Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo) Pozytonowa tomografia emisyjna w celu ujawnienia wzorców aktywności wywołanych głęboką stymulacją mózgu u szczurów

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63478

⸱

23 marca 2022

 ,  ,  ,  , 
1Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), 2Laboratorio de Imagen Médica, Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón, 3Departamento de Bioingeniería e Ingeniería Aeroespacial, Universidad Carlos III de Madrid, 4CIBER de Salud Mental (CIBERSAM), 5High Performance Research Group in Physiopathology and Pharmacology of the Digestive System (NeuGut), Universidad Rey Juan Carlos

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy przedkliniczną eksperymentalną metodę oceny neuromodulacji metabolicznej wywołanej przez ostrą głęboką stymulację mózgu za pomocą in vivo FDG-PET. Manuskrypt ten obejmuje wszystkie etapy eksperymentalne, od chirurgii stereotaktycznej po zastosowanie leczenia stymulacją oraz pozyskiwanie, przetwarzanie i analizę obrazów PET.

Streszczenie

Głęboka stymulacja mózgu (DBS) to inwazyjna technika neurochirurgiczna polegająca na zastosowaniu impulsów elektrycznych do struktur mózgu zaangażowanych w patofizjologię pacjenta. Pomimo długiej historii DBS, jego mechanizm działania i odpowiednie protokoły pozostają niejasne, co podkreśla potrzebę badań mających na celu rozwiązanie tych zagadek. W tym sensie ocena efektów DBS in vivo przy użyciu technik obrazowania funkcjonalnego stanowi potężną strategię określania wpływu stymulacji na dynamikę mózgu. W tym miejscu opisano protokół eksperymentalny dla modeli przedklinicznych (szczury Wistar), połączony z badaniem podłużnym [18F]-fluorodeoksyklokozowa pozytonowa tomografia emisyjna (FDG-PET), w celu oceny ostrych konsekwencji DBS dla metabolizmu mózgu. Najpierw zwierzęta przeszły operację stereotaktyczną w celu obustronnego wszczepienia elektrod do kory przedczołowej. Pobrano pooperacyjną tomografię komputerową (CT) każdego zwierzęcia w celu sprawdzenia umieszczenia elektrod. Po tygodniu rekonwalescencji pobrano pierwszy statyczny FDG-PET u każdego operowanego zwierzęcia bez stymulacji (D1), a dwa dni później (D2) pobrano drugi FDG-PET podczas stymulacji zwierząt. W tym celu elektrody podłączono do izolowanego stymulatora po podaniu FDG zwierzętom. W ten sposób zwierzęta stymulowano w okresie wychwytu FDG (45 min), rejestrując ostry wpływ DBS na metabolizm mózgu. Biorąc pod uwagę eksploracyjny charakter tego badania, obrazy FDG-PET analizowano za pomocą podejścia wokselowego opartego na sparowanym teście T między badaniami D1 i D2. Ogólnie rzecz biorąc, połączenie DBS i badań obrazowych pozwala opisać konsekwencje neuromodulacji w sieciach neuronowych, ostatecznie pomagając rozwikłać zagadki otaczające DBS.

Wprowadzenie

Termin neurostymulacja obejmuje szereg różnych technik mających na celu stymulację układu nerwowego w celu terapeutycznym1. Wśród nich głęboka stymulacja mózgu (DBS) wyróżnia się jako jedna z najbardziej rozpowszechnionych strategii neurostymulacji w praktyce klinicznej. DBS polega na stymulacji głębokich jąder mózgu impulsami elektrycznymi dostarczanymi przez neurostymulator, wszczepiany bezpośrednio do ciała pacjenta, za pośrednictwem elektrod umieszczonych w celu mózgowym w celu modulacji za pomocą operacji stereotaktycznej. Liczba artykułów oceniających wykonalność zastosowania DBS w różnych zaburzeniach neurologicznych i psychiatrycznych stale rośnie2, chociaż tylko niektóre z nich zostały zatwierdzone przez Stowarzyszenie Żywności i Leków (FDA) (np. drżenie samoistne, choroba Parkinsona, dystonia, zaburzenie obsesyjno-kompulsywne i padaczka oporna na leczenie)3. Co więcej, wiele celów mózgowych i protokołów stymulacji jest w trakcie badań nad leczeniem DBS znacznie większej liczby patologii niż oficjalnie zatwierdzone, ale żadna z nich nie jest uważana za ostateczną. Te niespójności w badaniach DBS i procedurach klinicznych mogą częściowo wynikać z braku pełnego zrozumienia jego mechanizmu działania4. W związku z tym podejmowane są ogromne wysiłki, aby rozszyfrować wpływ DBS in vivo na dynamikę mózgu, ponieważ każdy, nawet najmniejszy postęp, pomoże udoskonalić protokoły DBS w celu uzyskania większego sukcesu terapeutycznego.

