ustawić wysokość siekacza i dokręć nos clamp do pyska.
    5. Włącz wcześniej termiczną poduszkę grzewczą wbudowaną w ramkę stereotaktyczną, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C przez cały czas trwania zabiegów chirurgicznych.
    6. Umieść sondę termiczną w odbytnicy myszy w celu regulacji homeotermicznej.
      UWAGA: Położenie paska słuchowego należy sprawdzić, delikatnie chwytając i kołysząc pyskiem. Nausznik należy ponownie wyregulować, jeśli pysk można przesunąć na bok o więcej niż ~4 mm.
  4. Przykryj oczy wazeliną (patrz tabela materiałów), aby zapobiec wysuszeniu.
  5. Wstrzyknij 1% lidokainy w skórę głowy. Podnieś skórę głowy za pomocą kleszczy, zabezpiecz miejsce do wstrzyknięcia i wstrzyknij lidokainę pod skórę głowy.
  6. Wykonaj nacięcie strzałkowe za pomocą skalpela i drobnych nożyczek. Przytrzymaj naciętą skórę za pomocą mikrozacisku, aby poszerzyć widoczność pola operacyjnego.
    UWAGA: Długość nacięcia wynosi <1 cm powyżej bregmy i krawędzi ogonowej kości międzyciemieniowej.
  7. Usuń okostną za pomocą bawełnianych wacików. Jeśli wystąpi krwawienie, kauteryzuj czaszkę za pomocą bovie, aby uszczelnić naczynia krwionośne.
  8. Oczyść czaszkę solą fizjologiczną i oznacz miejsca kraniotomii za pomocą ramienia manipulatora: hipokamp przednio-tylny (AP) −1,8 do −2,8 mm, przyśrodkowo-boczny (ML) 0,5-2,5 mm i grzbietowo-brzuszny (DV) −1 do −2 mm.
    UWAGA: Biorąc pod uwagę grubość czaszki myszy, włóż tablicę optrodową od -1,2 do -2,2 mm od odsłoniętego obszaru mózgu. Biorąc pod uwagę szlak hipokampa, komórki piramidalne CA3 wysyłają swoje aksony do CA1. W związku z tym światłowody są o 1 mm dłuższe od elektrod rejestrujących, tak że włókna światłowodowe są umieszczone w CA3, a elektrody rejestrujące w CA1.
  9. Wywierć otwór nad móżdżkiem i włóż do ziemi. Wkręć uziemiającą na głębokość 0,5 mm za pomocą precyzyjnej, aż dotrze do górnej części móżdżku.
    UWAGA: Upewnij się, że śruba jest mocno wkręcona, która będzie używana jako elektroda uziemiająca i konstrukcja nośna, aby zmaksymalizować długoterminową stabilność implantacji, ponieważ zwiększa trójwymiarową powierzchnię przylegania cementu dentystycznego.
  10. Wywierć zaznaczony obszar i usuń kawałek czaszki za pomocą kleszczy.
  11. Zegnij końcówkę igły 26 G pod kątem 120° w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara i odsłoń obszar mózgu, wkładając skośną stronę igły skierowaną do góry. Uważaj, aby nie uszkodzić mózgu i naczyń krwionośnych.
  12. Oczyść odsłonięty mózg solą fizjologiczną, aby wypłukać pył kostny i obce substancje.
  13. Zamocuj matrycę opcjonalną w ramieniu manipulatora i zbliż się do odsłoniętego obszaru.
    UWAGA: Podczas umieszczania urządzenia ponowne obliczenie obszaru docelowego z bregmy może zwiększyć dokładność umieszczenia.
  14. Powoli włóż matrycę opcrodową i podłącz uziemiającą do srebrnego przewodu dołączonego do systemu42.
    UWAGA: W tym procesie matryca musi być mocno przymocowana do ramienia manipulatora, aby zminimalizować chybotanie i zapobiec uszkodzeniu mózgu przez mikroruchy podczas wkładania. Wprowadzanie należy wykonywać powoli, z odpoczynkiem przez 10 minut, aby uwzględnić obrzęk mózgu, który mógł zostać uciskany po włożeniu. Prędkość wprowadzania poniżej 1 μm/s do tkanki mózgowej jest zalecana ze względu na wysoką jakość stosunku sygnału do szumu i liczbę możliwych do oddzielenia pojedynczych jednostek42.
