Izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy

Podsumowanie

Intensywne przygotowanie nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu myszy z tętniczek miąższowych mózgu jest zilustrowane do badania regulacji przepływu krwi w mózgu. Ponadto pokazujemy eksperymentalne mocne strony tego modelu badania śródbłonka do obrazowania fluorescencyjnego i pomiaru elektrofizjologii kluczowych szlaków sygnalizacji komórkowej, w tym zmian wewnątrzkomórkowych [Ca²⁺] i potencjału błonowego.

Streszczenie

Przepływ krwi w mózgu jest przenoszony przez tętnice oporowe naczyniowe i znajdujące się poniżej tętniczki miąższowe. Opór naczyniowy w stanie ustalonym na przepływ krwi wzrasta wraz ze zmniejszaniem się średnicy od tętnic do tętniczek, które ostatecznie zasilają naczynia włosowate. Ze względu na ich mniejszy rozmiar i umiejscowienie w miąższu, tętniczki były stosunkowo słabo zbadane i miały mniejszą odtwarzalność wyników niż tętnice powierzchniowe. Niezależnie od tego, struktura i funkcja komórek śródbłonka tętniczek - integralna część fizjologii i etiologii przewlekłych chorób zwyrodnieniowych - wymaga szeroko zakrojonych badań. W szczególności pojawiające się dowody wskazują, że upośledzona funkcja śródbłonka poprzedza i nasila upośledzenie funkcji poznawczych i demencję.

W mikrokrążeniu miąższowym, funkcja kanału K⁺ w śródbłonku jest najmocniejszym bodźcem do precyzyjnego kontrolowania rozprzestrzeniania się rozszerzenia naczyń krwionośnych, aby promować wzrost przepływu krwi do obszarów aktywności neuronalnej. Niniejsza praca ilustruje udoskonaloną metodę świeżo izolowanej nienaruszonej i elektrycznie sprzężonej "rurek" śródbłonka (średnica, ~25 μm) z tętniczek miąższowych mózgu myszy. Śródbłonek tętnic jest zabezpieczany w warunkach fizjologicznych (37 °C, pH 7,4) w celu rozwiązania zmiennych eksperymentalnych, które obejmują funkcję kanału K ⁺ i ich regulację, w tym wewnątrzkomórkową dynamikę Ca^{2 +}, zmiany potencjału błonowego i regulację lipidów błonowych. Wyraźną zaletą techniczną w porównaniu ze śródbłonkiem tętniczym jest zwiększona rozdzielczość morfologiczna wymiarów komórek i organelli (np. mitochondriów), co zwiększa użyteczność tej techniki. Zdrowa perfuzja mózgowa przez całe życie pociąga za sobą silną funkcję śródbłonka w tętniczkach miąższowych, bezpośrednio łącząc przepływ krwi z napędzaniem aktywności neuronalnej i glejowej w precyzyjnych obszarach anatomicznych mózgu. W związku z tym oczekuje się, że metoda ta znacznie poszerzy ogólną wiedzę na temat fizjologii naczyń krwionośnych i neurologii dotyczącej zdrowego i chorego mózgu.

Wprowadzenie

Tętniczki miąższowe bezpośrednio dostarczają niezbędny tlen i składniki odżywcze do mózgu¹. Podczas interakcji z naczyniami włosowatymi, wysoce wazoaktywne tętniczki reagują na sygnalizację wsteczną inicjowaną przez kapilarne kanały jonowe, które wykrywają sygnały metaboliczne z określonych regionów neuronalnych². W związku z tym, że miąższ mózgu był historycznie przedmiotem większości badań, teraz pojawiła się rola dysfunkcji śródbłonka w wyjaśnianiu mechanizmów patologicznych związanych z różnymi zaburzeniami naczyniowo-mózgowymi, które leżą u podstaw demencji (np. udar niedokrwienny, choroba Alzheimera)^3,4,5,6. Śródbłonek jest integralną częścią perfuzji mózgu zgodnie z heterogenicznością genetyki, struktury i funkcji w wszystkich segmentach naczyniowych⁷. Tętnice Pial zostały szeroko przebadane ze względu na ich stosunkowo duży rozmiar, wysoki odcinkowy opór naczyniowy i rolę w dystrybucji przepływu krwi do leżącego poniżej mózgu^8,9. W związku z tym lepsze zrozumienie mechanizmów śródbłonka tętniczek prawdopodobnie przyczyni się do lepszego zrozumienia regulacji przepływu krwi w mózgu w zdrowiu i chorobie w kierunku opracowania nowych schematów terapeutycznych.

