Krojenie embrionalnego słuchowego pnia mózgu kurczaka w celu oceny gradientów tonotopowych i mikroobwodów

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania niekoronalnych warstw słuchowych pnia mózgu zarodka kurczaka w celu zbadania właściwości tonotopowych i trajektorii rozwojowych w obrębie jednego wycinka pnia mózgu. Przekroje te obejmują przekroje strzałkowe, poziome i poziome/poprzeczne obejmujące większe obszary tonotopowe w pojedynczej płaszczyźnie przekroju niż tradycyjne sekcje koronalne.

Streszczenie

Zarodek kurczaka jest powszechnie akceptowanym modelem zwierzęcym do badania słuchowego pnia mózgu, składającym się z wysoce wyspecjalizowanych mikroobwodów i topologii neuronalnej zorientowanych różnie wzdłuż osi tonotopowej (tj. częstotliwości). Oś tonotopowa umożliwia segregowane kodowanie dźwięków o wysokiej częstotliwości w płaszczyźnie rostralno-przyśrodkowej i kodowanie niskich częstotliwości w obszarach ogonowo-bocznych. Tradycyjnie, koronalne wycinki pnia mózgu tkanki embrionalnej pozwalają na badanie względnej indywidualnej blaszki o częstotliwości izotypowej. Chociaż jest to wystarczające do zbadania anatomicznych i fizjologicznych pytań dotyczących poszczególnych regionów o częstotliwości izoczęstotliwości, badanie zmienności tonotopowej i jej rozwoju w większych obszarach słuchowych pnia mózgu jest nieco ograniczone. Protokół ten opisuje techniki krojenia pnia mózgu z zarodków kurczaków, które obejmują większe gradienty obszarów częstotliwości w dolnym słuchowym pniu mózgu. Wykorzystanie różnych metod krojenia tkanki słuchowej pnia mózgu kurczaka pozwala na eksperymenty elektrofizjologiczne i anatomiczne w obrębie jednego wycinka pnia mózgu, gdzie większe gradienty właściwości tonotopowych i trajektorii rozwojowych są lepiej zachowane niż przekroje koronalne. Wiele technik krojenia pozwala na lepsze badanie różnorodnych właściwości anatomicznych, biofizycznych i tonotopowych słuchowych mikroobwodów pnia mózgu.

Wprowadzenie

Embrion kurczaka jest cennym modelem badawczym do badania podstawowych zagadnień biologicznych w licznych i różnorodnych dziedzinach naukowych, takich jak biologia komórki, immunologia, patologia i neurobiologia rozwojowa. Mikroobwody słuchowego pnia mózgu kurczaka są doskonałym przykładem wysoce wyspecjalizowanego obwodu, który można zrozumieć pod względem morfologii słuchowej i fizjologii. Na przykład Rubel i Parks (1975) po raz pierwszy opisali orientację tonotopową (tj. gradient częstotliwości) jądra magnocellularis kurczaka (NM) i jądra blaszkowego (NL) jako funkcję liniową w poprzek osi jąder, zorientowaną pod kątem ~30° w stosunku do płaszczyzny strzałkowej. Poszczególne neurony w NM i NL kodują swoją najlepszą częstotliwość dźwiękową - znaną jako częstotliwość charakterystyczna (CF) - wzdłuż płaszczyzny rostralno-przyśrodkowej do obszaru ogonowo-bocznego. Neurony wrażliwe na wysoką częstotliwość znajdują się w obszarze rostralno-przyśrodkowym, a neurony wrażliwe na niską częstotliwość są zlokalizowane ogonowo-bocznie. W związku z tym tradycyjne metody preparacji słuchowej tkanki pnia mózgu w celu zbadania właściwości tonotopowych wykorzystywały kolejne wycinki koronalne. Rzeczywiście, mikroukłady słuchowe rozwijających się zarodków kurczaków zostały stworzone jako modelowy system do badania przetwarzania sygnałów tonotopowych funkcji słuchowych poprzez kolejne wycinki pnia mózgu od ogona do rostralu w płaszczyźnie koronalnej od dziesięcioleci^1,2,3,4,5^,6.

Jednak organizacja tonotopowa NM i NL jest topologicznie i morfologicznie zawiła. Sygnały wejściowe nerwu słuchowego są rozprowadzone w taki sposób, że sygnały wejściowe o wysokiej mukowiscydozie kończą się strukturami podobnymi do cebulek, które pokrywają co najmniej jedną czwartą obwodu somatycznego komórki przydatkowej NM. I odwrotnie, wejścia o niskiej CF nie są zorganizowane z końcówkami przypominającymi bańki, ale z wieloma synapsami bouton na dendrytach neuronów NM. Środkowe wejścia CF kończą się zarówno jako synapsy przypominające żarówkę końcową, jak i bulion^4,7,8,9^,10,11,12. W Holandii wysoce stereotypowy gradient dendrytyczny jest widoczny nie tylko w długości dendrytycznej, ale także w szerokości dendrytycznej. Ten unikalny gradient dendrytyczny ściśle przylega do osi tonotopowej. Dendryty ulegają 11-krotnemu wzrostowi długości i pięciokrotnemu wzrostowi szerokości odpowiednio od neuronów o wysokiej i niskiej CF⁶. Aby przezwyciężyć tak zawiłe rozmieszczenie tych jąder w warstwach koronalnych, protokół ten opisuje podejścia do preparacji w płaszczyźnie strzałkowej, poziomej i poziomej/poprzecznej. Te techniki krojenia dostarczają przykładów słuchowej tkanki pnia mózgu, która wykazuje maksymalne właściwości tonotopowe w pojedynczej płaszczyźnie warstwy.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Protokoły preparacji i przygotowania tkanki pnia mózgu są zgodne z poprzednimi protokołami^5,13.