  15. W przypadku krwawienia należy bezpośrednio uciskać krwawiki suchym wacikiem lub stosować kauteryzację. Nie przechodź do kolejnych kroków, dopóki krwawienie nie zostanie całkowicie zatrzymane.
  16. Umieść piankę żelową między odsłoniętym mózgiem a urządzeniem, aby chronić substancje chemiczne przed bezpośrednim kontaktem z mózgiem.
    UWAGA: Pianka żelowa pomaga również w hemostazie i utrzymuje nawilżenie mózgu.
  17. Przetrzyj czaszkę bawełnianymi wacikami, aby usunąć jak najwięcej wilgoci i przejdź do następnego kroku utrwalania.
  18. Ostrożnie nałóż cement dentystyczny na czaszkę, aby zamocować urządzenie i przykryć piankę żelową. Zanim cement dentystyczny całkowicie stwardnieje, oddziel skórę głowy, jeśli jest przymocowany do cementu dentystycznego. Pociągnij naciętą skórę kleszczami, aby pokryć stwardniały cement dentystyczny i zszyć skórę głowy. Następnie zwolnij urządzenie z ramienia manipulatora.
    UWAGA: Upewnij się, że cement dentystyczny nie przykleja się do skóry i pokrywa tylko okolicę czaszki. Kiedy skóra rośnie, może odepchnąć cement i ostatecznie urządzenie odpadnie. Spowoduje to krytyczny problem dla długoterminowych eksperymentów in vivo.

3. Rekonwalescencja i pielęgnacja implantów

  1. Wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej.
  2. Roztwór karprofenu należy podawać za pomocą igły 26 G. Wstrzyknąć raz przed zabiegiem i 12 godzin (następnego ranka w przypadku operacji popołudniowej) i 24 godziny po zabiegu w celu zmniejszenia bólu.
    UWAGA: Stężenie leku w butelce wynosi 50 mg/ml i jest on przechowywany w temperaturze 4 °C. Karprofen jest lepki i należy go rozcieńczyć w sterylnej wodzie w stosunku 1:10. Jeśli zachowana jest sterylność, roztwór można przechowywać do 4 tygodni. Aby utrzymać skuteczny czas działania leku, należy wstrzykiwać roztwór karprofenu w odstępach 12-godzinnych.
  3. Umieść mysz na poduszce grzewczej i sprawdź, czy dobrze się regeneruje po znieczuleniu.
    UWAGA: Zwierzę nie jest pozostawiane bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności.
  4. Usuń nici szwu 7 - 10 dni po zabiegu.
  5. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie przez 1 tydzień. Monitoruj spożycie pokarmu i wody w czasie rekonwalescencji. Podaj lek przeciwbólowy i sprawdź, czy nie ma oznak dyskomfortu lub bólu.
    UWAGA: Zwierzęta, które przeszły operację, nie mogą pozostać z innymi zwierzętami, dopóki w pełni nie wyzdrowieją.
    1. W okresie rekonwalescencji codziennie waż mysz, aby sprawdzić, czy nie nastąpiły zmiany wagi. Ofiarować mysz (patrz punkt 6), jeśli występuje 20% spadek masy ciała w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi dopasowanymi pod względem wieku i płci.

4. Stymulacja optogenetyczna i zapis elektrofizjologiczny

  1. Znieczul mysz i umieść znieczuloną mysz w ramce stereotaktycznej.
  2. Ustaw parametry stymulacji.
    1. Ustaw przepis na impuls świetlny na 4% cykl pracy i częstotliwość 10 Hz43. Ustaw stymulację światłem na 2 s (20 impulsów) podczas rejestracji neuronowej.
    2. Użyj prądu 50 mA, aby wysterować natężenie światła 3 mW/mm2 na końcówce światłowodu. Zmierz moc światła za pomocą fotodiody i miernika mocy i podziel moc światła przez obszar fasetki światłowodu.
  3. Zdejmij plastikową osłonę i przymocuj górną część zawierającą system dostarczania światła za pomocą diody LED wielokrotnego użytku i obwodów.
