Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dwukolorowe, stymulowane rozpraszaniem Ramana w czasie rzeczywistym mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63484

⸱

1 lutego 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Washington

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) jest potężną, nieniszczącą i bezznacznikową techniką obrazowania. Jednym z pojawiających się zastosowań jest stymulowana histologia Ramana, w której dwukolorowe obrazowanie SRS w przejściach Ramana białek i lipidów jest wykorzystywane do generowania obrazów pseudo-hematoksyliny i eozyny. W tym miejscu demonstrujemy protokół dwukolorowego obrazowania SRS w czasie rzeczywistym w diagnostyce tkanek.

Streszczenie

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) stała się potężną techniką obrazowania optycznego do diagnozowania tkanek. W ostatnich latach wykazano, że dwukolorowy SRS jest w stanie zapewnić obrazy równoważne hematoksylinie i eozynie (H&E), które umożliwiają szybką i wiarygodną diagnozę raka mózgu. Takie możliwości umożliwiły ekscytujące zastosowania w śródoperacyjnej diagnostyce nowotworów. Dwukolorowe obrazowanie tkanki metodą SRS można wykonać za pomocą pikosekundowego lub femtosekundowego źródła laserowego. Lasery femtosekundowe mają tę zaletę, że umożliwiają elastyczne tryby obrazowania, w tym szybkie obrazowanie hiperspektralne i dwukolorowe obrazowanie SRS w czasie rzeczywistym. Podejście skupiające się spektralnie z ćwierkaniem impulsów laserowych jest zwykle stosowane w przypadku laserów femtosekundowych w celu osiągnięcia wysokiej rozdzielczości spektralnej.

Akwizycja dwukolorowego SRS może być realizowana z modulacją ortogonalną i wykrywaniem blokady. Złożoność ćwierkania, modulacji i charakterystyki pulsu jest wąskim gardłem dla powszechnego przyjęcia tej metody. Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół demonstrujący implementację i optymalizację spektralnego ogniskowania SRS oraz dwukolorowego obrazowania tkanki mózgowej myszy w czasie rzeczywistym w trybie epi. Protokół ten może być używany w szerokim zakresie zastosowań obrazowania SRS, które wykorzystują dużą szybkość i możliwości obrazowania spektroskopowego SRS.

Wprowadzenie

Tradycyjna diagnostyka tkanek opiera się na protokołach barwienia, po których następuje badanie pod mikroskopem optycznym. Jedną z powszechnych metod barwienia stosowanych przez patologów jest barwienie H&E: hematoksylina barwi jądra komórkowe na fioletowo-niebieski kolor, a eozyna barwi macierz zewnątrzkomórkową i cytoplazmę na różowo. To proste barwienie pozostaje złotym standardem w patologii dla wielu zadań związanych z diagnostyką tkanek, w szczególności w diagnostyce raka. Jednak histopatologia H&E, a w szczególności technika zamrożonego cięcia stosowana w warunkach śródoperacyjnych, nadal ma ograniczenia. Procedura barwienia jest pracochłonnym procesem obejmującym osadzanie tkanek, cięcie, utrwalanie i barwienie1. Typowy czas realizacji to 20 minut lub dłużej. Wykonywanie H&E podczas sekcjonowania przez zamrożenie może czasami stać się trudniejsze, gdy przetwarzanych jest wiele sekcji jednocześnie ze względu na konieczność oceny cech komórkowych lub wzorców wzrostu w 3D w celu oceny marginesu. Ponadto śródoperacyjne techniki histologiczne wymagają wykwalifikowanych techników i klinicystów. Ograniczenie liczby certyfikowanych patologów w wielu szpitalach jest w wielu przypadkach ograniczeniem dla konsultacji śródoperacyjnych. Ograniczenia te mogą zostać złagodzone dzięki szybkiemu rozwojowi zainteresowania patologią cyfrową i diagnostyką opartą na sztucznej inteligencji2. Jednak wyniki barwienia H&E są zmienne, w zależności od doświadczenia technika, co stanowi dodatkowe wyzwanie dla diagnostyki komputerowej2.

Te wyzwania mogą być potencjalnie rozwiązane za pomocą technik obrazowania optycznego bez etykiet. Jedną z takich technik jest mikroskopia SRS. SRS wykorzystuje zsynchronizowane lasery impulsowe - pompę i Stokesa - do wzbudzania drgań molekularnych z wysoką wydajnością3. Ostatnie doniesienia wykazały, że obrazowanie białek i lipidów metodą SRS może generować obrazy równoważne H&E (znane również jako stymulowana histologia Ramana lub SRH) z nienaruszoną świeżą tkanką, co omija potrzebę przetwarzania jakichkolwiek tkanek, znacznie skraca czas potrzebny na diagnozę i zostało dostosowane śródoperacyjnie4. Co więcej, obrazowanie SRS może dostarczać obrazy 3D, które dostarczają dodatkowych informacji do diagnozy, gdy obrazy 2D są niewystarczające5. SRH jest bezstronny i generuje obrazy cyfrowe, które są łatwo dostępne do diagnozy komputerowej. Szybko pojawia się jako możliwe rozwiązanie dla śródoperacyjnej diagnostyki raka i analizy marginesu guza, zwłaszcza w raku mózgu6,7,8. Ostatnio zasugerowano również, że obrazowanie SRS zmian chemicznych w tkance dostarcza użytecznych informacji diagnostycznych, które mogą dodatkowo pomóc klinicystom w stratyfikacji różnych typów lub etapów raka9.