1. Postępowanie z jajami

1. Kupuj zapłodnione jaja (Gallus gallus domesticus) od zatwierdzonego przez IACUC lokalnego dostawcy zwierząt.
2. Jaja należy przechowywać natychmiast po przybyciu w lodówce w temperaturze 14 °C i inkubować w ciągu 5 dni.
   UWAGA: Żywotność zarodków znacznie spada po 1 tygodniu.
3. Wysterylizuj jaja 70% etanolem przed inkubacją w temperaturze 38 ± 1 °C i wilgotności ~50%.

2. Skład i przygotowanie sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF)

1. Wymieszać następujące substancje chemiczne w 1 l 18,2 MΩcm dH₂O, aby uzyskać 10 x roztwór podstawowy ACSF: NaCl (chlorek sodu) 130 mM, NaHCO₃ (wodorowęglan sodu) 26 mM, KCl (chlorek potasu) 2,5 mM, NaH₂PO₄ (diwodorofosforan sodu) 1,25 mM, dekstroza (D-(+)-glukoza) 10 mM. Roztwór podstawowy należy przechowywać w lodówce.
2. Przygotować oddzielnie roztwory MgCl₂ (chlorek magnezu) 1 M i CaCl₂ (chlorek wapnia) 1 M w 18,2 MΩcm_dH2O i przechowywać w lodówce.
3. Bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć 10x ACSF do 1x i bąbelkować w sposób ciągły 95% O₂/5% CO₂ przez 15-20 min i dodać MgCl₂ i CaCl₂. Aby przygotować ACSF i dACSF (rozwarstwianie ACSF), dostosuj do końcowego stężenia Mg²⁺ 1 mM, Ca²⁺ 3 mM i Mg²⁺ 3 mM, Ca²⁺ 1 mM, odpowiednio.
4. Ustaw szybkość bulgotania dla ACSF tak, aby pH wynosiło 7,2-7,4 z osmolalnością między 300 a 310 mOsm/L.
   UWAGA: Umieszczenie ACSF w łaźni lodowej podczas bulgotania jest korzystne dla utrzymania niskiej temperatury roztworu, co wspiera integralność strukturalną tkanek podczas preparowania.

3. Przygotowanie bloku agarozy (5%)

1. Wymieszaj 5 g agarozy w 100 ml dACSF. Używaj łaźni wodnej o temperaturze 100 °C lub kuchenki mikrofalowej przez 2-3 minuty, mieszając co 30 sekund, aby zapobiec grudkom, aż agaroza całkowicie się rozpuści i zacznie bulgotać.
2. Wlej rozpuszczoną agarozę do pustej szalki Petriego o grubości do 5 mm i przechowuj w temperaturze pokojowej do stężenia. Po związaniu zamknąć szalkę Petriego za pomocą parafilmu i przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Pokrój agarozę na sześcienne bloki ostrym ostrzem i użyj ich w czasie sekcji.

4. Protokół sekcji i izolacja słuchowego pnia mózgu

1. Oczyść obszar sekcji za pomocą sprayu z 70% roztworem alkoholu etylowego.
2. Przyklej podtrzymujący lub ustawiony pod kątem blok agarozy do tacki na wibratomy.
3. Wybierz jaja w pożądanym wieku (E20 i E21 w niniejszym protokole). Obchodzić się z jajami i inkubować je zgodnie z protokołami wymienionymi powyżej, jak w kroku 1.
4. Zlokalizuj przestrzeń wypełnioną powietrzem, umieszczając jajko w jasnym świetle (świecowanie) i szukając tej przestrzeni po większej lub bardziej okrągłej stronie jajka.
5. Zaaklimatyzuj jaja do temperatury pokojowej, rozbij skorupkę nad przestrzenią wypełnioną powietrzem i odsłoń worek membranowy.
6. Wykonaj delikatne nacięcie w worku, aby odsłonić dziób.
7. Skalpelem delikatnie wyciągnij szyję i głowę z jajka.
8. Szybko odetnij głowę ostrymi nożyczkami.
9. Po dekapitacji oczyść głowę lodowatym dACSF, aby usunąć nadmiar krwi z podkładki preparcyjnej.
10. Trzymaj głowę stabilnie w chłodzonym lodem dACSF i wykonaj nacięcie rostro-ogonowe. Rozpocznij nacięcie za oczami i między oczami i podążaj wzdłuż długości zebranej szyi.
    UWAGA: Młodsze zarodki mogą wymagać mniejszego nacisku podczas wykonywania nacięcia.
11. Oddziel skórę, aby odsłonić czaszkę.
12. Przetnij czaszkę za okiem w kierunku od środkowego do bocznego. Zrób to dla obu półkul.
    UWAGA: Ten krok pomaga oddzielić rostralną część czaszki od przyczepionego mózgu, zachowując nienaruszoną tkankę mózgową⁵.
13. Pokrój rostralną część czaszki. Umieść ostrze za oczami i wykonaj szybkie cięcie.
    UWAGA: Czyste przecięcie dołączonej czaszki może wymagać wysiłku.
14. Zanurz głowę w naczyniu z zimnym dACSF.
15. Używając małej pary nożyczek, wykonaj nacięcia od środkowej do bocznej w okolicy ogonowej czaszki, aby spróbować oddzielić mózg od czaszki bez powodowania uszkodzenia tkanek.
16. Delikatnie odsłoń pień mózgu i móżdżek. Cofnij grzbietową część całej czaszki, ostrożnie usuń pień mózgu i odsłoń go za pomocą cienkiego pędzla z łagodnym jazdem na sankach. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby oczyścić pień mózgu z tkanki łączącej i naczyń krwionośnych. Zwróć szczególną uwagę na 8. obszar nerwu czaszkowego i pamiętaj, aby pozostawić krótki odcinek nienaruszonych włókien nerwowych po obu stronach.
17. Oddziel pień mózgu od móżdżku, przecinając szypułki i ostrożnie usuwając naczynia krwionośne. Przytnij pień mózgu z dodatkowych naczyń krwionośnych.
    UWAGA: Upewnij się, że cała procedura jest wykonywana w chłodzonym lodem dACSF w sposób ciągły bąbelkowany karbtlenem (95% O₂/5% CO₂).