  4. Podłącz przedwzmacniacz headstage do wbudowanego 5-pinowego złącza.
  5. Otwórz oprogramowanie, aby nagrywać sygnały neuronowe.
  6. Skonfiguruj filtry oprogramowania. Użyj filtra pasmowoprzepustowego przy 0,1-20 kHz i filtra wycinającego przy 60 Hz. Ustaw amplifier częstotliwość próbkowania na 20 kHz.
  7. Przed nagraniem sprawdź, czy wykryto sygnały impulsów neuronowych.
    UWAGA: Redukcja szumów jest ważna, ponieważ sygnały neuronowe są zbyt małe. Jeśli poziom szumu jest zbyt wysoki, sygnały neuronowe mogą zostać przesłonięte przez szum i stać się niewidoczne. Użyj odpowiedniego uziemienia i ekranowania fal elektromagnetycznych, aby zmniejszyć szumy.
  8. Po sprawdzeniu sygnału nagraj sygnały neuronowe bez stymulacji światłem w celu nagrania linii bazowej.
  9. Dostarczaj światło LED i jednocześnie rejestruj odpowiedzi neuronalne (Rysunek 5 i Rysunek 6).
    UWAGA: Po stymulacji, następny eksperyment stymulacji musi być przeprowadzony po przerwie co najmniej 5 minut, tak aby aktywność neuronalna wywołana przez poprzednią stymulację nie miała wpływu na następny eksperyment
    10. .

5. Analiza danych

  1. Załaduj pozyskane dane za pomocą programu MATLAB.
  2. Uzyskaj pojedyncze działania neuronowe za pomocą algorytmu sortowania impulsów "Wave-Clus"44,45. Wykryj skoki w każdym kanale za pomocą progu amplitudy, jak w Eq (1)45.
    Próg = 5 × mediany figure-protocol-1 (1)
    Gdzie x jest sygnałem filtrowanym pasmowo.
    1. Aby zainstalować "Wave-Clus", zapoznaj się z łączem pobierania w Tabeli materiałów.
    2. Aby otworzyć graficzny interfejs użytkownika (GUI), wpisz wave_clus w wierszu polecenia programu MATLAB.
    3. Wpisz Get_spikes('nazwa_pliku.ext') dla rozszerzenia pliku przygotowanego do wykrycia skoków. Następnie uruchom Do_clustering('filename_spikes.mat') w celu sortowania spajków.
  3. Policz posortowane skoki przed, w trakcie i po stymulacji świetlnej za pomocą określonych przedziałów czasowych. Do analizy należy używać przedziałów czasu 0,2 s i 2 s.
  4. Wykreśl liczbę skoków napięcia z każdego kanału nagrywania.
    UWAGA: Obliczono i wykreślono średnią z błędem standardowym (SEM) danych z wyników 8 powtórzonych eksperymentów.

6. Eutanazja

  1. Po wszystkich eksperymentach poświęć mysz przez wdychanie dwutlenku węgla (CO2 ).
  2. Bez wstępnego ładowania komory umieść mysz w przezroczystej komorze eutanazyjnej, bez dopływu CO2 i/lub wycieków.
  3. Włączyć gaz CO2 i wyprzeć powietrze z szybkością 30 - 50% objętości powietrza w komorze eutanazji na minutę
    UWAGA: Przepływomierz musi być podłączony do butli z gazem CO2 , aby zapewnić, że szybkość wypierania powietrza wynosi 30-50% objętości komory eutanazyjnej na minutę.
  4. Monitoruj ofiarowaną mysz pod kątem braku oddychania i zmienionego koloru oczu.
    UWAGA: Przewidywany czas eutanazji wynosi zwykle od 10 do 15 minut.
