Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Matryca optrodowa do jednoczesnej modulacji optogenetycznej i elektrycznego zapisu neuronowego

3.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63460

⸱

1 września 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electronic and Electrical Engineering, Ewha Womans University, 2Graduate Program in Smart Factory, Ewha Womans University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Seoul National University, 4Graduate School of Engineering Practice, Seoul National University, 5Department of Brain and Cognitive Sciences, Ewha Womans University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodę wytwarzania systemu optycznego ze światłowodami do dostarczania światła i matrycą elektrod do rejestracji neuronowej. Eksperymenty in vivo na transgenicznych myszach z ekspresją rodopsyny-2 pokazują wykonalność systemu do jednoczesnej stymulacji optogenetycznej i zapisu elektrofizjologicznego.

Streszczenie

W ciągu ostatniej dekady, optogenetyka stała się podstawowym narzędziem do badania sygnalizacji neuronalnej ze względu na jej unikalną zdolność do selektywnej modulacji lub monitorowania neuronów. Ponieważ określone typy komórek neuronalnych mogą być genetycznie modyfikowane w celu ekspresji białek opsyny, optogenetyka umożliwia stymulację optyczną lub hamowanie wybranych neuronów. W systemie optycznym dla optogenetyki dokonano kilku postępów technologicznych. Niedawno zaproponowano połączenie falowodu optycznego do dostarczania światła z zapisem elektrofizjologicznym w celu jednoczesnego monitorowania reakcji neuronalnych na stymulację lub hamowanie optogenetyczne. W tym badaniu opracowano wszczepialną matrycę optrodową (światłowody 2x2) z wbudowanymi elektrodami wielokanałowymi.

Jako źródło światła zastosowano diodę elektroluminescencyjną (LED), a mikrofabrykowany układ mikrosoczewek został zintegrowany, aby zapewnić wystarczającą moc światła na końcu światłowodów. System optrode array składa się z części jednorazowego użytku i części wielokrotnego użytku. Część jednorazowa posiada światłowody i elektrody, natomiast część wielokrotnego użytku posiada diodę LED i obwody elektroniczne do sterowania światłem i przetwarzania sygnałów neuronowych. Nowatorski projekt wszczepialnego systemu matrycy optycznej został przedstawiony w dołączonym filmie jako dodatek do procedury operacji implantacji optrodowej, optogenetycznej stymulacji światłem i elektrofizjologicznego zapisu neuronowego. Wyniki eksperymentów in vivo z powodzeniem wykazały zablokowane w czasie skoki nerwowe wywołane przez bodźce świetlne z neuronów pobudzających hipokampa myszy.

Wprowadzenie

Rejestrowanie i kontrolowanie aktywności neuronalnej jest niezbędne do zrozumienia, jak funkcjonuje mózg w sieci neuronowej i na poziomie komórkowym. Konwencjonalne metody zapisu elektrofizjologicznego obejmują zacisk krosowy1,2,3,4 za pomocą mikropipety i zapis zewnątrzkomórkowy za pomocą elektrod mikroneuronowych5,6,7,8. Jako metoda neuromodulacji, stymulacja elektryczna jest często stosowana do bezpośredniej stymulacji ogniskowego obszaru mózgu poprzez bezpośrednią lub pośrednią depolaryzację komórek neuronalnych. Jednak metoda elektryczna nie jest w stanie rozróżnić typów komórek neuronalnych do rejestracji lub stymulacji, ponieważ prądy elektryczne rozchodzą się we wszystkich kierunkach.

Jako rozwijająca się technologia, optogenetyka zapoczątkowała nową erę w zrozumieniu, jak działa układ nerwowy9,10,11,12,13,14,15,16. Istotą technik optogenetycznych jest wykorzystanie światła do kontrolowania aktywności wrażliwych na światło białek opsyny ulegających ekspresji w genetycznie zmodyfikowanych komórkach. W ten sposób optogenetyka umożliwia zaawansowaną modulację lub monitorowanie genetycznie wybranych komórek w skomplikowanych obwodach neuronowych14,17. Szersze zastosowanie podejścia optogenetycznego wymusiło jednoczesną rejestrację neuronalną w celu bezpośredniego potwierdzenia neuromodulacji optycznej. Dlatego niezwykle cenne byłoby zintegrowane urządzenie z funkcjami sterowania oświetleniem i nagrywania16,18,19,20,21,22,23,24,25.