W tym kontekście, techniki obrazowania molekularnego otwierają bezpośrednie okno do obserwacji in vivo neuromodulujących efektów DBS. Podejścia te dają możliwość nie tylko określenia wpływu DBS podczas jego stosowania, ale także rozwikłania natury jego konsekwencji, zapobiegania niepożądanym skutkom ubocznym i poprawy klinicznej, a nawet dostosowania parametrów stymulacji do potrzeb pacjenta5. Wśród tych metod szczególnie interesująca jest pozytonowa tomografia emisyjna (PET) z użyciem 2-deoksy-2-[18F]fluoro-D-glukozy (FDG), ponieważ dostarcza specyficznych i w czasie rzeczywistym informacji na temat stanu aktywacji różnych regionów mózgu6. W szczególności obrazowanie FDG-PET zapewnia pośrednią ocenę aktywacji neuronalnej w oparciu o fizjologiczną zasadę sprzężenia metabolicznego między neuronami a komórkami glejowymi6. W tym sensie kilka badań klinicznych wykazało wzorce aktywności mózgu modulowane przez DBS przy użyciu FDG-PET (patrz3 do przeglądu). Niemniej jednak badania kliniczne łatwo napotykają na kilka wad, gdy koncentrują się na pacjentach, takich jak heterogeniczność czy trudności z rekrutacją, które mocno ograniczają ich potencjał badawczy6. Kontekst ten skłania badaczy do wykorzystywania zwierzęcych modeli ludzkich schorzeń do oceny podejść biomedycznych przed ich klinicznym przełożeniem lub, jeśli są już stosowane w praktyce klinicznej, do wyjaśnienia fizjologicznego pochodzenia korzyści terapeutycznych lub skutków ubocznych. Tak więc, pomimo dużych odległości między patologią człowieka a modelowanym stanem u zwierząt laboratoryjnych, te podejścia przedkliniczne są niezbędne do bezpiecznego i skutecznego przejścia do praktyki klinicznej.

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalny protokół DBS dla modeli mysich, połączony z podłużnym badaniem FDG-PET, w celu oceny ostrych konsekwencji DBS dla metabolizmu mózgu. Wyniki uzyskane za pomocą tego protokołu mogą pomóc w rozwikłaniu skomplikowanych wzorców modulacyjnych indukowanych przez DBS na aktywność mózgu. W związku z tym zapewniona jest odpowiednia strategia eksperymentalna do zbadania in vivo konsekwencji stymulacji, co pozwala klinicystom przewidywać efekty terapeutyczne w określonych okolicznościach, a następnie dostosować parametry stymulacji do potrzeb pacjenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury badawcze z udziałem zwierząt przeprowadzono zgodnie z dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich 2010/63/EU, za zgodą Komitetu Etyki ds. Eksperymentów na Zwierzętach Szpitala Gregorio Marañón. Graficzne podsumowanie protokołu eksperymentalnego przedstawiono na Rysunku 1A.

1. Lokalizacja celu w mózgu za pomocą neuroobrazowania in vivo

  1. Przygotowanie zwierząt
    UWAGA: Wykorzystano samce szczurów Wistar o masie ok. 300 g.
    1. Umieścić zwierzę w komorze indukcyjnej do znieczulenia i szczelnie zamknąć górną pokrywę.
    2. Włączyć parownik sewofluranu (5% do indukcji w 100% O2). Po znieczuleniu szczura przekierować przepływ gazu do maski nosowej. Potwierdzić stan znieczulenia, ściskając łapę szczura.
    3. Ułożyć zwierzę na plecach na stole do tomografii komputerowej (CT), utrzymując znieczulenie sewofluranem (3% do podtrzymania w 100% O2).
  2. Obrazowanie CT
    UWAGA: Dobór natężenia prądu, napięcia, liczby projekcji, liczby ujęć oraz rozdzielczości wokseli zależy od tomografu komputerowego. W niniejszej procedurze zastosowano następujące parametry: 340 mA, 40 KV, 360 projekcji, 8 ujęć oraz rozdzielczość 200 µm7,8,9.
    1. Przymocować maskę twarzową lub nosową do szczura.
    2. Unieruchomić ciało szczura w obrębie głowy, barków, bioder i ogona za pomocą jedwabnej taśmy, aby zapewnić wystarczającą stabilizację bez powodowania obrażeń.
    3. stale monitorować stan szczura.
    4. Ustawić głowę w centrum pola widzenia tomografu komputerowego.
    5. Przystąpić do akwizycji obrazu CT, stosując parametry akwizycji zgodne ze specyfikacją skanera.
    6. Po 10 min, po zakończeniu badania CT in vivo, zatrzymać przepływ sewofluranu i umieścić szczura w skanerze MRI.
  3. Obrazowanie MR
    UWAGA: Specyfikacje akwizycji skanowania różnią się w zależności od skanerów, w tym od systemów oprogramowania, a przede wszystkim od konkretnego pytania badawczego. W niniejszej procedurze wykorzystano skaner 7-Tesla. Zastosowano sekwencję spin-echo ważoną T2 7,8,9 z TE = 33 ms, TR = 3732 ms, grubością warstwy 0,8 mm (34 warstwy), rozmiarem macierzy 256 x 256 pikseli oraz FOV 3,5 x 3,5 cm2.
    1. Ułożyć zwierzę na plecach na stole do MRI, utrzymując znieczulenie sewofluranem (3% do podtrzymania w 100% O2).
    2. Przymocować głowę do ramy stereotaktycznej umieszczonej na stole skanera, aby uniknąć ruchów głowy podczas akwizycji MRI. Resztę ciała szczura zabezpieczyć jedwabną taśmą.
    3. Ustawić głowę w centrum pola widzenia skanera MRI.
    4. Po prawidłowym ustawieniu pozycji przystąpić do akwizycji obrazu MRI.
    5. Po zakończeniu skanowania MRI in vivo zatrzymać przepływ sewofluranu i umieścić szczura w klatce.
    6. Umieścić lampę grzewczą w pobliżu klatki, ponieważ szczury zazwyczaj obniżają temperaturę ciała podczas skanowania.
    7. Monitorować szczura aż do pełnego wybudzenia z narkozy.
  4. Kolokalizacja z atlasem i obliczanie współrzędnych celu
    1. Po uzyskaniu i zrekonstruowaniu obrazów CT i MRI zgodnie z zaleceniami producenta skanera, przeprowadzić korejestrację obrazów CT i MRI.
    2. Użyć oprogramowania do przetwarzania obrazów w celu normalizacji przestrzennej obrazów CT i MRI przy użyciu automatycznego algorytmu rejestracji sztywnej opartej na wzajemnej informacji (mutual information)10.
    3. Zlokalizować linię Bregma na skorejestrowanym obrazie i zmierzyć odległość w osi przedniej/tylnej (AP: +3,5 mm), środkowej/bocznej (ML: +0,6 mm) oraz grzbietowo-brzusznej (DV: -3,4 mm) od Bregma do celu (tj. przyśrodkowej kory przedczołowej, mPFC), zgodnie z atlasem mózgu szczura Paxinosa i Watsona11.
      UWAGA: Współrzędne od Bregma do celu mogą różnić się między szczurami w zależności od ich masy, wielkości, płci i rasy.