  5. Po zaobserwowaniu znaków śmierci wyjmij mysz z komory eutanazji.
  6. Aby zakończyć procedurę eutanazji, należy zweryfikować zgon, potwierdzając zatrzymanie oddechu i serca.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System optrode został pomyślnie skonstruowany, aby zapewnić wystarczającą moc światła do aktywacji docelowych neuronów. Dokładne wyrównanie elektrod wolframowych uzyskuje się dzięki mikrowytwarzanemu krzemowi przez otwory. Zmierzone natężenie światła wynosi 3,6 mW/mm2 na końcówce światłowodu przy przyłożeniu prądu 50 mA. Mikrosoczewka zwiększyła wydajność świetlną o 3,13 dB. Ze względu na układ mikrosoczewek, który wzmacnia sprzężenie światła, przyłożony prąd jest w przybliżeniu o połowę mniejszy niż prąd wyma...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zweryfikowano możliwość jednoczesnej stymulacji optogenetycznej i zapisu elektrofizjologicznego systemu (ryc. 6). Duże skoki podczas stymulacji świetlnej to artefakty fotoelektryczne występujące w tym samym czasie co stymulacja światłem (ryc. 6A). Jest to wyraźnie widoczne w powiększonym widoku przebiegu w czerwonym przerywanym prostokącie (Rysunek 6A). Jak pokazano na rysunku 6A, artefakty fotoelektryc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Convergent Technology R&D Program for Human Augmentation przez National Research Foundation of Korea (NRF), finansowane przez Ministerstwo Nauki i ICT (NRF-2019M3C1B8090805) i wspierane przez grant National Research Foundation of Korea (NRF) finansowany przez rząd Korei (MSIT) (nr 2019R1A2C1088909). Dziękujemy laboratorium Seung-Hee Lee na Wydziale Nauk Biologicznych, KAIST, Daejeon, Korea, za uprzejme dostarczenie transgenicznych myszy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Złącze 5-pinoweNW3HD127Kraster 1,27 mm (0,050")
BovieFine Science Tools(FST)18010-00Zestaw do kauteryzacji wysokotemperaturowej
Oprogramowanie do akwizycji danychIntan Technologies, LLCOprogramowanie karty interfejsu USBPraca z płytą interfejsu USB RHD
Dental CementLang Dental Manufacturing Company, Inc.1223CLRUżyj płynu Jet i proszku w pakiecie do naprawy protez strumieniowych
Ramię manipulatora cyfrowegoStoelting Co.51904/51906Lewy, prawy każdy cyfrowy ramię manipulatora, 3-osiowe, dodatkowa
pianka żelowaCutanplastStandard (70*50*10 mm)Sterylna, wchłanialna gąbka żelatynowa z efektem hemostatycznym
Przedwzmacniacz czołowyIntan Technologies, LLC16-kanałowe nagrywanie RHD Headstages
Poduszka grzewczaStoelting Co.53800RStoelting Ocieplacz na gryzonie X1 z podkładką grzewczą dla szczurów
LEDOSLONGB CS8PM1.13λ typ. 470 nm, Kąt widzenia 80 °, Napięcie przewodzenia 2.85 V
MATLABMathWorks, Inc.R2019a
Mikro zaciskSURGIWAY12-1002-04Typ prosty, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3,5 cm
ŚwiatłowódThorlabs, Inc.FT200UMT0,39 NA, Ø 200 &mikro; m Rdzeń Światłowód wielomodowy, wysoki OH dla
drutu wolframowego powlekanego PFASystem AMZamówienie niestandardowe Typpręta, Ø 101.6 μ m (.004")
FotodiodaThorlabsS121C
miernik mocyThorlabs Inc.PM100D
Precyzyjny tasakFITELS326Narzędzie do krajalnicy włókien
PrismGraphPad5.01 wersja
SkalpelFeather™#20Ostrze skalpela z uchwytem skalpela o długości 100 mm Śruba
stali nierdzewnejNasa Koreaśrednica: 1,2 mm, długość: 3 mm
Srebrny drutNilaco CorporationAG-401265Ø 200 µ m
Stereotaxic FxrameStoelting Co.51500DCyfrowy nowy standard stereotaktyczny szew dla szczurów i myszy
ETHICONW9106rozmiar szwu: 4-0, długość: 75 cm, średnica drutu: 4-0
WazelinaUnilever PLCOryginalna100% czysta wazelina naftowa
Wave_Clusniedotyczy
#C3314 300 - 1200 nm ze nie dotyczy https://github.com/csn-le/wave_clus

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Y., Liu, Y. Z., Wang, S. Y., Wang, Z. In vivo whole-cell recording with high success rate in anaesthetized and awake mammalian brains. Molecular Brain. 9 (1), 86(2016).
