Izolacja mikropęcherzyków śledziony w mysim modelu wewnątrzotrzewnowego zakażenia bakteryjnego

Summary

Mikropęcherzyki wydzielane z błony plazmatycznej działają jak efektory komórkowe. Mikropęcherzyki śledziony (SMV) są zastępczymi markerami stanów patofizjologicznych. U szczurów i myszy zawartość i właściwości SMV charakteryzują starzenie się lub stan zapalny i są zmieniane przez leczenie cytoprotekcyjne, co czyni je cennym, ale obfitym narzędziem monitorowania w badaniach przedklinicznych.

Abstract

Mikropęcherzyki (MVs) to submikronowe fragmenty uwalniane z błony komórkowej aktywowanych komórek, które działają jako prozapalne i prokoagulacyjne efektory komórkowe. U szczurów MV śledziony (SMV) są zastępczymi markerami stanów patofizjologicznych. Wcześniejsze badania in vitro wykazały, że Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), główny patogen przyzębia, umożliwia złuszczanie śródbłonka i apoptozę, podczas gdy lipopolisacharyd (LPS) sprzyja złuszczaniu mikropęcherzyków pochodzących ze splenocytów (SMV). Badania in vivo wykazały możliwość farmakologicznej kontroli wydalania SMV. Niniejszy protokół ustanawia znormalizowaną procedurę izolowania SMV śledziony od modelu ostrej infekcji mysiej P. gingivalis. Zakażenie P. gingivalis wywołano u młodych myszy C57BL / 6 przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (trzy wstrzyknięcia 5 x 10⁷ bakterii / tydzień). Po dwóch tygodniach pobrano śledziony, zważono je i policzono splenocyty. SMV wyizolowano i oznaczono ilościowo za pomocą testów białek, RNA i protrombinazy. Żywotność komórek oceniano za pomocą jodku propidyny lub barwników wykluczających błękit trypanowy. Po ekstrakcji splenocytów liczbę neutrofili uzyskano metodą cytometrii przepływowej po 24 godzinach hodowli splenocytów. U myszy, którym wstrzyknięto P. gingivalis, zaobserwowano 2,5-krotny wzrost masy śledziony i 2,3-krotny wzrost liczby splenocytów, podczas gdy liczba neutrofili zwiększyła się 40-krotnie. Żywotność komórek splenocytów myszy z wstrzyknięciem P. gingivalis wahała się od 75% do 96% i zmniejszyła się o 50% po 24 godzinach hodowli bez żadnej znaczącej różnicy w porównaniu z nieeksponowanymi kontrolami. Jednak splenocyty od myszy, którym wstrzyknięto implanty, wydzielają większe ilości MV za pomocą testu protrombinazy lub pomiarów białka. Dane pokazują, że prokoagulacyjne SMV są wiarygodnymi narzędziami do oceny wczesnej odpowiedzi śledziony na wewnątrzotrzewnowe zakażenie P. gingivalis.

Introduction

Mikropęcherzyki (MV), zwane również mikrocząstkami lub ektosomami, to fragmenty błony plazmatycznej o średnicy 0,1-1,0 μm uwalniane w płynach ustrojowych i przestrzeni zewnątrzkomórkowej w odpowiedzi na różne bodźce komórkowe. Po raz pierwszy zidentyfikowany jako pył płytkowy odsłaniający prokoagulantowe fosfolipidy, głównie fosfatydyloserynę (PSer), MV stanowią dodatkową powierzchnię do składania kompleksów krzepnięcia krwi^1,2. Kluczowa rola krążących MV jako efektorów prokoagulacyjnych została wykazana u pacjentów z zespołem Scotta², rzadką chorobą genetyczną, która prowadzi do dysfunkcyjnej ekspozycji na PSer i krwawienia (Rysunek uzupełniający 1). MV były szeroko badane jako krążące biomarkery ryzyka zakrzepicy w chorobach przewlekłych związanych z zaburzeniami sercowo-naczyniowymi, takich jak cukrzyca, przewlekła choroba nerek, stan przedrzucawkowy i nadciśnienie^3,4. Obecnie są one rozpoznawane jako prawdziwe efektory komórkowe w płynach lub tkankach narządowych, takich jak myocardium¹. Ponieważ przenoszą aktywne białka, lipidy i miRNA, zdalnie modulują reakcje naczyniowe, takie jak hemostaza, zapalenie, angiogeneza naczyniowa i wzrost naczyń krwionośnych lub przebudowa tkanek⁵.