2. Operacja stereotaktyczna

UWAGA: Przed użyciem należy wysterylizować w autoklawie cały sprzęt chirurgiczny, implanty oraz aparaturę stereotaktyczną, a także zdezynfekować obszar zabiegowy, aby uniknąć infekcji i powikłań, które mogą wpłynąć na dobrostan zwierząt. Należy używać sterylnych rękawiczek chirurgicznych i przykryć zwierzę lepkimi obłożeniami, aby zapobiec kontaminacji.

  1. Przygotowanie zwierzęcia i znieczulenie
    1. Dzień przed operacją zwierzętom podano buprenorfinę w dawce 0,1 mg/kg drogą doszpikową. Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej do znieczulenia i zamknij górną pokrywę.
    2. Włącz parowar sewofluranu (5% do indukcji w 100% O2).
    3. Gdy szczur straci przytomność, wyłącz parowar sewofluranu i wyjmij szczura z komory.
    4. Podaj drogą doszpikową mieszaninę ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg), aby znieczulić zwierzę.
    5. Odczekaj, aż zwierzę zostanie całkowicie znieczulone. Sprawdź poziom znieczulenia, uciskając obszar między palcami.
    6. Ogól obszar między uszami a oczami.
  2. Umieszczenie w ramie stereotaktycznej i kraniotomia
    1. Umieść zwierzę w pozycji brzusznej w ramie stereotaktycznej i użyj adaptera do mocowania głowy szczurów, aby utrzymać zwierzę w prawidłowej pozycji podczas operacji.
    2. Zapewnij unieruchomienie głowy za pomocą prętów usznych dla szczurów. Zachowaj ostrożność podczas wkładania prętów usznych, ponieważ zbyt głębokie wprowadzenie może uszkodzić błonę bębenkową.
    3. Nałóż na oczy nawilżający żel oftalmiczny, aby zapobiec ich wysychaniu podczas operacji, i przykryj je sterylną gazą.
    4. Przykryj zwierzę lepkimi draperiami, aby zapobiec kontaminacji.
    5. Nanieś roztwór jodopowidonu na ogolony obszar i oczyść go sterylną gazą.
    6. Nałóż mewiwakainę w żelu na ogolony obszar, aby znieczulić lokalnie to miejsce.
    7. Wykonaj podłużne nacięcie skóry nad czaszką między uszami, rozciągając je na 1,5-2 cm od lambda do Bregma (tj. od wierzchołka czaszki w kierunku oczu).
    8. Odsłoń czaszkę za pomocą 2 lub 3 kleszczyków. Usuń okostną za pomocą patyczka higienicznego i oczyść krew roztworem soli fizjologicznej, aby odsłonić Bregma i szwy strzałkowe. Usuń nadmiar soli fizjologicznej gazą.
    9. Zadrap powierzchnię czaszki skalpelem, aby poprawić przyczepność cementu dentystycznego. Oczyść obszar patyczkiem higienicznym nasączonym nadtlenkiem wodoru.
  3. Umieszczenie elektrod i mocowanie do czaszki
    1. Wyprostuj elektrody plastikową pęsetą, aby zapewnić ich prawidłowe umieszczenie podczas operacji.
      UWAGA: W tym protokole stosuje się koncentryczne bipolarne elektrody platynowo-irydowe wraz z elektrodą uziemiającą.
    2. Umieść jedną elektrodę w uchwycie prawego ramienia ramy stereotaktycznej.
      UWAGA: Może być konieczne dostosowanie uchwytu do elektrody w celu lepszego jej zamocowania (patrz Rysunek 1B). Upewnij się, że elektroda jest równoległa do osi uchwytu.
    3. Przesuń prawe ramię z elektrodą w ramach ramy stereotaktycznej i umieść końcówkę elektrody dokładnie nad Bregma. Postaraj się zbliżyć końcówkę elektrody jak najbliżej czaszki, ale bez dotykania jej, aby uniknąć odkształcenia elektrody, i zapisz wynikające z tego współrzędne dla Bregma dostarczone przez ramę stereotaktyczną. Zaznacz na czaszce początną pozycję elektrody za pomocą pisaka chirurgicznego.