5. Krojenie wibratomu

UWAGA: W kolejnych krokach, tył tkanki musi być podparty sześciennym kawałkiem agarozy.

1. Umieść ostrze wibratomu wzdłuż osi poziomej i przyklej pień mózgu na tacy do krojenia. Przyklej stronę rostralną, utrzymując oś rostralno-ogonową w pionie dla plastrów koronalnych.
   1. Utrzymuj oś boczną-przyśrodkową w pionie dla plastrów strzałkowych.
   2. Przyklej stronę brzuszną, utrzymując oś grzbietowo-brzuszną pionowo dla poziomych plastrów.
2. Aby uzyskać ostrą płaszczyznę kątową strzałkowo-poziomą, przyklej brzuszną stronę pnia mózgu, utrzymując oś brzuszno-grzbietową pionowo na przeciwprostokątnej bloku agarozy, która jest cięta pod kątem 45°. Przyklej przeciwległą powierzchnię bloku agarozy skierowaną w stronę tacki do krojenia i utrzymuj oś rostralno-ogonową równolegle do krawędzi ostrza.

6. Obchodzenie się z delikatnymi lub dużymi kawałkami tkanki pnia mózgu

1. W alternatywnym podejściu do kroku 5 zanurz izolowany pień mózgu w 4% agarozie o niskiej temperaturze topnienia (LMP) w temperaturze ~40 °C na szalce Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm.
   1. Po wylaniu agarozy na zanurzony pień mózgu, umieść szalkę Petriego na lodzie do zestalenia. Przetnij sześcienny blok agarozy z osadzonym pniem mózgu za pomocą ostrej żyletki.
2. Przyklej blok agarozy LMP po jego stronie rostralnej, utrzymując oś rostralno-ogonową pnia mózgu w pionie.
   1. Weź wycinki koronalne, aż będzie można uwidocznić obszar NM.
   2. Usuń blok agarozy z kleju ostrym ostrzem. Aby dostrzec jądra, delikatnie umieść 0,5 μl barwnika (toluidyna niebieska lub pomarańczowa G) na NM za pomocą cienkiej igły.
   3. Ponownie zamontuj ten blok na tacce do krojenia w przypadku plastrów strzałkowych lub poziomych i zidentyfikuj jądra w odniesieniu do zabarwionego obszaru.
3. Aby uzyskać najlepszą wydajność, ustaw prędkość krojenia wibratomu na 4 - 5 (~30 ± 4 mm/min), częstotliwość wibracji na 85-87 Hz i amplitudę krojenia na 4-6 (~1 ± 0,2 mm).
4. Po wycięciu pnia mózgu umieść sekwencyjnie zebrane plastry o wielkości 200-300 μm w dostępnej w handlu komorze na plastry, aby zrównoważyć przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ACSF, stale bąbelkując mieszaniną 95% O₂/5% CO₂ (pH 7,2-7,4, osmolarność 300-310 mOsm / L). W tych warunkach plastry zachowują żywotność do 5-6 godzin.

7. Elektrofizjologia: procedura zaciskania łatki

1. Przenieś wycinek pnia mózgu do komory rejestracyjnej z ciągłą perfuzją karbotlenowego ACSF ~1,5 ± 0,5 ml / min.
2. Wyciągać pipety krosowe za pomocą ściągacza do mikropipet o średnicy końcówki 1-2 μm i rezystancji w zakresie 3-6 MΩ.
   1. Napełnij pipety wewnętrznym roztworem na bazie glukonianu K (do rejestracji cęgów prądowych).
3. Aby przetestować właściwości neuronalne w różnych regionach tonotopowych w wycinku, zlokalizuj neurony na obu końcach płaszczyzny wycinka i zbliż się do niego z elektrodą rejestrującą.
4. Utrzymuj dodatnie ciśnienie powietrza na końcówce pipety, zbliżając się do neuronu.
5. Poruszaj się w kierunku somy, aż na neuronie zostanie uwidocznione wgłębienie. Szybko wykonaj kolejne dwa kroki.
6. Wykonaj uszczelnienie gigaomowe (1 GΩ), uwalniając dodatnie ciśnienie powietrza.
7. Utrzymuj ustawienie wzmacniacza w trybie voltage-clamp i skoryguj przesunięcie pipety na zero pA. Przeprowadzić test szczelności (impuls testowy 10 mV przy 100 Hz). Zastosuj ujemne ciśnienie powietrza, aby rozerwać mały fragment błony neuronalnej.
8. Aby przetestować aktywne wewnętrzne właściwości neuronów słuchowych, zastosuj hiperpolaryzujące i depolaryzujące zastrzyki prądu somatycznego.
   UWAGA: Przykłady tej procedury można zilustrować na filmie uzupełniającym S1, S2. Szczegóły tej procedury znajdują się w legendach wideo.

