Artykuł metodologiczny

Krojenie embrionalnego słuchowego pnia mózgu kurczaka w celu oceny gradientów tonotopowych i mikroobwodów

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63476

⸱

12 lipca 2022

 ,  ,  , 
1Roxelyn and Richard Department of Communication Sciences and Disorders, Northwestern University, 2Knowles Hearing Research Center, Northwestern University, 3Department of Neurobiology, Northwestern University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania niekoronalnych warstw słuchowych pnia mózgu zarodka kurczaka w celu zbadania właściwości tonotopowych i trajektorii rozwojowych w obrębie jednego wycinka pnia mózgu. Przekroje te obejmują przekroje strzałkowe, poziome i poziome/poprzeczne obejmujące większe obszary tonotopowe w pojedynczej płaszczyźnie przekroju niż tradycyjne sekcje koronalne.

Streszczenie

Zarodek kurczaka jest powszechnie akceptowanym modelem zwierzęcym do badania słuchowego pnia mózgu, składającym się z wysoce wyspecjalizowanych mikroobwodów i topologii neuronalnej zorientowanych różnie wzdłuż osi tonotopowej (tj. częstotliwości). Oś tonotopowa umożliwia segregowane kodowanie dźwięków o wysokiej częstotliwości w płaszczyźnie rostralno-przyśrodkowej i kodowanie niskich częstotliwości w obszarach ogonowo-bocznych. Tradycyjnie, koronalne wycinki pnia mózgu tkanki embrionalnej pozwalają na badanie względnej indywidualnej blaszki o częstotliwości izotypowej. Chociaż jest to wystarczające do zbadania anatomicznych i fizjologicznych pytań dotyczących poszczególnych regionów o częstotliwości izoczęstotliwości, badanie zmienności tonotopowej i jej rozwoju w większych obszarach słuchowych pnia mózgu jest nieco ograniczone. Protokół ten opisuje techniki krojenia pnia mózgu z zarodków kurczaków, które obejmują większe gradienty obszarów częstotliwości w dolnym słuchowym pniu mózgu. Wykorzystanie różnych metod krojenia tkanki słuchowej pnia mózgu kurczaka pozwala na eksperymenty elektrofizjologiczne i anatomiczne w obrębie jednego wycinka pnia mózgu, gdzie większe gradienty właściwości tonotopowych i trajektorii rozwojowych są lepiej zachowane niż przekroje koronalne. Wiele technik krojenia pozwala na lepsze badanie różnorodnych właściwości anatomicznych, biofizycznych i tonotopowych słuchowych mikroobwodów pnia mózgu.

Wprowadzenie

Embrion kurczaka jest cennym modelem badawczym do badania podstawowych zagadnień biologicznych w licznych i różnorodnych dziedzinach naukowych, takich jak biologia komórki, immunologia, patologia i neurobiologia rozwojowa. Mikroobwody słuchowego pnia mózgu kurczaka są doskonałym przykładem wysoce wyspecjalizowanego obwodu, który można zrozumieć pod względem morfologii słuchowej i fizjologii. Na przykład Rubel i Parks (1975) po raz pierwszy opisali orientację tonotopową (tj. gradient częstotliwości) jądra magnocellularis kurczaka (NM) i jądra blaszkowego (NL) jako funkcję liniową w poprzek osi jąder, zorientowaną pod kątem ~30° w stosunku do płaszczyzny strzałkowej. Poszczególne neurony w NM i NL kodują swoją najlepszą częstotliwość dźwiękową - znaną jako częstotliwość charakterystyczna (CF) - wzdłuż płaszczyzny rostralno-przyśrodkowej do obszaru ogonowo-bocznego. Neurony wrażliwe na wysoką częstotliwość znajdują się w obszarze rostralno-przyśrodkowym, a neurony wrażliwe na niską częstotliwość są zlokalizowane ogonowo-bocznie. W związku z tym tradycyjne metody preparacji słuchowej tkanki pnia mózgu w celu zbadania właściwości tonotopowych wykorzystywały kolejne wycinki koronalne. Rzeczywiście, mikroukłady słuchowe rozwijających się zarodków kurczaków zostały stworzone jako modelowy system do badania przetwarzania sygnałów tonotopowych funkcji słuchowych poprzez kolejne wycinki pnia mózgu od ogona do rostralu w płaszczyźnie koronalnej od dziesięcioleci1,2,3,4,5,6.

Jednak organizacja tonotopowa NM i NL jest topologicznie i morfologicznie zawiła. Sygnały wejściowe nerwu słuchowego są rozprowadzone w taki sposób, że sygnały wejściowe o wysokiej mukowiscydozie kończą się strukturami podobnymi do cebulek, które pokrywają co najmniej jedną czwartą obwodu somatycznego komórki przydatkowej NM. I odwrotnie, wejścia o niskiej CF nie są zorganizowane z końcówkami przypominającymi bańki, ale z wieloma synapsami bouton na dendrytach neuronów NM. Środkowe wejścia CF kończą się zarówno jako synapsy przypominające żarówkę końcową, jak i bulion4,7,8,9,10,11,12. W Holandii wysoce stereotypowy gradient dendrytyczny jest widoczny nie tylko w długości dendrytycznej, ale także w szerokości dendrytycznej. Ten unikalny gradient dendrytyczny ściśle przylega do osi tonotopowej. Dendryty ulegają 11-krotnemu wzrostowi długości i pięciokrotnemu wzrostowi szerokości odpowiednio od neuronów o wysokiej i niskiej CF6. Aby przezwyciężyć tak zawiłe rozmieszczenie tych jąder w warstwach koronalnych, protokół ten opisuje podejścia do preparacji w płaszczyźnie strzałkowej, poziomej i poziomej/poprzecznej. Te techniki krojenia dostarczają przykładów słuchowej tkanki pnia mózgu, która wykazuje maksymalne właściwości tonotopowe w pojedynczej płaszczyźnie warstwy.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Protokoły preparacji i przygotowania tkanki pnia mózgu są zgodne z poprzednimi protokołami5,13.

1. Postępowanie z jajami

  1. Kupuj zapłodnione jaja (Gallus gallus domesticus) od zatwierdzonego przez IACUC lokalnego dostawcy zwierząt.
  2. Jaja należy przechowywać natychmiast po przybyciu w lodówce w temperaturze 14 °C i inkubować w ciągu 5 dni.
    UWAGA: Żywotność zarodków znacznie spada po 1 tygodniu.
  3. Wysterylizuj jaja 70% etanolem przed inkubacją w temperaturze 38 ± 1 °C i wilgotności ~50%.