    4. Przesuń uchwyt do współrzędnych AP i ML uzyskanych w kroku 1.4.3 i zaznacz na czaszce pisakiem chirurgicznym pozycję docelową elektrody.
    5. Usuń prawe ramię ramy stereotaktycznej trzymające elektrodę. Uważaj, aby elektrodą niczego nie dotknąć.
    6. Za pomocą małego wiertła elektrycznego wykonaj otwór w czaszce (o średnicy około 1-1,5 mm) w pozycji docelowej, aż do momentu, gdy pojawi się opona twarda. Zatamuj wszelkie krwawienie za pomocą patyczka higienicznego.
    7. Wywierć 4 otwory w czaszce, aby umieścić 4 śruby (najlepiej stalowe śruby o długości 2-3 mm), co zwiększy powierzchnię przyczepności cementu dentystycznego i pozwoli na umieszczenie uziemienia. Zamontuj 4 śruby.
    8. Ustaw prawe ramię ramy stereotaktycznej z właściwą elektrodą. Przesuń ramię do obliczonej pozycji, która powinna pokrywać się z otworem. Następnie opuść elektrodę, aż dotknie opony twardej. Pozycja ta będzie służyć jako poziom 0 w kierunku DV.
    9. Wprowadź końcówkę elektrody w kierunku DV, korzystając z pozycji DV z kroku 1.4.3. Oczyść krew i płyn mózgowo-rdzeniowy wokół obszaru elektrody za pomocą patyczka higienicznego.
    10. Przymocuj uziemienie do jednej ze śrub znajdujących się najbliżej elektrody.
    11. Nałóż cement dentystyczny wokół elektrody i śrub, dbając o uformowanie cementu tak, aby uniknąć ostrych krawędzi, które mogłyby zranić zwierzę. Cement dentystyczny nakłada się warstwowo, aby zapobiec przegrzaniu/urazowi termicznemu tkanki lub czaszki. Grubsze warstwy wymagają więcej czasu na utwardzenie przed dodaniem kolejnych warstw. Upewnij się, że cement dentystyczny jest całkowicie utwardzony przed wyjęciem elektrody z uchwytu.
      OSTROŻNIE: Przygotowanie cementu dentystycznego powoduje wydzielanie toksycznych oparów z mieszaniny, co trwa do momentu stwardnienia cementu. Dlatego od tego momentu aż do końca operacji należy nosić maskę ochronną skuteczną przeciwko gazom chemicznym.
    12. Powtórz tę samą procedurę z kroków 2.3.2-2.3.11 dla drugiej półkuli mózgu.
    13. Nałóż więcej cementu dentystycznego, aby utworzyć otulenie, nie zakrywając elektrody. Odczekaj do jego utwardzenia.
    14. Użyj niewchłanialnej plecionej nici jedwabnej 1/0 z igłą trójkątną, aby zaszyć skórę przed i za otuleniem. Jeśli jest to wymagane, usuń szwy niewchłanialne w określonym czasie, zależnie od regionu ciała, w którym się znajdują. Użyj roztworu jodopowidonu do dezynfekcji obszaru chirurgicznego.
    15. Wyjmij szczura z ramy stereotaktycznej.
  4. Obrazowanie CT w celu potwierdzenia umiejscowienia elektrod
    1. Wykonaj kroki 1.2.4-1.2.5 i zapoznaj się z Rysunkiem 1C.
    2. Po zakończeniu skanowania CT in vivo umieść szczura w klatce.
    3. Postępuj zgodnie z krokami 1.3.6. i 1.3.7.
  5. Opieka pooperacyjna
    1. W ramach opieki pooperacyjnej podawaj antybiotyk (ceftriakson, 100 mg/kg, podskórnie) przez 5 dni oraz lek przeciwbólowy (buprenorfina, 0,1 mg/kg, doszpikowo) przez 3 dni. Ten schemat antybiotykoterapii może zostać przedłużony o 5 dni, jeśli wokół otulenia pojawią się jakiekolwiek oznaki infekcji (zaczerwienienie, obrzęk i wysięk).
    2. Codziennie przeprowadzaj oględziny każdego zwierzęcia w poszukiwaniu oznak bólu lub dyskomfortu i oczyszczaj otulenie roztworem jodopowidonu.
    3. Zapewnij intensywną opiekę do 1 tygodnia po operacji.