Wyniki

Wszystkie pokazane tutaj wycinki pnia mózgu zostały pozyskane z tkanki pnia mózgu (~200-300 μm) i zobrazowane przy użyciu obiektywu 5x i optyki kontrastu różnicowego (DIC). Kamera została zamontowana na mikroskopie sekcyjnym i podłączona do komputera z oprogramowaniem do akwizycji obrazu (patrz tabela materiałów). Wstawki satelitarne dla tych figur (prawe panele) zostały zobrazowane za pomocą obiektywu do zanurzenia w wodzie z 60-krotnym powiększeniem. Zadbano o to, aby wszystkie obszary wycinka pnia mózgu były jednakowo powiększone podczas uzyskiwania obrazów cyfrowych. Zdjęcia zostały wykonane z optymalną jasnością i ostrością. Cyfrowe obrazy wycinków pnia mózgu zostały zszyte w sposób płaski w oparciu o nakładający się obszar i zaimportowane do komputera stacjonarnego w celu dalszej regulacji jasności, kontrastu i skali szarości. Podstawowe mikroukłady słuchowego pnia mózgu kurczaka zostały zidentyfikowane zgodnie z wcześniejszymi pracami^1,2,5,13. Pod mikroskopem (obiektyw 5x) jądra słuchowe zostały zidentyfikowane jako obszar przylegający do silnie zmielinizowanych włókien nerwowych krążących wokół każdego jądra zarówno ipsilateralnie, jak i kontralateralnie wzdłuż grzbietowych obszarów wycinka.

Rysunek 1 pokazuje tradycyjne przekroje koronalne tkanki pnia mózgu (200-300 μm) z zarodka kurczaka E21. Cztery pokazane tutaj wycinki koronalne reprezentują względne obszary o częstotliwości izologicznej jąder słuchowych pnia mózgu, od najniższego obszaru słuchowego mukowiscydozy (Ryc. 1A, ogonowo-boczny) do najwyższego regionu słuchowego mukowiscydozy (Rysunek 1D, rostralno-przyśrodkowy). Dla wszystkich czterech wycinków koronalnych w Rysunek 1A-D, powiększone obszary oznaczonych NM i NL są pokazane w środkowej kolumnie i powiększone (obiektyw 60x) po prawej stronie panelu figur (a i b, odpowiednio, we wstawkach satelitarnych). Strzałka w Rysunek 1A,B pokazuje wejście włókien nerwu słuchowego, a grot strzałki pokazuje rozwidlenie aksonów NM po lewej stronie przekroju. Rysunek 1C pokazuje inną strukturę jądra ślimaka ptaka, znaną jako jądro kątowe (NA, strzałka po lewej i grot po prawej). Dwa najbardziej rostralne wycinki koronalne pokazują górne jądro oliwkowe (SON) zlokalizowane wzdłuż brzuszno-bocznego obszaru wycinka koronalnego (Rysunek 1C, D, białe przerywane koła).

Rysunek 2 pokazuje strzałkowe przekroje tkanki pnia mózgu (200-300 μm) z zarodka kurczaka E21. Dla wszystkich trzech przekrojów strzałkowych (Rysunek 2A-C), powiększone obszary oznaczonych NM i NL są pokazane w środkowej kolumnie i powiększone (obiektyw 60x) po prawej stronie panelu rysunku (odpowiednio a i b na zdjęciach satelitarnych). NM i NL zostały zidentyfikowane w miejscu, w którym włókna nerwu słuchowego (Ryc. 2A, środkowa strzałka) wchodziły w skupisko neuronów obserwowanych przy większym powiększeniu (Rycina 2A, środek, małe, białe przerywane kółka i groty strzałek) i podkreślają punkt początkowy obszaru słuchowego (Rycina 2A, po lewej, duże, białe przerywane kółko i grot strzałki). SON został zidentyfikowany w obszarze rostro-bocznym najbardziej bocznego wycinka (Ryc. 2A, mały, biały, przerywany okrąg). Rysunek 2B pokazuje rozszerzone regiony tonotopowe, które zawierają zarówno stosunkowo niskie, jak i wysokie obszary słuchowe z NM i NL wzdłuż osi rostralno-ogonowej (obszary z białymi konturami, zobacz także wstawkę satelitarną). Rysunek 2C pokazuje ipsilateralne i przeciwległe kępki aksonalne w najbardziej przyśrodkowym wycinku i punkcie końcowym obszaru słuchowego (strzałki w lewo i środkową). Orientacja pokazanych tutaj warstw kontrastuje z tradycyjną orientacją plasterków, jak widać na Rysunek 1 (tj. koronalny). Zostało to wykonane w celu wyświetlenia orientacji, która najlepiej odpowiada podejściu szklanej pipety wymaganej do zapisów elektrofizjologicznych.

Aby potwierdzić, że duży obszar osi tonotopowej był reprezentowany w Rysunek 2B, wykonano zapisy elektrofizjologii cęgów prądowych z neuronów NM. Rysunek 3 pokazuje funkcjonalne podobieństwa i różnice dojrzałych (E21) neuronów NM zarejestrowanych z wycinka koronalnego (Rysunek 3A,B) i strzałkowego wycinka (Rysunek 3C,D, Dodatkowe wideo S1, S2). Dwa neurony NM zostały wybrane z przyśrodkowego i bocznego końca wycinka koronalnego (podobnego do wycinka pokazanego na Rysunek 1B), a dwa neurony NM zostały wybrane z rostralnych i ogonowych końców NM w wycinku strzałkowym (jak w wycinku pokazanym na Rysunek 2B). Rysunek 3A,B pokazuje podobne właściwości reakcji elektrofizjologicznej na wstrzyknięcia prądu somatycznego (od −100 pA do +200 pA, przyrosty +10 pA, czas trwania 100 ms). Wzorzec wypalania tych dwóch neuronów NM wykazuje subtelne różnice w tej płaszczyźnie wycinka, wskazując na względną blaszkę o częstotliwości izo dla neuronów NM o średniej częstotliwości. Rysunek 3C,D pokazuje, że wzorce odpalania mają zasadnicze różnice wzdłuż osi rostralno-ogonowej, co wskazuje na stosunkowo wyższy gradient tonotopowy od neuronu NM o niskiej częstotliwości (Rysunek 3C) do neuronu NM o wysokiej częstotliwości (Rysunek 3D). Oba neurony przedstawiły swoje stereotypowe wzorce odpalania, jak wcześniej zgłoszono^14,15.