2. Skład i przygotowanie sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF)

  1. Wymieszać następujące substancje chemiczne w 1 l 18,2 MΩcm dH2O, aby uzyskać 10 x roztwór podstawowy ACSF: NaCl (chlorek sodu) 130 mM, NaHCO3 (wodorowęglan sodu) 26 mM, KCl (chlorek potasu) 2,5 mM, NaH2PO4 (diwodorofosforan sodu) 1,25 mM, dekstroza (D-(+)-glukoza) 10 mM. Roztwór podstawowy należy przechowywać w lodówce.
  2. Przygotować oddzielnie roztwory MgCl2 (chlorek magnezu) 1 M i CaCl2 (chlorek wapnia) 1 M w 18,2 MΩcmdH2O i przechowywać w lodówce.
  3. Bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć 10x ACSF do 1x i bąbelkować w sposób ciągły 95% O2/5% CO2 przez 15-20 min i dodać MgCl2 i CaCl2. Aby przygotować ACSF i dACSF (rozwarstwianie ACSF), dostosuj do końcowego stężenia Mg2+ 1 mM, Ca2+ 3 mM i Mg2+ 3 mM, Ca2+ 1 mM, odpowiednio.
  4. Ustaw szybkość bulgotania dla ACSF tak, aby pH wynosiło 7,2-7,4 z osmolalnością między 300 a 310 mOsm/L.
    UWAGA: Umieszczenie ACSF w łaźni lodowej podczas bulgotania jest korzystne dla utrzymania niskiej temperatury roztworu, co wspiera integralność strukturalną tkanek podczas preparowania.

3. Przygotowanie bloku agarozy (5%)

  1. Wymieszaj 5 g agarozy w 100 ml dACSF. Używaj łaźni wodnej o temperaturze 100 °C lub kuchenki mikrofalowej przez 2-3 minuty, mieszając co 30 sekund, aby zapobiec grudkom, aż agaroza całkowicie się rozpuści i zacznie bulgotać.
  2. Wlej rozpuszczoną agarozę do pustej szalki Petriego o grubości do 5 mm i przechowuj w temperaturze pokojowej do stężenia. Po związaniu zamknąć szalkę Petriego za pomocą parafilmu i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Pokrój agarozę na sześcienne bloki ostrym ostrzem i użyj ich w czasie sekcji.

4. Protokół sekcji i izolacja słuchowego pnia mózgu

  1. Oczyść obszar sekcji za pomocą sprayu z 70% roztworem alkoholu etylowego.
  2. Przyklej podtrzymujący lub ustawiony pod kątem blok agarozy do tacki na wibratomy.
  3. Wybierz jaja w pożądanym wieku (E20 i E21 w niniejszym protokole). Obchodzić się z jajami i inkubować je zgodnie z protokołami wymienionymi powyżej, jak w kroku 1.
  4. Zlokalizuj przestrzeń wypełnioną powietrzem, umieszczając jajko w jasnym świetle (świecowanie) i szukając tej przestrzeni po większej lub bardziej okrągłej stronie jajka.
  5. Zaaklimatyzuj jaja do temperatury pokojowej, rozbij skorupkę nad przestrzenią wypełnioną powietrzem i odsłoń worek membranowy.
  6. Wykonaj delikatne nacięcie w worku, aby odsłonić dziób.
  7. Skalpelem delikatnie wyciągnij szyję i głowę z jajka.
  8. Szybko odetnij głowę ostrymi nożyczkami.
  9. Po dekapitacji oczyść głowę lodowatym dACSF, aby usunąć nadmiar krwi z podkładki preparcyjnej.
  10. Trzymaj głowę stabilnie w chłodzonym lodem dACSF i wykonaj nacięcie rostro-ogonowe. Rozpocznij nacięcie za oczami i między oczami i podążaj wzdłuż długości zebranej szyi.
    UWAGA: Młodsze zarodki mogą wymagać mniejszego nacisku podczas wykonywania nacięcia.
  11. Oddziel skórę, aby odsłonić czaszkę.
  12. Przetnij czaszkę za okiem w kierunku od środkowego do bocznego. Zrób to dla obu półkul.
    UWAGA: Ten krok pomaga oddzielić rostralną część czaszki od przyczepionego mózgu, zachowując nienaruszoną tkankę mózgową5.
  13. Pokrój rostralną część czaszki. Umieść ostrze za oczami i wykonaj szybkie cięcie.
    UWAGA: Czyste przecięcie dołączonej czaszki może wymagać wysiłku.
  14. Zanurz głowę w naczyniu z zimnym dACSF.
  15. Używając małej pary nożyczek, wykonaj nacięcia od środkowej do bocznej w okolicy ogonowej czaszki, aby spróbować oddzielić mózg od czaszki bez powodowania uszkodzenia tkanek.
  16. Delikatnie odsłoń pień mózgu i móżdżek. Cofnij grzbietową część całej czaszki, ostrożnie usuń pień mózgu i odsłoń go za pomocą cienkiego pędzla z łagodnym jazdem na sankach. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby oczyścić pień mózgu z tkanki łączącej i naczyń krwionośnych. Zwróć szczególną uwagę na 8. obszar nerwu czaszkowego i pamiętaj, aby pozostawić krótki odcinek nienaruszonych włókien nerwowych po obu stronach.
  17. Oddziel pień mózgu od móżdżku, przecinając szypułki i ostrożnie usuwając naczynia krwionośne. Przytnij pień mózgu z dodatkowych naczyń krwionośnych.
    UWAGA: Upewnij się, że cała procedura jest wykonywana w chłodzonym lodem dACSF w sposób ciągły bąbelkowany karbtlenem (95% O2/5% CO2).

5. Krojenie wibratomu

UWAGA: W kolejnych krokach, tył tkanki musi być podparty sześciennym kawałkiem agarozy.