Pomimo ogromnego potencjału w zastosowaniach do diagnostyki tkanek, obrazowanie SRS jest głównie ograniczone do laboratoriów akademickich specjalizujących się w optyce, ze względu na złożoność związaną z platformą obrazowania, która obejmuje ultraszybkie lasery, laserowy mikroskop skaningowy i zaawansowaną elektronikę detekcyjną. Protokół ten zapewnia szczegółowy przepływ pracy w celu zademonstrowania wykorzystania powszechnego źródła lasera femtosekundowego do dwukolorowego obrazowania SRS w czasie rzeczywistym i generowania obrazów pseudo-H&E z tkanki mózgowej myszy. Protokół będzie obejmował następujące procedury:

Optymalizacja wyrównania i ćwierkania
Większość schematów obrazowania SRS wykorzystuje lasery pikosekundowe lub femtosekundowe jako źródło wzbudzenia. W przypadku laserów femtosekundowych szerokość pasma lasera jest znacznie większa niż szerokość linii Ramana. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, stosuje się podejście skupiające spektralne, aby ustawić lasery femtosekundowe do pikosekundowej skali czasowej w celu uzyskania wąskiej rozdzielczości spektralnej10. Optymalna rozdzielczość spektralna jest osiągana tylko wtedy, gdy czasowe ćwierkanie (znane również jako dyspersja opóźnienia grupowego lub po prostu dyspersja) jest odpowiednio dopasowane do pompy i laserów Stokesa. Procedura wyrównywania i kroki potrzebne do optymalizacji dyspersji wiązek laserowych przy użyciu wysoce dyspersyjnych prętów szklanych są pokazane tutaj.

Kalibracja częstotliwości
Zaletą ogniskowania spektralnego SRS jest to, że wzbudzenie Ramana można szybko dostroić, zmieniając opóźnienie czasowe między pompą a laserami Stokesa. Takie dostrajanie zapewnia szybkie obrazowanie i niezawodną akwizycję spektralną w porównaniu z dostrajaniem długości fal laserowych. Jednak liniowa zależność między częstotliwością wzbudzenia a opóźnieniem czasowym wymaga kalibracji zewnętrznej. Rozpuszczalniki organiczne ze znanymi pikami Ramana są używane do kalibracji częstotliwości Ramana dla ogniskowania widmowego SRS.

Obrazowanie dwukolorowe w czasie rzeczywistym<br /> Ważne jest, aby zwiększyć szybkość obrazowania w zastosowaniach do diagnostyki tkanek, aby skrócić czas potrzebny na analizę dużych próbek tkanek. Jednoczesne dwukolorowe obrazowanie SRS lipidów i białek eliminuje potrzebę dostrajania lasera lub opóźnienia czasowego, co zwiększa prędkość obrazowania ponad dwukrotnie. Osiągnięto to dzięki zastosowaniu nowatorskiej techniki modulacji ortogonalnej i dwukanałowej demodulacji ze wzmacniaczem typu lock-in11. W artykule opisano protokół modulacji ortogonalnej i dwukanałowej akwizycji obrazu.

Epi-mode SRS imaging
Większość dotychczas pokazanych obrazowań SRS jest wykonywana w trybie transmisyjnym. Obrazowanie w trybie Epi wykrywa wstecznie rozproszone fotony z tissue12. W przypadku zastosowań patologicznych próbki chirurgiczne mogą być dość duże. W przypadku obrazowania w trybie transmisyjnym często konieczne jest cięcie tkanek, co w niepożądany sposób wymaga dodatkowego czasu. W przeciwieństwie do tego, obrazowanie w trybie epi może działać z nienaruszonymi próbkami chirurgicznymi. Ponieważ ten sam obiektyw jest używany do zbierania światła rozproszonego wstecznie, nie ma również potrzeby ustawiania kondensora o dużej aperturze numerycznej wymaganego do obrazowania transmisyjnego. Tryb Epi jest również jedyną opcją, gdy cięcie tkanek jest trudne, na przykład w przypadku kości. Wcześniej wykazaliśmy, że w przypadku tkanki mózgowej obrazowanie w trybie epi zapewnia lepszą jakość obrazowania dla grubości tkanki > 2 mm13. Protokół ten wykorzystuje polaryzacyjny rozdzielacz wiązki (PBS) do zbierania rozproszonych fotonów zdepolaryzowanych przez tkankę. Możliwe jest zebranie większej ilości fotonów za pomocą detektora pierścieniowego kosztem złożoności dostosowanego zestawu detektora12. Podejście PBS jest prostsze do wdrożenia (podobnie jak fluorescencyjne), przy czym standardowa fotodioda jest już używana do wykrywania trybu transmisji.

Generowanie obrazów pseudo-H&E
Po zebraniu dwukolorowych obrazów SRS można je ponownie pokolorować, aby symulować barwienie H&E. W artykule przedstawiono procedurę przekształcania obrazów SRS lipidów i białek w obrazy pseudo-H&E SRS do zastosowań patologicznych. Protokół eksperymentalny szczegółowo opisuje kluczowe kroki potrzebne do wygenerowania wysokiej jakości obrazów SRS. Przedstawiona tutaj procedura ma zastosowanie nie tylko w diagnostyce tkanek, ale może być również dostosowana do wielu innych zastosowań obrazowania hiperspektralnego SRS, takich jak obrazowanie leków i obrazowanie metaboliczne14,15.

Ogólne wymagania systemowe
System laserowy dla tego protokołu musi być w stanie wyprowadzić 2 zsynchronizowane femtosekundowe wiązki laserowe. Idealnie nadaje się do wyposażenia w optyczny oscylator parametryczny (OPO) do dostrajania jednej z wiązek laserowych o szerokiej długości fali. Konfiguracja w tym protokole wykorzystuje komercyjny system laserowy Insight DS+, który wysyła dwa lasery (jeden o stałej wiązce o długości fali 1 040 nm i jedną przestrajalną wiązkę opartą na OPO, w zakresie od 680 do 1 300 nm) z częstotliwością powtarzania 80 MHz. Laserowe mikroskopy skaningowe, zarówno od głównych producentów mikroskopów, jak i zbudowane w domu, mogą być używane do obrazowania SRS. Zastosowany mikroskop to pionowy laserowy mikroskop skaningowy zbudowany na komercyjnej ramie mikroskopu pionowego. Do skanowania wiązki laserowej służy para luster galvo o średnicy 5 mm. Użytkownicy, którzy zdecydują się na domowy laserowy mikroskop skaningowy, powinni zapoznać się z wcześniej opublikowanym protokołem budowy laserowego mikroskopu skaningowego16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem zwierząt przeprowadzono na utrwalonych, pociętych przekrojach mózgów myszych o grubości 200 µm, zgodnie z protokołem (# 4395-01) zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Waszyngtońskiego. Myszy typu dzikiego (szczep C57BL/6J) poddano eutanazji za pomocą CO2. Następnie wykonano kraniotomię w celu wyjęcia mózgów i ich utrwalenia w 4% paraformaldehydzie w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym. Mózgi zatopiono w mieszaninie 3% agarozy i 0,3% żelatyny, a następnie pocięto na plastry o grubości 200 μm przy użyciu wibratomu.