  2. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54024(2016).
  3. Lee, D., Shtengel, G., Osborne, J. E., Lee, A. K. Anesthetized- and awake-patched whole-cell recordings in freely moving rats using UV-cured collar-based electrode stabilization. Nature Protocols. 9 (12), 2784-2795 (2014).
  4. Tao, C., Zhang, G., Xiong, Y., Zhou, Y. Functional dissection of synaptic circuits: in vivo patch-clamp recording in neuroscience. Frontiers in Neural Circuits. 9, 23(2015).
  5. Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. Journal of Neurophysiology. 84 (1), 390-400 (2000).
  6. Takahashi, S., Anzai, Y., Sakurai, Y. Automatic sorting for multi-neuronal activity recorded with tetrodes in the presence of overlapping spikes. Journal of Neurophysiology. 89 (4), 2245-2258 (2003).
  7. Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neuroscience. 7 (5), 446-451 (2004).
  8. Rossant, C., et al. Spike sorting for large, dense electrode arrays. Nature Neuroscience. 19 (4), 634-641 (2016).
  9. Balasubramaniam, S., et al. Wireless communications for optogenetics-based brain stimulation: present technology and future challenges. IEEE Communications Magazine. 56 (7), 218-224 (2018).
  10. Bedbrook, C. N., et al. Machine learning-guided channelrhodopsin engineering enables minimally invasive optogenetics. Nature Methods. 16 (11), 1176-1184 (2019).
  11. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  12. Deng, W., Goldys, E. M., Farnham, M. M., Pilowsky, P. M. Optogenetics, the intersection between physics and neuroscience: light stimulation of neurons in physiological conditions. American journal of physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 307 (11), 1292-1302 (2014).
  13. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
  14. Mahmoudi, P., Veladi, H., Pakdel, F. G. Optogenetics, tools and applications in neurobiology. Journal of Medical Signals and Sensors. 7 (2), 71-79 (2017).
  15. Sasaki, Y., et al. Near-infrared optogenetic genome engineering based on photon-upconversion hydrogels. Angewandte Chemie International Edition in English. 58 (49), 17827-17833 (2019).
  16. Zhang, Y., et al. Battery-free, lightweight, injectable microsystem for in vivo wireless pharmacology and optogenetics. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (43), 21427-21437 (2019).
  17. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in Cognitive Sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
  18. Wang, J., et al. Integrated device for combined optical neuromodulation and electrical recording for chronic in vivo applications. Journal of Neural Engineering. 9 (1), 016001(2012).
  19. Royer, S., et al. Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal. European Journal of Neuroscience. 31 (12), 2279-2291 (2010).
  20. Zhang, J., et al. Integrated device for optical stimulation and spatiotemporal electrical recording of neural activity in light-sensitized brain tissue. Journal of Neural Engineering. 6 (5), 055007(2009).
  21. Park, S. I., et al. Stretchable multichannel antennas in soft wireless optoelectronic implants for optogenetics. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (50), 8169-8177 (2016).
  22. Kravitz, A. V., Owen, S. F., Kreitzer, A. C. Optogenetic identification of striatal projection neuron subtypes during in vivo recordings. Brain Research. 1511, 21-32 (2013).
  23. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
  24. Anikeeva, P., et al. Optetrode: a multichannel readout for optogenetic control in freely moving mice. Nature Neuroscience. 15 (1), 163-170 (2011).
  25. Obaid, S. N., et al. Multifunctional flexible biointerfaces for simultaneous colocalized optophysiology and electrophysiology. Advanced Functional Materials. 30 (24), 1910027(2020).
  26. Wang, L., et al. An artefact-resist optrode with internal shielding structure for low-noise neural modulation. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046024(2020).
  27. Shin, H., et al. Multifunctional multi-shank neural probe for investigating and modulating long-range neural circuits in vivo. Nature Communications. 10 (1), 3777(2019).
  28. Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystem & Nanoengineering. 4, 10(2018).
  29. Schwaerzle, M., Paul, O., Ruther, P. Compact silicon-based optrode with integrated laser diode chips, SU-8 waveguides and platinum electrodes for optogenetic applications. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (6), 065004(2017).