  1. Umieść ostrze wibratomu wzdłuż osi poziomej i przyklej pień mózgu na tacy do krojenia. Przyklej stronę rostralną, utrzymując oś rostralno-ogonową w pionie dla plastrów koronalnych.
    1. Utrzymuj oś boczną-przyśrodkową w pionie dla plastrów strzałkowych.
    2. Przyklej stronę brzuszną, utrzymując oś grzbietowo-brzuszną pionowo dla poziomych plastrów.
  2. Aby uzyskać ostrą płaszczyznę kątową strzałkowo-poziomą, przyklej brzuszną stronę pnia mózgu, utrzymując oś brzuszno-grzbietową pionowo na przeciwprostokątnej bloku agarozy, która jest cięta pod kątem 45°. Przyklej przeciwległą powierzchnię bloku agarozy skierowaną w stronę tacki do krojenia i utrzymuj oś rostralno-ogonową równolegle do krawędzi ostrza.

6. Obchodzenie się z delikatnymi lub dużymi kawałkami tkanki pnia mózgu

  1. W alternatywnym podejściu do kroku 5 zanurz izolowany pień mózgu w 4% agarozie o niskiej temperaturze topnienia (LMP) w temperaturze ~40 °C na szalce Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm.
    1. Po wylaniu agarozy na zanurzony pień mózgu, umieść szalkę Petriego na lodzie do zestalenia. Przetnij sześcienny blok agarozy z osadzonym pniem mózgu za pomocą ostrej żyletki.
  2. Przyklej blok agarozy LMP po jego stronie rostralnej, utrzymując oś rostralno-ogonową pnia mózgu w pionie.
    1. Weź wycinki koronalne, aż będzie można uwidocznić obszar NM.
    2. Usuń blok agarozy z kleju ostrym ostrzem. Aby dostrzec jądra, delikatnie umieść 0,5 μl barwnika (toluidyna niebieska lub pomarańczowa G) na NM za pomocą cienkiej igły.
    3. Ponownie zamontuj ten blok na tacce do krojenia w przypadku plastrów strzałkowych lub poziomych i zidentyfikuj jądra w odniesieniu do zabarwionego obszaru.
  3. Aby uzyskać najlepszą wydajność, ustaw prędkość krojenia wibratomu na 4 - 5 (~30 ± 4 mm/min), częstotliwość wibracji na 85-87 Hz i amplitudę krojenia na 4-6 (~1 ± 0,2 mm).
  4. Po wycięciu pnia mózgu umieść sekwencyjnie zebrane plastry o wielkości 200-300 μm w dostępnej w handlu komorze na plastry, aby zrównoważyć przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ACSF, stale bąbelkując mieszaniną 95% O2/5% CO2 (pH 7,2-7,4, osmolarność 300-310 mOsm / L). W tych warunkach plastry zachowują żywotność do 5-6 godzin.

7. Elektrofizjologia: procedura zaciskania łatki

  1. Przenieś wycinek pnia mózgu do komory rejestracyjnej z ciągłą perfuzją karbotlenowego ACSF ~1,5 ± 0,5 ml / min.
  2. Wyciągać pipety krosowe za pomocą ściągacza do mikropipet o średnicy końcówki 1-2 μm i rezystancji w zakresie 3-6 MΩ.
    1. Napełnij pipety wewnętrznym roztworem na bazie glukonianu K (do rejestracji cęgów prądowych).
  3. Aby przetestować właściwości neuronalne w różnych regionach tonotopowych w wycinku, zlokalizuj neurony na obu końcach płaszczyzny wycinka i zbliż się do niego z elektrodą rejestrującą.
  4. Utrzymuj dodatnie ciśnienie powietrza na końcówce pipety, zbliżając się do neuronu.
  5. Poruszaj się w kierunku somy, aż na neuronie zostanie uwidocznione wgłębienie. Szybko wykonaj kolejne dwa kroki.
  6. Wykonaj uszczelnienie gigaomowe (1 GΩ), uwalniając dodatnie ciśnienie powietrza.
  7. Utrzymuj ustawienie wzmacniacza w trybie voltage-clamp i skoryguj przesunięcie pipety na zero pA. Przeprowadzić test szczelności (impuls testowy 10 mV przy 100 Hz). Zastosuj ujemne ciśnienie powietrza, aby rozerwać mały fragment błony neuronalnej.
  8. Aby przetestować aktywne wewnętrzne właściwości neuronów słuchowych, zastosuj hiperpolaryzujące i depolaryzujące zastrzyki prądu somatycznego.
    UWAGA: Przykłady tej procedury można zilustrować na filmie uzupełniającym S1, S2. Szczegóły tej procedury znajdują się w legendach wideo.

Wyniki

Wszystkie przedstawione tutaj przekroje pnia mózgu zostały pobrane z tkanki pnia mózgu (~200-300 μm) i obrazowano przy użyciu obiektywu 5x oraz optyki kontrastu interferencyjnego (DIC). Kamera była zamontowana na mikroskopie stereotypowym i podłączona do komputera z oprogramowaniem do akwizycji obrazu (patrz Tabela materiałów). Wstawki satelitarne dla tych rycin (panele prawe) zostały obrazowane przy użyciu obiektywu imersyjnego wodnego o powiększeniu 60x. Podczas pozyskiwania obrazów cyfrowych zadbano o to, aby wszystkie obszary przekroju pnia mózgu były powiększone w tym samym stopniu. Fotografie wykonano przy optymalnej jasności i ostrości. Cyfrowe obrazy przekrojów pnia mózgu zostały zszyte w sposób planarny na podstawie obszarów nakładania się, a następnie zaimportowane do komputera stacjonarnego w celu dalszej korekty jasności, kontrastu i skali szarości. Podstawowe mikroukłady słuchowe pnia mózgu kurczaka zidentyfikowano zgodnie z wcześniejszymi pracami1,2,5,13. Pod mikroskopem (obiektyw 5x) jądra słuchowe zidentyfikowano jako obszary sąsiadujące z silnie zmielinizowanymi włóknami nerwowymi przebiegającymi wokół każdego jądra, zarówno po stronie ipsilateralnej, jak i kontralateralnej, wzdłuż obszarów grzbietowych przekroju.