Podczas gdy badania kliniczne badają wartość prognostyczną MV w odniesieniu do czynników ryzyka, MV wyizolowane z płynów lub tkanek pacjenta umożliwiają ocenę ex vivo ich właściwości efektorowych⁶. Rozszyfrowanie mechanizmów rządzących biogenezą MV i zdolnościami do przesłuchiwania jest na ogół osiągane w modelach hodowli komórkowych w celu identyfikacji aktywnych cząsteczek wystawionych na działanie MV lub w nich zamkniętych oraz ich dalszej sygnalizacji. Interakcje MV z komórkami docelowymi będą zależeć od wiązania białka błonowego z białkiem, gdy dostępne są odpowiednie przeciwligandy i/lub fuzji lipidów⁷.

W warunkach fizjologicznych, MV krążące w osoczu pochodzą głównie z komórek naczyniowych, co zostało zidentyfikowane przez markery różnicowania klastrów linii (CD)^8,9. Jednak w patologii, zwłaszcza w raku¹⁰ i odrzuceniu przeszczepu^11,12, MV są wydalane z uszkodzonej tkanki i mają szkodliwe cechy prokoagulacyjne i prozapalne. Są one wykrywane w krążeniu ogólnoustrojowym, co czyni je użytecznymi sondami do monitorowania terapii ochronnych lub odmładzających oraz możliwych celów farmakologicznych¹³. Ponieważ MV krążą jako dynamiczna pula pamięci odzwierciedlająca homeostazę komórek naczyniowych i tkankowych w zdrowiu i chorobie, lepsze zrozumienie ich zdalnego działania musi być również zbadane in vivo, po wstrzyknięciu dożylnym lub wkropleniu do nosa u małych zwierząt^14,15. Rzeczywiście, MV zostały uznane za główne czynniki przyczyniające się do skomplikowanych szlaków łączących przesadny stan zapalny i zakrzepicę¹⁶.

Zapalenie przyzębia jest chorobą zapalną pochodzenia zakaźnego, wpływającą na tkanki podtrzymujące zęby^17,18 i wiąże się z ryzykiem zakrzepowym. Charakteryzuje się krwawieniem dziąseł, niszczeniem kości wyrostka zębodołowego, ruchomością zębów i może ostatecznie prowadzić do utraty zębów. Zapalenie przyzębia jest bardzo rozpowszechnione na całym świecie i dotyka ponad 50% populacji, z czego 11% ma ciężką postać¹⁹. Zapalenie przyzębia jest wywoływane przez bakteryjną dysbiozę biofilmów poddziąsłowych, które utrzymują zaostrzoną reakcję zapalną, która powoduje zniszczenie tkanek²⁰. W ciągu ostatniej dekady zapalenie przyzębia zostało powiązane z chorobami ogólnoustrojowymi, takimi jak zaburzenia sercowo-naczyniowe, cukrzyca i reumatoidalne zapalenie stawów. Możliwymi wyjaśnieniami są działanie patogenów przyzębia na odległość i/lub zwiększony ogólnoustrojowy stan zapalny, w którym pośredniczą cytokiny prozapalne, takie jak interleukina (IL-1, IL-6) i TNF-α^21,22.