Rysunek 4 pokazuje poziome przekroje tkanki pnia mózgu (200-300 μm) zarodka kurczaka E21. Dla obu poziomych wycinków (Rysunek 4A,B), powiększone obszary oznaczonych NM i NL są pokazane w środkowej kolumnie i powiększone (obiektyw 60x) po prawej stronie panelu figur (odpowiednio a i b we wstawkach satelitarnych). W poziomych warstwach NM i NL zidentyfikowano w kierunku linii środkowej, a neurony rozsiano wzdłuż osi boczno-przyśrodkowej (Rysunek 4A, B, środek, biały, przerywane obszary konturu). Powiększone obrazy pokazują duży zakres gradientu tonotopowego. Neurony o niskiej częstotliwości znajdują się w obszarach ogonowo-bocznych, a neurony o wysokiej częstotliwości znajdują się w obszarach rostralno-przyśrodkowych (Rysunek 4A, B, po prawej, satelity). Włókna biegnące przez linię środkową wzdłuż osi rostralno-ogonowej pokazują przeciwległe połączenia jąder słuchowych, ale organizacja tych włókien nie przebiega w prostej płaszczyźnie. Jednak ostre kątowe plastry z przekroju poziomego/poprzecznego mogą podążać za tymi włóknami aksonalnymi w kierunku płaszczyzny strzałkowej. Warstwy tkanki pnia mózgu o grubości 200-300 μM pod ostrym kątem (45°) od płaszczyzny poziomej są pokazane na Rysunek 5. Jądra słuchowe pnia mózgu można zobaczyć w dużym rozpiętości po przekątnej, zaczynając od najbardziej bocznego wycinka, a kończąc na najbardziej przyśrodkowym wycinku (Ryc. 5A-C, oznaczone środkowe panele, obszar obrysowany na biało). Co więcej, orientacja kątowa regionów NM i NL może być również wizualizowana w kolejnych asymetrycznych wycinkach (Rysunek 5A-C, oznaczone środkowe panele, biały, przerywany obszar konturowy). Powiększone obrazy (obiektyw 60x) pokazują oś tonotopową jąder słuchowych biegnącą wzdłuż osi rostralno-przyśrodkowej do ogonowo-bocznej (Ryc. 5A-C, po prawej, wstawka satelitarna). Orientacja plasterków w Rysunek 5 jest podobny do tej w Rysunek 2. Kontrastują one z tradycyjną prezentacją obrazów, ale są bardziej odpowiednie do eksperymentów elektrofizjologicznych.