Istnieją ograniczenia tradycyjnej, laserowej stymulacji optogenetycznej, która wymaga nieporęcznego i drogiego systemu dostarczania światła26,27,28,29,30. W związku z tym niektóre grupy badawcze zastosowały sondy krzemowe oparte na μLED, aby zminimalizować rozmiar systemu dostarczania światła31,32,33,34. Istnieje jednak ryzyko termicznego uszkodzenia mózgu spowodowanego bezpośrednim kontaktem z diodami μLED ze względu na niską wydajność konwersji energii diod LED. Falowody świetlne, takie jak światłowody, SU-8 i tlenoazotek krzemu (SiON), zostały zastosowane w celu uniknięcia uszkodzeń termicznych30,35,36,37,38,39. Jednak ta strategia ma również wadę ze względu na niską wydajność sprzężenia między źródłami światła a falowodami.

Matryca mikrosoczewek została wcześniej wprowadzona w celu zwiększenia efektywności sprzężenia światła między diodami LED a światłowodami40. W oparciu o technologie systemów mikroelektromechanicznych (MEMS) do stymulacji optycznej i rejestracji elektrycznej w mikroskali opracowano system optrodowy40. Układ mikrosoczewek pomiędzy diodą LED a światłowodami zwiększył wydajność świetlną o 3,13 dB. Jak pokazano na rysunku Rysunek 1, układ światłowodów 2x2 jest wyrównany na układzie mikrosoczewek 4x4, a dioda LED jest umieszczona poniżej układu mikrosoczewek. Światłowody 2x2 są montowane zamiast 4x4, aby zmniejszyć uszkodzenia mózgu. Układ elektrod wolframowych jest umieszczony w sąsiedztwie układu optrodowego za pomocą krzemu przez otwory do zapisu elektrofizjologicznego (Rysunek 1B).

System składa się z górnej części jednorazowej i odłączanej części dolnej. Górna jednorazowa część, która obejmuje matrycę światłowodową, matrycę mikrosoczewek i matrycę elektrod wolframowych, jest przeznaczona do trwałego wszczepienia do mózgu w celu eksperymentów in vivo. W dolnej części znajduje się źródło światła LED i zewnętrzna linia zasilająca, którą można łatwo zdemontować i ponownie wykorzystać do innego eksperymentu na zwierzętach. Dołączana plastikowa osłona chroni jednorazową część po wyjęciu zdejmowanej części.

Wykonalność systemu jest weryfikowana poprzez wszczepienie do mózgów transgenicznych myszy eksprymujących rodopsynę kanałową-2 (ChR2) w neuronach Ca2+/kinazy białkowej zależnej od kalmoduliny II-dodatnich (Mysz CaMKIIα::ChR2). Elektrody rejestrujące wykorzystano do rejestrowania aktywności neuronalnej poszczególnych neuronów podczas optycznej stymulacji neuronów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opieka nad zwierzętami oraz procedury chirurgiczne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na Ewha Womans University (nr 20-029).

1. Przygotowanie matrycy optrodowej (Rycina 1 i Rysunek 2)

  1. Mocowanie światłowodów do matrycy mikrosoczewek.
    1. Usuń powłokę pasywacyjną ze światłowodu i potnij go na odcinki o długości 5 mm za pomocą precyzyjnego przecinaka do światłowodów.
    2. Zanurz światłowód w przezroczystej żywicy UV, a następnie umieść światłowody na matrycy mikrosoczewek.
    3. Utwardź żywicę za pomocą lampy UV.
    4. Przymocuj matrycę mikrosoczewek do obudowy wydrukowanej w technologii 3D za pomocą żywicy epoksydowej.
  2. Wyrównywanie drutów wolframowych powlekanych perfluoroalkoksydem (PFA).
    1. Przylutuj 4 odcinki drutów wolframowych PFA o długości 30 mm oraz 1 srebrny drut do 5-pinowego gniazda żeńskiego o skoku 1,27 mm. Drut srebrny wykorzystaj jako elektrodę odniesienia.
    2. Podłącz gniazdo żeńskie o skoku 1,27 mm do przedwzmacniacza głowicy (headstage).
    3. Ostrożnie przeprowadź druty wolframowe przez otwory w silikonie (Rysunek 1B>, aby ułatwić precyzyjne wyrównanie elektrod wolframowych.
    4. Przytnij wyrównane druty wolframowe tak, aby były o 1 mm krótsze od długości światłowodu.
    5. Przymocuj złącze do obudowy wydrukowanej w technologii 3D za pomocą żywicy epoksydowej.
  3. Umieszczanie diod LED
    1. Umieść diodę LED w obudowie wydrukowanej w technologii 3D.
    2. Podłącz diodę LED do obwodu sterującego generującego modulację szerokości impulsu (PWM).
      UWAGA: Impuls PWM jest generowany przez mikrokontroler.
    3. Ze względu na szumy indukowane przez obwód sterujący LED, należy upewnić się, że elektrody rejestrujące znajdują się w odległości 50 mm od obwodu sterującego LED.
    4. Zmierz natężenie światła na końcu końcówki światłowodu za pomocą fotodiody.
  4. Zanurz elektrody wolframowe i światłowody w alkoholu na 15 min. Następnie zanurz system w sterylnej wodzie dejonizowanej (D.I water) i wysterylizuj tlenkiem etylenu.