Wśród patogenów związanych z początkiem i rozwojem zapalenia przyzębia, Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis)²³ występuje w najcięższych zmianach, które zbierają kilka czynników wirulencji, w tym lipopolisacharyd (LPS)²⁴ indukujące reakcje zapalne za pośrednictwem receptora Toll-podobnego (TLR)²⁵ oraz rekrutacja neutrofili i leukocytów wielojądrzastych (PMN) w miejscu początkowej infekcji²⁶. LPS z P. gingivalis aktywuje TLR-4 lub TLR-2, ułatwiając wykrywanie immunologiczne i unikanie przetrwania bakterii²⁷. Na poziomie naczyniowym aktywacja TLR2 przez LPS jest związana z immunozakrzepicą. Unikalna zdolność P. gingivalis do wywoływania sygnalizacji TLR-2, podczas gdy rozpoznawanie zależne od TLR-4 jest znacznie upośledzone, sprzyja uporczywemu zakażeniu o niskim stopniu złośliwości^28,29.

Procedury in vivo do badania reakcji MV na przewlekłą i długotrwałą infekcję patogenu o niskim stopniu złośliwości są rzadkie. Podejścia metodologiczne do ekstrakcji MV są słabo opisane w literaturze i na ogół dotyczą pozyskiwania MV z patologicznych tkanek, takich jak guzy lite, stłuszczenie wątroby, blaszki miażdżycowe lub przeszczepy^11,29,30, podczas gdy śledziona wyczuwa bakterie i wirusy w krwiobiegu. Przechowuje również erytrocyty, płytki krwi, limfocyty, monocyty, bazofile i eozynofile biorące udział w odpowiedzi immunologicznej. Granulocyty, takie jak neutrofile z czerwonej miazgi, również generują reaktywne formy tlenu (ROS) i proteazy, które niszczą patogeny i zapobiegają rozprzestrzenianiu się infekcji^31,32. Zdumiewające i zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, MV śledziony nie są badane w kontekście uszkodzeń tkanek wywołanych przez patogeny. Istnieje globalna niezaspokojona potrzeba zbadania zmienności MV mięśni zębowych w fizjopatologii.

Dane in vitro z naszego laboratorium wykazały, że LPS indukuje wydzielanie prokoagulantów MV ze splenocytów szczurów, co z kolei prowadzi do starzenia się hodowanych komórek śródbłonka wieńcowego i kolejnego prozapalnego i prozapalnego fenotypu śródbłonka¹¹. Wykonalność farmakologicznej kontroli MV śledziony została dodatkowo wykazana po potraktowaniu zwierzęcia zoptymalizowaną formułą omega-3. Stwierdzono, że zgłębnik doustny szczurów w średnim i starszym wieku chroni zarówno przed wydalaniem prokoagulantów MV ze splenocytów, jak i przed ich szkodliwymi właściwościami prozaescencyjnymi w kierunku śródbłonka naczyń wieńcowych³³.

W porównaniu do krwi, śledziona ma tę zaletę, że jest ważnym źródłem leukocytów u jednej osoby. Ponadto niedawno zaproponowano oś śledzionowo-sercową^3,34, co sprawia, że śledziona może przyczyniać się do ryzyka sercowo-naczyniowego związanego z infekcją, co ma korzystne znaczenie dla kontroli farmakologicznej. Ocena właściwości lub uwalniania SMV ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia reakcji wywołanych przez patogen lub zapalnych. Co ciekawe, można to osiągnąć u leczonych zwierząt i w różnych modelach fizjopatologicznych (wiek, nadciśnienie, cukrzyca). Rzeczywiście, porównując szczury w średnim i starszym wieku³³, różnice we właściwościach MVs śledziony i uwalnianiu można udowodnić po prostej 24-godzinnej hodowli splenocytów.