Rysunek 1 przedstawia tradycyjne przekroje czołowe tkanki pnia mózgu (200-300 µm) zarodka kurczaka w stadium E21. Cztery pokazane tutaj przekroje czołowe reprezentują względne obszary izofrekwencyjne jąder słuchowych pnia mózgu, od obszaru słuchowego o najniższej CF (Rysunek 1A, kaudo-lateralny) przechodząc do obszaru słuchowego o najwyższej CF (Rysunek 1D, rostralno-medialny). Dla wszystkich czterech przekrojów czołowych na Rysunku 1A-D, powiększone regiony znakowanego NM i NL są pokazane w środkowej kolumnie oraz powiększone (obiektyw 60x) po prawej stronie panelu rysunku (odpowiednio a i b, w wstawkach satelitarnych). Strzałka na Rysunku 1A,B wskazuje wejście włókien nerwu słuchowego, a grot strzałki wskazuje rozwidlenie aksonów NM po lewej stronie przekroju. Rysunek 1C pokazuje inną strukturę jądra ślimakowego ptaków znaną jako nucleus angularis (NA, strzałka po lewej i grot strzałki po prawej). Dwa najbardziej rostralne przekroje czołowe pokazują jądro oliwki górnej (SON) zlokalizowane wzdłuż regionu brzuszno-bocznego przekroju czołowego (Rysunek 1C,D, białe przerywane okręgi).

Rysunek 2 przedstawia przekroje strzałkowe tkanki pnia mózgu (200-300 µm) z embrionu kurczaka w stadium E21. Dla wszystkich trzech przekrojów strzałkowych (Rysunek 2A-C) powiększone obszary oznakowanych NM i NL pokazano w środkowej kolumnie oraz w jeszcze większym powiększeniu (obiektyw 60x) po prawej stronie panelu rysunku (odpowiednio a i b na obrazach satelitarnych). NM i NL zidentyfikowano w miejscu, gdzie włókna nerwu słuchowego (Rysunek 2A, środkowa strzałka) wchodziły w skupisko neuronów zaobserwowane przy większym powiększeniu (Rysunek 2A, środek, małe, białe przerywane okręgi i groty strzałek), co wyznacza punkt początkowy obszaru słuchowego (Rysunek 2A, lewa strona, duży, biały przerywany okrąg i grot strzałki). SON zidentyfikowano w regionie rostro-lateralnym najbardziej lateralnego przekroju (Rysunek 2A, mały, biały, przerywany okrąg). Rysunek 2B przedstawia rozległe obszary tonotopowe, które zawierają zarówno relatywnie niskie, jak i wysokie obszary CF dla NM i NL wzdłuż osi rostralno-kaudalnej (obszary obrysowane biało, patrz również wstawka satelitarna). Rysunek 2C pokazuje ipsilateralne i kontralateralne kępki aksonalne w najbardziej medialnym przekroju oraz punkt końcowy obszaru słuchowego (strzałki lewa i środkowa). Orientacja tutaj przedstawionych przekrojów różni się od tradycyjnej orientacji przekrojów widocznej na Rysunku 1 (tj. koronarnej). Zastosowano to w celu zaprezentowania orientacji, która najlepiej umożliwia podejście szklaną pipetą wymaganą do rejestracji elektrofizjologicznych.

Aby potwierdzić, że w rysunku 2B przedstawiony został szeroki obszar osi tonotopowej, przeprowadzono rejestracje elektrofizjologiczne w konfiguracji current-clamp z neuronów NM. Rysunek 3 przedstawia podobieństwa i różnice funkcjonalne dojrzałych (E21) neuronów NM zarejestrowanych z przekroju czołowego (rysunek 3A,B) oraz przekroju strzałkowego (rysunek 3C,D, film uzupełniający S1, S2). Wybrano dwa neurony NM z przyśrodkowej i bocznej krawędzi przekroju czołowego (analogicznie do przekroju pokazanego na rysunku 1B) oraz dwa neurony NM z przedniej i tylnej części NM w przekroju strzałkowym (podobnie jak w przekroju pokazanym na rysunku 2B). Rysunek 3A,B przedstawia podobne właściwości odpowiedzi elektrofizjologicznej na wstrzykiwanie prądu do somy (−100 pA do +200 pA, w przyrostach +10 pA, czas trwania 100 ms). Wzorzec wyładowań tych dwóch neuronów NM wykazuje subtelne różnice w tej płaszczyźnie przekroju, co wskazuje na względnie izoczęstotliwościowe blaszki dla neuronów NM o średniej częstotliwości. Rysunek 3C,D pokazuje, że wzorce wyładowań wykazują istotne różnice wzdłuż osi rostralno-kaudalnej, co wskazuje na stosunkowo wyższy gradient tonotopowy od neuronu NM niskiej częstotliwości (rysunek 3C) do neuronu NM wysokiej częstotliwości (rysunek 3D). Oba neurony wykazały stereotypowe wzorce wyładowań, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami14,15.

Rysunek 4 przedstawia poziome przekroje tkanki pnia mózgu (200-300 µm) zarodka kurczaka w E21. Dla obu poziomych skrawków (Rysunek 4A,B) powiększone obszary oznakowanych NM i NL pokazano w środkowej kolumnie oraz w jeszcze większym powiększeniu (obiektyw 60x) po prawej stronie panelu rysunku (odpowiednio a i b, w wstawkach satelitarnych). W przekrojach poziomych NM i NL zidentyfikowano w kierunku linii środkowej, a neurony były rozproszone wzdłuż osi boczno-przyśrodkowej (Rysunek 4A,B, środek, białe obszary zaznaczone przerywaną linią). Powiększone obrazy ukazują znaczny zasięg gradientu tonotopowego. Neurony niskich częstotliwości znajdują się w obszarach ogonowo-bocznych, a neurony wysokich częstotliwości w obszarach rostralno-przyśrodkowych (Rysunek 4A,B, prawa strona, satelity). Włókna biegnące przez linię środkową wzdłuż osi rostralno-ogonowej wykazują połączenia przeciwstronne jąder słuchowych, jednak organizacja tych włókien nie odbywa się w prostej płaszczyźnie. Niemniej jednak, ostre przekroje kątowe z sekcji poziomej/poprzecznej pozwalają śledzić te włókna aksonalne w kierunku płaszczyzny strzałkowej. Skrawki tkanki pnia mózgu o grubości 200-300 µM wycięte pod ostrym kątem (45°) względem płaszczyzny poziomej przedstawiono na Rysunku 5. Jądra słuchowe pnia mózgu są widoczne w szerokim rozciągnięciu diagonalnym, zaczynając od najbardziej bocznego skrawka, a kończąc na najbardziej przyśrodkowym (Rysunek 5A-C, oznakowane panele środkowe, obszar obwiedziony białą linią). Ponadto, orientacja kątowa obszarów NM i NL może być również zwizualizowana w kolejnych asymetrycznych skrawkach (Rysunek 5A-C, oznakowane panele środkowe, biały obszar zaznaczony przerywaną linią). Powiększone obrazy (obiektyw 60x) pokazują oś tonotopową jąder słuchowych przebiegającą wzdłuż osi rostralno-przyśrodkowej do ogonowo-bocznej (Rysunek 5A-C, prawa strona, wstawka satelitarna). Orientacja skrawków na Rysunku 5 jest podobna do tej na Rysunku 2. Kontrastują one z tradycyjnym sposobem prezentacji obrazów, lecz są bardziej odpowiednie do eksperymentów elektrofizjologicznych.