1. Wstępne wyrównanie

UWAGA: Aby uzyskać najlepszą czułość i rozdzielczość, należy upewnić się, że rozmiar i dywergencja wiązek obu ramion są dopasowane. Skolimuj wiązki pompy i Stokesa oraz dostosuj ich rozmiary przed wprowadzeniem do skanującego mikroskopu laserowego. W tym celu użyj pary soczewek achromatycznych dla każdej wiązki przed ich połączeniem na lustrze dichroicznym. Podczas ustawiania wiązek zawsze noś odpowiednie okulary ochronne do pracy z laserem.

  1. Kolimacja wiązki
    1. Zainstaluj parę soczewek achromatycznych dla wiązki pompowania. Jako punkt wyjścia użyj soczewki 100 mm i soczewki 200 mm, aby dwukrotnie powiększyć rozmiar wiązki laserowej. Upewnij się, że odległość między dwiema soczewkami wynosi około 300 mm. Wycentruj wiązkę pompowania względem obu soczewek.
    2. Umieść lustro za drugą soczewką, aby skierować wiązkę w stronę ściany (odległość >1 m). Zachowaj ostrożność podczas przesyłania wiązki na duże odległości. Śledź przebieg wiązki od lustra do ściany za pomocą karty IR i sprawdź, czy rozmiar wiązki ulega zmianie. Skolimuj wiązkę, jeśli jej rozmiar zmienia się w funkcji odległości.
      1. Jeśli wiązka jest zbieżna (rozmiar zmniejsza się wraz z propagacją), przesuń soczewki bliżej siebie.
      2. Jeśli wiązka jest rozbieżna (rozmiar zwiększa się wraz z propagacją), zwiększ odległość między soczewkami. Reguluj odległość do momentu skolimowania wiązki.
    3. Powtórz kroki 1.1.1 i 1.1.2 dla wiązki Stokesa, aby ją skolimować.
  2. Regulacja rozmiaru wiązki
    1. Jeśli dostępny jest profiler wiązki, zmierz rozmiar skolimowanej wiązki dla każdego z laserów. Alternatywnie, oszacuj rozmiar wiązki za pomocą karty IR i linijki, aby uzyskać średnicę wiązki rzędu 4-5 mm.
    2. Jeśli rozmiar wiązki jest zbyt mały lub zbyt duży, zmień parę soczewek użytych w kroku 1.1. Reguluj parę soczewek, aż obie wiązki osiągną średnicę 4-5 mm.
      UWAGA: Powiększenie wiązki jest stosunkiem ogniskowej drugiej soczewki do ogniskowej pierwszej soczewki (f2/f1).
  3. Nakładanie przestrzenne
    UWAGA: Obrazowanie SRS wymaga połączenia obu wiązek laserowych w przestrzeni i czasie w celu wzbudzenia drgań cząsteczkowych. Schemat obrazowania SRS z wykorzystaniem skupiania spektralnego przedstawiono na Rysunku 1.
    1. Połącz dwie wiązki laserowe, instalując lustro dichroiczne oraz kilka luster sterujących do regulacji. Zoptymalizuj nakładanie przestrzenne wiązki pompowania i wiązki Stokesa, monitorując wiązki za lustrem dichroicznym w dwóch oddalonych od siebie pozycjach (~1 m). Iteracyjnie reguluj lustro sterujące przed lustrem dichroicznym oraz samo lustro dichroiczne, aby wyrównać wiązkę Stokesa z wiązką pompowania.
      UWAGA: Jeśli obie wiązki nakładają się przestrzennie w obu pozycjach, oznacza to, że są wystarczająco zbieżne.
    2. Upewnij się, że połączone wiązki są kierowane do centrum luster skanujących mikroskopu skaningowego, regulując parę luster sterujących w sytuacji, gdy lustra skanujące znajdują się w pozycji parkingowej. Upewnij się, że obie wiązki przechodzą przez centrum obiektywu mikroskopu i kondensora.
    3. Za kondensorem użyj kolejnej pary soczewek o ogniskowych odpowiednio 100 mm i 30 mm, aby przenieść wiązkę przechodzącą na fotodiodę. Upewnij się, że obie wiązki mieszczą się w obszarze fotodiody i zainstaluj dwa filtry dolnoprzepustowe, aby odciąć modulowaną wiązkę Stokesa.