Rysunek 1: Reprezentatywne koronalne odcinki szeregowe pnia mózgu. (A-D) Po lewej: przekroje od osi ogonowej do rostralnej, jądra słuchowe i włókna łączące zaznaczone białym przerywanym okręgiem. Środkowa wstawka to większy widok obszaru słuchowego, gdzie jądra są pokazane w białych przerywanych okręgach a: NM i b: NL. Strzałki pokazują włókna doprowadzające nerwy słuchowe, a grot strzałki pokazuje rozwidlenie aksonów NM w A,B. Strzałka pokazuje NA w C. Boczne białe przerywane kółko pokazuje SON w C,D. Po prawej: wstawka satelitarna pokazuje te jądra przy 60x obiektywie: a: NM i b: NL. Skróty: NM = nucleus magnocellularis; NL = jądro blaszkowate; NA = jądro kątowe; SON = jądro oliwkowe górne; LF = neurony o stosunkowo niskiej częstotliwości; MF = neurony średniej częstotliwości; HF = neurony o wysokiej częstotliwości; D = grzbietowy; L = boczny; V = brzuszny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne strzałkowe odcinki szeregowe pnia mózgu. (A-C) Po lewej: przekroje od osi bocznej do środkowej z jądrami słuchowymi oznaczonymi białym przerywanym okręgiem. Środkowa wkładka pokazuje ten sam obszar jąder słuchowych w większym widoku, oznaczony białymi przerywanymi okręgami. (A) Białe przerywane kółko w środku plasterka podkreśla SON; strzałka pokazująca włókna nerwu słuchowego i grot strzałki pokazujący NA. Ciemna plama na prawym końcu plastra to artefakt obrazowania. Obszary móżdżku można zobaczyć grzbietowo do okolicy słuchowej w obu warstwach A i B w lewym panelu. (B) Strzałkowy wycinek, którego orientacja została zmieniona na płaszczyznę koronalną (podczas krojenia). Obszar słuchowy został zidentyfikowany za pomocą niebieskiego barwnika (strzałka) i ponownie przecięty w płaszczyźnie strzałkowej. (A-C) Środkowa wstawka NM i NL obszar zaznaczony przerywanymi białymi liniami. Po prawej: widok satelitarny pokazuje a: NM i b: NL obserwowane w 60-krotnym powiększeniu obiektywu. Gradient tonotopowy LF i HF w jądrach słuchowych pokazano wzdłuż osi ostro-ogonowej. Strzałki wskazujące na ciemny obszar w (C) pokazują silnie zmielinizowane włókna NM biegnące w poprzek linii środkowej przez oś przyśrodkową. Włókna łączą się po obu stronach jąder słuchowych. Skróty: NM = nucleus magnocellularis; NL = jądro blaszkowate; NA = jądro kątowe; SON = jądro oliwkowe górne; LF = neurony o stosunkowo niskiej częstotliwości; HF = neurony o wysokiej częstotliwości; D = grzbietowy; V = brzuszny; R = rostralny; C = ogonowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Elektrofizjologiczne zapisy reakcji neuronalnej na wstrzyknięcia prądu somatycznego (od -100 pA do +200 pA, przyrosty +10 pA, czas trwania 100 ms) w obecnym trybie cęgowym. Neurony zostały wybrane do nagrań w tym samym wycinku, ale w skrajnie przeciwległych regionach NM. Panie przewodniczący, panie i panowie! Reprezentatywne odpowiedzi neuronalne w pojedynczym wycinku koronalnym wskazujące względne właściwości izoczęstotliwości z subtelnymi różnicami. Właściwości odpowiedzi reprezentują dwa różne neurony MF zarejestrowane z najbardziej przyśrodkowych (A) i bocznych (B) regionów NM w wycinku koronalnym. (C,D) Reprezentatywne nagrania neuronalne z pojedynczego wycinka strzałkowego. Nagrania pokazują względnie LF NM odpowiedź (C) i odpowiedź HF NM (D), podkreślając istotne różnice w gradieniu tonotopowym w obrębie pojedynczego odcinka strzałkowego. Skróty: NM = nucleus magnocellularis; LF = neurony o stosunkowo niskiej częstotliwości; MF = neurony o średniej częstotliwości; HF = neurony o wysokiej częstotliwości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywne poziome odcinki szeregowe pnia mózgu. Panie przewodniczący, panie i panowie! Po lewej: plastry wzdłuż osi grzbietowej do brzusznej, jądra słuchowe są oznaczone białymi przerywanymi okręgami. 8^włókna doprowadzające nerwu czaszkowego łączą jądra słuchowe oznaczone strzałką. Środkowa wstawka to większy widok obszaru jąder słuchowych z jądrami słuchowymi zaznaczonymi białymi liniami przerywanymi, pokazane są regiony NM i NL. Wyraźny ruch topologiczny jąder słuchowych można zaobserwować w A,B. (A,B) Po prawej: duży widok satelitarny pokazujący a: NM i b: NL. Prawa wkładka przedstawia jądra słuchowe obserwowane w 60-krotnym powiększeniu obiektywu oraz zakrzywioną oś topologiczną od LF do HF wzdłuż osi ogonowo-bocznej do rostralno-przyśrodkowej. Skróty: NM = nucleus magnocellularis; NL = jądro blaszkowate; LF = neurony o stosunkowo niskiej częstotliwości; HF = neurony o wysokiej częstotliwości; L = boczny; R = rostralny; C = ogonowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Reprezentatywne poziome/poprzeczne ostre kątowe (45°) odcinki szeregowe. (A-C) Po lewej: szeregowe odcinki pnia mózgu, jądra słuchowe zaznaczone białym przerywanym kółkiem. Środkowa wkładka to większy widok obszaru słuchowego. (A) Środkowa wstawka wykazuje największy rozrzut neuronów NM i NL w tych wycinkach. (B,C) Wstawka środkowa: jądra słuchowe oznaczone białymi liniami przerywanymi wykazują stopniową zmianę topologiczną w porównaniu do (A-C). Po prawej: wkładka satelitarna pokazująca jądra słuchowe a: NM i b: NL w 60-krotnym powiększeniu obiektywu. Oś tonotopowa od regionów LF do HF w NM i NL obraca się kątowo od warstw bocznych do przyśrodkowych. Skróty: NM = nucleus magnocellularis; NL = jądro blaszkowate; LF = neurony o stosunkowo niskiej częstotliwości; HF = neurony o wysokiej częstotliwości; V = brzuszny; R = rostralny; D = grzbietowy; C = ogonowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dodatkowe wideo S1: Hiperpolaryzujące i depolaryzujące zastrzyki prądu somatycznego. Właściwości odpowiedzi neuronu o niskiej i wysokiej częstotliwości na wstrzyknięcia prądu somatycznego 100 ms w trybie cęgów prądowych. Neurony zostały wybrane z tego samego strzałkowego wycinka pnia mózgu. Zakres wstrzyknięć wynosi od -100 do +200 pA w krokach co +10 pA, czas trwania 100 ms. Potencjały czynnościowe są obserwowane w odpowiedzi na wystarczające kroki prądu depolaryzującego. Film odpowiada końcowym śladom pokazanym w Rysunek 3C. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowe wideo S2: Hiperpolaryzujące i depolaryzujące zastrzyki prądu somatycznego. Podobnie jak w przypadku dodatkowego filmu S1, ten film pokazuje właściwości odpowiedzi neuronu o niskiej i wysokiej częstotliwości na wstrzyknięcia prądu somatycznego o długości 100 ms w trybie cęgów prądowych. Neurony zostały wybrane z tego samego strzałkowego wycinka pnia mózgu. Zakres wstrzyknięć wynosi od -100 do +200 pA w krokach co +10 pA, czas trwania 100 ms. Potencjały czynnościowe są obserwowane w odpowiedzi na wystarczające kroki prądu depolaryzującego. Film odpowiada końcowym śladom pokazanym w Rysunek 3D. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Przekroje koronalne embrionalnej tkanki pnia mózgu kurczaka pozwoliły na badanie względnej indywidualnej blaszki o częstotliwości izoseksualnej^przez dziesięciolecia ^1,2,5. Jednak tonotopowa (tj. częstotliwościowa) organizacja słuchowego pnia mózgu kurczaka jest topologicznie zawiła i może być bardziej dostępna w innych osiach anatomicznych w zależności od konkretnego pytania badawczego. Chociaż jest to wystarczające do zbadania anatomicznych i fizjologicznych kwestii odnoszących się do poszczególnych regionów o częstotliwości izoczęstotliwości, badanie zmian tonotopowych i ich rozwoju w większych obszarach słuchowych pnia mózgu jest nieco ograniczone przez przekroje koronalne. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, protokół ten opisuje podejścia w płaszczyźnie strzałkowej, poziomej i poziomej/poprzecznej, aby dostarczyć dodatkowych przykładów słuchowej tkanki pnia mózgu, która wykazuje maksymalne właściwości tonotopowe i gradienty w pojedynczym odcinku pnia mózgu.