Biorąc pod uwagę powyższe dowody na zmianę właściwości efektorowych MV śledziony wraz ze stanem fizjopatologicznym i wykonalnością ich farmakologicznej kontroli u szczurów, tutaj opisano standardowy protokół izolacji MV śledziony myszy. Procedura ta lepiej pasowałaby do dogłębnych badań nad mechanizmami in vivo wspierającymi efekty wywoływane przez SMV, ostatecznie na zmodyfikowanych myszach. Procedura została opracowana na myszach C57BL/6 z wykorzystaniem miejscowego zakażenia dootrzewnowego przez P. gingivalis, w celu ustalenia dowodu na zdalne działanie patogenu na właściwości efektorowe śledziony MV (SMV).

Protocol

Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone i przestrzegały odpowiednich wytycznych lokalnego Komitetu Etyki (APAFIS#28745-2020121815051557) oraz opieki nad zwierzętami macierzystego Uniwersytetu i INSERM. Do eksperymentów wykorzystano samce młodych myszy C57BL/6 w wieku 6-8 tygodni. Myszy były regularnie badane w celu oceny bólu i stresu, a ich waga była codziennie monitorowana. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie i roztwory ekstrakcyjne muszą być sterylne i mieć temperaturę pokojową.

1. Przygotowanie zwierząt

1. Podawać myszom sześć wstrzyknięć dootrzewnowych P. gingivalis (PG) co 2 dni przez 2 tygodnie (trzy wstrzyknięcia 5 x 10⁷ bakterii / tydzień, plik uzupełniający 1).
2. Znieczulenie myszy za pomocą kombinacji 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny.
3. Poświęć znieczulone myszy i zbierz śledzionę po laparotomii.
   UWAGA: Szczególne warunki zakażenia P. gingivalis i uśmiercania zwierząt w celu pobrania śledziony są szczegółowo opisane w sekcji "doświadczenia na zwierzętach" w pliku uzupełniającym 1. Schematyczne przedstawienie kroków protokołu jest pokazane w Rysunek 1.

2. Ekstrakcja splenocytów

1. Za pomocą skalpela zmielić tkankę śledziony na plastry ~1 mm na szalce Petriego już wypełnionej 3 ml RPMI zawierającej antybiotyki (Streptomycyna (100 U/ml)/Penicylina (100 U/ml), Fungizone (250 mg/mL), L-glutamina (2 mM)) i uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) (patrz Tabela materiałów).
2. Przenieś plastry na sito (patrz Tabela Materiałów), które jest wcześniej przymocowane do probówki z polistyrenu o pojemności 50 ml.
3. Użyj tłoka strzykawki jako tłuczka, aby zmiażdżyć chusteczki na sicie.
4. Przepłukać sito pożywką RPMI (3 ml).
5. Odwirować zawiesinę komórkową, eluować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ostrożnie wyrzucić supernatant przez przepływ wsteczny.

3. Usuwanie erytrocytów za pomocą wstrząsu osmotycznego

1. Dodać 1 ml buforu ACK (patrz tabela materiałów), dobrze wymieszać, inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i delikatnie wstrząsnąć, obracając ręcznie.
2. Rozcieńczyć, dodając 9 ml RPMI i dobrze wymieszać, używając aspiracji i przepływu zwrotnego.
3. Wirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
4. Odrzucić supernatant przez aspirację i przepływ wsteczny, a następnie ponownie zawiesić osad w 5 ml pożywki RPMI.
5. Delikatnie wymieszać (zasysanie/przepływ wsteczny) i ostatecznie usunąć wszelkie zanieczyszczenia lipidowe za pomocą pipetowania lub użycia sita.