3. Akwizycja obrazowania PET/CT

UWAGA: Każde zwierzę poddaje się dwóm badaniom PET/CT (tj. wykluczając i podczas podawania DBS) w znieczuleniu inhalacyjnym w celu oceny ostrych efektów wywołanych stymulacją elektryczną. Obie sesje skanowania przebiegają zgodnie z tym samym protokołem akwizycji obrazu i są wykonywane 1 tydzień po operacji (D1, bez stymulacji) oraz 2 dni później (D2, podczas DBS).

  1. Przygotowanie zwierzęcia i znieczulenie
    1. Szczura należy poddać głodówce przez 8-12 h przed każdym skanowaniem PET, aby umożliwić większy wychwyt FDG przez mózg, co poprawia stosunek sygnału do szumu12.
    2. Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej do znieczulenia i zamknij górną pokrywę.
    3. Włącz waporyzator sewofluranu (5% do indukcji w 100% O2).
    4. Gdy szczur zostanie znieczulony, skieruj przepływ gazu do maski nosowej.
  2. Iniekcja FDG i okres wychwytu
    UWAGA: FDG jest radiotracerem, dlatego należy zastosować środki ochrony radiologicznej, aby uniknąć ekspozycji na promieniowanie. Należy potwierdzić, że instytucja posiada wszelkie zezwolenia na pracę ze związkami radioaktywnymi.
    1. Fiolkę z FDG należy przechowywać w szafce wyłożonej ołowiem aż do momentu użycia, aby uniknąć niepożądanej ekspozycji na promieniowanie.
    2. Napełnij strzykawkę o małym rozmiarze igły (~27G) ilością ~37 MBq roztworu FDG w jak najmniejszej objętości, zmierzoną w aktywimetrze.
    3. Umieść podkładkę grzewczą pod ogonem zwierzęcia lub użyj światła podczerwonego, aby rozszerzyć żyły ogonowe.
    4. Gdy żyły boczne staną się widoczne w górnej części ogona, oczyść ten obszar alkoholem sanitarnym (96%).
    5. Wstrzyknij roztwór FDG do jednej z bocznych żył ogonowych, wprowadzając strzykawkę równolegle do przebiegu żyły, z ostrzem igły skierowanym ku górze.
    6. Wyłącz znieczulenie i umieść zwierzę z powrotem w klatce, aby w pełni doszło do wybudzenia pod lampą grzewczą.
    7. Odczekaj 45 min na wychwyt radiotracera przed rozpoczęciem sesji akwizycji obrazów. W tym czasie zwierzę powinno pozostać w stanie czuwania w komorze osłoniętej ołowiem.
    8. W przypadku badania D2, w okresie wychwytu FDG przeprowadź DBS, zgodnie z opisem w sekcji 4 (Podawanie stymulacji elektrycznej).
  3. Akwizycja PET i rekonstrukcja obrazu
    UWAGA: Specyfikacje akwizycji obrazów PET zależą od skanera i czasu skanowania. W tym protokole statyczny obraz PET pozyskiwano przez 45 min przy użyciu skanera PET/CT dla małych zwierząt, stosując okno energetyczne 400-700 keV7,8,9. Przed opracowaniem protokołu akwizycji należy zapoznać się ze specyfikacją sprzętu PET/CT.
    1. 45 min po iniekcji FDG umieść zwierzę w komorze indukcyjnej do znieczulenia i zamknij górną pokrywę.
    2. Włącz waporyzator sewofluranu (5% do indukcji w 100% O2).
    3. Przenieś zwierzę na stół PET/CT i ułóż je w pozycji grzbietnej, mocując nos do maski znieczulającej i utrzymując znieczulenie sewofluranem (3% do podtrzymania w 100% O2). Potwierdź stan znieczulenia poprzez uciśnięcie łapy szczura.
    4. Powtórz kroki 1.2.2 i 1.2.3.
    5. Ustaw głowę w centrum pola widzenia skanera PET.
    6. Pozyskaj statyczny obraz PET, stosując parametry akwizycji zgodnie ze specyfikacją skanera.
    7. Przejdź do rekonstrukcji obrazu przy użyciu algorytmu 2D-OSEM (ordered subset expectation maximization) i zastosuj korekcję rozpadu oraz czasu martwego7,8,9.
    8. Po zakończeniu skanowania PET in vivo, utrzymuj przepływ sewofluranu do szczura, aby następnie przejść do akwizycji CT bez zmiany pozycji głowy zwierzęcia na stole skanera.
  4. Akwizycja CT
    1. Bez zmiany pozycji zwierzęcia względem poprzedniej akwizycji PET, przystąp do pozyskania obrazu CT.
    2. Powtórz kroki 1.2.3-1.2.5.
    3. Po zakończeniu skanowania CT in vivo, zatrzymaj przepływ sewofluranu i umieść szczura w odpowiedniej klatce w celu wybudzenia.
    4. Postępuj zgodnie z krokami 1.3.6. i 1.3.7.
    5. Przechowuj zwierzę w komorze osłoniętej ołowiem do czasu całkowitego rozpadu radioaktywności.

4. Podawanie stymulacji elektrycznej

UWAGA: Stymulacja elektryczna jest podawana podczas okresu wychwytu FDG w sesji obrazowania D2. W ramach niniejszego protokołu stymulację podawano za pomocą izolowanego stymulatora, stosując wysokoczęstotliwościową (130 Hz) stymulację elektryczną w trybie stałego prądu, 150 µA, przy szerokości impulsu wynoszącej 100 µs7,13,14.

  1. Konfiguracja stymulatora DBS
    1. Przygotuj odizolowany stymulator oraz wymagane przewody w przestronnym i cichym pomieszczeniu, zapewniając odpowiednią ilość miejsca na klatki dla zwierząt i minimalizując wpływ potencjalnie zakłócających bodźców.
    2. Podłącz przewody stymulacyjne do przegubów (swivels), aby umożliwić zwierzętom swobodne poruszanie się w klatkach, oraz do stymulatora.
    3. Ustaw parametry stymulacji zgodnie z wymogami badania.
    4. Użyj oscyloskopu, aby sprawdzić tryb prądowy, częstotliwość oraz szerokość impulsu. Potwierdź dwufazowy przebieg fali o prostokątnym kształcie impulsu (Rysunek 1D).
  2. Podawanie stymulacji DBS
    1. Po sesji obrazowania D1 i aż do akwizycji D2 poddaj zwierzęta codziennemu protokołowi habituacji (45 min/dobę), aby przyzwyczaić je do systemu stymulacji i obsługi przez operatora, co pozwoli uniknąć niepożądanych reakcji stresowych w dniu D2. Podłącz system stymulacji do każdego zwierzęcia, ale bez włączania stymulacji.
    2. Po skonfigurowaniu stymulatora i wstrzyknięciu FDG zwierzęciu, podłącz przegub do elektrod i włącz stymulator.
    3. Po 45 min wyłącz stymulator, odłącz zwierzę od przegubu i szybko przenieś je do komory indukcji znieczulenia, aby rozpocząć krok 3.3.

Proces głębokiej stymulacji mózgu z obrazowaniem PET/CT, rozmieszczenie elektrod; zawiera dane obrazowania mPFC.
Rycina 1: Projekt eksperymentalny. (A) Podsumowanie kroków eksperymentalnych zastosowanych w niniejszym protokole. (B) Reprezentatywne zdjęcia adaptacji uchwytu dla lepszej stabilizacji elektrody, z elektrodą (lewo) i bez elektrody (prawo). (C) Obraz zfuzowany MRI z CT zoperowanego zwierzęcia, pokazujący prawidłowe rozmieszczenie elektrody w przyśrodkowej korze przedczołowej (mPFC). (D) Zrzut ekranu z oscyloskopu pokazujący dwufazową postać fali stymulacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

5. Przetwarzanie i analiza obrazów PET

UWAGA: Zastosuj tę samą procedurę przetwarzania obrazów dla obrazów z D1 i D2, aby uzyskać porównywalne dane do późniejszej analizy statystycznej w obrębie wokseli.