Pojawiające się dowody podkreślają znaczenie badania tętniczek miąższowych w odniesieniu do różnych szlaków sygnałowych i chorób^8,10. Jednak podejście to zostało ograniczone do użycia nienaruszonych preparatów tętniczki ciśnieniowej¹¹ i/lub preparatów do tętniczek kapilarno-miąższowych (CaPA)¹². Świeżo wyizolowane, natywne komórki śródbłonka tętniczek mózgowych pozbawione innych typów komórek i czynników zakłócających nie zostały zbadane, prawdopodobnie z powodu trudności technicznych w ich izolacji. W tym artykule rozwinięto poprzednią technikę podkreślającą izolację śródbłonka tętniczego tętniczego pialnego¹³, aby teraz niezawodnie i powtarzalnie izolować śródbłonek tętniczek miąższowych mózgu (szerokość: ~25 μm, długość: ~250 μm). Technika ta pomaga osiągnąć optymalną rozdzielczość elektrycznie i chemicznie sprzężonych komórek w ich indywidualnej orientacji i sieciach komórkowych.

Kluczowe interesujące szlaki obejmowały interakcję wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i) oraz hiperpolaryzację potencjału błonowego (V_m)^14,15—integralna z rozszerzeniem naczyń krwionośnych¹⁶—aby umożliwić krew wejście do naczyń włosowatych i dostarczenie tlenu i składników odżywczych do aktywnego miąższu¹⁷. Preparaty te pozwalają na elektrofizjologiczne zapisy kanałów jonowych, w tym kanałów przepuszczalnych dla^Ca2+, przejściowego potencjału receptorowego (TRP) i K⁺ i/lub obrazowanie fluorescencyjne organelli wewnątrzkomórkowych w rurkach komórek śródbłonka w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Jest to odpowiednia technika dla badaczy zainteresowanych fizjologicznymi mechanizmami komórkowymi, które regulują kontrolę komórek śródbłonka nad dostarczaniem przepływu krwi do miąższu mózgu. Podsumowując, technika ta pomoże naukowcom lepiej zrozumieć podstawowe szlaki sygnałowe śródbłonka i komunikację sieciową tętniczek osadzonych w miąższu mózgu, jednocześnie odpowiadając na pytania związane z fizjologią i patologią naczyń mózgowych.

Protokół

Eksperymentatorzy powinni upewnić się, że wyznaczone wykorzystanie zwierząt i związane z tym protokoły są zatwierdzone przez ich Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) i wykonywane zgodnie z "Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych" Narodowej Rady ds. Badań Naukowych (8^th Edition, 2011) oraz wytycznymi ARRIVE. IACUC Uniwersytetu Loma Linda i Uniwersytetu Arizony zatwierdziło wszystkie protokoły użyte w tym manuskrypcie dla myszy C57BL/6N i 3xTg-AD (samce i samice; przedział wiekowy: 2-30 miesięcy). Zobacz Rysunek 1 jako przegląd izolacji i badania śródbłonka tętniczek świeżo wyizolowanych z miąższowych tętniczek mózgu.

1. Materiały i sprzęt

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów dla wszystkich odczynników i materiałów wymaganych dla tego protokołu. Ponadto w razie potrzeby można również zapoznać się z instrukcjami i stronami internetowymi powiązanymi z odpowiednimi dostawcami. Ilustracje stacji preparacyjnych i aparatury doświadczalnej zostały już wcześniej udostępnione¹³.