2. Operacja implantacji (Rysunek 3 i Rysunek 4)

UWAGA: Podczas operacji należy przestrzegać zasad techniki sterylnej.

  1. Przygotuj zwierzęta transgeniczne, które zostały zmodyfikowane genetycznie w celu ekspresji światłoczułych białek opsyn w konkretnym typie komórek neuronalnych.
    UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano samca transgenicznej myszy w wieku 2 miesięcy, wykazującego ekspresję kanałorodopsyny-2 (ChR2) w neuronach dodatnich dla kinazy białkowej II zależnej od Ca2+/kalmoduliny (mysz CaMKIIα::ChR2)41.
  2. Zanurz mysz w narkozie, podając dootrzewnowo koktajl ketaminy z ksylazyną – mieszaninę ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg).
    1. Sprawdzaj stan znieczulonego zwierzęcia co 30 min, monitorując ruchy wibrysów oraz reakcję na uciśnięcie łapy.
    2. W razie potrzeby pogłębienia narkozy wstrzyknij koktajl ketaminy z ksylazyną w połowie dawki początkowej.
  3. Wygol skórę głowy i umieść znieczuloną mysz w aparacie stereotaktycznym.
    UWAGA: Przeprowadź chirurgiczne przygotowanie skóry i obłóż zwierzę sterylnymi materiałami. Przygotowanie skóry obejmuje usunięcie owłosienia, a następnie oczyszczenie skóry środkami przeciwdrobniczymi.
    1. Ustaw głowę w aparacie stereotaktycznym i wprowadź pręty uszne do kanałów słuchowych.
    2. Wycentruj głowę myszy w aparacie stereotaktycznym, wielokrotnie luzując i dokręcając pręty uszne w celu precyzyjnego ustawienia.
    3. Umieść pręt do siekaczy tak, aby górne siekacze zahaczyły o przednią wewnętrzną krawędź.
    4. Wyreguluj pręt do siekaczy, aby ustawić jego wysokość, a następnie dokręć zacisk nosowy na pysku.
    5. Włącz wcześniej wbudowaną w aparat stereotaktyczny matę grzewczą, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C podczas wszystkich procedur chirurgicznych.
    6. Wprowadź sondę termiczną do odbytnicy myszy w celu regulacji homeotermicznej.
      UWAGA: Należy sprawdzić stabilność prętów usznych, delikatnie chwytając i kołysząc pyszkiem. Pręty uszne muszą zostać ponownie wyregulowane, jeśli pyszczek przemieszcza się lateralnie o więcej niż ~4 mm.
  4. Przykryj oczy wazeliną (patrz Tabela materiałów), aby zapobiec ich wysychaniu.
  5. Wstrzyknij 1% lidokainy w skórę głowy. Unieś skórę głowy pęsetą, zabezpiecz przestrzeń do iniekcji i wstrzyknij lidokainę pod skórę.
  6. Wykonaj nacięcie strzałkowe za pomocą skalpela i cienkich nożyczek. Odciągnij naciętą skórę mikroklemą, aby zwiększyć widoczność pola operacyjnego.
    UWAGA: Długość nacięcia wynosi <1 cm powyżej bregmy i krawędzi ogonowej kości międzyparietalnej.
  7. Usuń okostną za pomocą patyczków bawełnianych. W przypadku krwawienia przyżeg zespół czaszki za pomocą elektrokoagulatora Bovie, aby zamknąć naczynia krwionośne.
  8. Oczyść czaszkę solą fizjologiczną i zaznacz miejsca kraniotomii za pomocą ramienia manipulatora: hipokamp w osi przednio-tylnej (AP) −1.8 do −2.8 mm, w osi przyśrodkowej-bocznej (ML) 0.5-2.5 mm oraz w osi grzbietowo-brzusznej (DV) −1 do −2 mm.
    UWAGA: Biorąc pod uwagę grubość czaszki myszy, wprowadź macierz optrodową na głębokość -1.2 do -2.2 mm od odsłoniętego obszaru mózgu. Z uwagi na przebieg dróg hipokampa, komórki piramidowe pola CA3 przesyłają aksony do CA1. Dlatego włókna światłowodowe są o 1 mm dłuższe niż elektrody rejestrujące, tak aby światłowody znajdowały się w CA3, a elektrody rejestrujące w CA1.
  9. Wywierć otwór nad móżdżkiem i wprowadź śrubę uziemiającą. Wkręć śrubę uziemiającą na głębokość 0.5 mm za pomocą wkrętaka precyzyjnego, aż dotrze ona do górnej części móżdżku.
    UWAGA: Należy zapewnić ciasne osadzenie śruby, która posłuży jako elektroda uziemiająca i struktura wsporcza w celu maksymalizacji długoterminowej stabilności implantacji, ponieważ zwiększa ona trójwymiarową powierzchnię przylegania cementu dentystycznego.
  10. Wywierć otwór w zaznaczonym obszarze i usuń fragment czaszki pęsetą.
  11. Zegnij końcówkę igły 26 G zgodnie z ruchem wskazówek zegara o 120° i odsłoń obszar mózgu, wprowadzając igłę ściętą stroną skierowaną do góry. Należy uważać, aby nie uszkodzić mózgu i naczyń krwionośnych.
  12. Oczyść odsłonięty mózg solą fizjologiczną, aby wypłukać pył kostny i zanieczyszczenia.
  13. Zamocuj macierz optrodową w ramieniu manipulatora i zbliż ją do odsłoniętego obszaru.
    UWAGA: Podczas umieszczania urządzenia ponowne przeliczenie obszaru docelowego od bregmy może zwiększyć dokładność pozycjonowania.
  14. Powoli wprowadź macierz optrodową i połącz śrubę uziemiającą ze srebrnym drutem podłączonym do systemu42.
    UWAGA: W tym procesie macierz musi być sztywno zamocowana do ramienia manipulatora, aby zminimalizować chwianie się i zapobiec uszkodzeniu mózgu w wyniku mikroruchów podczas wprowadzania. Wprowadzanie należy przeprowadzać powoli, z 10-minutową przerwą, aby uwzględnić obrzęk mózgu, który mógł zostać uciśnięty po insercji. Dla uzyskania wysokiej jakości stosunku sygnału do szumu oraz liczby separowalnych jednostek pojedynczych zaleca się prędkość wprowadzania do tkanki mózgowej poniżej 1 µm/s42.
  15. W przypadku krwawienia wywrzyj bezpośredni ucisk na krwawiące miejsca suchym patyczkiem bawełnianym lub zastosuj kauteryzację. Nie przechodź do kolejnych kroków, dopóki krwawienie nie zostanie całkowicie zatrzymane.
  16. Wprowadź gąbkę żelową między odsłonięty mózg a urządzenie, aby chronić tkankę przed bezpośrednim kontaktem z substancjami chemicznymi.
    UWAGA: Gąbka żelowa wspomaga również hemostazę i utrzymuje wilgotność mózgu.
  17. Wytrzyj czaszkę patyczkami bawełnianymi, aby maksymalnie usunąć wilgoć, i przejdź do następnego etapu mocowania.
  18. Ostrożnie nałóż cement dentystyczny na czaszkę, aby zamocować urządzenie i przykryć gąbkę żelową. Przed całkowitym utwardzeniem cementu dentystycznego oddziel skórę głowy, jeśli przywarła do cementu. Odciągnij naciętą skórę pęsetą, aby przykryć stwardniały cement i zaszyj skórę głowy. Następnie zwolnij urządzenie z ramienia manipulatora.
    UWAGA: Upewnij się, że cement dentystyczny nie przykleił się do skóry i pokrywa jedynie obszar czaszki. W miarę wzrostu skóry cement może zostać odepchnięty, co w konsekwencji doprowadzi do wypadnięcia urządzenia. Stworzy to krytyczny problem w długoterminowych eksperymentach in vivo.