  1. Rejestracja przestrzenna obrazów PET
    1. Użyj specjalistycznego oprogramowania do przetwarzania obrazów. Cały proces rejestracji przedstawiono na Rysunku 2.
    2. Wycentruj i przytnij każdy obraz PET i CT do pola widzenia. Zarejestruj obraz PET do odpowiadającego mu obrazu CT, używając automatycznego algorytmu rejestracji sztywnej opartej na wzajemnej informacji15.
      UWAGA: Metody rejestracji sztywnej są odpowiednie tylko wtedy, gdy między zwierzętami nie występują znaczące różnice w masie ciała lub rozmiarze. W przeciwnym razie rozważ zastosowanie metod elastycznych.
    3. Zarejestruj każdy obraz CT do referencyjnego obrazu CT zarejestrowanego przestrzennie do atlasu mózgu szczura Paxinos i Watson11, zgodnie z krokiem 5.1.2. Zapisz uzyskane parametry transformacji.
    4. Zastosuj parametry transformacji uzyskane w kroku 5.1.3. do każdego zarejestrowanego obrazu PET, aby uzyskać obraz PET zarejestrowany do referencyjnego obrazu CT.
    5. Zapisz wszystkie końcowe obrazy PET w formacie Nifti.
  2. Normalizacja intensywności i wygładzanie obrazów PET
    UWAGA: Normalizacja intensywności i wygładzanie są wykonywane za pomocą różnych wewnętrznych skryptów opartych na publicznie dostępnych zasobach.
    1. Wygładź obrazy PET za pomocą izotropowego jądra Gaussa o pełnej szerokości połówce maksymalnej (FWHM) wynoszącej 2 mm, aby skorygować ewentualne błędy rejestracji.
      UWAGA: Rozmiar filtru wygładzającego zależy od rozdzielczości akwizycji PET, jednak zaleca się stosowanie filtru o FWHM od 2 do 3 razy większym niż rozmiar woksela.
    2. Znormalizuj intensywność wartości wokseli PET, stosując odpowiednią metodę normalizacji klastra referencyjnego16.
    3. Wyodrębnij maskę mózgu z referencyjnego obrazu MRI zarejestrowanego do referencyjnego obrazu CT.
    4. Zastosuj maskę mózgu do każdego obrazu PET, aby wykluczyć z analizy wokselowej woksele znajdujące się poza mózgiem.
  3. Analiza wokselowa
    UWAGA: Analiza statystyczna, polegająca na analizie wokselowej danych z obrazów PET, została przeprowadzona przy użyciu specjalistycznego oprogramowania do analizy obrazowej17.
    1. Porównaj obrazy PET z D1 i D2 za pomocą testu t-studenta dla prób zależnych, ustalając odpowiednie progi istotności statystycznej.
    2. Za ostateczne wyniki analizy uznaj tylko te klastry, które składają się z więcej niż 50 sąsiednich wokseli, aby zminimalizować błędy typu I.
    3. Przedstaw wyniki w formie map T nałożonych na obraz MRI T2, pokazując zmiany w metabolizmie glukozy w mózgu wywołane przez DBS (kolory zimne dla spadku FDG i kolory ciepłe dla wzrostu FDG).