4. Dostosowanie stężenia izolowanych splenocytów

1. Napełnij mikroprobówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą 900 μl RPMI.
2. Za pomocą mikropipety pobrać 100 μl zawiesiny komórkowej, dodać do 1,5 ml mikroprobówki zawierającej 900 μl pożywki RPMI i dobrze wymieszać.
3. Przenieś 10 μl rozcieńczonych komórek do mikroprobówki, dodaj 10 μl barwnika wykluczającego błękit trypanowy i dobrze wymieszaj.
4. Umieścić 10 μl roztworu (krok 3.3) na szkiełku zliczającym automatycznego licznika komórek (patrz Tabela Materiałów) i określić liczbę komórek.
   UWAGA: Oprogramowanie urządzenia podaje dwie wartości: całkowitą liczbę komórek oraz liczbę żywych komórek i procent.
5. Dostosuj stężenie żywych komórek do 3 lub 5 x 10⁶ komórek/ml (V_max = 20 ml; maksymalna całkowita pojemność to 100 x 10⁶ komórek/ml).
6. Zasiać komórki w kolbie o pojemności 75 ml zawierającej RPMI.
7. Inkubować kolbę pionowo w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 24 h.
   UWAGA: Błękit trypanowy jest czynnikiem mutagennym i rakotwórczym^35,36. Upewnij się, że nosisz rękawiczki podczas liczenia, nawet poza kapturem. Natychmiast wyrzuć końcówki i płyny do pojemników i umyj powierzchnię stołu.
   UWAGA: Jeśli pobrane komórki są mniejsze niż 50 x 10⁶, użyj kolby hodowlanej o pojemności 25 ml. Numer komórki nie powinien się zbytnio różnić w zależności od osoby. Na tym etapie odsetek żywych komórek jest na ogół wyższy niż 80%.