2. Detekcja sygnału SRS

  1. Modulacja elektrooptyczna (EOM)
    UWAGA: Do modulacji amplitudy fali Stokesa wykorzystano modulator elektrooptyczny (EOM) o częstotliwości 20 MHz. Jak omówiono dalej, EOM jest sprzężony z ciągiem impulsów laserowych o częstotliwości 80 MHz, co jest wymagane dla modulacji ortogonalnej. W przypadku przeprowadzania SRS tylko w jednym kolorze lub w trybie hiperspektralnym można zastosować inne częstotliwości modulacji. W takim przypadku synchronizacja częstotliwości modulacji z częstotliwością lasera nie jest konieczna. Do sterowania EOM można użyć generatora częstotliwości z wzmacniaczem mocy RF. W konsekwencji można pominąć kroki 2.1.1–2.1.4.
    1. Umieść próbnik wiązki na drodze wiązki Stokesa, aby pobrać 10% wiązki i przesłać ją do szybkiej fotodiody w celu detekcji pociągu impulsów o częstotliwości 80 MHz.
      UWAGA: Sygnał z fotodiody jest przesyłany do dzielnika częstotliwości w celu wygenerowania wyjścia TTL o częstotliwości 20 MHz. Wyjście to jest następnie kierowane do bufora rozdzielczego (fanout buffer) w celu powielenia sygnału na cztery identyczne wyjścia 20 MHz. Jedno z wyjść służy do wyzwalania oscyloskopu.
    2. Pobierz jeden z sygnałów wyjściowych bufora rozdzielczego i przefiltruj go za pomocą filtra pasmowo-przepustowego, aby uzyskać falę sinusoidalną o częstotliwości 20 MHz. Użyj tłumika RF, aby dostosować szczytowe napięcie wyjściowe (peak-to-peak) do wartości ok. 500 mV.
    3. Prześlij otrzymany sygnał wyjściowy do przesuwnika fazowego, który umożliwia precyzyjną regulację fazy RF za pomocą źródła napięcia. Prześlij ten sygnał do wzmacniacza mocy RF i podłącz wyjście wzmacniacza do EOM.
    4. Odblokuj wiązkę Stokesa i zoptymalizuj głębokość modulacji EOM1, umieszczając fotodiodę na drodze wiązki. Reguluj napięcie EOM oraz płytkę ćwierćfalową, aż głębokość modulacji (stosunek wartości minimum do maksimum) będzie satysfakcjonująca.
      UWAGA: Przy modulacji 20 MHz (1/4 częstotliwości repetycji lasera) oczekiwane są dwa impulsy co 50 ns.
  2. Nakładanie się w czasie
    UWAGA: Nakładanie się w czasie impulsów pompowych i stokesowskich uzyskuje się poprzez opóźnienie jednego z dwóch ciągów impulsów laserowych za pomocą retroreflektora zamontowanego na stole opóźniającym (Rycina 1 pokazuje opóźnienie sygnału Stokesa). Grube nakładanie jest monitorowane za pomocą oscyloskopu, natomiast precyzyjne nakładanie jest monitorowane za pomocą sygnału SRS. Precyzyjne nakładanie czasowe można również osiągnąć przy użyciu autokorelatora, jeśli jest on dostępny.
    1. Umieść fotodiodę za lustrem dichroicznym, aby wykryć wiązkę lasera. Najpierw zablokuj wiązkę Stokesa. Powiększ jeden z pików impulsów pompy na oscyloskopie. Umieść kursor pionowy, aby zaznaczyć na oscyloskopie położenie czasowe tego piku.
    2. Zablokuj wiązkę pompowania i odblokuj wiązkę Stokesa. Przesuń człon opóźniający tak, aby czasowo dopasować pozycję piku na oscyloskopie do pozycji zaznaczonej w poprzednim kroku. Patrz Rysunek 2 do obrazowania czasowego nakładania się dwóch wiązek.
      1. (OPCJONALNIE) Jeśli przesunięcie stopnia opóźnienia jest niewystarczające do czasowego zsynchronizowania obu wiązek, należy przesunąć stopień opóźnienia do środka zakresu jego ruchu.
      2. Oblicz odległość opóźnienia wymaganą do dopasowania obu wiązek, wyznaczając różnicę czasową między wiązkami, a następnie mnożąc tę różnicę przez prędkość światła, aby określić wartość odległości niezbędną do czasowego zsynchronizowania obu wiązek.
      3. Wydłuż drogę wiązki szybszej lub skróć drogę wiązki wolniejszej, aby odpowiednio dopasować opóźnienie czasowe.
    3. Przygotuj preparat na szkiełku przedmiotowym, wykorzystując DMSO oraz dwustronną taśmę jako dystans utrzymujący próbkę pomiędzy szkiełkiem a szkiełkiem nakrywką.
    4. Umieść próbkę na mikroskopie tak, aby strona z szkiełkiem zakrywowym była skierowana w stronę obiektywu. Przełącz mikroskop na oświetlenie w polu jasnym i obserwuj próbkę przez okular. Ustaw ostrość obrazu, najpierw lokalizując płaszczyznę ostrości na górnej i dolnej warstwie pęcherzyków powietrza na styku szkła i taśmy, a następnie przesuwając punkt ostrości pomiędzy obie warstwy taśmy.
      UWAGA: Przed spojrzeniem przez okular należy upewnić się, że wiązki laserowe są zablokowane.
    5. Ustaw regulowaną długość fali wiązki wyjściowej na 798 nm. W zależności od przepustowości optycznej kondensora, dostrój moc optyczną tak, aby dla wiązki pompowania i wiązki Stokesa wynosiła ona około 40 mW w ognisku obiektywu.
    6. Otwórz ScanImage w programie MATLAB (lub innym oprogramowaniu do skanowania sterującym mikroskopem) i kliknij przycisk o nazwie OGNISKO aby rozpocząć skanowanie.
      UWAGA: Wiązki laserowe będą skanowane rastrowo przez próbkę w celu wygenerowania obrazu. Wyjście sygnału niskiej częstotliwości z fotodiody (<100 kHz) jest przesyłany bezpośrednio do kanału 1 karty akwizycji danych (zwanego kanałem DC). Wyjście wysokiej częstotliwości (>(100 kHz) z fotodiody jest przesyłany do wzmacniacza lock-in, a sygnał z wyjścia X wzmacniacza lock-in jest przesyłany do kanału 2 karty akwizycji danych (zwanego kanałem AC).
    7. Wyreguluj lustro kierujące przed skanerem galwanometrycznym, aby wycentrować sygnał DC na wyświetlaczu kanału 1. Przesuń zmotoryzowaną przekładnię opóźniającą i uważnie obserwuj sygnał z detektora lock-in wyświetlany na kanale 2 (tj. kanale AC).
      UWAGA: W momencie, gdy impuls pompowy i impuls Stokesa pokrywają się w czasie, w kanale AC pojawi się sygnał. Wskazane jest dostosowanie skali kolorów kanału AC, aby umożliwić wyświetlenie niewielkiej zmiany intensywności.
    8. Maksymalizuj natężenie sygnału AC poprzez precyzyjną regulację opóźnienia czasowego. Ustaw lustro dichroiczne tak, aby wycentrować sygnał SRS na kanale AC (utrzymując jednocześnie centrowanie kanału DC). Dostrój fazę wzmacniacza lock-in, aby zmaksymalizować sygnał. Patrz Rysunek 3 do uzyskania satysfakcjonującego sygnału.

3. Optymalizacja rozdzielczości widmowej

UWAGA: Wiązki pompowania i Stokesa docierające do próbki powinny mieć tę samą wartość dyspersji opóźnienia grupowego (GDD), aby zmaksymalizować rozdzielczość spektralną. Dyspersja w dużym stopniu zależy od konfiguracji eksperymentalnej. Opisana tutaj konfiguracja wykorzystuje impulsy femtosekundowe o długości 1 040 nm i 800 nm odpowiednio jako wiązkę Stokesa i wiązkę pompowania. W качестве medium do wydłużania impulsów zastosowano pręty z gęstego szkła krzemianowego (H-ZF52A).