3. Rekonwalescencja i pielęgnacja implantu

  1. Wyjąć mysz z zestawu stereotaktycznego.
  2. Podać roztwór karprofenu za pomocą igły 26 G. Wstrzyknąć jednokrotnie przed operacją oraz 12 h (następnego ranka w przypadku operacji popołudniowej) i 24 h po operacji w celu zmniejszenia bólu.
    UWAGA: Stężenie leku w butelce wynosi 50 mg/mL, a lek jest przechowywany w temperaturze 4 °C. Karprofen jest lepki i wymaga rozcieńczenia w wodzie sterylnej w stosunku 1:10. Jeśli zachowana zostanie sterylność, roztwór można przechowywać do 4 tygodni. Aby utrzymać skuteczność leku, roztwór karprofenu należy wstrzykiwać w odstępach 12 h.
  3. Umieścić mysz na macie grzewczej i sprawdzić, czy prawidłowo budzi się z narkozy.
    UWAGA: Zwierzę nie może pozostać bez nadzoru, dopóki nie odzyska wystarczającej świadomości.
  4. Usunąć nici chirurgiczne 7–10 dni po operacji.
  5. Pozostawić zwierzę do rekonwalescencji na 1 tydzień. Monitorować spożycie pokarmu i wody w czasie rekonwalescencji. Podawać lek przeciwbólowy i sprawdzać pod kątem objawów dyskomfortu lub bólu.
    UWAGA: Zwierzęta po operacji nie mogą przebywać z innymi zwierzętami do czasu pełnego wyzdrowienia.
    1. W okresie rekonwalescencji codziennie ważyć mysz, aby kontrolować zmiany masy ciała. Uśmiercić mysz (patrz sekcja 6) w przypadku utraty 20% masy ciała w porównaniu do zwierząt kontrolnych dopasowanych pod względem wieku i płci.