1. Komora przepływowa
   1. Przymocuj komorę superfuzji ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym do platformy wykonanej z anodyzowanego aluminium. Przymocuj platformę z komorą do aluminiowego stolika mikroskopu.
   2. Ustaw mikromanipulator z pipetą przypinającą na każdym końcu platformy na aluminiowym stoliku mikroskopu.
      UWAGA: W razie potrzeby użyj przenośnego aparatu stage z jednostką komory przepływowej, aby przenieść zabezpieczoną, izolowaną rurkę śródbłonka z jednego aparatu mikroskopowego do drugiego w celu eksperymentowania.
2. Mikroskopy
   1. Do zabiegów preparacyjnych należy używać mikroskopów stereoskopowych (zakres powiększenia od 5x do 50x) i światłowodowych źródeł światła.
   2. Do izolacji rurek śródbłonka należy użyć odwróconego statywu mikroskopowego wyposażonego w obiektywy kompatybilne z kontrastem fazowym lub kontrastem interferencyjnym różnicowym (DIC) (10x, 20x i 40x) oraz aluminiowy stolik.
   3. Obok aparatury przeznaczonej do izolowania rurek śródbłonkowych z częściowo strawionych naczyń krwionośnych należy przygotować sterownik pompy mikrostrzykawkowej.
   4. Ustaw aparaturę doświadczalną, ustawiając mikroskop odwrócony (obiektywy: 4x, 10x, 20x, 40x i 60x) oraz ręczny stolik aluminiowy na stole do izolacji drgań.
3. Wewnątrzkomórkowe urządzenia rejestrujące V_m
   1. Podłącz elektrometr do kompatybilnej sceny czołowej. Używaj akcesoriów, takich jak generator funkcyjny i stymulator, w przypadku protokołów wymagających wstrzyknięcia prądu.
   2. Podłącz wyjścia wzmacniacza do systemu digitizera danych, oscyloskopu i dźwiękowych monitorów linii bazowej. Zamocuj elektrodę do kąpieli referencyjnej (granulat Ag/AgCl) w pobliżu wyjścia z komory przepływowej.
   3. Zmontuj system fotometryczny ze zintegrowanymi komponentami interfejsu systemu fluorescencyjnego, lampą łukową o dużej intensywności i zasilaczem, hiperprzełącznikiem, lampą fotopowielacza (lub PMT) i kamerą do pomiaru [Ca^{2 +} ]_i w komórkach śródbłonka.
   4. Zamontuj regulator temperatury wyposażony w grzałkę liniową, aby podnieść i utrzymać temperaturę fizjologiczną (37 °C) przez cały czas trwania eksperymentu.
   5. Zamontuj wielokanałową platformę połączoną ze sterownikiem zaworu z wbudowanym zaworem sterującym przepływem, aby kontrolować dostarczanie roztworów do rurek śródbłonka zabezpieczonych w komorze.
4. Mikropipety i ostre elektrody
   UWAGA: Eksperymentator będzie potrzebował elektronicznego ściągacza do szkła i mikrokuźni do przygotowania pipet do rozcierania i przypinania.
   1. Aby oddzielić rurkę śródbłonka od częściowo strawionego odcinka tętniczki, należy przygotować polerowane termicznie pipety do rozdrabniania (wewnętrzna średnica końcówki: 30-50 μm) z kapilar ze szkła borokrzemianowego.
   2. Aby zabezpieczyć rurkę śródbłonka w komorze superfuzyjnej, należy przygotować polerowane na gorąco pipety pinowe z, kulistym końcem (średnica zewnętrzna: 50-70 μm) przygotowane z cienkościennych kapilar ze szkła borokrzemianowego.
   3. Aby zarejestrować V_m komórki śródbłonka, przygotuj ostre elektrody o rezystancji końcówki ~150 ± 30 MΩ ze szklanych naczyń włosowatych za pomocą samego ściągacza do szkła.