Strzałkowe odcinki słuchowych obszarów pnia mózgu pokazują, że różne obszary tonotopowe są rozmieszczone w większym regionie w obrębie wycinka w porównaniu z odcinkami koronalnymi (strzałkowy obszar słuchowy = ~ 300-600 μm, obszar słuchowy koronalny = ~ 200-350 μm). Na przykład regiony NM i NL uwidoczniono na większym obszarze wzdłuż osi ostro-ogonowej w przekrojach strzałkowych (np. Ryc. 2B), a funkcjonalny gradient tonotopowy, który biegnie wzdłuż tej osi anatomicznej, był w dużej mierze zawarty w pojedynczym wycinku strzałkowym. Zostało to dodatkowo potwierdzone zapisami cęgów prądowych wewnętrznych różnic neuronalnych, które zmieniają się wzdłuż gradientu rostralno-ogonowego, jak wcześniej zgłoszono ^14,15 (np. Figura 3C, D). Przyszłe eksperymenty, które podkreślą właściwości anatomiczne i immunohistochemiczne wzdłuż osi tonotopowej, mogą dokładniej zbadać znane gradienty właściwości słuchowych w obrębie pojedynczej strzałkowej płaszczyzny warstwy. Należą do nich między innymi barwienie MAP2 i wzorce ekspresji kanału potasowego, które są znanymi gradientami architektury dendrytycznej i wewnętrznych właściwości NM i NL, które zostały wcześniej wykazane w kolejnych sekcjach koronalnych¹⁶.

Poziome odcinki słuchowych obszarów pnia mózgu pokazują, że NM i NL znajdują się w kierunku linii środkowej. Część słuchowych włókien aksonalnych biegnie po przekątnej lub prostopadle do płaszczyzny poziomej (ryc. 4). Za tymi włóknami można podążać, wykonując ostry kątowy plaster pod kątem 45° do płaszczyzny strzałkowej. Powstałe poziome/poprzeczne warstwy były większe niż plastry strzałkowe lub poziome, a długie włókna aksonalne przebiegały przez oś ostro-ogonową zarówno po stronie ipsilateralnej, jak i przeciwległej. Zarówno NM, jak i NL można wizualizować w większym obszarze przekątnej (~400-700 μm), dzięki czemu połączenia kontralateralne można wizualizować wzdłuż osi boczno-przyśrodkowej. Dodatkowo, pozioma/poprzeczna płaszczyzna przekroju pokazuje również, w jaki sposób obszary słuchowe i wynikający z tego gradient tonotopowy dokonują zwrotu kątowego (ryc. 5). Kątowa ekspozycja połączeń kontralateralnych na większym obszarze sprawia, że wycinki te są bardziej odpowiednie do stymulacji elektrofizjologicznej i badań mikroobwodów niż tradycyjne plastry koronalne.

Dodatkowe atuty
Tworzenie mikroobwodów słuchowych wymaga czasoprzestrzennej koordynacji sygnałów, które sprzyjają przetrwaniu neuronów, synaptogenezie, różnicowaniu aksonów, architekturze dendrytycznej i dojrzewaniu. W ten sposób alternatywne sekcje pnia mózgu mikroukładu słuchowego zarodka kurzego mogą być wykorzystane do następujących tematów badawczych: morfologiczna organizacja neuronów w topograficznie różnych wymiarach; organizowanie i mapowanie konektomów wszystkich jąder słuchowych i przedsionkowych; identyfikacja i charakterystyka wzorców aktywności składników obwodów w płaszczyznach izoczęstotliwości i tonotopów; topograficzna organizacja mikroobwodów pobudzających i hamujących oraz relacje z wyspecjalizowanymi populacjami neuronów (jądrami); lokalizacja przestrzenna neuronów jąder słuchowych i ich predykcyjna mukowiscydoza¹⁷; systematyczne celowanie w określone tonotopowe typy neuronów; śledzenie komórek progenitorowych i ich rozwoju w konserwatywne jądra; genetyczna linia komórek do ewolucji obwodów neuronalnych¹⁸; porównawcza anatomia pnia mózgu między gatunkami; badanie obwodów przedsionkowych, takich jak kompleks przedsionkowy Deitera (DC)¹⁹; oraz synchronizacja i przesłuch między jądrami przedsionkowymi.

Wieloaspektowe podejście wykorzystujące różne płaszczyzny warstw może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące nieznanych właściwości anatomicznych i biofizycznych mikroobwodów pnia mózgu. Dobrym przykładem jest związek między głównymi jądrami słuchowymi (NM, NA, NL i SON) a jądrami przedsionkowymi, w tym jądrem grzbietowym lemniscusa bocznego (LLDp), jądrem półksiężycowatym (SLu)²⁰ i jądrem stycznym (TN)³. Jednak ten protokół i te badania oparte na wycinkach mają pewne ograniczenia.

Środki ostrożności i ograniczenia
W zależności od instytucji przeprowadzającej eksperymenty, wytyczne etyczne i postępowanie z zarodkami kurczaków mogą się różnić. Podczas gdy wytyczne National Institutes of Health dotyczące opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych zezwalają na szybkie ścięcie głowy, istnieją alternatywne metody eutanazji zarodków^kurczaków. Wcześnie rozwijająca się tkanka pnia mózgu zarodka kurczaka jest miękka i delikatna w porównaniu ze starszymi zarodkami. Ma kilka połączeń i naczyń krwionośnych na powierzchni, które wymagają szczególnej ostrożności podczas ich usuwania. Tkanka powinna być przechowywana w lodowatym dACSF i perfuzji z 95% O₂/5% CO_{2 w} celu zwiększenia żywotności.