  1. Wprowadź 48 cm silnie dyspersyjnego pręta szklanego (H-ZF52A lub równoważnego szkła krzemianowego o wysokim współczynniku załamania) do drogi wiązki 800 nm. Oszacuj GDD korzystając z równania (1):
    Równanie GDD: GDD = grubość materiału × GVD; fizyka optyczna i analiza dyspersji. (1)
    UWAGA: GVD dla różnych materiałów szklanych przy różnych długościach fal można znaleźć w bazie danych współczynników załamania. Na przykład H-ZF52A posiada GVD wynoszące 220,40 fs2/mm przy 800 nm. Całkowite GDD wynosi 105792 fs2.
  2. Oblicz, ile cm dyspersyjnego pręta szklanego należy dodać do drogi wiązki 1,040 nm, aby dopasować GDD do pompy. Wprowadź odpowiednią długość dyspersyjnych prętów szklanych do drogi wiązki 1,040 nm, aby w przybliżeniu dopasować GDD do wiązki 800 nm. Należy pamiętać, że dodanie prętów szklanych zmieni nakładanie się czasowe obu wiązek, co może wymagać regulacji opóźnienia.
  3. Kalibracja rozdzielczości spektralnej
    1. Przygotuj próbkę na szkiełku przedmiotowym z DMSO. Umieść szkiełko pod mikroskopem i sprawdź moc wiązek wychodzących z kondensora mikroskopu. Dostosuj moc tak, aby w ogniskowej próbki wynosiła ona ~40 mW dla każdej wiązki.
    2. Uruchom ScanImage z programu MATLAB. Znajdź maksymalny sygnał SRS, skanując etap opóźnienia, co odpowiada piku Ramanowskiego DMSO przy 2,913 cm-1. Oszacuj pozycję etapu na podstawie poprzedniej pozycji z uwzględnieniem zwiększonej długości drogi optycznej wynikającej z wprowadzenia prętów. Ponownie ustaw przestrzenne nakładanie się wiązek ze względu na niewielkie odchylenie wiązki po dodaniu prętów szklanych.
    3. Zapisz hiperspektralny skan SRS, wykonując sekwencyjnie serię obrazów SRS podczas przesuwania zmotoryzowanego etapu.
      UWAGA: Zakres skanowania opóźnienia obejmuje dwa piki Ramanowskie, odpowiadające odpowiednio pikom 2,913 cm-1 i 2,994 cm-1 dla DMSO. Te dwa przejścia są obserwowane przy zastosowaniu pompy 800 nm i lasera Stokesa 1,040 nm.
    4. Wykreśl widma SRS roztworu DMSO za pomocą programu ImageJ lub MATLAB. Dopasuj szeroki pik DMSO 2,913 cm-1 do funkcji Gaussa lub Lorentza w MATLAB, aby obliczyć pełną szerokość połówkową (FWHM) piku.
      UWAGA: Reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rysunku 4. Jeśli obecny jest tylko jeden szeroki pik, oznacza to, że albo rozdzielczość spektralna jest zbyt słaba, aby rozróżnić oba piki i wymagane są dodatkowe pręty szklane, albo zakres skanowania był zbyt mały, aby wykryć drugi pik. Zazwyczaj akceptowalna rozdzielczość spektralna dla DMSO wynosi ~20-25 cm-1 przy zastosowaniu prętów szklanych o długości >60 cm. Niższa rozdzielczość jest często stosowana w obrazowaniu tkanek, aby uzyskać silniejsze sygnały przy krótszych impulsach17.
  4. (OPCJONALNIE) Użyj autokorelatora lub urządzenia FROG (Frequency-Resolved Optical Gating), aby określić czas trwania impulsu w każdym ramieniu w celu dokładnego obliczenia wartości GDD oraz długości prętów potrzebnych do dopasowania GDD między pompą a wiązką Stokesa.
  5. Powtórz kroki 3.3.2-3.3.4 dla różnych długości prętów w wiązce Stokesa, aby znaleźć optymalną rozdzielczość spektralną, co oznacza eksperymentalne znalezienie najlepszego dopasowania GDD. Użyj kilku zestawów prętów szklanych o różnej długości, aby osiągnąć optymalną rozdzielczość spektralną.

4. Charakterystyka stosunku sygnału do szumu (SNR)

  1. Należy upewnić się, że krok 4.2 zostanie wykonany po całkowitym dopasowaniu przestrzennym i czasowym.
  2. Należy pozyskać obraz SRS odpowiadający piku Ramanowskiemu DMSO przy 2,913 cm-1. Otwórz obraz w programie ImageJ i zaznacz niewielki obszar w centrum kadru. Użyj funkcji measure, aby obliczyć średnią i odchylenie standardowe wartości w zaznaczonym obszarze.
  3. Aby wyznaczyć wartość SNR, podziel średnią wartość zaznaczonego obszaru przez odchylenie standardowe, zgodnie z równaniem (2).
    Wzór na stosunek sygnału do szumu: SNR = średnia intensywność sygnału / odchylenie standardowe, równanie. (2).
    UWAGA: Dobra wartość SNR dla systemu (przy stałej czasowej detektora lock-in wynoszącej 4 μs) z użyciem DMSO przy mocy 40 mw/40 mw w ognisku dla obu ramion wynosi >800. W przypadku ograniczonej rozdzielczości bitowej karty akwizycji danych można zastosować niższe stężenia DMSO lub niższą moc, aby dokładniej oszacować SNR.
  4. Jeśli SNR jest zbyt niski, należy ponownie ustawić impulsy laserowe, aby zoptymalizować nakładanie się przestrzenne, nakładanie się czasowe, dopasowanie rozmiaru/kolimacji wiązki i/lub dopasowanie dyspersji. W przypadku obiektywu z pierścieniem korekcji aberracji, należy zoptymalizować sygnał poprzez regulację pierścienia korekcyjnego.

