Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pierwotne kultury astrocytów szczurów i mikrogleju oraz ich zastosowanie w badaniu stwardnienia zanikowego bocznego

3.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63483

⸱

23 czerwca 2022

 ,  ,  , 
1Center for Laser Microscopy, Institute for Physiology and Biochemistry “Jean Giaja”, University of Belgrade Faculty of Biology

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy tutaj protokół, jak przygotować pierwotne hodowle komórek glejowych, astrocytów i mikrogleju z kory mózgowej szczurów do obrazowania poklatkowego wewnątrzkomórkowego Ca2+ do badań nad patofizjologią stwardnienia zanikowego bocznego w modelu szczurzym hSOD1G93A.

Streszczenie

Ten protokół pokazuje, jak przygotować pierwotne hodowle komórek glejowych, astrocytów i mikrogleju z kory mózgowej szczurów Sprague Dawley oraz jak wykorzystać te komórki do badania patofizjologii stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) w szczurzym modelu hSOD1G93A. Po pierwsze, protokół pokazuje, jak izolować i hodować astrocyty i mikroglej z pourodzeniowej kory szczura, a następnie, jak scharakteryzować i przetestować te kultury pod kątem czystości za pomocą immunocytochemii przy użyciu markera kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP) astrocytów i zjonizowanej cząsteczki adaptora wiążącego wapń 1 (Iba1) markera mikrogleju. W kolejnym etapie opisano metody obciążania barwnikiem (wrażliwy na wapń Fluo 4-AM) hodowanych komórek oraz zapisy zmian Ca2+ w eksperymentach obrazowania wideo na żywych komórkach.

Przykłady nagrań wideo obejmują: (1) przypadki obrazowania Ca2+ hodowanych astrocytów ostro narażonych na immunoglobulinę G (IgG) wyizolowanych od pacjentów z ALS, wykazujących charakterystyczną i specyficzną odpowiedź w porównaniu z odpowiedzią na ATP, jak wykazano w tym samym eksperymencie. Przykłady pokazują również bardziej wyraźny przejściowy wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia wywołany przez ALS IgG w astrocytach hSOD1G93A w porównaniu z nietransgenicznymi kontrolami; (2) Obrazowanie Ca2 + hodowanych astrocytów podczas wyczerpywania się zapasów wapnia przez thapsygarginę (Thg), niekonkurencyjny inhibitor ATPazy Ca2 + retikulum endoplazmatycznego, a następnie wejście wapnia w magazynie wywołane przez dodanie wapnia do roztworu rejestrującego, co pokazuje różnicę między działaniem magazynu Ca2 + w hSOD1G93A i w astrocytach nietransgenicznych; (3) Obrazowanie Ca2 + hodowanego mikrogleju wykazujące głównie brak odpowiedzi na ALS IgG, podczas gdy zastosowanie ATP wywołało zmianę Ca2 +. W artykule podkreślono również możliwe zastrzeżenia i przestrogi dotyczące krytycznej gęstości komórek i czystości kultur, wyboru odpowiedniego stężenia barwnika Ca2+ i technik ładowania barwnikiem.

Wprowadzenie

Techniki hodowli komórkowych dały początek licznym postępom w różnych dziedzinach neurofizjologii komórkowej w zdrowiu i chorobie. W szczególności pierwotne hodowle komórkowe, świeżo wyizolowane z tkanki neuronalnej zwierzęcia laboratoryjnego, pozwalają eksperymentatorowi dokładnie badać zachowanie różnych komórek w różnych pożywkach biochemicznych i konfiguracjach fizjologicznych. Wykorzystanie różnych fluorescencyjnych wskaźników fizjologicznych, takich jak barwniki wrażliwe na Ca2+, w połączeniu z poklatkową mikroskopią wideo zapewnia lepszy wgląd w komórkowe procesy biofizyczne i biochemiczne w czasie rzeczywistym.

ALS jest wyniszczającą chorobą neurodegeneracyjną, która atakuje górne i dolne neurony ruchowe1. Choroba ma złożoną patogenezę typu rodzinnego, ale głównie w postaci sporadycznej (90% przypadków)2. Powszechnie wiadomo, że autonomiczne mechanizmy niekomórkowe przyczyniają się do patofizjologii ALS, przede wszystkim ze względu na istotną rolę komórek glejowych3. ALS jest również dobrze scharakteryzowany jako choroba neurozapalna z udziałem humoralnych i komórkowych czynników zapalenia.

Immunoglobulina G jest szeroko stosowana jako marker molekularny w ALS i innych chorobach neurodegeneracyjnych. Badanie poziomu tego markera w surowicy może wskazywać na obecność i stadium zapalenia układu nerwowego w chorobie4,5,6, podczas gdy jego obecność w płynie mózgowo-rdzeniowym może wskazywać na naruszenie bariery krew-mózg7. IgG zidentyfikowano również jako złogi w neuronach ruchowych rdzenia kręgowego u pacjentów z ALS7. Niemniej jednak podejście to wykazało pewne niespójności w korelacji poziomu IgG ze stopniem zaawansowania i charakterystyką choroby6.