4. Stymulacja optogenetyczna i rejestracja elektrofizjologiczna

  1. Zpodaj myszy znieczulenie i umieść ją w aparacie stereotaktycznym.
  2. Ustaw parametry stymulacji.
    1. Ustaw cykl pracy impulsu świetlnego na 4% i częstotliwość na 10 Hz43. Zaprogramuj stymulację świetlną na 2 s (20 impulsów) podczas rejestracji sygnałów neuronalnych.
    2. Użyj prądu 50 mA, aby uzyskać natężenie światła 3 mW/mm2 na końcówce włókna optycznego. Zmierz moc światła za pomocą fotodiody i watomierza, a następnie podziel moc światła przez powierzchnię czoła włókna optycznego.
  3. Zdejmij plastikową osłonę i zamocuj górną część zawierającą system dostarczania światła z wielorazową diodą LED i układami elektronicznymi.
  4. Podłącz przedwzmacniacz headstage do wszczepionego złącza 5-pinowego.
  5. Uruchom oprogramowanie do rejestracji sygnałów neuronalnych.
  6. Skonfiguruj filtry w oprogramowaniu. Użyj filtra pasmowo-przepustowego w zakresie 0,1-20 kHz oraz filtra notch na 60 Hz. Ustaw częstotliwość próbkowania wzmacniacza na 20 kHz.
  7. Przed rozpoczęciem rejestracji sprawdź, czy wykrywane są sygnały impulsowe (spike'y) neuronów.
    UWAGA: Redukcja szumów jest istotna, ponieważ sygnały neuronalne są bardzo słabe. Jeśli poziom szumów będzie zbyt wysoki, sygnały neuronalne mogą zostać przez nie zamaskowane i stać się niewidoczne. Aby zredukować szum, zastosuj odpowiednie uziemienie i ekranowanie przed falami elektromagnetycznymi.
  8. Po sprawdzeniu sygnału zarejestruj sygnały neuronalne bez stymulacji świetlnej w celu uzyskania pomiaru bazowego.
  9. Dostarcz światło LED i jednocześnie rejestruj odpowiedzi neuronalne (Rycina 5 i Rycina 6).
    ​UWAGA: Po przeprowadzeniu stymulacji kolejny eksperyment stymulacyjny musi zostać wykonany po przerwie wynoszącej co najmniej 5 min, aby aktywność neuronalna wywołana poprzednią stymulacją nie wpływała na następny pomiar.

5. Analiza danych

  1. Wczytaj pozyskane dane za pomocą programu MATLAB.
  2. Uzyskaj aktywność pojedynczych neuronów, wykorzystując algorytm sortowania impulsów (spike sorting) „Wave-Clus“44,45. Wykryj impulsy w każdym kanale, stosując próg amplitudy zgodnie z równaniem (1)45.
    Próg = 5 × median Formuła ułamka |x|/0,6745 w ilustracji wyrażenia matematycznego. (1)
    ​Gdzie x to sygnał przefiltrowany filtrem pasmowym.
    1. Aby zainstalować program „Wave-Clus”, skorzystaj z linku do pobierania znajdującego się w Tabeli materiałów.
    2. Aby otworzyć graficzny interfejs użytkownika (GUI), wpisz wave_clus w wierszu poleceń programu MATLAB.
    3. Użyj funkcji Get_spikes('filename.ext') dla rozszerzenia pliku przygotowanego do detekcji impulsów. Następnie uruchom Do_clustering('filename_spikes.mat') w celu sortowania impulsów.
  3. Policz posortowane impulsy przed, w trakcie i po stymulacji światłem, stosując określone przedziały czasowe (time bins). Do analizy wykorzystaj przedziały czasowe 0,2 s oraz 2 s.
  4. Przedstaw na wykresie liczbę impulsów z każdego kanału rejestracji.
    UWAGA: Obliczono i naniesiono na wykres średnią wraz ze standardowym błędem średniej (SEM) danych z wyników 8 powtórzeń eksperymentu.