Schemat rejestracji obrazów PET-CT: przycinanie, wspólna informacja, wizualizacja wyniku procesu fuzji.
Figura 2: Przepływ pracy rejestracji obrazowania Micro PET/CT. Szczegółowe etapy przetwarzania normalizacji przestrzennej obrazu PET dla późniejszej analizy woxelowej z wykorzystaniem oprogramowania Statistical Parametric Mapping (SPM). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zwierzęta uśpiono za pomocą CO2 po zakończeniu badania lub w przypadku pogorszenia stanu ich dobrostanu. Przykład kompletnego badania PET/CT u zwierzęcia po operacji przedstawiono na Rysunku 3. W ten sposób elektrodę wprowadzoną do mózgu szczura można wyraźnie zaobserwować na obrazie CT przedstawionym na Rysunku 3A. Ta metoda obrazowania dostarcza dobrych informacji anatomicznych i ułatwia rejestrację obrazów FDG-PET, ponieważ obrazowanie funkcjonalne...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Biorąc pod uwagę postępy w zrozumieniu funkcji mózgu i sieci neuronowych zaangażowanych w patofizjologię zaburzeń neuropsychiatrycznych, coraz więcej badań dostrzega potencjał DBS w szerokim zakresie patologii o podłożu neurologicznym2. Jednak mechanizm działania tej terapii pozostaje niejasny. W kilku teoriach podjęto próbę wyjaśnienia efektów uzyskanych w określonych warunkach patologicznych i stymulacyjnych, ale niejednorodność proponowanych badań sprawia, że bardzo trudno jest dojść do ostatec...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że w związku z niniejszym artykułem nie występują konflikty interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Prof. Christine Winter, Julii Klein, Alexandrze de Francisco i Yolandzie Sierra za ich nieocenione wsparcie w optymalizacji opisanej tu metodologii. MLS był wspierany przez Ministerio de Ciencia e Innovación, Instituto de Salud Carlos III (numer projektu PI17/01766 i numer grantu BA21/0030) współfinansowany przez Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego (EFRR), "Sposób na Europę"; CIBERSAM (numer projektu CB07/09/0031); Delegación del Gobierno para el Plan Nacional sobre Drogas (numer projektu 2017/085); Fundación Mapfre; oraz Fundación Alicia Koplowitz. MCV było wspierane przez Fundación Tatiana Pérez de Guzmán el Bueno jako stypendystkę tej instytucji oraz Wspólny Program UE - Badania nad chorobami neurodegeneracyjnymi (JPND). DRM był wspierany przez Consejería de Educación e Investigación, Comunidad de Madrid, współfinansowany przez Europejski Fundusz Społeczny "Investing in your future" (numer grantu PEJD-2018-PRE/BMD-7899). NLR był wspierany przez Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón, "Programa Intramural de Impulso a la I+D+I 2019". Prace MD były wspierane przez Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN) i Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PT20/00044). CNIC jest wspierany przez Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN) i Fundację Pro CNIC, a także jest Centrum Doskonałości Severo Ochoa (SEV-2015-0505).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Skaner 7-Tesla Biospec 70/20Bruker, NiemcySN0021Skaner MRI do obrazowania małych zwierząt
BetadineMeda Pharma S.L., Hiszpania644625.6Roztwór jodu (jodopowidon)
Beurer IL 11BeurerSN87318Światło podczerwone
bipolarny 50 cm z siatką 50 cm o pokryciu do 100 cmPlastics One, Stany Zjednoczone305-305 (CM)
bipolarny TT2  50 cm do 100 cmPlastics One, USA305-340/2bipolarny TT2  50 cm do 100 cm
BuprexSchering-Plough, S.A961425Buprenorfina (przeciwbólowa)
Ceftriaxona Reig Jofré 1g IMLaboratorio Reig Jofré SA, Hiszpania624239.1Ceftriakson (antybiotyk)
KomutatorPlastics One, USASL2 + 2C4-kanałowy komutator do
DBS Koncentryczne bipolarne elektrody platynowo-irydowePlastics One, USAMS303/8-AIU/SPCElektrody do
wiertarkiDBS BoshT58704Wiertarka
FDGCurium Pharma Hiszpania S.A., Hiszpania-----2-[18F]fluoro-2-deoksy-D-glukoza (radioznacznik PET)
Poduszka grzewczaDAGA, Hiszpania23115Poduszka grzewcza
KetolarPfizer S.L., Hiszpania776211.9Ketamina (lek znieczulający)
Lipolasowy 2 mg/gBausch & Lomb S.A, Hiszpania65277Okulistyczny żel smarujący
MatLab R2021aOprogramowanie MathWorks, IncSupport dla SPM12
MRIcroMcCausland Center for Brain Imaging,  Uniwersytet Południowej Karoliny, USAv2.1.58-0Oprogramowanie do wstępnego przetwarzania i analizy obrazowania
Multimodalna stacja robocza (MMWKS)BiiG, HiszpaniaOprogramowanie do przetwarzania i analizy obrazowania
Omicrom VISION VETRGB Urządzenia medyczne, Hiszpania731100 ReV BMonitor krążeniowo-oddechowy do małego obrazowania
Prevex Patyczki kosmetycznePrevex, Finlandia-----Patyczki kosmetyczne
SevoraneAbbVie Hiszpania, S.L.U, Hiszpania673186.4Sevoflurane (znieczulenie wziewne)
MałeMax Witte GmbH1,2 x 2 DIN 84 A2Małe
Standardowy instrument stereotaktyczny w kształcie litery U dla szczurów, 18° Ear BarHarvard Apparatus, USA75-1801Dwuramienna ramka stereotaktyczna dla szczurów
Statystyczne mapowanie parametryczne (SPM12)The Wellcome Center for Human Neuroimaging, UCL Queen Square Institute of Neurology, Wielka BrytaniaSPM12Oprogramowanie do analizy obrazowania wokselowego
STG1004Multi Channel Systems GmbH, NiemcySTG1004Izolowany stymulator
SkanerPET/CT SuperArgusSedecal, HiszpaniaS0026403Skaner NanoPET/CT do obrazowania małych zwierząt
Nici do szwów z igłą, 1/ºLorca Marí n S.A., Hiszpania55325Pleciony jedwab naturalny niewchłanialny szew 1/0, z igłą trójkątną
Technovit 4004 (proszek i płyn)Kulzer Technique, Niemcy64708471; 64708474Akrylowy cement dentystyczny do kranu kraniotomijnego
Szczury Wistar (Rattus norvergicus)Charles River, Hiszpaniadla zwierzątzwierzęcy używany
XylagesicLaboratorios Karizoo, AA, Hiszpania572599-4Ksylazyna (lek znieczulający)
Normon S.A., Hiszpania602910Mepiwakaina w żelu do stosowania miejscowego
Obiekt Model