IgG wyizolowane z surowicy pacjentów z ALS (ALS IgG) może wywołać odpowiedź wapniową u naiwnych astrocytów8 i uwalnianie glutaminianu w neuronach, wskazując na efekt ekscytotoksyczny - cechę charakterystyczną patologii ALS9. Jednak badania na szczurzym modelu ALS hSOD1G93A (zawierającym wiele kopii ludzkiej mutacji SOD110) wykazały szereg markerów stresu oksydacyjnego w hodowanych komórkach neurogleju11, tissues12,13,14, lub żywe zwierzęta13. Warto zauważyć, że astrocyty wyhodowane z modelu szczura ALS były bardziej podatne na stres oksydacyjny wywołany nadtlenkiem niż astroglej z nietransgenicznych rodzeństwa z miotu11.

Komórki mikrogleju w hodowli są dotknięte ALS IgG w mniej widoczny sposób. Mianowicie, linia komórek mikrogleju BV-2 wykazała wzrost sygnału z fluorescencyjnych markerów stresu oksydacyjnego w odpowiedzi na zastosowanie tylko próbek pacjentów z 4/11 ALS IgG15. Powszechnie wiadomo, że mikroglej uczestniczy w wielu patologiach neurozapalnych, przyczyniając się do stresu oksydacyjnego i późnej fazy progresji w niekomórkowym autonomicznym mechanizmie ALS16,17. Niemniej jednak dane z ALS IgG wskazują, że komórki te mogą nie być tak reaktywne jak astrocyty na te humoralne czynniki zapalenia ALS. Przeprowadzono kilka badań na pierwotnych astrocytach z mysich modeli ALS, nie tylko u młodych, ale także u zwierząt z objawami, zarówno na mózgu, jak i na rdzeniu kręgowym18,19,20,21. Dotyczy to również pierwotnych kultur mikrogleju, choć w mniejszym stopniu niż astrocytów i głównie z regionów mózgu w stadium embrionalnym22,23,24.

Używamy obrazowania poklatkowego Ca2+ na komórkach w hodowli głównie jako sposobu na śledzenie wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych tego jonu jako fizjologicznego markera ekscytotoksyczności. Tak więc, poprzez biofizyczną charakterystykę tych stanów nieustalonych (amplituda, obszar pod stanem przejściowym, czas narastania, częstotliwość) badacz może uzyskać eksperymentalne parametry diagnostyczne z różnych komórkowych modeli neurodegeneracji. Technika ta oferuje zatem przewagę w postaci ilościowej oceny fizjologicznej IgG jako biomarkerów choroby. Istnieje obszerna literatura na temat roli IgG i Ca2+ w indukcji ALS. Większość z tych badań przeprowadzono poprzez indukcję ALS poprzez wstrzyknięcie pacjentom IgG do zwierząt doświadczalnych25,26,27,28,29, które następnie wykazały wewnątrzkomórkowe podwyższenie Ca2+ i depozycje IgG. W ramach szeregu badań badano wpływ ALS IgG na synapsę ruchową in vitro30,31,32. W powyższym kontekście, przedstawiona tutaj technika skupia się na komórkach glejowych jako ważnych graczach w niekomórkowym autonomicznym mechanizmie ALS i określa ilościowo ich potencjalną odpowiedź ekscytotoksyczną na IgG jako humoralne czynniki zapalenia nerwów. Podejście to może mieć szersze zastosowanie w testowaniu innych czynników humoralnych, takich jak całe surowice, płyn mózgowo-rdzeniowy lub cytokiny w różnych systemach hodowli komórkowych oraz w komórkowych modelach ogólnego stanu zapalnego.

Ten artykuł opisuje, jak przygotować pierwotne kultury komórek glejowych, astrocytów i mikrogleju z kory mózgowej szczurów Sprague Dawley i jak dalej wykorzystywać te komórki do badania patofizjologii ALS za pomocą IgG pochodzącej z surowic pacjenta. Szczegółowe są protokoły dotyczące obciążania barwnikiem hodowanych komórek (Rysunek 1) oraz zapisów zmian Ca2+ w eksperymentach z obrazowaniem poklatkowym. Przykłady nagrań wideo pokażą, jak komórki glejowe reagują na ALS IgG w porównaniu z ATP, które aktywuje receptory błony purynergicznej. Po raz pierwszy pokazano przykład, w jaki sposób astrocyty wyizolowane z mózgu szczura ALS hSOD1G93A reagują z bardziej wyraźną odpowiedzią Ca2 + na IgG ALS w porównaniu z kontrolami nietransgenicznymi i jak powiązać ten proces z różnicami w działaniu magazynu Ca2 +. Pokazano również przykład obrazowania wapnia w komórkach mikrogleju z ostrym wyzwaniem ALS IgG, z jedynie umiarkowaną odpowiedzią wewnątrzkomórkowego wapnia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z dyrektywami UE dotyczącymi ochrony zwierząt do celów naukowych i za zgodą Komisji Etycznej Wydziału Biologii Uniwersytetu w Belgradzie (numer zatwierdzenia EK-BF-2016/08). Jeśli chodzi o materiał pacjenta (surowice dla IgG), został on pobrany do rutynowego badania klinicznego za świadomą zgodą pacjenta zgodnie z Kodeksem Etycznym Światowego Stowarzyszenia Lekarzy (Deklaracja Helsińska) dla eksperymentów z udziałem ludzi. Protokół został zatwierdzony przez komisję bioetyczną Centrum Klinicznego Serbii (nr 850/6).