5. Izolacja mikropęcherzyków splenocytów

1. Po 24 godzinach wlać zawartość kolby do probówki z polipropylenu lub styropianu o pojemności 50 ml.
2. Wirować przy 450 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń.
3. Po odwirowaniu należy zachować 100 μl pierwszego supernatantu (SN1) do ostatecznego pomiaru początkowego stężenia MV w celu obliczenia wydajności izolacji. Zwróć uwagę na wolumin SN1.
4. Odwirować SN1 przy 450 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
5. Wyrzucić osad i ponownie odwirować przy 450 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Szybko wypłać i zbierz SN2 (zwróć uwagę na objętość).
6. Przenieś SN2 do mikroprobówek o pojemności 1,8 ml ze stożkowym dnem. Zachowaj 100 μl SN2 do ewentualnego pomiaru początkowego stężenia MV w celu obliczenia wydajności izolacji w przypadku, gdy zbyt duża ilość zanieczyszczeń ostatecznie pogorszy pomiar MV w SN1.
7. Dodaj 5 ml pożywki RPMI do osadu (komórek) i policz splenocyty.
   UWAGA: Zawiesinę komórek można również utrwalić w celu charakterystyki cytometrii przepływowej w 0,1% paraformaldehydzie (stężenie końcowe)37.
8. Wirować SN2 przy 14 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C i ostatecznie wcześniej schłodzić wirnik, uruchamiając pusty wirnik w temperaturze 4 °C. Ten krok generuje SN3.
9. Natychmiast pobrać SN3 z każdej mikroprobówki, odwracając ją do jednej sterylnej probówki o pojemności 50 ml (pod pokrywą). Zwróć uwagę na wolumin SN3.
10. Delikatnie wymieszaj SN3 za pomocą pipety pod maską. Zachowaj podwielokrotności do ewentualnych pomiarów w zawiesinie.
    UWAGA: Roztwór jest teraz pozbawiony MV, ale zawiera rozpuszczalne mediatory i egzosomy.
11. Zeskrob każdą mikroprobówkę (zamkniętą) na kolczastym stojaku, aby mechanicznie sprzyjać ponownemu zawieszeniu MV w granulce.
12. Dodać 200 μl zbilansowanego roztworu soli Hanka bez Ca²⁺ i Mg²⁺ (HBSS) do pierwszej mikroprobówki (patrz tabela materiałów).
13. Zawiesić osad MV z pierwszej probówki w delikatnych cyklach zasysania/przepływu zwrotnego (~10 razy) za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml. Należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć pienienia, ponieważ sprzyja to utlenianiu pęcherzyków i innych ugrupowań w zawiesinie.
14. Zbierz pierwsze 200 μl zawieszonych MV i wlej je do drugiej probówki nad granulkami. Delikatnie wymieszaj jak powyżej, a następnie ponownie wlej do trzeciej probówki i delikatnie wymieszaj. Zawieszenie staje się coraz bardziej mętne od rury do rury. Zamknij trzecią rurkę.
15. Rozpocznij pobieranie kolejnych trzech mikroprobówek, jak powyżej (krok 4.14).
16. Zebrać wszystkie zawieszone MV w jednej (lub dwóch) mikroprobówkach kolektora (2 ml z dnem w kształcie stożka). Zachowaj 50 μl do ostatecznego obliczenia wydajności na tym etapie. Zwróć uwagę na objętość zawieszenia.
17. Odwirować probówkę kolektora o stężeniu 14 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Ten krok generuje SN4.
18. Natychmiast wyrzucić SN4 (zalać probówką zbiorczą nad osadnikiem). Zachować podwielokrotność SN4 w celu obliczenia wydajności etapu oczyszczania i delikatnie zawiesić osad w 500 μl HBBS (bez Ca²⁺ i Mg²⁺). Zachowaj 50 μl podwielokrotności zawieszonego osadu, aby obliczyć wydajność oczyszczania i zanotować jego objętość.
19. Zawieszony osad należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca w przypadku testów funkcjonalnych w sterylnych warunkach lub w temperaturze -20 °C w przypadku prób strukturalnych.
20. Obliczyć wydajność oczyszczania (patrz UWAGA poniżej) dla każdego etapu lub całej procedury, mierząc stężenie MV w supernatantach i/lub zawiesinach granulek.
    UWAGA: Wydajność oczyszczania (%): ([MV1] x objętość SN1) / ([MV4] x końcowa objętość zawiesiny) x 100,
    Wydajność tę należy zracjonalizować do liczby splenocytów wyizolowanych z kolby hodowlanej i policzyć w kroku 4.4. Wydajność oczyszczania w obecnym eksperymencie wynosi ~ 70%, zaczynając od 111 x 10⁶ komórek i 60 ml supernatantu.
    1. Oceń utratę SMV spowodowaną procedurą, mierząc SMV pozostające w supernatantach zubożonych w SMV i zawierających głównie egzosomy (SN2 i SN4).
    2. Zmierz stężenie MV za pomocą testu TRPS lub protrombinazy³⁸ dla wysokiej czułości i swoistości.
       UWAGA: Zebrać MV po odwirowaniu poprzez szybkie nalewanie supernatantu do góry nogami. Odczekanie lub użycie mikrorurek w kształcie litery U spowoduje utratę MV na ściance mikrorurki. Nigdy nie używać mikropipet do wyrzucania supernatantu; Zamiast tego granulat można zassać. Nigdy nie opóźniaj procesu po zatrzymaniu wirówki. Wirowanie z nadmierną prędkością spowoduje zanieczyszczenie granulatu MV egzosomami.
       UWAGA: Prędkości i czas trwania wirowania są zoptymalizowane pod kątem wzbogacania MV przy minimalnym zanieczyszczeniu egzosomami. Protokół ten nie jest wiarygodny w badaniu MV monocytów/makrofagów śledziony, ponieważ komórki te mogą fagocytować i szybko odzyskiwać własne MVs³⁹. Protokół nie może zostać wstrzymany i ponownie uruchomiony później z powodu utraty komórek z powodu żywotności komórek.