2. Rozwiązania i leki

1. Fizjologiczny roztwór soli (PSS)
   1. Przygotować co najmniej 1 l PSS przy użyciu 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowego (HEPES) i 10 mM glukozy.
   2. Przygotować niezbędne roztwory bez CaCl₂ (zero Ca²⁺ PSS) do wypreparowania tętniczek mózgowych i izolacji rurki śródbłonkowej.
      UWAGA: Przygotować wszystkie roztwory w ultraczystym dejonizowanym_H2O, a następnie przeprowadzić filtrację (0,22 μm). Upewnij się, że produkt końcowy ma pH 7,4 i osmolalność między 290 a 300 mOsm.
2. Albumina surowicy bydlęcej (BSA, 10%)
   1. Rozpuścić 1 g liofilizowanego proszku BSA w zlewce o pojemności 10 ml o zerowym Ca²⁺ PSS. Przykryj zlewkę i odczekaj co najmniej 2 godziny, powoli mieszając, aż BSA się rozpuści.
   2. Przefiltrować roztwór za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i filtra 0,22 μm i przygotować 1 ml porcji do przechowywania w temperaturze -20 °C.
3. Roztwór do rozwarstwiania
   1. Dodaj 500 μl BSA (10%) do 49,5 ml zero Ca²⁺ PSS, aby uzyskać całkowitą objętość 50 ml.
   2. Przenieść roztwór na szalkę Petriego w celu rozwarstwienia tętniczek.
4. Rozwiązanie do dysocjacji
   1. Dodać 5 μl roztworu CaCl₂ (1 M) i 500 μl BSA (10%) do 49,5 ml zerowego Ca²⁺ PSS, aby uzyskać całkowitą objętość 50 ml. Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.
5. enzymy
   1. Przygotuj 1 ml roztworu wytrawiającego ze 100 μg/ml papainy, 170 μg/ml ditioerytrytolu, 250 μg/ml kolagenazy (mieszanka typu H) i 40 μg/ml elastazy.
      UWAGA: Aktywność enzymów może się różnić, chociaż skuteczne protokoły prawdopodobnie będą wymagały następujących aktywności enzymatycznych: ≥ 10 jednostek/mg dla papainy, ≥ 1 jednostka/mg dla kolagenazy i ≥ 5 jednostek/mg dla elastazy.
6. Fura-2 i środki farmakologiczne
   1. Przygotować zapas Fura-2 AM w dimetylosulfotlenku (DMSO; 1 mM). Przygotować 500 μl stężenia roboczego (10 μM), dodając 5 μl wywaru do 495 μl PSS do załadunku.
   2. Przygotować co najmniej 50 ml roboczych stężeń środków farmakologicznych w PSS lub DMSO, odpowiednio.
7. Roztwór przewodzący
   1. Przygotować 2 M KCl, rozpuszczając KCl w dejonizowanym_H2O(7,455 g KCl w 50 ml_H2O). Przepuść roztwór przez strzykawkę z filtrem 0,22 μm przed zasypaniem ostrych elektrod.
8. Fluorescencyjne urządzenia śledzące organelle i przeciwciała
   1. Przygotować trackery błony plazmatycznej lub organelli (np. jądra, retikulum endoplazmatycznego) w odpowiednim roztworze soli fizjologicznej zgodnie z instrukcjami producenta.
   2. Przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe przygotować zgodnie z instrukcjami producenta w odpowiednim roztworze soli fizjologicznej.

3. Rozwarstwienie i izolacja tętniczek mózgowych myszy

UWAGA: Stereomikroskopy i zaostrzone narzędzia do mikrodysekcji (np. kleszczyki z cienką końcówką, nożyczki do preparacji w stylu Vannasa) muszą być używane do powiększania próbek (do 50x) we wszystkich tych procedurach preparacyjnych.