1. Przygotowanie pierwotnej hodowli komórkowej

  1. Izolacja tkanki mózgowej
    UWAGA: Izolację należy wykonać na lodzie, używając lodowatych roztworów.
    1. Użyj nowonarodzonych szczeniąt w wieku 1-3 dni do podstawowej hodowli komórek noworodków33.
      UWAGA: W przedstawionym tutaj badaniu wykorzystano Sprague Dawley hSOD1G93A i nietransgeniczne szczury. Do genotypowania wykorzystano ogony szczurów do późniejszej ekstrakcji DNA i PCR.
    2. Posyp głowę szczeniaka 70% etanolem i natychmiast szybko odetnij jej głowę za pomocą nożyczek.
    3. Rozetnij skórę za pomocą nożyczek o małym kącie, aby odsłonić czaszkę. Otwórz czaszkę, wykonując cięcie od otworu wielkiego w kierunku oczodołów. Następnie wykonaj prostopadłe cięcie linii środkowej. Usunąć mózg z czaszki i umieścić go na szalce Petriego zawierającej sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
      UWAGA: Wyczyść narzędzia między szczeniętami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu między szczeniętami transgenicznymi i nietransgenicznymi. Izolacja kory mózgowej od reszty mózgu powinna być wykonana pod mikroskopem stereoskopowym.
    4. Za pomocą końcówki kleszczy rozerwij połączenia między obiema półkulami. Następnie oddziel półkule zakrzywionymi kleszczami, delikatnie popychając półkulę od środka na bok.
    5. Usuń opony, ostrożnie rozrywając je prostymi i zakrzywionymi kleszczami.
    6. Usuń hipokamp, ściskając go zakrzywionymi kleszczami. Wyrzuć hipokamp lub użyj go do innego przygotowania hodowli komórkowych.
      UWAGA: Dalsze kroki należy wykonywać pod okapem z przepływem laminarnym, aby zapewnić sterylne warunki.
  2. Homogenizacja i dysocjacja tkanek
    1. Przenieś jedną korę do 15 ml probówki wypełnionej 3 ml zimnego PBS. Pipetować zawiesinę w górę i w dół za pomocą końcówki o pojemności 1 ml, wykonując 10-15 ruchów, aż zawiesina stanie się jednorodna.
      UWAGA: Bądź bardzo ostrożny, aby nie wytwarzać pęcherzyków w tym procesie.
    2. Wirować przy 500 × g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml zimnego PBS, pipetując go w górę i w dół za pomocą końcówki o pojemności 1 ml. Powtórz krok wirowania.
      UWAGA: Wszystkie roztwory stosowane od tego momentu należy wstępnie podgrzać do temperatury 37 °C.
    3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml kompletnego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i antybiotykami (penicyliną i streptomycyną). Przenieść homogenat do probówki o pojemności 2 ml.
    4. Przepuścić homogenat przez igły 21 G i 23 G (po trzy razy każda) w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.
      UWAGA: Bądź bardzo ostrożny, aby nie wytwarzać pęcherzyków w tym procesie.
  3. Wlać zawiesinę komórkową przygotowaną z jednej kory do płytki Petriego o średnicy 60 mm lub kolby T25 (z powierzchnią wstępnie pokrytą powłoką polipeptydową do wzrostu przylegających komórek) zawierającej 3 ml kompletnego DMEM. Lekko wstrząsnąć szalką Petriego, aby zawiesina została równomiernie rozprowadzona.
  4. Hodować komórki w inkubatorze w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 / 95% powietrza o temperaturze 37 °C.
  5. Zmienić pożywkę 48 godzin po izolacji i wymieniać pożywkę co 3 dni.
  6. Aby pobudzić wzrost astrocytów, gdy komórki osiągną zbieżność 70%-80%, umyj je wstępnie podgrzanym PBS, aby usunąć luźno przyczepione komórki glejowe i ślady FBS w pożywce.
    1. Trypsynizuj leżącą poniżej warstwę astrocytów, dodając 1 ml wstępnie podgrzanego roztworu trypsyny (0,25% trypsyny, 0,02% EDTA w PBS, sterylnie filtrowane).
    2. Umieścić naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 2-5 minut.
    3. Sprawdź komórki pod mikroskopem. Kiedy zaczną się odłączać, dodaj 4 ml kompletnego DMEM.
    4. Zebrać zawiesinę komórek i przenieść ją do probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 500 × g przez 5 min.
    5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml kompletnego podłoża. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
    6. Ponownie pokryć komórki w gęstości 10,4 komórek/cm, 2 w 5 ml świeżego, kompletnego DMEM.
  7. Zmieniaj podłoże co 3 dni. Aby zminimalizować obecność innych typów komórek glejowych, po osiągnięciu przez astrocyty 50% konfluencji i przed każdą wymianą pożywki, umyj komórki kompletnym DMEM.
    1. Odessać pożywkę sklarowaną nad osadem za pomocą pipety o pojemności 1 ml i kilkakrotnie delikatnie nanieść na warstwę komórek. Upewnij się, że cała powierzchnia warstwy komórek jest pokryta podczas tego etapu mycia.
  8. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji (zwykle po 14 dniach), powtórz trypsynizację i pobieranie astrocytów, jak opisano w kroku 1.6.
  9. Nasiona 5 × 103 astrocytów na okrągłym szkiełku nakrywkowym o średnicy 7 mm pokrytym poli-L-lizyną (50 μg/ml). Używaj ich w eksperymentach po 48 godzinach.
  10. Aby promować mikroglej, po kroku 1.7 pozwól komórkom glejowym dotrzeć do warstwy zlewającej się34. Kiedy komórki mikrogleju pojawią się na wierzchu warstwy astrocytów (po 10-15 dniach, rozpoznawane po mniejszych, bardziej owalnych ciałach i krótszych procesach), potrząsaj szalką Petriego na wytrząsarce orbitalnej przez 2 godziny z prędkością 220 obr./min.
  11. Dyspergowanie i wysiewanie komórek mikrogleju
    1. Oderwane i luźno połączone komórki należy delikatnie umyć, zasysając pożywkę sklarowaną nad osadem końcówką pipety o pojemności 1 ml i delikatnie nanieść ją kilkakrotnie na warstwę komórek. Upewnij się, że podczas tego etapu płukania pokryłeś całą powierzchnię warstwy komórek, zbierz pożywkę z oderwanymi komórkami i przenieś ją do probówki o pojemności 15 ml.
    2. Wirować przy 500 × g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki.
    3. Przepuścić zawiesinę komórek przez igłę 21 G, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
      UWAGA: Większość opublikowanych metod wykorzystuje trypsynę lub papainę do dysocjacji tkanki; jednak igły 21 G mają tę zaletę, że zapobiegają nadmiernemu trawieniu komórek, co pozwala na łagodniejszą dysocjację.
    4. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Wysiew 5 × 103 komórek mikrogleju na okrągłym szkiełku nakrywkowym o średnicy 7 mm pokrytym poli-L-lizyną (50 μg/ml). Używaj ich w eksperymentach po 48 godz.
      UWAGA: Trudno jest uzyskać czystą hodowlę mikrogleju przez wstrząsanie, ponieważ komórki prekursorowe oligodendrocytów i astrocyty mogą być nadal obecne w zmiennej liczbie, w zależności od doświadczenia eksperymentatora. Protokół immunocytochemiczny używany do szacowania obecności różnych populacji komórek w hodowlach glejowych został opisany w innym miejscu35.