  30. Son, Y., et al. In vivo optical modulation of neural signals using monolithically integrated two-dimensional neural probe arrays. Scientific Reports. 5, 15466(2015).
  31. Yasunaga, H., et al. Development of a neural probe integrated with high-efficiency MicroLEDs for in vivo application. Japanese Journal of Applied Physics. 60 (1), 016503(2020).
  32. Kim, K., et al. Artifact-free and high-temporal-resolution in vivo opto-electrophysiology with microLED optoelectrodes. Nature Communications. 11 (1), 2063(2020).
  33. Mendrela, A. E., et al. A high-resolution opto-electrophysiology system with a miniature integrated headstage. IEEE Transactions on Biomedical Circuits and Systems. 12 (5), 1065-1075 (2018).
  34. Scharf, R., et al. Depth-specific optogenetic control in vivo with a scalable, high-density muLED neural probe. Scientific Reports. 6, 28381(2016).
  35. Oh, K., Sonsi, Y. -A., Ha, S. Optogenetic stimulator with µLED-coupled optical fiber on flexile substrate via 3D printed mount. 2021 21st International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (Transducers). , 1476-1479 (2021).
  36. McAlinden, N., et al. Multisite microLED optrode array for neural interfacing. Neurophotonics. 6 (3), 035010(2019).
  37. Kwon, K. Y., Lee, H. M., Ghovanloo, M., Weber, A., Li, W. Design, fabrication, and packaging of an integrated, wirelessly-powered optrode array for optogenetics application. Frontiers in Systems Neuroscience. 9, 69(2015).
  38. Bernstein, J. G., Allen, B. D., Guerra, A. A., Boyden, E. S. Processes for design, construction and utilisation of arrays of light-emitting diodes and light-emitting diode-coupled optical fibres for multi-site brain light delivery. Journal of Engineering. , Stevenage. (2015).
  39. Stark, E., Koos, T., Buzsaki, G. Diode probes for spatiotemporal optical control of multiple neurons in freely moving animals. Journal of Neurophysiology. 108 (1), 349-363 (2012).
  40. Jeon, S., et al. Implantable optrode array for optogenetic modulation and electrical neural recording. Micromachines. 12 (6), Basel. 725(2021).
  41. Song, Y. H., et al. A neural circuit for auditory dominance over visual perception. Neuron. 93 (4), 940-954 (2017).
  42. Fiáth, R., et al. Slow insertion of silicon probes improves the quality of acute neuronal recordings. Scientific Reports. 9 (1), 111(2019).
  43. Melchior, J. R., Ferris, M. J., Stuber, G. D., Riddle, D. R., Jones, S. R. Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release. Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).
  44. Quiroga, R. Q., Nadasdy, Z., Ben-Shaul, Y. Unsupervised spike detection and sorting with wavelets and superparamagnetic clustering. Neural Computation. 16 (8), 1661-1687 (2004).
  45. Chaure, F. J., Rey, H. G., Quian Quiroga, R. A novel and fully automatic spike-sorting implementation with variable number of features. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1859-1871 (2018).
  46. Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PLoS One. 9 (4), 94919(2014).
  47. Iseri, E., Kuzum, D. Implantable optoelectronic probes for in vivo optogenetics. Journal of Neural Engineering. 14 (3), 031001(2017).
  48. Arias-Gil, G., Ohl, F. W., Takagaki, K., Lippert, M. T. Measurement, modeling, and prediction of temperature rise due to optogenetic brain stimulation. Neurophotonics. 3 (4), 045007(2016).
  49. Jeon, S., et al. Multi-wavelength light emitting diode-based disposable optrode array for in vivo optogenetic modulation. Journal of Biophotonics. 12 (5), 201800343(2019).
  50. Korposh, S., James, S. W., Lee, S. -W., Tatam, R. P. Tapered optical fibre sensors: current trends and future perspectives. Sensors. 19 (10), 2294(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optrode ArrayOptogenetic ModulationNeural RecordingOptical StimulationElectrophysiological RecordingLED Light SourceMicrolens ArrayStereotactic SurgerySpike SortingWireless Optogenetics

Related Articles