Schemat neuroanatomiczny, przekroje A-D pokazujące obszary mózgu NM, NL, LF, MF, HF, szczegółowa mikroskopia.
Rycina 1: Reprezentatywne seryjne przekroje czołowe pnia mózgu. (A-D) Lewo: skrawki od osi ogonowej do rostralnej, jądra słuchowe i włókna łączące zaznaczone białą przerywaną linią. Środkowa wstawka to powiększony widok obszaru słuchowego, gdzie jądra są pokazane wewnątrz białych przerywanych kół a: NM oraz b: NL. Strzałki wskazują aferentne włókna nerwu słuchowego, a grot strzałki wskazuje bifurkację aksonu NM w A,B. Strzałka wskazuje NA w C. Boczna biała przerywana linia pokazuje SON w C,D. Prawo: wstawka pomocnicza pokazuje te jądra przy użyciu obiektywu 60x: a: NM oraz b: NL. Skróty: NM = nucleus magnocellularis; NL = nucleus laminaris; NA = nucleus angularis; SON = superior olivary nucleus; LF = neurony o stosunkowo niskiej częstotliwości; MF = neurony o średniej częstotliwości; HF = neurony o wysokiej częstotliwości; D = grzbietowy; L = boczny; V = brzuszny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopowy obraz histologicznego przekroju mózgu przedstawiający warstwy neuronalne i identyfikację jąder.
Rycina 2: Reprezentatywne seryjne przekroje strzałkowe pnia mózgu. (A-C) Po lewej: skrawki od osi bocznej do przyśrodkowej z zaznaczonymi białymi przerywanymi okręgami jądrami słuchowymi. Środkowa wstawka pokazuje ten sam obszar jąder słuchowych w powiększeniu, zaznaczony białymi przerywanymi okręgami. (A) Biały przerywany okrąg w centrum skrawka wyróżnia SON; strzałka wskazuje włókna nerwu słuchowego, a grot strzałki NA. Ciemna czarna plama na prawym brzegu skrawka jest artefaktem obrazowania. Obszary móżdżku są widoczne grzbietowo względem obszaru słuchowego na obu skrawkach A i B w panelu lewym. (B) Przekrój strzałkowy, którego orientacja została zmieniona na płaszczyznę czołową (podczas krojenia). Obszar słuchowy zidentyfikowano za pomocą niebieskiego barwnika (czarna strzałka), a następnie ponownie wycięto w płaszczyźnie strzałkowej. (A-C) Środkowa wstawka: obszary NM i NL zaznaczone przerywanymi białymi liniami. Po prawej: widok satelitarny przedstawia a: NM oraz b: NL obserwowane przy powiększeniu obiektywu 60x. Gradient tonotopowy LF i HF w jądrach słuchowych jest pokazany wzdłuż osi rostralno-kaudalnej. Strzałki wskazujące ciemny obszar w (C) pokazują silnie zmielinizowane włókna NM biegnące przez linię środkową wzdłuż osi przyśrodkowej. Włókna te łączą obie strony jąder słuchowych. Skróty: NM = nucleus magnocellularis; NL = nucleus laminaris; NA = nucleus angularis; SON = superior olivary nucleus; LF = neurony niskoczęstotliwościowe; HF = neurony wysokoczęstotliwościowe; D = grzbietowo (dorsal); V = brzusznie (ventral); R = rostralnie; C = kaudalnie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres rejestracji elektrofizjologicznych z metodami koronalną i strzałkową ilustrujący aktywność neuronalną.
Rycina 3: Rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi neuronalnej na wstrzyknięcia prądu somatycznego (−100 pA do +200 pA, przyrosty +10 pA, czas trwania 100 ms) w trybie current clamp. Neurony wybrano do rejestracji w tym samym skrawku, ale w skrajnie przeciwległych obszarach NM. (A,B) Reprezentatywne odpowiedzi neuronalne w pojedynczym skrawku koronalnym wskazujące na względne właściwości izoczęstotliwościowe z subtelnymi różnicami. Właściwości odpowiedzi reprezentują dwa różne neurony MF zarejestrowane z najbardziej przyśrodkowej (A) i bocznej (B) części NM w skrawku koronalnym. (C,D) Reprezentatywne rejestracje neuronalne z pojedynczego skrawka strzałkowego. Rejestracje pokazują odpowiednio odpowiedź NM LF (C) oraz odpowiedź NM HF (D), co podkreśla istotne różnice w gradiencie tonotopowym w obrębie jednego przekroju strzałkowego. Skróty: NM = nucleus magnocellularis; LF = neurony o względnio niskiej częstotliwości; MF = neurony o średniej częstotliwości; HF = neurony o wysokiej częstotliwości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat mikroskopowy widoków grzbietowego i brzusznego, z wyróżnionymi płatami nerwowymi i cechami lokomocyjnymi.
Rycina 4Reprezentatywne poziome skrawki seryjne pnia mózgu. (A, B) Lewo: przekroje wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej, jądra słuchowe zaznaczono białymi przerywanymi okręgami. 8th dośrodkowe włókna nerwów czaszkowych łączą się z jądrami słuchowymi zaznaczonymi strzałką. Środkowy wstawka stanowi powiększony widok obszaru jąder słuchowych, w którym jądra słuchowe zostały zaznaczone białymi liniami przerywanymi; przedstawiono regiony NM i NL. Wyraźne przesunięcie topologiczne jąder słuchowych jest widoczne w A,B. (A,B) Prawa strona: szeroki widok satelitarny przedstawiający aNM i bNL. Prawy wstawek przedstawia jądra słuchowe obserwowane przy 60-krotnym powiększeniu obiektywu oraz zakrzywioną oś topologiczną od LF do HF wzdłuż osi kaudo-lateralnej do rostralno-medialnej. Skróty: NM = nucleus magnocellularis; NL = nucleus laminaris; LF = neurony o względnio niskiej częstotliwości; HF = neurony o wysokiej częstotliwości; L = boczny; R = rostralny; C = kaudalny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat histologiczny; analiza struktur mózgu w płaszczyźnie boczno-przyśrodkowej z warstwami neuronów i orientacją włókien.
Rycina 5: Reprezentatywne poziome/poprzeczne seryjne przekroje pod ostrym kątem (45°). (A-C) Po lewej: seryjne przekroje pnia mózgu, jądra słuchowe zaznaczone białą przerywaną linią. Środkowa wstawka przedstawia powiększony widok obszaru słuchowego. (A) Środkowa wstawka pokazuje największy rozrzut neuronów NM i NL w tych przekrojach. (B,C) Środkowa wstawka: jądra słuchowe zaznaczone białymi przerywanymi liniami wykazują stopniową zmianę topologiczną w porównaniu do (A-C). Po prawej: wstawka satelitarna pokazująca jądra słuchowe a: NM i b: NL przy powiększeniu obiektywu 60x. Oś tonotopowa od obszarów LF do HF w NM i NL obraca się kątowo od przekrojów bocznych do przyśrodkowych. Skróty: NM = nucleus magnocellularis; NL = nucleus laminaris; LF = neurony względnie niskich częstotliwości; HF = neurony wysokich częstotliwości; V = brzuszny; R = rostralny; D = grzbietowy; C = ogonowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wideo uzupełniające S1: Hiperpolaryzujące i depolaryzujące wstrzyknięcia prądu somatycznego. Właściwości odpowiedzi neuronu niskoczęstotliwościowego i wysokoczęstotliwościowego na 100 ms wstrzyknięcia prądu somatycznego w trybie clamp prądowy. Neurony wybrano z tego samego strzałkowego skrawka pnia mózgu. Wstrzyknięcia obejmują zakres od -100 do +200 pA w krokach co +10 pA, o czasie trwania 100 ms. Potencjały czynnościowe są widoczne w odpowiedzi na wystarczające depolaryzujące skoki prądu. Wideo odpowiada końcowym śladom przedstawionym na Rysunku 3C. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Wideo uzupełniające S2: Hiperpolaryzujące i depolaryzujące wstrzyknięcia prądu somatycznego. Podobnie jak w Wideo uzupełniającym S1, film ten przedstawia właściwości odpowiedzi neuronu niskoczęstotliwościowego i wysokoczęstotliwościowego na 100 ms wstrzyknięcia prądu somatycznego w trybie clamp prądowym. Neurony wybrano z tego samego strzałkowego skrawka pnia mózgu. Wstrzyknięcia obejmują zakres od -100 do +200 pA w krokach co +10 pA, o czasie trwania 100 ms. Potencjały czynnościowe są widoczne w odpowiedzi na odpowiednie depolaryzujące skoki prądu. Wideo odpowiada końcowym przebiegom pokazanym na Rysunku 3D. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Przekroje koronalne embrionalnej tkanki pnia mózgu kurczaka pozwoliły na badanie względnej indywidualnej blaszki o częstotliwości izoseksualnejprzez dziesięciolecia 1,2,5. Jednak tonotopowa (tj. częstotliwościowa) organizacja słuchowego pnia mózgu kurczaka jest topologicznie zawiła i może być bardziej dostępna w innych osiach anatomicznych w zależności od konkretnego pytania badawczego. Chociaż jest to wystarczające do zbadania anatomicznych i fizjologicznych kwestii odnoszących się do poszczególnych regionów o częstotliwości izoczęstotliwości, badanie zmian tonotopowych i ich rozwoju w większych obszarach słuchowych pnia mózgu jest nieco ograniczone przez przekroje koronalne. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, protokół ten opisuje podejścia w płaszczyźnie strzałkowej, poziomej i poziomej/poprzecznej, aby dostarczyć dodatkowych przykładów słuchowej tkanki pnia mózgu, która wykazuje maksymalne właściwości tonotopowe i gradienty w pojedynczym odcinku pnia mózgu.