2. Immunocytochemia

  1. Opłucz komórki posiane na szkiełkach nakrywkowych w PBS, 2 x 1 min.
  2. Utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  3. Prać w PBS 3 x 5 min.
  4. Inkubować w roztworze blokującym zawierającym 10% normalnej surowicy osła (NDS)/1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)/0,1% Triton X-100 przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
    1. Dodać 50 μl roztworu blokującego na szkiełko nakrywkowe o średnicy 10 mm.
  5. Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe w 1% NDS/1% BSA/0,1% TritonX-100 w następujących rozcieńczeniach: mysie anty-GFAP 1:300, kozie anty-Iba1 1:500. Inkubować komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez noc w temperaturze +4 °C.
  6. Płukać w PBS, 3 x 10 min.
  7. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem: anty-mysim osłem (wzbudzenie 488 nm [1:200)) lub anty-kozłem osła (wzbudzonym przy 647 nm [1:200)). Inkubować komórki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.
  8. Prać w PBS, 7 x 5 min.
  9. Inkubować komórki z 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI, 1:4,000) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Prać w PBS 5 x 5 min.
  11. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych za pomocą roztworu montażowego; użyj jednej kropli na szkiełko nakrywkowe.
    UWAGA: Rozcieńczenia przeciwciał mogą się różnić w zależności od producenta. Użytkownicy muszą określić optymalne rozcieńczenia dla swoich eksperymentów.

3. Obrazowanie filmów poklatkowych

UWAGA: Roztwory zawierające barwnik fluorescencyjny powinny być chronione przed bezpośrednim światłem. Przed rozpoczęciem eksperymentu z obrazowaniem upewnij się, że szklane szkiełko nakrywkowe nie porusza się podczas włączania perfuzji.