1. Izolacja mózgu myszy
   1. Znieczulić standardową mysz laboratoryjną (np. C57BL/6, 3xTg-AD; w wieku 2-30 miesięcy, samiec lub samica) za pomocą inhalacji izofluranu (3% przez 2-3 min), a następnie natychmiast zdekapitalizować za pomocą ostrych nożyczek lub gilotyny zgodnie z aprobatą IACUC. Umieścić głowę myszy na szalce Petriego (średnica 10 cm, głębokość 1,5 cm) zawierającej zimny (4 °C) roztwór preparacyjny.
   2. Podczas oglądania pod mikroskopem stereoskopowym usuń skórę i włosy nad czaszką i zmyj nadmiar krwi zimnym roztworem preparacyjnym. Używając końcówek standardowych nożyczek preparacyjnych (np. ostrzy 24 mm), wykonaj nacięcie zaczynając od kości potylicznej i rozciągając się w górę przez kość nosową czaszki. Użyj kleszczy z grubą końcówką, aby ostrożnie otworzyć czaszkę wzdłuż nacięcia i oddzielić tkankę łączną (błonę oponową), aby wyizolować mózg zawierający nienaruszony krąg Willisa.
   3. Umyj wyizolowany mózg zimnym roztworem preparacyjnym w zlewce lub szalce Petriego, aby usunąć pozostałą krew z powierzchni mózgu. Umieść brzuszną stronę mózgu skierowaną do góry w komorze zawierającej zimny roztwór preparacyjny do izolacji tętniczek miąższowych (Ryc. 2A).
2. Izolacja tętniczek miąższowych
   UWAGA: Do tego protokołu wybierane są tętniczki wywodzące się ze środkowych tętnic mózgowych (MCA) i osadzone w miąższu mózgu. Tętniczki są izolowane zgodnie z wcześniejszym opisem¹¹, z modyfikacją.
   1. Użyj stalowych kołków (średnica: 0,2 mm, długość: 11 do 12 mm), aby zabezpieczyć izolowany mózg w zimnym roztworze preparacyjnym na szalce Petriego zawierającej powłokę z polimeru krzemowego nasączoną węglem drzewnym (głębokość ≥ 50 cm).
   2. Używając ostrych i wyrównanych nożyczek preparacyjnych, wytnij prostokąt tkanki mózgowej (długość: 5 mm, szerokość: 3 mm) (Rysunek 2B) wokół MCA, upewniając się, że górna część segmentu tkanki znajduje się poza punktem rozgałęzienia od koła Willisa. Wytnij kolejny prostokąt tkanki mózgowej z drugiej półkuli mózgu, aby w razie potrzeby uzyskać dostęp do większej liczby tętniczek.
   3. Zabezpiecz oddzielony segment tkanki mózgowej w naczyniu z MCA skierowanym do góry (dystalnie od koła Willisa) za pomocą stalowych kołków (średnica: 0,1 mm, długość: 13 do 14 mm). Ostrożnie wykonaj płytkie nacięcie w pobliżu szpilek, aby usunąć pia za pomocą małych kleszczy, delikatnie odrywając od jednego końca do drugiego (Rysunek 2C). Usuń pia z drugiego segmentu tkanki, aby w razie potrzeby uzyskać dostęp do większej liczby tętniczek. Ostrożnie zabezpiecz izolowaną pia z tętniczkami miąższowymi rozgałęzionymi od MCA w naczyniu z szpilkami i wypreparuj tętniczki miąższowe (Rysunek 2D), upewniając się, że tętniczki nie są uszkodzone.
      UWAGA: Jeśli tętniczki nie są łatwe do wyciągnięcia za pomocą pia z miąższu, użyj cienkich kleszczy i wbij się w mózg, zaczynając od punktu rozgałęzienia MCA od Koła Willisa. Zlokalizuj tętniczkę, ostrożnie poluzuj tkankę wokół tętniczek (Ryc. 2E) i delikatnie wyciągnij tętniczkę z miąższu, przytrzymując górny koniec tętniczki (Ryc. 2F). Z jednego prostokąta tkanki mózgowej można wyizolować wiele tętniczek (długość: ~1,5-2 mm).
   4. Upewnij się, że tętniczka jest czysta i nie ma do niej przyczepionej tkanki, i odetnij wszelkie pozostałe dystalne gałęzie (Rysunek 3A). Użyj tej czystej, nienaruszonej tętniczki do trawienia enzymatycznego. Alternatywnie pokrój każdą tętniczkę na dwie części (długość: 0,75-1 mm) w celu trawienia enzymatycznego w celu przygotowania rurek śródbłonka, jeśli jest to pożądane.