Strzałkowe odcinki słuchowych obszarów pnia mózgu pokazują, że różne obszary tonotopowe są rozmieszczone w większym regionie w obrębie wycinka w porównaniu z odcinkami koronalnymi (strzałkowy obszar słuchowy = ~ 300-600 μm, obszar słuchowy koronalny = ~ 200-350 μm). Na przykład regiony NM i NL uwidoczniono na większym obszarze wzdłuż osi ostro-ogonowej w przekrojach strzałkowych (np. Ryc. 2B), a funkcjonalny gradient tonotopowy, który biegnie wzdłuż tej osi anatomicznej, był w dużej mierze zawarty w pojedynczym wycinku strzałkowym. Zostało to dodatkowo potwierdzone zapisami cęgów prądowych wewnętrznych różnic neuronalnych, które zmieniają się wzdłuż gradientu rostralno-ogonowego, jak wcześniej zgłoszono 14,15 (np. Figura 3C, D). Przyszłe eksperymenty, które podkreślą właściwości anatomiczne i immunohistochemiczne wzdłuż osi tonotopowej, mogą dokładniej zbadać znane gradienty właściwości słuchowych w obrębie pojedynczej strzałkowej płaszczyzny warstwy. Należą do nich między innymi barwienie MAP2 i wzorce ekspresji kanału potasowego, które są znanymi gradientami architektury dendrytycznej i wewnętrznych właściwości NM i NL, które zostały wcześniej wykazane w kolejnych sekcjach koronalnych16.

Poziome odcinki słuchowych obszarów pnia mózgu pokazują, że NM i NL znajdują się w kierunku linii środkowej. Część słuchowych włókien aksonalnych biegnie po przekątnej lub prostopadle do płaszczyzny poziomej (ryc. 4). Za tymi włóknami można podążać, wykonując ostry kątowy plaster pod kątem 45° do płaszczyzny strzałkowej. Powstałe poziome/poprzeczne warstwy były większe niż plastry strzałkowe lub poziome, a długie włókna aksonalne przebiegały przez oś ostro-ogonową zarówno po stronie ipsilateralnej, jak i przeciwległej. Zarówno NM, jak i NL można wizualizować w większym obszarze przekątnej (~400-700 μm), dzięki czemu połączenia kontralateralne można wizualizować wzdłuż osi boczno-przyśrodkowej. Dodatkowo, pozioma/poprzeczna płaszczyzna przekroju pokazuje również, w jaki sposób obszary słuchowe i wynikający z tego gradient tonotopowy dokonują zwrotu kątowego (ryc. 5). Kątowa ekspozycja połączeń kontralateralnych na większym obszarze sprawia, że wycinki te są bardziej odpowiednie do stymulacji elektrofizjologicznej i badań mikroobwodów niż tradycyjne plastry koronalne.