5. Kalibracja osi częstotliwości

UWAGA: Krok ten jest wykonywany w celu powiązania pozycji stopnia opóźnienia ze skanowanym przejściem Ramanowskim. Do stworzenia odpowiedniej „linijki ramanowskiej” wymagany jest staranny dobór rozpuszczalników. DMSO jest skutecznym rozpuszczalnikiem dla wiązań CH, ponieważ posiada dwa ostre piki ramanowskie przy 2,913 cm-1 oraz 2,994 cm-1.

  1. Zapisz skan hiperspektralny z zakresem przesuwu etapu opóźniającego obejmującym piki Ramanowskie DMSO przy 2,913 cm-1 i 2,994 cm-1. Zapisz pozycje etapu odpowiadające zestawowi danych hiperspektralnych.
    UWAGA: Globalny szczyt maksimum widma odpowiada przesunięciu Ramanowskiemu DMSO przy 2,913 cm-1, a drugi szczyt maksimum odpowiada przesunięciu Ramanowskiemu DMSO przy 2,994 cm-1.
  2. Wykonaj regresję liniową dla pozycji etapu i przesunięć Ramanowskich przy 2,913 cm-1 oraz 2,994 cm-1. Wykorzystując równanie regresji liniowej wiążące pozycję etapu z przesunięciem Ramanowskim, przelicz pozycje opóźnienia na odpowiadające im częstotliwości Ramanowskie.

6. Modulacja ortogonalna i obrazowanie dwukolorowe

UWAGA: Etap modulacji ortogonalnej jest konieczny tylko wtedy, gdy wymagane jest obrazowanie dwukolorowe w czasie rzeczywistym. Schemat tego rozwiązania przedstawiono na Rysunku 5. Modulacja ortogonalna wykorzystuje parę modulatorów elektrooptycznych (EOM), sterowanych z częstotliwością stanowiącą jedną czwartą częstotliwości lasera (20 MHz dla lasera 80 MHz), z przesunięciem fazowym o 90° między nimi. Ten etap modulacji ortogonalnej można pominąć w przypadku jednobarwnego obrazowania SRS lub hiperspektralnego obrazowania SRS.

  1. Modulacja EOM1
    1. Zainstaluj PBS (PBS2), ćwierćfalową płytkę kwarcową (QWP2) oraz drugi modulator elektrootyczno (EOM2) na drodze wiązki Stokesa za pierwszym EOM. Odłącz wejście sygnału do EOM2. Podłącz wejście sygnału do EOM1 i włącz go.
    2. Moduluj wiązkę Stokesa (ustawioną na 1 040 nm) z częstotliwością 20 MHz (f0/4), przepuszczając wiązkę przez pierwszy EOM. Dostosuj nachylenie i pozycję EOM1, aby upewnić się, że wiązka pada prostopadle i jest wycentrowana w kryształu EOM.
    3. Monitoruj głębokość modulacji, obserwując obie polaryzacje wychodzące z PBS1 za pomocą dwóch fotodiod i wyświetlając modulację na oscyloskopie.
    4. Dostosuj QWP1, napięcie EOM1 oraz fazę sygnału wejściowego 20 MHz (używając przesuwnika fazowego), aby zoptymalizować głębokość modulacji wiązki przechodzącej do poziomu bliskiego 100%. Ilustracja prawidłowej głębokości modulacji znajduje się na Rysunku 2B.
  2. Modulacja EOM2
    1. Odłącz EOM1 i podłącz EOM2.
    2. Prześlij wysokonapięciowy sygnał wyjściowy z drugiego wzmacniacza o częstotliwości 20 MHz do EOM2. Dostosuj nachylenie i pozycję EOM2, aby upewnić się, że wiązka pada prostopadle i jest wycentrowana w kryształu EOM.
    3. Ponownie monitoruj głębokość modulacji, obserwując obie polaryzacje wychodzące z PBS2 na oscyloskopie. W razie potrzeby dostosuj QWP2, napięcie EOM2 i przesuwnik fazowy, aby uzyskać modulację bliską 100% dla obu polaryzacji.
    4. Upewnij się, że modulacja pociągu impulsów ma przesunięcie fazowe o 90° względem pierwszej modulacji.
      UWAGA: Jeśli dwa pociągi impulsów pompy nie są ortogonalne pod kątem 90°, pojawi się problem z przesłuchami między dwoma kanałami.
    5. Przetestuj ortogonalność modulacji, włączając i podłączając jednocześnie EOM1 oraz EOM2. Monitoruj obie polaryzacje rozdzielone przez PBS2 za pomocą oscyloskopu. Ponownie zoptymalizuj oddzielnie EOM1 i EOM2, jeśli pociąg impulsów za drugim PBS nie odpowiada temu na Rysunku 2C.
    6. Zainstaluj 20 mm dwójłomny kryształ kwarcowy (BRC) oraz HWP za EOM2. Podłącz oba EOM jednocześnie i monitoruj pociąg impulsów tak, aby odpowiadał on Rysunkowi 2D.
      UWAGA: Dla chirp użytego w tym eksperymencie, BRC o długości 20 mm indukuje opóźnienie czasowe odpowiadające przesunięciu Ramanowskiemu 80 cm-1. W przypadku zastosowania innego chirp może być wymagana inna długość BRC.
  3. Kalibracja
    1. Zkalibruj system przy użyciu DMSO, wykrywając sygnały z wyjść kanału X i Y wzmacniacza lock-in (przesłane do kanałów 2 i 3 karty akwizycji danych).
    2. Sprawdź, czy sygnały generowane przez pik 2 913 cm-1 z szybszej polaryzacji oraz z polaryzacji wolniejszej są przesunięte w fazie o blisko 90° we wzmacniaczu lock-in. Jeśli tak nie jest, dostosuj ustawienie EOM, aż oba sygnały będą przesunięte w fazie o blisko 90°.
    3. Po zakończeniu kalibracji znajdź pozycję opóźnienia, która bada przejście białka przy 2 930 cm-1 dla jednej z wiązek ortogonalnych. Upewnij się, że druga polaryzacja bada przejście lipidowe przy 2 850 cm-1.