Results

Dostarczone dane dają pełną reprezentację całej procedury, przy użyciu dwóch głównych warunków zwierzęcych: kontrola nieleczonych młodych myszy C57BL/6 i ich rodzeństwa z miotu poddanych sześciu dootrzewnowym (IP) zastrzyków PG co 2 dni, przez 2 tygodnie. Pokazują również zdalne działanie dootrzewnowego wstrzyknięcia PG na odpowiedź śledziony po 2 tygodniach. Mikropęcherzyki splenocytów oznaczono ilościowo za pomocą testu enzymatycznego protrombinazy lub mierząc ich stężenie białek i RNA za pomocą spektrofotometrii, a pr...

Discussion

Niniejsze badanie potwierdza, że śledziona jest głównym i wiarygodnym źródłem MV o znaczeniu fizjopatologicznym w porównaniu z innymi źródłami, takimi jak krew, o ograniczonej objętości u myszy. Pod warunkiem podjęcia środków ostrożności metoda jest łatwa w konfiguracji i nie wymaga drogiego sprzętu. Ponieważ nie jest dostępny żaden alternatywny sposób inny niż ocena in vivo , obecny model wydaje się być cenną metodą badania wpływu proleków na wydalanie MV. Co ważne, przedstawiony tutaj ustandaryzowany protokół ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Probówki 2 ml typu Eppendorf	Dutscher	54816	Stożkowe dno ostre; riel mikroprobówki
Allegra 64 R Wirówka	Beckman Coulter
Automatyczny licznik komórek	Biorad
Albumina surowicy bydlęcej	Euromedex	04-100-812-E	Przygotowany, przefiltrowany 0,22 &mikro; m sita i przechowywane w temperaturze 4 & stopni; C w sterylnych warunkach przy użyciu następujących wzorów: 2 mM EDTA, 0,5% BSA i sterylny PBS
CD11 (Mac-1)	e-Biosciences	45-00112-80	Sprzężony z eFluor 450; λ max wzbudzenie 405 nm λ Emisja max 445 nm
CD16/32	BD Biosciences	553142	niesprzężony
EDTA	Calbiochem	Calbiochem	S 6381-92-6
Rurka Falcon	Cell star	227261	50 ml
Płodowa surowica bydlęca	Dutscher	S1810-500	Numer serii = S14028S1810
Fortessa Aria	BD Biosciences		dla sortowanie komórek
Cytometr przepływowy Fortessa	Becton-Dickinson.
Fungizone	PAN biotech	P06-01050
HBSS	Gibco	14175-053	Bez czerwieni fenolowej, bez Ca+2 i Mg+2
ICAM-1	abcam	ab171123
LYG-6 (Gr-1)	BD Biosciences	566218	Sprzężony z BUV395; λ max wzbudzenie 348 nm, λ Emisja max 395 nm
Erytrocyty buforowe do lizy (ACK)	Sigma		Przygotowany, przefiltrowany 0,22 &mikro; m przesiewać i przechowywać w temperaturze 4° C w sterylnych warunkach przy użyciu następujących wzorów: NH4Cl, 0,15 M (molowość), 53,491 (mw) 4 g KHCO3 1 mM (molowość) 100,115 (mw), 50 mg EDTA  0,1 mM (molowość), 292,24 (mw), 14,6 g pH: 7,2– 7.4
Spektrofotometr NanoDrop 1000	Thermoscientific
PBS	Lonza	17-516F	Bez Ca+2  i Mg+2
Plastikowa szalka			100 mm
Rurka polistyrenowa	Falcon	352070
q-Nano Gold	iZON science
Pożywka hodowlana RPMI 1640: 2 g/L glukozy	PAN biotech	p04-18047	Uzupełniony o Streptomycynę (100 U/ml) / Penicylinę (100 U / ml), Fungizone (250 mg / ml), L-glutaminę (2 mM) i FBS 10%.
Skalpel
Sito Nylon	Falcon USA	352360	100 &mikro; m
Streptomycyna/Penicylina	PAN biotech	P06-07100
Strzykawka			2 ml
Trypan Blue	Biorad	1450013
VCAM1	abcam	ab215380