4. Trawienie tętniczek miąższowych i przygotowanie rurki śródbłonka

1. Rozmieszczenie sprzętu i pipet
   UWAGA: Izolacja śródbłonka tętniczego od mózgu została opisana wcześniej^13,18. Obecny protokół zawiera modyfikacje dotyczące izolacji śródbłonka z tętniczek miąższowych (śródmózgowych). Wiele tętniczek i/lub kawałków tętniczek może być używanych razem do trawienia enzymatycznego.
   1. Zmontuj aparat do rozdrabniania¹³ do przygotowania rurek śródbłonka za pomocą aluminiowego stolika podtrzymującego komorę i mikromanipulatorów. Zmontuj mikroskop wyposażony w obiektywy (5x-60x) i kamerę podłączoną do monitora komputera. Zabezpiecz mikrostrzykawkę ze sterownikiem pompy obok stolika i próbki.
   2. Umieścić pipetę do napełniania olejem mineralnym na tłoku mikrostrzykawki. Użyj mikrostrzykawki ze sterownikiem pompy, aby pobrać roztwór dysocjacyjny do pipety do rozcierania (~130 nL) na wierzchu oleju mineralnego, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza w pipecie.
2. Częściowe trawienie odcinków tętniczek
   1. Umieść nienaruszone segmenty tętniczek w 1 ml roztworu dysocjacyjnego w szklanej probówce o pojemności 10 ml zawierającej 100 μg/ml papainy, 170 μg/ml ditioerytrytolu, 250 μg/ml kolagenazy i 40 μg/ml elastazy. Inkubować segmenty tętniczek w temperaturze 34 °C przez 10-12 minut.
   2. Po strawieniu zastąp roztwór enzymu 3-4 ml świeżego roztworu dysocjacyjnego o temperaturze pokojowej.
3. Izolacja śródbłonka tętniczki
   UWAGA: Po roztrawieniu i zastąpieniu roztworu enzymu, przenieść jeden lub wiele częściowo strawionych segmentów do roztworu dysocjacyjnego w komorze superfuzyjnej przymocowanej do ruchomej platformy. Podczas oglądania w powiększeniu od 100x do 200x wybierz jeden częściowo strawiony, ale nieuszkodzony segment naczynia i skup się na nim pod mikroskopem.
   1. Umieścić pipetę do rozcierania dołączoną do iniektora mikrostrzykawkowego w roztworze dysocjacyjnym w komorze i umieścić ją blisko jednego końca wytrawionego segmentu naczynia. Ustaw szybkość w zakresie 1-3 nL/s na sterowniku pompy, aby uzyskać delikatne rozcieranie.
   2. Utrzymując powiększenie od 100x do 200x, wyjmij segment tętniczki do pipety, a następnie wysuń, aby dysocjować przydankę i komórki mięśni gładkich (Rysunek 3B). Rozdziel segment naczynia, aż wszystkie komórki mięśni gładkich zostaną rozdzielone, a tylko komórki śródbłonka pozostaną jako nienaruszona "rurka"
      UWAGA: Jeśli to konieczne podczas rozcierania, ostrożnie użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby usunąć zdysocjowaną przydankę i wewnętrzną elastyczną blaszkę z rurki śródbłonka. Zazwyczaj tylko kilka cykli tarturacji daje nienaruszoną rurkę śródbłonka.
   3. Użyj mikromanipulatorów, aby zabezpieczyć każdy koniec rurki śródbłonka na szklanym szkiełku nakrywkowym w komorze za pomocą pipet przypinających ze szkła borokrzemianowego (Rysunek 3C, D).
4. Zabezpieczenie śródbłonka tętniczki
   1. Zastąp roztwór dysocjacyjny roztworem do superfuzji (PSS zawierającym 2 mM CaCl₂), upewniając się, że materiał nieśródbłonkowy został wypłukany z komory.
   2. Przeniesienie zabezpieczonej rurki śródbłonka na platformie mobilnej do stanowiska mikroskopowego przeznaczonego do ciągłego superfuzji i wewnątrzkomórkowych lub fluorescencyjnych zapisów/obrazowania.
   3. Zastosuj ciągłe dostarczanie PSS podczas eksperymentu. Ręcznie ustaw natężenie przepływu (5-7 ml/min) przez cały czas trwania eksperymentu za pomocą zaworu sterującego przepływem w linii, zgodnie z przepływem laminarnym, jednocześnie dopasowując dopływ przepływu roztworu do stopnia zasysania podciśnienia. Pozwól, aby ≥5 minuty przepływu PSS do komory w celu przefuzji rurki śródbłonka przed uzyskaniem danych tła i/lub załadowaniem barwnika.

5. Wykorzystanie śródbłonka tętniczek do badania fizjologii komórkowej

UWAGA: Izolowane i zabezpieczone śródbłonki tętniczek mogą być używane do wewnątrzkomórkowych zapisów dynamiki [Ca²⁺]_i i V_m przy użyciu odpowiednio fotometrii i elektrofizjologii elektrod ostrych, jak wcześniej zilustrowano¹³ (Rysunek 4). [Ca²⁺]_i i V_m mogą być mierzone jako oddzielne lub połączone zmienne eksperymentalne w zależności od potrzeb¹³ (Rysunek 4). Jednak śródbłonek tętniczek jest delikatniejszy niż śródbłonek tętniczy, a czas eksperymentowania nie powinien przekraczać 1 godziny.