7. Obrazowanie SRS w trybie epi

UWAGA: W schemacie obrazowania w trybie transmisji obiektyw skupia laser w próbce, a następnie soczewka kondensacyjna kieruje wiązkę transmitowaną do fotodiody w celu detekcji synchronicznej. W schemacie obrazowania w trybie epi- światło rozproszone wstecznie i depolaryzowane przez próbkę jest ponownie zbierane przez obiektyw skupiający i izolowane za pomocą polaryzacyjnego dzielnika wiązki. Odizolowane i rozproszone wstecznie fotony są przesyłane do fotodiody przez parę soczewek przekaźnikowych w celu detekcji synchronicznej. Rysunek 6 przedstawia schemat obrazowania w trybie epi-.

  1. Zainstaluj płytkę ćwierćfalową (HWP) przed wjściem wiązki do mikroskopu, aby zmienić polaryzację wiązki wnikającej do urządzenia. Umieść dzielnik wiązki polaryzacyjnej (PBS) nad obiektywem, aby umożliwić dotarcie depolaryzowanej wiązki odbitej do detektora.
  2. Użyj pary soczewek składającej się z soczewki achromatycznej 75 mm i soczewki asferycznej 30 mm, aby przekazać fotony rozproszone wstecz z tylnej apertury obiektywu do fotodetektora. Zamontuj detektor w sposób umożliwiający zbieranie światła rozproszonego wstecz kierowanego przez PBS. Zainstaluj filtr, aby zablokować wnikanie modulowanej wiązki do detektora.
  3. Umieść próbkę tkanki pod obiektywem. Ponieważ kondensor nie jest niezbędny do obrazowania w trybie epi, usuń go, jeśli wymagana jest większa przestrzeń.
  4. Obrazowanie
    1. Zablokuj wiązkę za pomocą migawki, oświetl próbkę z boku białym źródłem światła i użyj trybu jasnego pola, aby ustawić ostrość obiektywu.
    2. Odsłoń obie wiązki i wykorzystaj wstępnie skalibrowane pozycje opóźnienia, aby uzyskać obrazy SRS lipidów i białek z tkanki z dwóch wyjść wzmacniacza lock-in.
    3. Dostosuj wzmocnienie wzmacniacza lock-in oraz współczynnik binowania pikseli, aby uzyskać wysokiej jakości obrazy.