Metoda krojenia strzałkowego jest przydatna tylko w tonotopii ipsilateralnej. Ta metoda krojenia zapewnia większe plasterki niż plastry koronalne, których obsługa może być niepewna. Można jednak przycinać plastry za pomocą metod krzyżowych opisanych szczegółowo w innym miejscu²². Użycie 4% bloku agarozy LMP osadzonego w pniu mózgu może uratować delikatne struktury w plastrach, ale należy uważać, aby nie wlać zbyt gorącej agarozy. Szybkie ustawienie poprzez umieszczenie zablokowanego przez agarozę pnia mózgu w chłodnym środowisku na ~1 minutę sprawia, że plasterki są bardziej opłacalne w przypadku nagrań elektrofizjologicznych.

Nakładanie superglue w nadmiernych ilościach może być toksyczne. Należy go nakładać w minimalnym stopniu, a nadmiar należy natychmiast zmyć poprzez wymianę dACSF. W przypadku plastrów o ostrym kącie (45°) cięcie kąta bloku agarozy ma kluczowe znaczenie; Można użyć lustra, aby zobaczyć przedni kąt podczas cięcia bloku agarozy ostrym ostrzem. Dostępne w handlu ostrza mogą mieć powłokę woskową, którą należy zetrzeć alkoholem i wysuszyć przed użyciem. Wymagana jest optymalizacja szybkości i częstotliwości cięcia wibratomu, ponieważ kępki włókien aksonalnych są twardsze niż tkanka korowa lub macierzowa. Utrzymanie wysokiej amplitudy i stosowanie schłodzonego roztworu preparacyjnego może zapobiec uszkodzeniu tkanek.

Wszystkie roztwory powinny być przygotowane świeże, a Ca²⁺ i Mg²⁺ należy dodać do ACSF po bulgotaniu 95% O₂/5% CO_{2 .} W przeciwnym razie mogą wystąpić opady Ca²⁺. Do delikatnego obchodzenia się z plastrami w wibratomie należy użyć pędzla. Jeśli to możliwe, utrzymuj całkowity czas krojenia poniżej 15 minut. Szklana pipeta Pasteura może być używana do manewrowania plasterkami pnia mózgu.

Nie używaj detergentów ani środków piorących do szkła i sprzętu, który ma kontakt z plastrami stosowanymi w elektrofizjologii. Wykonane zdjęcia przedstawiają wygląd tkanki o grubości 200-300 μM w optyce z kontrastem interferencyjnym (DIC). Jakość wizualna będzie gorsza niż immunohistochemia czy mikroskopia elektronowa, ale dokładnie oddaje to, co zobaczy eksperymentator podczas wykonywania zapisów elektrofizjologicznych.

Badania dotyczące wczesnego rozwoju mikroobwodów wzdłuż alternatywnej osi anatomicznej, niezależnie od tego, czy są one grzbietowo-brzuszne, rostralno-ogonowe, czy ipsilateralno-przeciwstronne, są ograniczone w słuchowym pniu mózgu kurczaka. Jednym z powodów takiego stanu rzeczy jest to, że rola kodów transkrypcyjnych i regulacja rozwoju tonotopowego w pniu mózgu wciąż nie jest w pełni poznana. Zjawiska funkcjonalne, takie jak modulacja odgórna i spontaniczna aktywność, są często tracone podczas obserwacji aktywności in vitro. Jednak badania in vivo są uzupełniane specyficznymi i bezpośrednimi zapisami pojedynczych neuronów, które są możliwe tylko w tych warunkach warstwowych. Udoskonalenie metody pozyskiwania tkanki pnia mózgu w różnych orientacjach może dostarczyć wnikliwych informacji na temat rozwoju i złożoności gradientów tonotopowych w mikroobwodach słuchowych pnia mózgu kurczaków.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Adobe Photoshop 2021	Adobe
Stół antywibracyjny 30"x 36" - OTMC - 63533	TMC
Standardowe oprogramowanie Cell sens	URZĄDZENIA
Digidata 1440A Wzmacniacz
linearslicer pro7	TED PELLA, INC
Mikromanipulator MPC-385 / OSI-MPC-385-2	OLYMPUS AMERICA INC
Ściągacz do mikropipet P-97	SUTTER INSTRUMENTS Mikroskop
BX51W1	OLYMPUS AMERICA INC
MS ICE oprogramowanie	Microsoft Corporation
Ohaus model wagi AV212	Ohaus Kamera Adventurer
Olympus DPSI0 / DPS80	Oprogramowanie do
pClamp i Axoclamp	URZĄDZENIA MOLEKULARNE
pH-metr lab 850 stacjonarne	SCHOTT INSTRUMENTS
Ostre ostrze ze stali nierdzewnej	Dorco/Personna
Osmometr ciśnienia pary model 5600	WESCOR INC
Systemy uzdatniania wody Smart2pure 6UV/UF	Thermo Scientific
Chemicals- lista
Agrose Niskotopliwy IB70051	IBI SCIENTIFIC
CaCl2 (Chlorek wapnia)	ACROS organics
Cynergy klej błyskawiczny CA6001	Resinlab
Dekstroza (D-(+)-glukoza)	VWR Life Science
Alkohol etylowy	IBI SCIENTIFIC
KCl (chlorek potasu)	Amresco.Inc
MgCl2 (Chlorek magnezu)	Sigma-Aldrich
NaCl (Chlorek sodu)	Amresco.Inc
NaH2PO4 (Diwodorofosforan sodu)	Amresco.Inc
NaHCO3 (wodorowęglan sodu)	Amresco.Inc