1. Pomiar [Ca²⁺]_i
   1. Włączyć sprzęt i oprogramowanie do zapisów [Ca²⁺]_i, utrzymując ciągłą superfuzję przy natężeniu przepływu 5-7 ml/min.
   2. Załaduj rurkę śródbłonka barwnikiem Ca²⁺ Fura-2 AM przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przemywać komórki roztworem superfuzyjnym przez kolejne 20-30 minut, stopniowo podnosząc temperaturę kąpieli do 37 °C. Utrzymuj temperaturę 37 °C przez cały czas trwania eksperymentu.
   3. Ręcznie dostosuj okno obrazowania za pomocą oprogramowania fotometrycznego, aby ustawić ostrość na ~20 komórkach śródbłonka (Rysunek 4A). W przypadku braku światła włącz PMT na granicy faz fluorescencji i rozpocznij akwizycję [Ca²⁺]_i poprzez wzbudzanie Fura-2 na przemian (≥10 Hz) przy 340 nm i 380 nm, zbierając emisję fluorescencji przy 510 nm. Po ustaleniu stabilnego zapisu wyjściowego [Ca^{2 +}] _i należy zastosować środki farmakologiczne (np. agonistów receptora purynergicznego) zgodnie z celem eksperymentalnym (Figura 4B).
2. Pomiar V_m
   1. Włącz sprzęt i oprogramowanie do nagrań V_m i ustaw szybkość akwizycji danych (≥10 Hz) przy zachowaniu ciągłej superfuzji przy natężeniu przepływu 5-7 ml/min. Stopniowo zwiększaj temperaturę kąpieli do 37 °C i utrzymuj ją do końca eksperymentu.
   2. Pociągnij ostrą elektrodę za pomocą kapilary ze szkła borokrzemianowego, zasyp ją 2 M KCl i zabezpiecz ją na srebrnym drucie pokrytym chlorkiem w uchwycie na pipetę przymocowanym do elektrometru, który z kolei jest trzymany przez mikromanipulator.
   3. Podczas patrzenia przez obiektyw 4x użyj mikromanipulatora, aby ostrożnie ustawić ostrą końcówkę elektrody tuż nad komórką śródbłonka tętniczki do przepływającego PSS w komorze.
   4. Stopniowo zwiększaj powiększenie do 400x i w razie potrzeby zmień położenie końcówki elektrody.
   5. Za pomocą mikromanipulatora delikatnie włóż końcówkę ostrej elektrody do jednej z komórek rurki śródbłonka i rozpocznij rejestrację V_m za pomocą elektrometru (Rysunek 4A).
   6. Gdy spoczynkowe V_m śródbłonka ustabilizuje się (−30 do −40 mV), zastosuj pożądane środki farmakologiczne zgodnie z celem eksperymentalnym (Rysunek 4C).

6. Obrazowanie komórkowe

UWAGA: Rurki śródbłonka zabezpieczone w komorze platformy mobilnej mogą być również używane do obrazowania mikroskopowego zarówno w warunkach na żywo, jak i stałych¹⁹ przy użyciu standardowej mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej. Można również zastosować immunohistochemię z różnymi przeciwciałami dla receptorów i kanałów jonowych, jak opisano wcześniej²⁰.

1. Załadować rurkę śródbłonka z urządzeniem do śledzenia fluorescencji dla błony plazmatycznej lub pożądanych organelli (np. jądra, retikulum endoplazmatycznego) w temperaturze 37 °C przez 15-30 minut.
2. Umyj komórki świeżym superfuzyjnym PSS i zobrazuj żywe komórki pod mikroskopem na długości fali wzbudzenia odpowiednich barwników ( Rysunek 4D, E).
   UWAGA: Immunohistochemię można przeprowadzić na tym modelu probówki przy użyciu interesujących przeciwciał.

Wyniki

Demonstracja protokołu jest pokazana odpowiednio w Rysunek 1 z etapami rozwarstwienia tętniczki i izolacji rurki śródbłonkowej jako Rysunek 2 i Rysunek 3, odpowiednio. W tym przypadku funkcję śródbłonka oceniano, mierząc [Ca^{2 +}] _i V_m za pomocą fotometrii Fura-2 i elektrofizjologii elektrod ostrych (Rysunek 4A) w odpowiedzi na środek farmakologiczny [difosforan 2-metylotioadenozyny...