  1. Przygotowanie roztworów i komórek
    1. Przygotuj roztwór zewnątrzkomórkowy (ECS) do obrazowania: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal2, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glukozy i 10 mM HEPES. Dostosować pH do 7,4. Upewnij się, że osmolarność wynosi 280-300 mOsm/kg i przygotuj ECS bez Ca2+: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glukozy, 10 mM HEPES i 0,1 mM EGTA.
    2. Przygotować roztwory testowe: 100 μM ATP rozpuszczone w ECS, 1 μM Thg w ECS bez Ca2+ i 0,1 mg/ml ALS IgG w ECS8.
    3. Przenieś jedno szkiełko nakrywkowe do naczynia z ECS, aby wypłukać cały DMEM. Przygotować roztwór do ładowania barwnikiem, rozcieńczając 1 mM roztwór podstawowy Fluo-4 AM z ECS do końcowego stężenia 5 μM Fluo-4 AM.
      1. Umieść szkiełko nakrywkowe z komórkami w roztworze nasycającym barwnik na 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Myj komórki w ECS przez 20 minut.
    4. Jeśli ogniwa nie są odpowiednio obciążone (tj. jeśli podstawowy poziom fluorescencji jest zbyt niski <5% zakresu dynamicznego kamery przy czasie naświetlania większym niż 400 ms), należy wydłużyć czas ładowania do 45 min do 1 h w temperaturze 37 °C. Alternatywnie, należy zmieszać roztwór podstawowy Fluo-4 AM z równą objętością 20% (w/v) detergentu (Pluronic) w DMSO przed rozcieńczeniem w ECS, co daje końcowe stężenie Pluronic ~0,02%.
      UWAGA: Eksperymentalne przykłady tego badania przeprowadzono z ludzkimi IgG wyizolowanymi z surowic krwi pacjentów z ALS, jak opisano wcześniej4,5,11. Każdy eksperyment przeprowadzono na próbkach IgG od jednego pacjenta.
  2. Obrazowanie wideo
    UWAGA: W tym protokole system obrazowania wideo został połączony z ksenonową lampą o krótkim łuku, systemem polichromatora i odwróconym mikroskopem epifluorescencyjnym wyposażonym w obiektyw zanurzeniowy w wodzie, glicerynie i oleju. Obrazowanie poklatkowe wykonano przy użyciu systemu aparatów cyfrowych.
    1. Włącz elementy zestawu do obrazowania na 15 minut przed eksperymentem, aby system osiągnął temperaturę roboczą.
    2. Umieścić szkiełko nakrywkowe w komorze rejestracyjnej z 1 ml roztworu roboczego (ECS lub ECS bez Ca2+).
    3. Aby wybrać właściwy protokół obrazowania, otwórz oprogramowanie do obrazowania i w panelu Akwizycja wybierz pary filtrów dla Fluo4-AM o długości fali wzbudzenia przy 480 nm, zwierciadle dichroicznym przy 505 nm i długości fali emisji przy 535 nm.
    4. Wybierz pole widzenia, zwracając uwagę na stałą liczbę komórek w całym eksperymencie. Dostosuj odpowiednio czas ekspozycji i wzmocnienie detektora, w taki sposób, aby sygnał nie był nasycony. Wybierz tryb pseudokoloru do akwizycji. Aby uzyskać bardziej szczegółowe instrukcje, zapoznaj się z instrukcją dostarczoną przez producenta.
    5. Dostosuj częstotliwość próbkowania do 1 Hz (1 klatka na sekundę).
    6. Obrazowanie należy rozpocząć od uzyskania podstawowego poziomu fluorescencji przez 3-5 minut w celu wyznaczenia linii podstawowej (F0). Zapewnić stały przepływ roztworu roboczego.
    7. Zatrzymaj przepływ roztworu roboczego i przełącz się na roztwór testowy na żądany czas (zobacz również słupki czasu w przykładach Rysunek 2 i Rysunek 3). Pomiędzy każdym roztworem badanym przemywać komórki stałym przepływem roztworu roboczego przez 3-5 minut.
    8. Utrzymuj objętość roztworu w komorze zapisu na poziomie ~1 ml, organizując stałe ssanie od góry roztworu (patrz Rysunek 2E).
      UWAGA: Aby zastosować leczenie bezpośrednio do obrazowanych komórek, niestandardowy system dostarczania wykonany ze szklanej pipety (średnica wewnętrzna 0,8 mm) został umieszczony w odległości ~350 μm i ~1 mm nad komórkami, pod kątem 45° w połączeniu z systemem wymiany roztworu zawierającym zawory zaciskowe i elektroniczny sterownik zaworu (patrz Rysunek 2E).