6. Eutanazja

  1. Po zakończeniu wszystkich eksperymentów uśmierć mysz poprzez inhalację dwutlenkiem węgla (CO2).
  2. Bez wcześniejszego napełniania komory umieść mysz w przezroczystej komorze do eutanazji, bez dopływu CO2 i/lub wycieków.
  3. Włącz dopływ gazu CO2 i wypieraj powietrze z prędkością 30–50% objętości powietrza w komorze do eutanazji na minutę.
    UWAGA: Do butli z gazem CO2 musi być podłączony przepływomierz, aby zapewnić, że szybkość wypierania powietrza wynosi 30–50% objętości komory do eutanazji na minutę.
  4. Obserwuj uśmiercaną mysz pod kątem ustania oddechu i zmiany koloru oczu.
    UWAGA: Przewidywany czas eutanazji wynosi zazwyczaj od 10 do 15 min.
  5. Po zaobserwowaniu oznak śmierci wyjmij mysz z komory do eutanazji.
  6. Aby zakończyć procedurę eutanazji, zweryfikuj zgon, potwierdzając zatrzymanie oddechu i akcji serca.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

System optrody został pomyślnie wykonany w sposób zapewniający wystarczającą moc światła do aktywacji docelowych neuronów. Precyzyjne wyrównanie elektrod wolframowych osiągnięto dzięki mikrofabrykowanemu krzemowi za pomocą otworów. Zmierzona intensywność światła na końcówce światłowodu wynosiła 3,6 mW/mm2 przy przyłożonym prądzie 50 mA. Mikrosoczewka zwiększyła wydajność świetlną o 3,13 dB. Dzięki zastosowaniu matrycy mikrosoczewek, która poprawia sprzężenie światła, przyłożony prąd stanowi około połowy prądu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zweryfikowano możliwość jednoczesnej stymulacji optogenetycznej i zapisu elektrofizjologicznego systemu (ryc. 6). Duże skoki podczas stymulacji świetlnej to artefakty fotoelektryczne występujące w tym samym czasie co stymulacja światłem (ryc. 6A). Jest to wyraźnie widoczne w powiększonym widoku przebiegu w czerwonym przerywanym prostokącie (Rysunek 6A). Jak pokazano na rysunku 6A, artefakty fotoelektryc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Convergent Technology R&D Program for Human Augmentation przez National Research Foundation of Korea (NRF), finansowane przez Ministerstwo Nauki i ICT (NRF-2019M3C1B8090805) i wspierane przez grant National Research Foundation of Korea (NRF) finansowany przez rząd Korei (MSIT) (nr 2019R1A2C1088909). Dziękujemy laboratorium Seung-Hee Lee na Wydziale Nauk Biologicznych, KAIST, Daejeon, Korea, za uprzejme dostarczenie transgenicznych myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Złącze 5-pinoweNW3HD127Kraster 1,27 mm (0,050")
BovieFine Science Tools(FST)18010-00Zestaw do kauteryzacji wysokotemperaturowej
Oprogramowanie do akwizycji danychIntan Technologies, LLCOprogramowanie karty interfejsu USBPraca z płytą interfejsu USB RHD
Dental CementLang Dental Manufacturing Company, Inc.1223CLRUżyj płynu Jet i proszku w pakiecie do naprawy protez strumieniowych
Ramię manipulatora cyfrowegoStoelting Co.51904/51906Lewy, prawy każdy cyfrowy ramię manipulatora, 3-osiowe, dodatkowa
pianka żelowaCutanplastStandard (70*50*10 mm)Sterylna, wchłanialna gąbka żelatynowa z efektem hemostatycznym
Przedwzmacniacz czołowyIntan Technologies, LLC16-kanałowe nagrywanie RHD Headstages
Poduszka grzewczaStoelting Co.53800RStoelting Ocieplacz na gryzonie X1 z podkładką grzewczą dla szczurów
LEDOSLONGB CS8PM1.13λ typ. 470 nm, Kąt widzenia 80 °, Napięcie przewodzenia 2.85 V
MATLABMathWorks, Inc.R2019a
Mikro zaciskSURGIWAY12-1002-04Typ prosty, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3,5 cm
ŚwiatłowódThorlabs, Inc.FT200UMT0,39 NA, Ø 200 &mikro; m Rdzeń Światłowód wielomodowy, wysoki OH dla
drutu wolframowego powlekanego PFASystem AMZamówienie niestandardowe Typpręta, Ø 101.6 μ m (.004")
FotodiodaThorlabsS121C
miernik mocyThorlabs Inc.PM100D
Precyzyjny tasakFITELS326Narzędzie do krajalnicy włókien
PrismGraphPad5.01 wersja
SkalpelFeather™#20Ostrze skalpela z uchwytem skalpela o długości 100 mm Śruba
stali nierdzewnejNasa Koreaśrednica: 1,2 mm, długość: 3 mm
Srebrny drutNilaco CorporationAG-401265Ø 200 µ m
Stereotaxic FxrameStoelting Co.51500DCyfrowy nowy standard stereotaktyczny szew dla szczurów i myszy
ETHICONW9106rozmiar szwu: 4-0, długość: 75 cm, średnica drutu: 4-0
WazelinaUnilever PLCOryginalna100% czysta wazelina naftowa
Wave_Clusniedotyczy
#C3314 300 - 1200 nm ze nie dotyczy https://github.com/csn-le/wave_clus