Dodatkowe atuty
Tworzenie mikroobwodów słuchowych wymaga czasoprzestrzennej koordynacji sygnałów, które sprzyjają przetrwaniu neuronów, synaptogenezie, różnicowaniu aksonów, architekturze dendrytycznej i dojrzewaniu. W ten sposób alternatywne sekcje pnia mózgu mikroukładu słuchowego zarodka kurzego mogą być wykorzystane do następujących tematów badawczych: morfologiczna organizacja neuronów w topograficznie różnych wymiarach; organizowanie i mapowanie konektomów wszystkich jąder słuchowych i przedsionkowych; identyfikacja i charakterystyka wzorców aktywności składników obwodów w płaszczyznach izoczęstotliwości i tonotopów; topograficzna organizacja mikroobwodów pobudzających i hamujących oraz relacje z wyspecjalizowanymi populacjami neuronów (jądrami); lokalizacja przestrzenna neuronów jąder słuchowych i ich predykcyjna mukowiscydoza17; systematyczne celowanie w określone tonotopowe typy neuronów; śledzenie komórek progenitorowych i ich rozwoju w konserwatywne jądra; genetyczna linia komórek do ewolucji obwodów neuronalnych18; porównawcza anatomia pnia mózgu między gatunkami; badanie obwodów przedsionkowych, takich jak kompleks przedsionkowy Deitera (DC)19; oraz synchronizacja i przesłuch między jądrami przedsionkowymi.

Wieloaspektowe podejście wykorzystujące różne płaszczyzny warstw może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące nieznanych właściwości anatomicznych i biofizycznych mikroobwodów pnia mózgu. Dobrym przykładem jest związek między głównymi jądrami słuchowymi (NM, NA, NL i SON) a jądrami przedsionkowymi, w tym jądrem grzbietowym lemniscusa bocznego (LLDp), jądrem półksiężycowatym (SLu)20 i jądrem stycznym (TN)3. Jednak ten protokół i te badania oparte na wycinkach mają pewne ograniczenia.

Środki ostrożności i ograniczenia
W zależności od instytucji przeprowadzającej eksperymenty, wytyczne etyczne i postępowanie z zarodkami kurczaków mogą się różnić. Podczas gdy wytyczne National Institutes of Health dotyczące opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych zezwalają na szybkie ścięcie głowy, istnieją alternatywne metody eutanazji zarodkówkurczaków. Wcześnie rozwijająca się tkanka pnia mózgu zarodka kurczaka jest miękka i delikatna w porównaniu ze starszymi zarodkami. Ma kilka połączeń i naczyń krwionośnych na powierzchni, które wymagają szczególnej ostrożności podczas ich usuwania. Tkanka powinna być przechowywana w lodowatym dACSF i perfuzji z 95% O2/5% CO2 w celu zwiększenia żywotności.

Metoda krojenia strzałkowego jest przydatna tylko w tonotopii ipsilateralnej. Ta metoda krojenia zapewnia większe plasterki niż plastry koronalne, których obsługa może być niepewna. Można jednak przycinać plastry za pomocą metod krzyżowych opisanych szczegółowo w innym miejscu22. Użycie 4% bloku agarozy LMP osadzonego w pniu mózgu może uratować delikatne struktury w plastrach, ale należy uważać, aby nie wlać zbyt gorącej agarozy. Szybkie ustawienie poprzez umieszczenie zablokowanego przez agarozę pnia mózgu w chłodnym środowisku na ~1 minutę sprawia, że plasterki są bardziej opłacalne w przypadku nagrań elektrofizjologicznych.

Nakładanie superglue w nadmiernych ilościach może być toksyczne. Należy go nakładać w minimalnym stopniu, a nadmiar należy natychmiast zmyć poprzez wymianę dACSF. W przypadku plastrów o ostrym kącie (45°) cięcie kąta bloku agarozy ma kluczowe znaczenie; Można użyć lustra, aby zobaczyć przedni kąt podczas cięcia bloku agarozy ostrym ostrzem. Dostępne w handlu ostrza mogą mieć powłokę woskową, którą należy zetrzeć alkoholem i wysuszyć przed użyciem. Wymagana jest optymalizacja szybkości i częstotliwości cięcia wibratomu, ponieważ kępki włókien aksonalnych są twardsze niż tkanka korowa lub macierzowa. Utrzymanie wysokiej amplitudy i stosowanie schłodzonego roztworu preparacyjnego może zapobiec uszkodzeniu tkanek.

Wszystkie roztwory powinny być przygotowane świeże, a Ca2+ i Mg2+ należy dodać do ACSF po bulgotaniu 95% O2/5% CO2 . W przeciwnym razie mogą wystąpić opady Ca2+. Do delikatnego obchodzenia się z plastrami w wibratomie należy użyć pędzla. Jeśli to możliwe, utrzymuj całkowity czas krojenia poniżej 15 minut. Szklana pipeta Pasteura może być używana do manewrowania plasterkami pnia mózgu.

Nie używaj detergentów ani środków piorących do szkła i sprzętu, który ma kontakt z plastrami stosowanymi w elektrofizjologii. Wykonane zdjęcia przedstawiają wygląd tkanki o grubości 200-300 μM w optyce z kontrastem interferencyjnym (DIC). Jakość wizualna będzie gorsza niż immunohistochemia czy mikroskopia elektronowa, ale dokładnie oddaje to, co zobaczy eksperymentator podczas wykonywania zapisów elektrofizjologicznych.