4. Analiza danych

  1. Zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) odpowiadający pojedynczej komórce.
    1. Wybierz klatkę o największym natężeniu sygnału (tj. z aplikacji ATP) i okrąż jedną komórkę za pomocą aplikacji Polygonal Tool. Powtórz te czynności dla wszystkich komórek w pobranym polu. Wybierz pięć ROI w tle za pomocą narzędzia Okrąg.
    2. Aby zmierzyć średnią intensywność sygnału pojedynczej komórki i tła dla każdej klatki czasowej, wybierz wszystkie ROI i użyj polecenia Multi Measure w Menedżerze ROI w ImageJ lub dowolnego równoważnego polecenia w oprogramowaniu komercyjnym (patrz Spis materiałów).
  2. Wyeksportuj średnie wartości intensywności sygnału ROI jako arkusz kalkulacyjny.
  3. Uśrednij pięć ROI tła i odejmij uśrednione tło każdej klatki od średniej intensywności ROI klatki uzyskanej w tym samym czasie.
  4. Aby znormalizować uzyskane dane do sygnału bazowego, należy użyć równania (1):
    ΔF/F0 = (F - F0)/F0 (1)
    gdzie F jest intensywnością sygnału w każdej ramce czasowej po odjęciu tła, a F0 jest podstawową fluorescencją Fluo-4.
    UWAGA: W tym badaniu użyto niestandardowego kodu.
  5. Aby przeanalizować aktywność wapnia, należy określić kilka parametrów4: amplituda piku wapnia (ΔF/F0), zintegrowana zmiana (całka czasowa, powierzchnia pod zapisem odpowiedzi) stanu przejściowego wapnia (ΔF/F0 × s), czas do osiągnięcia szczytu, który upłynął od początku stymulacji do maksimum stanu przejściowego wapnia (s), czas narastania-czas, jaki upłynął od początku stymulacji do wartości ΔF/F0, która osiąga 50%-80% maksymalnej amplitudy (s), połowa szerokości-pełna szerokość stanu nieustalonego przy połowie maksymalnej amplitudy (s), częstotliwość odpowiedzi, jeśli są powtarzalne (Hz).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Charakterystyka różnych typów komórek glejowych w hodowli
Przygotowanie astrocytów do eksperymentów zajmuje zazwyczaj od 15 do 21 dni, natomiast hodowla komórek mikrogleju trwa od 10 do 15 dni. W celu oceny czystości hodowli komórkowych przeprowadzono barwienie immunocytochemiczne. Rysunek 1 przedstawia ekspresję podwójnego znakowania markera astrocytarnego GFAP oraz markera mikrogleju Iba1 w odpowiednich hodowlach.

Obrazowanie wapnia pozwala ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule przedstawiono metodę pierwotnej hodowli komórek jako szybkie i "budżetowe" narzędzie do badania różnych aspektów (pato)fizjologii komórki, takich jak ALS w szczurzym modelu hSOD1G93A . Technika ta nadaje się zatem do badań na poziomie pojedynczych komórek, które można ekstrapolować i dalej badać na wyższym poziomie organizacji (tj. w wycinkach tkanek lub na żywym zwierzęciu). Hodowla komórkowa jako technika ma jednak kilka zastrzeżeń. Niezwykle ważne jest wykonanie izolacji tkanki mózgowej i dysocja...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Ministerstwo Edukacji, Nauki i Rozwoju Technologicznego Republiki Serbii Kontrakt nr 451-03-9/2021-14/ 200178, projekt FENS - NENS Education and Training Cluster "Trilateral Course on Glia in Neuroinflammation" oraz grant EC H2020 MSCA RISE #778405. Dziękujemy Mariji Adžić i Minie Perić za dostarczenie obrazów immunohistochemicznych oraz Danijeli Bataveljić za pomoc w pisaniu artykułów na papierze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka 15 mlSarstedt, Niemcy62 554 502
Probówka 2 mlSarstedt, Niemcy72.691
Igła 21 GNipro, JaponiaHN-2138-ET
Igła 23 GNipro, JaponiaHN-2338-ET
Strzykawka 5 mlNipro, JaponiaSY3-5SC-EC
6 mm okrągłe szklane szkiełko nakrywkoweMenzel Glasser, Niemcy630-2113
60 mm szalka PetriegoThermoFisher Sientific, Stany Zjednoczone130181
ATPSigma-Aldrich, NiemcyA9062
AxioObserver A1Carl Zeiss, Niemcy
Albumina surowicy bydlęcejSigma-Aldrich, NiemcyB6917
Chlorek wapniaSigma-Aldrich, Niemcy2110
WirówkaEppendorf, Niemcy
DAPISigma-Aldrich, Niemcy10236276001
D-glukozaSigma-Aldrich, Niemcy158968
DMEMSigma-Aldrich, NiemcyD5648
Osioł-anty koza AlexaFluor 647 Przeciwciało IgGInvitrogen, USAA-21447
Osioł-anty mysz AlexaFluor 488 Przeciwciało IgGInvitrogen, USAA-21202
EDTASigma-Aldrich, NiemcyEDS-100G
EGTASigma-Aldrich, NiemcyE4378
" evolve"-EM 512 System aparatów cyfrowychFotometria, Stany Zjednoczone
Surowica bydlęca płodu (FBS)Gibco, ThermoFisher Scientific, USA10500064
Fidżi ImageJ SoftwareOpen source na licencji GNU General Public License
Zestaw filtrów FITCChroma Technology Inc., Stany Zjednoczone
Sondy molekularneFluo-4 AMF14201
Kozia anty-Iba1Fujifilm Wako Chemicals, USA011-27991
HEPESBiowest, FrancjaP5455
System szybkiej wymiany roztworówALA Scientific Instruments, USA
InkubatorMemmert GmbH + Co. KG, Niemcy
Chlorek magnezuSigma-Aldrich, NiemcyM2393
Oprogramowanie MatlabMath Works, USA
Mysz anty-GFAPMerck Millipore, USAMAB360
Mowiol 40-88Sigma-Aldrich, Niemcy324590
Normalna surowica osłaSigma-Aldrich, NiemcyD9663
ParaformaldehydSigma-Aldrich, Niemcy158127
Penicilin i StreptomycynaThermoFisher Sientific, Stany Zjednoczone15140122
Poli-L-lizynaSigma-Aldrich, NiemcyP5899
Chlorek potasuSigma-Aldrich, NiemcyP5405
Diwodorofosforan potasuOdczynniki Carlo Erba, Hiszpania
DELFIA PlateShakePerkinElmer Life Sciencies, USA
Wodorowęglan soduSigma-Aldrich, NiemcyS3817
Chlorek soduSigma-Aldrich, NiemcyS5886
Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodnyCarl ROTH GmbHX987.2
Pirogronian soduSigma-Aldrich, NiemcyP5280
ThapsigargineTocris Bioscience, Wielka Brytania1138
Triton X - 100Sigma-Aldrich, NiemcyT8787
TrypsynaSigma-Aldrich, NiemcyT4799
Oscylometr ciśnienia par Vapro 5520Wescor, ELITechGroup Inc., Stany Zjednoczone
System obrazowania ViiFluorVisitron System Gmbh, Niemcy
System polichromatora VisiChromeVisitron System Gmbh, Niemcy
Konfiguracja o wysokiej wydajności VisiViewVisitron System Gmbh, Niemcy
Ksenonowa lampa łukowaUshio, Japonia
, USA Wytrząsarka 471686