Bibliografia

  1. Wang, Y., Liu, Y. Z., Wang, S. Y., Wang, Z. In vivo whole-cell recording with high success rate in anaesthetized and awake mammalian brains. Molecular Brain. 9 (1), 86(2016).
  2. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54024(2016).
  3. Lee, D., Shtengel, G., Osborne, J. E., Lee, A. K. Anesthetized- and awake-patched whole-cell recordings in freely moving rats using UV-cured collar-based electrode stabilization. Nature Protocols. 9 (12), 2784-2795 (2014).
  4. Tao, C., Zhang, G., Xiong, Y., Zhou, Y. Functional dissection of synaptic circuits: in vivo patch-clamp recording in neuroscience. Frontiers in Neural Circuits. 9, 23(2015).
  5. Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. Journal of Neurophysiology. 84 (1), 390-400 (2000).
  6. Takahashi, S., Anzai, Y., Sakurai, Y. Automatic sorting for multi-neuronal activity recorded with tetrodes in the presence of overlapping spikes. Journal of Neurophysiology. 89 (4), 2245-2258 (2003).
  7. Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neuroscience. 7 (5), 446-451 (2004).
  8. Rossant, C., et al. Spike sorting for large, dense electrode arrays. Nature Neuroscience. 19 (4), 634-641 (2016).
  9. Balasubramaniam, S., et al. Wireless communications for optogenetics-based brain stimulation: present technology and future challenges. IEEE Communications Magazine. 56 (7), 218-224 (2018).
  10. Bedbrook, C. N., et al. Machine learning-guided channelrhodopsin engineering enables minimally invasive optogenetics. Nature Methods. 16 (11), 1176-1184 (2019).
  11. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  12. Deng, W., Goldys, E. M., Farnham, M. M., Pilowsky, P. M. Optogenetics, the intersection between physics and neuroscience: light stimulation of neurons in physiological conditions. American journal of physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 307 (11), 1292-1302 (2014).
  13. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
  14. Mahmoudi, P., Veladi, H., Pakdel, F. G. Optogenetics, tools and applications in neurobiology. Journal of Medical Signals and Sensors. 7 (2), 71-79 (2017).
  15. Sasaki, Y., et al. Near-infrared optogenetic genome engineering based on photon-upconversion hydrogels. Angewandte Chemie International Edition in English. 58 (49), 17827-17833 (2019).
  16. Zhang, Y., et al. Battery-free, lightweight, injectable microsystem for in vivo wireless pharmacology and optogenetics. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (43), 21427-21437 (2019).
  17. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in Cognitive Sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
  18. Wang, J., et al. Integrated device for combined optical neuromodulation and electrical recording for chronic in vivo applications. Journal of Neural Engineering. 9 (1), 016001(2012).
  19. Royer, S., et al. Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal. European Journal of Neuroscience. 31 (12), 2279-2291 (2010).
  20. Zhang, J., et al. Integrated device for optical stimulation and spatiotemporal electrical recording of neural activity in light-sensitized brain tissue. Journal of Neural Engineering. 6 (5), 055007(2009).
  21. Park, S. I., et al. Stretchable multichannel antennas in soft wireless optoelectronic implants for optogenetics. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (50), 8169-8177 (2016).
  22. Kravitz, A. V., Owen, S. F., Kreitzer, A. C. Optogenetic identification of striatal projection neuron subtypes during in vivo recordings. Brain Research. 1511, 21-32 (2013).
  23. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
  24. Anikeeva, P., et al. Optetrode: a multichannel readout for optogenetic control in freely moving mice. Nature Neuroscience. 15 (1), 163-170 (2011).
  25. Obaid, S. N., et al. Multifunctional flexible biointerfaces for simultaneous colocalized optophysiology and electrophysiology. Advanced Functional Materials. 30 (24), 1910027(2020).
  26. Wang, L., et al. An artefact-resist optrode with internal shielding structure for low-noise neural modulation. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046024(2020).
  27. Shin, H., et al. Multifunctional multi-shank neural probe for investigating and modulating long-range neural circuits in vivo. Nature Communications. 10 (1), 3777(2019).