8. Barwienie w fałszywych kolorach

  1. Otwórz stos obrazów w programie ImageJ.
  2. Wyodrębnij dwa obrazy odpowiadające lipidom (2 850 cm⁻¹)-1) oraz białka (2,930 cm-1) gatunki, klikając prawym przyciskiem myszy na obrazie i wybierając Duplikat.
  3. Zmień nazwę obrazu lipidów na lipidy oraz obraz białka do białka.
  4. Przejdź do Proces | Kalkulator obrazu oraz przeprowadzić białka odjąć lipidy.
  5. Połącz obrazy, przechodząc do Obraz | Kolor | Połącz kanałyustawienia lipidy Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. zielony i białka do niebieskiOtwórz kanały obrazu narzędzie (Obraz | Kolor | Narzędzie kanałów) i dostosuj jasność oraz kontrast (Obraz | Regulacja | Jasność/Kontrast).
  6. Dostosuj jasność i kontrast dla każdego kanału za pomocą kanały narzędzia. W przypadku kanału lipidowego należy dostosować kontrast tak, aby elementy komórkowe wydawały się ciemne. W przypadku kanału białkowego należy dostosować kontrast tak, aby elementy komórkowe wydawały się niebieskie. Przekonwertuj obraz z połączonych kanałów zielonego i niebieskiego na obraz RGB, przechodząc do Obraz | Typ | Kolor RGBWyeksportuj ten obraz poprzez Plik | Zapisz jako | Tiff.
    UWAGA: W przypadku wyników fałszywie dodatnich H&W barwieniu E schemat kolorystyczny wykazuje różową cytoplazmę, natomiast jądra komórkowe są ciemnomodro-fioletowe.
  7. Pobierz skrypt MATLAB HE.m z folderu false H&zasób skryptu barwienia E w Tabela materiałów.
  8. Uruchom skrypt HE.m w programie MATLAB. Wybierz wyeksportowany obraz RGB z poprzedniego kroku, aby wygenerować sztucznie H&Obraz z barwieniem E.
  9. (OPCJONALNIE) Znormalizuj intensywność obrazu w przypadku obrazowania z dużym polem widzenia, ponieważ obraz na peryferiach wydaje się ciemniejszy niż w centrum.
    1. Aby przeprowadzić normalizację pola obrazów, należy uśrednić tak wiele obrazów, jak to możliwe. Następnie należy usunąć cechy intensywności za pomocą programu ImageJ (Proces | Filtry | Rozmycie Gaussa | Promień=50).
    2. Zmierz maksymalną intensywność rozmytego obrazu (Ctrl+M). Podziel obraz rozmyty przez maksymalną intensywność (Proces | Matematyka | Dzielenie). Podziel surowy obraz SRS przez obraz rozmyty (Proces | Obraz | Kalkulator).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Optymalizacja rozdzielczości spektralnej:
Dyspersja w materiale zależy od ośrodka dyspersyjnego (długości i rodzaju materiału) oraz długości fali. Zmiana długości pręta dyspersyjnego wpływa na rozdzielczość spektralną oraz wielkość sygnału. Jest to zależność kompromisowa, którą można różnie wyważyć w zależności od zastosowania. Pręty rozciągają impuls wiązki z postaci szerokiej w częstotliwości i wąskiej w czasie do postaci wąskiej w częstotliwości i szerokiej w czasie. Rysunek 7...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dwukolorowy schemat obrazowania SRS przedstawiony w tym protokole opiera się na prawidłowej implementacji jednokolorowego obrazowania SRS. W jednokolorowym obrazowaniu SRS krytycznymi etapami są wyrównanie przestrzenne, wyrównanie czasowe, głębokość modulacji i przesunięcie fazowe. Przestrzenne połączenie dwóch wiązek odbywa się za pomocą zwierciadła dichroicznego. Kilka lusterek kierowniczych służy do precyzyjnej regulacji podczas wysyłania wiązek światła do lusterka dichroicznego. Po połączeniu wiązki z lustrem dichroi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez NIH R35 GM133435 do D.F.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Soczewka achromatyczna 100 mmTHORLABSAC254-100-Bszerokopasmowa, 650 - 1,050 nm, ogniskowa obiektywu achromatycznego
filtr pasmowo-przepustowyMiniukładyBBP-21.4 +Lumped LC Band Pass Filter, 19,2 - 23,6 MHz, 50 Ω
Soczewka achromatyczna 200 mmTHORLABSAC254-200-BSzerokopasmowa, 650 - 1,050 nm, ogniskowa soczewki achromatycznej, 200 mm
Achromatyczna półfalowaUnion OpticWPA2210-650-1100-M25.4Szerokopasmowa półfalowa
Achromatyczna ćwierćfalowapłyta optycznaUnion Optic WPA4210-650-1100-M25.4Szerokopasmowa ćwierćfalowa
Beam SamplerTHORLABSBSN1110:90 Płytowy rozdzielacz wiązki
Lustro dichroiczneTHORLABSDMSP1000Można stosować inne dichroiki o środkowej długości fali około 1,000 nm.
DMSO (dimetylosulfotlenek)Sigma Aldrich472301Rozpuszczalnik do kalibracji przesunięcia Ramana. Można stosować inne rozpuszczalniki o znanych pikach Ramana.
Elektrooptyczny modulator amplitudyTHORLABSEO-AM-NR-C1Do modulacji ortogonalnej i obrazowania dwukanałowego potrzebne są dwa EOM. Zalecana jest wersja rezonansowa, aby można było zastosować niższe napięcie sterujące.
Fałszywy H& E Staining ScriptMatlabhttps://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout BufferPRL-414BPulse Research Lab1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, do generowania częstotliwości sterującej EOM i odniesienia do blokady
Szybka fotodiodaTHORLABSDET10A2Si Detector, 1 ns Increase
Time Frequency DividerPRL-220ALaboratoriumBadań ImpulsówDzielnik częstotliwości TTL (f/2, f/4, f/8, f/16), do generowania 20MHz z wyjścia laserowego.
Pręty szklane o wysokiej dyspersjiUnion OpticCYLROD01Soczewka prętowa H-ZF52A o wysokiej dyspersji 120 mm, soczewka prętowa SF11 100 mm
Insight DS+NewportSystem laserowy zdolny do wysyłania dwóch zsynchronizowanych laserów impulsowych (jeden o stałej wiązce o długości fali 1,040 nm i jedna przestrajalna wiązka w zakresie 680-1,300 nm) z częstotliwością powtarzania 80 MHz.
Wzmacniacz typu lock-inLiquid InstrumentsMoku LabWzmacniacz typu lock-in do ekstrakcji sygnału SRS z fotodiody. Można również użyć instrumentu Zurich HF2LI lub podobnego instrumentu.
LustraTHORLABSBB05-E03-10Szerokopasmowe zwierciadło dielektryczne, 750 - 1 100 nm. Można również użyć srebrnych luster.
Zmotoryzowany stopień opóźniającyZaberX-DMQ12P-DE52Stopień opóźniający do precyzyjnej kontroli czasowego nakładania się pompy i laserów Stokesa. Każdy inny zmotoryzowany etap powinien działać.
Kondensator zanurzeniowy olejowyNikonCSC10031.4 NA. Można stosować inne skraplacze z NA>1.2.
OscyloskopTektronixTDS7054Każdy inny oscyloskop o paśmie 400 MHz lub wyższym powinien działać.
Przesuwnik fazowySigaTekSF50A2Do przesuwania fazy częstotliwości modulacji
FotodiodaHamamatsu CorpS3994-01Krzemowa dioda PIN o dużej powierzchni (10 x 10 cm2). Można stosować inne diody o dużej powierzchni i niskiej pojemności.
Rozdzielacz wiązki polaryzacyjnejUnion OpticPBS9025-620-1000Szerokopasmowy rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej
Baza danychrefractiveindex.info
OdbłyśnikEdmund Optics34-408BBAR Pryzmat kątowy. Można zastosować inne pryzmaty lub retroreflektor.
Miniukładywzmacniacza mocy RFZHL-1-2W+Blok wzmocnienia, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Lustra skanująceCambridge Technologies6215HUżyliśmy zestawu luster 5 mm z powłoką srebrną
ScanImageVidrioScanImage BasicOprogramowanie sterujące laserowym mikroskopem skaningowym
Filtr krótkoprzepustowyTHORLABSFESH100025,0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Długość fali: 1,000 nm. Do skutecznego tłumienia Stokesa mogą być konieczne dwa filtry.
Mikroskop pionowyNikonEclipse FN1Można użyć dowolnej innej ramy mikroskopu. Jeśli dostępny jest laserowy mikroskop skaningowy, można go używać bezpośrednio. W przeciwnym razie do mikroskopu trzeba było dodać skaner galvo i soczewkę skanującą.
Obiektyw do zanurzenia w wodzieOlympusXLPLN25XWMP2Wielofotonowy obiektyw 25X ma NA 1,05. Można zastosować inne podobne cele.
, 100 mm 20 MHz płytka indeksu refaktywnego

Bibliografia

  1. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
  2. Cui, M., Zhang, D. Y. Artificial intelligence and computational pathology. Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).
  3. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  4. Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1, 0027(2017).
  5. Ji, M., et al. label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  6. Hollon, T. C., et al. Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks. Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).
  7. Shin, K. S., et al. Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 9 (1), 20392(2019).
  8. Lu, F. -K., et al. Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging. Cancer Research. 76 (12), 3451-3462 (2016).
  9. Shin, K. S., et al. Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes. Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).
  10. Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).
  11. Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).
  12. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  13. Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
  14. Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
  15. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  16. Tsai, P. S., et al. Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging. In Vivo Optical Imaging of Brain. Frostig, R. D., et al. , CRC Press. 113-171 (2002).
  17. Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy. PLoS One. 12 (5), 0178750(2017).
  18. Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
  19. Kong, L., et al. Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator. Optics Letters. 38, 145-147 (2013).
  20. He, R., et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica. 4 (1), 44-47 (2017).
  21. Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
  22. Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).
  23. Wright, A. J., et al. Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy. Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dwukolorowe SRSogniskowanie widmoweobrazowanie m zgu myszyobrazowanie w czasie rzeczywistymSRS w trybie epiobrazowanie pik w Ramanamikroskopia pompa sondaodpowiednik hematoksyliny i eozyny
Dwukolorowe, stymulowane rozpraszaniem Ramana w czasie rzeczywistym mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.