Bibliografia

  1. Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
  2. Taylor, J. P., Brown, R. H. J., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
  3. Gleichman, A. J., Carmichael, S. T. Glia in neurodegeneration: Drivers of disease or along for the ride. Neurobiology of Disease. 142, 104957(2022).
  4. Zhang, R., et al. Evidence for systemic immune system alterations in sporadic amyotrophic lateral sclerosis (sALS). Journal of Neuroimmunology. 159 (1-2), 215-224 (2005).
  5. Saleh, I. A., et al. Evaluation of humoral immune response in adaptive immunity in ALS patients during disease progression. Journal of Neuroimmunology. 215 (1-2), 6(2009).
  6. Wang, M., et al. Evaluation of Peripheral Immune Activation in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Frontiers in Neurology. 12, 628710(2021).
  7. Li, J. -Y., et al. Blood-brain barrier dysfunction and myelin basic protein in survival of amyotrophic lateral sclerosis with or without frontotemporal dementia. Neurological Sciences. 43 (5), 3201-3210 (2022).
  8. Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis affects cytosolic Ca2+ homeostasis in cultured rat astrocytes. Cell Calcium. 54 (1), 17-25 (2013).
  9. Andjus, P. R., Stevic-Marinkovic, Z., Cherubini, E. Immunoglobulins from motoneurone disease patients enhance glutamate release from rat hippocampal neurones in culture. Journal of Physiology. 504, 103-112 (1997).
  10. Howland, D. S., et al. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (3), 1604-1609 (2002).
  11. Dučić, T., Stamenković, S., Lai, B., Andjus, P., Lučić, V. Multimodal synchrotron radiation microscopy of intact astrocytes from the hSOD1 G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Analytical Chemistry. 91 (2), 1460-1471 (2019).
  12. Popović-Bijelić, A., et al. Iron-sulfur cluster damage by the superoxide radical in neural tissues of the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 96, 313-322 (2016).
  13. Stamenković, S., et al. In vivo EPR pharmacokinetic evaluation of the redox status and the blood brain barrier permeability in the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 108, 258-269 (2017).
  14. Stamenković, S., Dučić, T., Stamenković, V., Kranz, A., Andjus, P. R. Imaging of glial cell morphology, SOD1 distribution and elemental composition in the brainstem and hippocampus of the ALS hSOD1(G93A) rat. Neuroscience. 357, 37-55 (2017).
  15. Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from sera of amyotrophic lateral sclerosis patients induce oxidative stress and upregulation of antioxidative system in BV-2 microglial cell line. Frontiers in Immunology. 8, 1619(2017).
  16. Boillée, S., Cleveland, D. W. Revisiting oxidative damage in ALS: microglia, Nox, and mutant SOD1. Journal of Clinical Investigation. 118 (2), 474-478 (2008).
  17. Boillée, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
  18. Martínez-Palma, L., et al. Mitochondrial modulation by dichloroacetate reduces toxicity of aberrant glial cells and gliosis in the SOD1G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of American Society for Experimental Neurotherapeutics. 16 (1), 203-215 (2019).
  19. Díaz-Amarilla, P., et al. Phenotypically aberrant astrocytes that promote motoneuron damage in a model of inherited amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), 18126-18131 (2011).
  20. Barbosa, M., et al. Recovery of depleted miR-146a in ALS cortical astrocytes reverts cell aberrancies and prevents paracrine pathogenicity on microglia and motor neurons. Frontiers in Cell Developmental Biology. 9, 634355(2021).
  21. Gomes, C., et al. Astrocyte regional diversity in ALS includes distinct aberrant phenotypes with common and causal pathological processes. Experimental Cell Research. 395 (2), 112209(2020).
  22. Kovacs, M., et al. CD34 identifies a subset of proliferating microglial cells associated with degenerating motor neurons in ALS. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3880(2019).
  23. Komiya, H., et al. Ablation of interleukin-19 improves motor function in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Molecular Brain. 14 (1), 1-13 (2021).