Bibliografia

  1. Gildenberg, P. L. Neuromodulation: A historical perspective. Neuromodulation. 1, 9-20 (2009).
  2. Lee, D. J., Lozano, C. S., Dallapiazza, R. F., Lozano, A. M. Current and future directions of deep brain stimulation for neurological and psychiatric disorders. Journal of Neurosurgery. 131 (2), 333-342 (2019).
  3. Casquero-Veiga, M. Preclinical molecular neuroimaging in deep brain stimulation. Complutense University of Madrid. , Faculty of Medicine, Department of Pharmacology (2021).
  4. Blaha, C. D. Theories of deep brain stimulation mechanisms. Deep Brain Stimulation: Indictions and Applications. , Jenny Stanford Publishing. New York. 314-338 (2016).
  5. Fins, J. J. Deep brain stimulation: Ethical issues in clinical practice and neurosurgical research. Neuromodulation. 1, 81-91 (2009).
  6. Desmoulin-Canselier, S., Moutaud, B. Animal models and animal experimentation in the development of deep brain stimulation: From a specific controversy to a multidimensional debate. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 51(2019).
  7. Casquero-Veiga, M., Hadar, R., Pascau, J., Winter, C., Desco, M., Soto-Montenegro, M. L. Response to deep brain stimulation in three brain targets with implications in mental disorders: A PET study in rats. PLOS One. 11 (12), 0168689(2016).
  8. Casquero-Veiga, M., García-García, D., Desco, M., Soto-Montenegro, M. L. Understanding deep brain stimulation: In vivo metabolic consequences of the electrode insertional effect. BioMed Research International. 2018, 1-6 (2018).
  9. Casquero-Veiga, M., García-García, D., Pascau, J., Desco, M., Soto-Montenegro, M. L. Stimulating the nucleus accumbens in obesity: A positron emission tomography study after deep brain stimulation in a rodent model. PLOS One. 13 (9), 0204740(2018).
  10. Pascau, J., Vaquero, J. J., Abella, M., Cacho, R., Lage, E., Desco, M. Multimodality workstation for small animal image visualization and analysis. Scientific Papers. Molecular Imaging and Biology. 8, 97-98 (2006).
  11. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. Sydney. (1998).
  12. Roy, M., et al. A dual tracer PET-MRI protocol for the quantitative measure of regional brain energy substrates uptake in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (82), e50761(2013).
  13. Klein, J., et al. A novel approach to investigate neuronal network activity patterns affected by deep brain stimulation in rats. Journal of Psychiatric Research. 45 (7), 927-930 (2011).
  14. Soto-Montenegro, M. L., Pascau, J., Desco, M. Response to deep brain stimulation in the lateral hypothalamic area in a rat model of obesity: In vivo assessment of brain glucose metabolism. Molecular Imaging and Biology. , 830-837 (2014).
  15. Pascau, J., et al. Automated method for small-animal PET image registration with intrinsic validation. Molecular Imaging and Biology. 11 (2), 107-113 (2009).
  16. Andersson, J. L. R. How to estimate global activity independent of changes in local activity. Neuroimage. 244 (60), 237-244 (1997).
  17. Wellcome Trust Centre for Neuroimaging SPM12-Statitstical Parametric Mapping. , Available from: https://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/software/spm12/ (2022).
  18. Lozano, A. M., et al. Deep brain stimulation: current challenges and future directions. Nature Reviews Neurology. 15 (3), (2019).
  19. Boecker, H., Drzezga, A. A perspective on the future role of brain pet imaging in exercise science. NeuroImage. 131, (2016).
  20. Sprengers, M., et al. Deep brain stimulation reduces evoked potentials with a dual time course in freely moving rats: Potential neurophysiological basis for intermittent as an alternative to continuous stimulation. Epilepsia. 61 (5), 903-913 (2020).
  21. Middlebrooks, E. H., et al. Acute brain activation patterns of high- versus low-frequency stimulation of the anterior nucleus of the thalamus during deep brain stimulation for epilepsy. Neurosurgery. 89 (5), 901-908 (2021).
  22. Ashkan, K., Rogers, P., Bergman, H., Ughratdar, I. Insights into the mechanisms of deep brain stimulation. Nature Reviews Neurology. 13 (9), 548-554 (2017).
  23. Williams, N. R., Taylor, J. J., Lamb, K., Hanlon, C. A., Short, E. B., George, M. S. Role of functional imaging in the development and refinement of invasive neuromodulation for psychiatric disorders. World Journal of Radiology. 6 (10), 756-778 (2014).
  24. Rodman, A. M., Dougherty, D. D. Nuclear medicine in neuromodulation. Neuromodulation in Psychiatry. , John Wiley & Sons. West Sussex, UK. 81-99 (2016).
  25. Albaugh, D. L., Shih, Y. -Y. I. Neural circuit modulation during deep brain stimulation at the subthalamic nucleus for Parkinson's disease: what have we learned from neuroimaging studies. Brain Connectivity. 4 (1), 1-14 (2014).
  26. Mayberg, H. S., et al. Reciprocal limbic-cortical function and negative mood: Converging PET findings in depression and normal sadness. Neurology, and Radiology. 156 (5), 675-682 (1999).
  27. Kennedy, S. H., et al. Differences in brain glucose metabolism between responders to CBT and Venlafaxine in a 16-week randomized controlled trial. American Journal of Psychiatry. 164 (5), 778-788 (2007).
  28. Kennedy, S. H., et al. Changes in regional brain glucose metabolism measured with positron emission tomography after paroxetine treatment of major depression. American Journal of Psychiatry. 158 (6), 899-905 (2001).
  29. Brown, E. C., Clark, D. L., Forkert, N. D., Molnar, C. P., Kiss, Z. H. T., Ramasubbu, R. Metabolic activity in subcallosal cingulate predicts response to deep brain stimulation for depression. Neuropsychopharmacology. 45, 1681-1688 (2020).
  30. Klooster, D. C. W., et al. Technical aspects of neurostimulation: Focus on equipment, electric field modeling, and stimulation protocols. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 65, 113-141 (2016).
  31. Kasoff, W., Gross, R. E. Deep brain stimulation: Introduction and Technical Aspects. Neuromodulation in Psychiatry. , John Wiley & Sons. West Sussex, UK. 245-275 (2016).
  32. Perez-Caballero, L., et al. Early responses to deep brain stimulation in depression are modulated by anti-inflammatory drugs. Molecular Psychiatry. 19, 607-614 (2014).
  33. Solera Ruiz, I., UñaOrejón, R., Valero, I., Laroche, F. Craniotomy in the conscious patient. Considerations in special situations. Spanish Journal of Anesthesiology and Resuscitation. 60 (7), 392-398 (2013).
  34. Casali, M., et al. State of the art of 18F-FDG PET/CT application in inflammation and infection: a guide for image acquisition and interpretation. Clinical and Translational Imaging. 9 (4), 299-339 (2021).
  35. Gonzalez-Escamilla, G., Muthuraman, M., Ciolac, D., Coenen, V. A., Schnitzler, A., Groppa, S. Neuroimaging and electrophysiology meet invasive neurostimulation for causal interrogations and modulations of brain states. NeuroImage. 220, 117144(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie FDG PETmetabolizm m zguchirurgia stereotaktycznakora przedczo owaimplantacja elektrodaktywno sieci neuronowychobrazowanie m zgu szczuraanaliza woxelowa
In vivo (in vivo) Pozytonowa tomografia emisyjna w celu ujawnienia wzorców aktywności wywołanych głęboką stymulacją mózgu u szczurów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.