Badania dotyczące wczesnego rozwoju mikroobwodów wzdłuż alternatywnej osi anatomicznej, niezależnie od tego, czy są one grzbietowo-brzuszne, rostralno-ogonowe, czy ipsilateralno-przeciwstronne, są ograniczone w słuchowym pniu mózgu kurczaka. Jednym z powodów takiego stanu rzeczy jest to, że rola kodów transkrypcyjnych i regulacja rozwoju tonotopowego w pniu mózgu wciąż nie jest w pełni poznana. Zjawiska funkcjonalne, takie jak modulacja odgórna i spontaniczna aktywność, są często tracone podczas obserwacji aktywności in vitro. Jednak badania in vivo są uzupełniane specyficznymi i bezpośrednimi zapisami pojedynczych neuronów, które są możliwe tylko w tych warunkach warstwowych. Udoskonalenie metody pozyskiwania tkanki pnia mózgu w różnych orientacjach może dostarczyć wnikliwych informacji na temat rozwoju i złożoności gradientów tonotopowych w mikroobwodach słuchowych pnia mózgu kurczaków.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy oświadczają, że badanie zostało przeprowadzone bez jakiegokolwiek interesu komercyjnego lub finansowego oraz że nie mają żadnego konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez grant NIH/NIDCD R01 DC017167. Dziękujemy Kristine McLellan za komentarze redakcyjne do wcześniejszej wersji rękopisu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Adobe Photoshop 2021Adobe
Stół antywibracyjny 30"x 36" - OTMC - 63533TMC
Standardowe oprogramowanie Cell sensURZĄDZENIA
Digidata 1440A Wzmacniacz
linearslicer pro7TED PELLA, INC
Mikromanipulator MPC-385 / OSI-MPC-385-2OLYMPUS AMERICA INC
Ściągacz do mikropipet P-97SUTTER INSTRUMENTS Mikroskop
BX51W1OLYMPUS AMERICA INC
MS ICE oprogramowanieMicrosoft Corporation
Ohaus model wagi AV212Ohaus Kamera Adventurer
Olympus DPSI0 / DPS80Oprogramowanie do
pClamp i AxoclampURZĄDZENIA MOLEKULARNE
pH-metr lab 850 stacjonarneSCHOTT INSTRUMENTS
Ostre ostrze ze stali nierdzewnejDorco/Personna
Osmometr ciśnienia pary model 5600WESCOR INC
Systemy uzdatniania wody Smart2pure 6UV/UFThermo Scientific
Chemicals- lista
Agrose Niskotopliwy IB70051IBI SCIENTIFIC
CaCl2 (Chlorek wapnia)ACROS organics
Cynergy klej błyskawiczny CA6001Resinlab
Dekstroza (D-(+)-glukoza)VWR Life Science
Alkohol etylowyIBI SCIENTIFIC
KCl (chlorek potasu)Amresco.Inc
MgCl2 (Chlorek magnezu)Sigma-Aldrich
NaCl (Chlorek sodu)Amresco.Inc
NaH2PO4 (Diwodorofosforan sodu)Amresco.Inc
NaHCO3 (wodorowęglan sodu)Amresco.Inc
MOLEKULARNE OLYMPUS cyfrowy  Multiclamp 700B Urządzenia molekularne Linia DSK akwizycji danych OLYMPUS

Bibliografia

  1. Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. Journal of Comparative Neurology. 164 (4), 411-433 (1975).
  2. Rubel, E. W., et al. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. Journal of Comparative Neurology. 166 (4), 469-489 (1976).
  3. Shao, M., et al. Spontaneous synaptic activity in chick vestibular nucleus neurons during the perinatal period. Neuroscience. 127 (1), 81-90 (2004).
  4. Fukui, I., Ohmori, H. Tonotopic gradients of membrane and synaptic properties for neurons of the chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 24 (34), 7514-7523 (2004).
  5. Sanchez, J. T., Seidl, A. H., Rubel, E. W., Barria, A. Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices. Journal of Visualized Experiments. (49), e2527(2011).
  6. Sanchez, J. T., Lu, Y. Glutamate signaling in the auditory brainstem. Auditory Development and Plasticity: Springer Handbook of Auditory Research. Fay, R. R., Popper, A. N., Cramer, K., Coffin, A. 64 (4), Springer. New York, NY. 75-108 (2017).
  7. Parks, T. N. Morphology of axosomatic endings in an avian cochlear nucleus: nucleus magnocellularis of the chicken. Journal of Comparative Neurology. 203 (3), 425-440 (1981).
  8. Jhaveri, S., Morest, D. K. Sequential alterations of neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the developing chicken: a Golgi study. Neuroscience. 7 (4), 837-853 (1982).
  9. Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
  10. Köppl, C. Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies. Journal of Comparative Neurology. 339 (3), 438-446 (1994).
  11. Fukui, I., et al. Improvement of phase information at low sound frequency in nucleus magnocellularis of the chicken. Journal of Neurophysiology. 96 (2), 633-641 (2006).
  12. Wang, X., et al. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
  13. Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628(2017).
  14. Hong, H., Sanchez, J. T. Need for speed and precision: structural and functional specialization in the cochlear nucleus of the avian auditory system. Journal of Experimental Neuroscience. (12), 1-16 (2018).
  15. Hong, H., et al. Diverse intrinsic properties shape functional phenotype of low-frequency neurons in the auditory brainstem. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-24 (2018).
  16. Wang, X., Hong, H., Brown, D. H., Sanchez, J. T., Wang, Y. Distinct neural properties in the low-frequency region of the chicken cochlear nucleus magnocellularis. eNeuro. 4 (2), 1-26 (2017).
  17. Tabor, K. M., et al. Tonotopic organization of the superior olivary nucleus in the chicken auditory brainstem. Journal of Comparative Neurology. 520 (7), 1493-1508 (2012).
  18. Lipovsek, M., Wingate, R. J. Conserved and divergent development of brainstem vestibular and auditory nuclei. Elife. 7, 40232(2018).
  19. Passetto, M. F., et al. Morphometric analysis of the AMPA-type neurons in the Deiter's vestibular complex of the chick brain. Journal of Chemical Neuroanatomy. 35 (4), 334-345 (2008).
  20. Curry, R. J., Lu, Y. Intrinsic properties of avian interaural level difference sound localizing neurons. Brain Research. 1752, 147258(2021).
  21. Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX - Alternatives to Animal Experimentation. 32 (2), 143-147 (2015).
  22. Palkovits, M. Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat. Brain Research. 14 (59), 449-450 (1973).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Krojenie pnia mózgurozwój mikroobwodówprzekroje wieńcoweprzekroje strzałkoweprzekroje poziomeeksperymenty elektrofizjologicznejądro wielkokomórkowejądro laminarne
Krojenie embrionalnego słuchowego pnia mózgu kurczaka w celu oceny gradientów tonotopowych i mikroobwodów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.