Dyskusja

Coraz więcej dowodów sugeruje, że choroby naczyń mózgowych (CVD), starzenie się i choroba Alzheimera są silnie ze sobą powiązane i są aktualnym tematem badań nad demencją 4,8,14,21. Jest więc oczywiste, że badania sieci naczyniowo-mózgowej miałyby szeroki wpływ na zdrowie, a jednocześnie wymagałyby ciągłych szeroko zakrojonych badań w stanach chorobowych. Od ponad 50 lat podkreśla się ogólne zn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wzmacniacze	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Dźwiękowe monitory bazowe	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA&	nbsp; Chłodziarka kąpielowa BM-A-TM
(Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Kapilary ze szkła borokrzemianowego (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Kapilary ze szkła borokrzemianowego (elektrody Sharp)	Warner Instruments	GC100F-10
Kapilary ze szkła borokrzemianowego (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
BSA: Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A7906
CaCl2: Chlorek wapnia	Sigma	223506
kolagenaza (mieszanka typu H)	Sigma	C8051
Szkło nakrywkowe (2.4  &czasy;   5.0  cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Digitizer do pobierania danych	Urządzenia molekularne, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
(szklana Petri z dnem Sylgard z węgla drzewnego)	Oprzyrządowanie systemów żywych, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Ditioerytrytol	Sigma	D8255
DMSO: Dimetylosulfotlenek	Sigma	D8418
Elastaza (trzustka świni)	Sigma	E7885
Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide)	ThermoFisher Scientific	E34250
Światłowodowe źródła światła	Schott, Moguncja, Niemcy & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Zawór sterujący przepływem Warner	Instruments	Interfejs systemu fluorescencji FR-50
, lampa ARC i zasilacz, hyperswitch i	urządzenia molekularne PMT, Sunnyvale, CA, USA	Kleszcze IonOptix Systems
(z cienką końcówką, zaostrzone)	FST	Dumont #5 i Dumont #55
Function Generator	EZ Digital, Seul, Korea Południowa	FG-8002
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
HCl: Kwas solny	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Headstages	Molecular Urządzenia	HS-2A & HS-9A
HEPES: (Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy)	Sigma	H4034
Podgrzewacz roztworu w linii	Warner Instruments	SH-27B
KCl: Chlorek potasu	Sigma	P9541
MgCl2: Chlorek magnezu	Sigma	M2670
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	Mikromanipulator MF-900
	Siskiyou	Ściągacz do mikropipet MX10
(cyfrowy)	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	Mikroskop P-97 lub P-1000
(odwrócony Nikon)	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Mikroskop Ts2
(odwrócony Nikon)	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) i 40X (Plan Fluor)
Platforma mikroskopu (aluminium anodowane; średnica, 7.8  cm)	Warner Instruments	PM6 lub PH6
(aluminium)	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Sterownik pompy mikrostrzykawkowej	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
MTA: sól trisodowa 2-metylotioadenozynodifosforanu	Tocris	1624
NaCl: Chlorek sodu	Sigma	S7653
NaOH: Wodorotlenek sodu	Sigma	S8045
Barwienie jądrowe (odczynnik NucBlue Live ReadyProbes; Hoechst 33342)	Oscyloskop ThermoFisher Scientific	R37605
	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Papaina	Sigma	P4762
Obiektywy z kontrastem fazowym	Nikon Instruments Inc	( Ph1 DL; 10X & 20X)
Barwnik błony plazmatycznej (CellMask Deep Red)	ThermoFisher Scientific	C10046
Komora do superfuzji z pleksiglasu	Warner Instruments, Camden, CT, USA	Nożyczki RC-27
(ostrza 3 mm i 7 mm)	Narzędzia do nauki precyzyjnej (lub FST), Foster City, CA, USA	Nożyczki Moria MC52 i 15000-00
(styl Vannas; 9.5  mm & 3  mm ostrzy)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Mikroskopy stereoskopowe	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Filtr strzykawkowy (0,22 µ m)	Regulator temperatury ThermoFisher Scientific	722-2520
(dwukanałowy)	Warner Instruments	TC-344B lub C
System sterowania zaworami	Warner Instruments	VC-6
Stół do izolacji drgań	Produkcja techniczna, Peabody, MA, USA	Mikro-g