  24. Trias, E., et al. Emergence of microglia bearing senescence markers during paralysis progression in a rat model of inherited ALS. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 1-14 (2019).
  25. Pullen, A. H., Demestre, M., Howard, R. S., Orrell, R. W. Passive transfer of purified IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis to mice results in degeneration of motor neurons accompanied by Ca2+ enhancement. Acta Neuropatholgica. 107 (1), 35-46 (2004).
  26. Obál, I., et al. Intraperitoneally administered IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis or from an immune-mediated goat model increase the levels of TNF-α, IL-10 in the spinal cord and serum of mice. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 121(2016).
  27. Obál, I., et al. Experimental motor neuron disease induced in mice with long-term repeated intraperitoneal injections of serum from ALS patients. International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2573(2019).
  28. Mohamed, H. A., et al. Immunoglobulin Fc gamma receptor promotes immunoglobulin uptake, immunoglobulin-mediated calcium increase, and neurotransmitter release in motor neurons. Journal of Neuroscience Research. 69 (1), 110-116 (2002).
  29. Engelhardt, J. I., Siklos, L., Appel, S. H. Altered calcium homeostasis and ultrastructure in motoneurons of mice caused by passively transferred anti-motoneuronal IgG. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 56 (1), 21-39 (1997).
  30. Pagani, M. R., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Calcium signaling pathways mediating synaptic potentiation triggered by amyotrophic lateral sclerosis IgG in motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2661-2672 (2006).
  31. Carter, J. R., Mynlieff, M. Amyotrophic lateral sclerosis patient IgG alters voltage dependence of Ca2+ channels in dissociated rat motoneurons. Neuroscience Letters. 353 (3), 221-225 (2003).
  32. Fratantoni, S. A., Weisz, G., Pardal, A. M., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Amyotrophic lateral sclerosis IgG-treated neuromuscular junctions develop sensitivity to L-type calcium channel blocker. Muscle & Nerve. 23 (4), 543-550 (2000).
  33. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
  34. Vay, S. U., et al. The impact of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) and voltage-gated potassium KCNQ/Kv7 channels on primary microglia function. Journl of Neuroinflammation. 17 (1), 100(2020).
  35. Bijelić, D. D., et al. Central nervous system-infiltrated immune cells induce calcium increase in astrocytes via astroglial purinergic signaling. Journal of Neuroscience Research. 98 (11), 2317-2332 (2020).
  36. Kawamata, H., et al. Abnormal intracellular calcium signaling and SNARE-dependent exocytosis contributes to SOD1G93A astrocyte-mediated toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2331-2348 (2014).
  37. Nims, R. W., Price, P. J. Best practices for detecting and mitigating the risk of cell culture contaminants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 53 (10), 872-879 (2017).
  38. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079(2013).
  39. Adzic, M., et al. Extracellular ATP induces graded reactive response of astrocytes and strengthens their antioxidative defense in vitro. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1053-1066 (2017).
  40. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 198(2020).
  41. Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nature Neuroscince. 17 (1), 131-143 (2014).
  42. Vankriekelsvenne, E., et al. Transmembrane protein 119 is neither a specific nor a reliable marker for microglia. Glia. 70 (6), 1170-1190 (2022).
  43. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Podstawowa hodowla astrocyt whodowla mikroglejuobrazowanie wapniaizolacja kom rek glejowychmodel hSOD1G93Aimmunocytochemiamarker GFAPmarker Iba1barwnik Fluo 4 AM
Pierwotne kultury astrocytów szczurów i mikrogleju oraz ich zastosowanie w badaniu stwardnienia zanikowego bocznego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.