  28. Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystem & Nanoengineering. 4, 10(2018).
  29. Schwaerzle, M., Paul, O., Ruther, P. Compact silicon-based optrode with integrated laser diode chips, SU-8 waveguides and platinum electrodes for optogenetic applications. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (6), 065004(2017).
  30. Son, Y., et al. In vivo optical modulation of neural signals using monolithically integrated two-dimensional neural probe arrays. Scientific Reports. 5, 15466(2015).
  31. Yasunaga, H., et al. Development of a neural probe integrated with high-efficiency MicroLEDs for in vivo application. Japanese Journal of Applied Physics. 60 (1), 016503(2020).
  32. Kim, K., et al. Artifact-free and high-temporal-resolution in vivo opto-electrophysiology with microLED optoelectrodes. Nature Communications. 11 (1), 2063(2020).
  33. Mendrela, A. E., et al. A high-resolution opto-electrophysiology system with a miniature integrated headstage. IEEE Transactions on Biomedical Circuits and Systems. 12 (5), 1065-1075 (2018).
  34. Scharf, R., et al. Depth-specific optogenetic control in vivo with a scalable, high-density muLED neural probe. Scientific Reports. 6, 28381(2016).
  35. Oh, K., Sonsi, Y. -A., Ha, S. Optogenetic stimulator with µLED-coupled optical fiber on flexile substrate via 3D printed mount. 2021 21st International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (Transducers). , 1476-1479 (2021).
  36. McAlinden, N., et al. Multisite microLED optrode array for neural interfacing. Neurophotonics. 6 (3), 035010(2019).
  37. Kwon, K. Y., Lee, H. M., Ghovanloo, M., Weber, A., Li, W. Design, fabrication, and packaging of an integrated, wirelessly-powered optrode array for optogenetics application. Frontiers in Systems Neuroscience. 9, 69(2015).
  38. Bernstein, J. G., Allen, B. D., Guerra, A. A., Boyden, E. S. Processes for design, construction and utilisation of arrays of light-emitting diodes and light-emitting diode-coupled optical fibres for multi-site brain light delivery. Journal of Engineering. , Stevenage. (2015).
  39. Stark, E., Koos, T., Buzsaki, G. Diode probes for spatiotemporal optical control of multiple neurons in freely moving animals. Journal of Neurophysiology. 108 (1), 349-363 (2012).
  40. Jeon, S., et al. Implantable optrode array for optogenetic modulation and electrical neural recording. Micromachines. 12 (6), Basel. 725(2021).
  41. Song, Y. H., et al. A neural circuit for auditory dominance over visual perception. Neuron. 93 (4), 940-954 (2017).
  42. Fiáth, R., et al. Slow insertion of silicon probes improves the quality of acute neuronal recordings. Scientific Reports. 9 (1), 111(2019).
  43. Melchior, J. R., Ferris, M. J., Stuber, G. D., Riddle, D. R., Jones, S. R. Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release. Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).
  44. Quiroga, R. Q., Nadasdy, Z., Ben-Shaul, Y. Unsupervised spike detection and sorting with wavelets and superparamagnetic clustering. Neural Computation. 16 (8), 1661-1687 (2004).
  45. Chaure, F. J., Rey, H. G., Quian Quiroga, R. A novel and fully automatic spike-sorting implementation with variable number of features. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1859-1871 (2018).
  46. Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PLoS One. 9 (4), 94919(2014).
  47. Iseri, E., Kuzum, D. Implantable optoelectronic probes for in vivo optogenetics. Journal of Neural Engineering. 14 (3), 031001(2017).
  48. Arias-Gil, G., Ohl, F. W., Takagaki, K., Lippert, M. T. Measurement, modeling, and prediction of temperature rise due to optogenetic brain stimulation. Neurophotonics. 3 (4), 045007(2016).
  49. Jeon, S., et al. Multi-wavelength light emitting diode-based disposable optrode array for in vivo optogenetic modulation. Journal of Biophotonics. 12 (5), 201800343(2019).
  50. Korposh, S., James, S. W., Lee, S. -W., Tatam, R. P. Tapered optical fibre sensors: current trends and future perspectives. Sensors. 19 (10), 2294(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

stymulacja optycznarejestracja elektrofizjologicznar d o wiat a LEDmatryca mikrosoczewekchirurgia stereotaktycznasortowanie impuls wbezprzewodowa optogenetyka
Matryca optrodowa do jednoczesnej modulacji optogenetycznej i elektrycznego zapisu neuronowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.