Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) jest potężną, nieniszczącą i bezznacznikową techniką obrazowania. Jednym z pojawiających się zastosowań jest stymulowana histologia Ramana, w której dwukolorowe obrazowanie SRS w przejściach Ramana białek i lipidów jest wykorzystywane do generowania obrazów pseudo-hematoksyliny i eozyny. W tym miejscu demonstrujemy protokół dwukolorowego obrazowania SRS w czasie rzeczywistym w diagnostyce tkanek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Dwukolorowe, stymulowane rozpraszaniem Ramana w czasie rzeczywistym mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) stała się potężną techniką obrazowania optycznego do diagnozowania tkanek. W ostatnich latach wykazano, że dwukolorowy SRS jest w stanie zapewnić obrazy równoważne hematoksylinie i eozynie (H&E), które umożliwiają szybką i wiarygodną diagnozę raka mózgu. Takie możliwości umożliwiły ekscytujące zastosowania w śródoperacyjnej diagnostyce nowotworów. Dwukolorowe obrazowanie tkanki metodą SRS można wykonać za pomocą pikosekundowego lub femtosekundowego źródła laserowego. Lasery femtosekundowe mają tę zaletę, że umożliwiają elastyczne tryby obrazowania, w tym szybkie obrazowanie hiperspektralne i dwukolorowe obrazowanie SRS w czasie rzeczywistym. Podejście skupiające się spektralnie z ćwierkaniem impulsów laserowych jest zwykle stosowane w przypadku laserów femtosekundowych w celu osiągnięcia wysokiej rozdzielczości spektralnej.
Akwizycja dwukolorowego SRS może być realizowana z modulacją ortogonalną i wykrywaniem blokady. Złożoność ćwierkania, modulacji i charakterystyki pulsu jest wąskim gardłem dla powszechnego przyjęcia tej metody. Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół demonstrujący implementację i optymalizację spektralnego ogniskowania SRS oraz dwukolorowego obrazowania tkanki mózgowej myszy w czasie rzeczywistym w trybie epi. Protokół ten może być używany w szerokim zakresie zastosowań obrazowania SRS, które wykorzystują dużą szybkość i możliwości obrazowania spektroskopowego SRS.
Wprowadzenie
Tradycyjna diagnostyka tkanek opiera się na protokołach barwienia, po których następuje badanie pod mikroskopem optycznym. Jedną z powszechnych metod barwienia stosowanych przez patologów jest barwienie H&E: hematoksylina barwi jądra komórkowe na fioletowo-niebieski kolor, a eozyna barwi macierz zewnątrzkomórkową i cytoplazmę na różowo. To proste barwienie pozostaje złotym standardem w patologii dla wielu zadań związanych z diagnostyką tkanek, w szczególności w diagnostyce raka. Jednak histopatologia H&E, a w szczególności technika zamrożonego cięcia stosowana w warunkach śródoperacyjnych, nadal ma ograniczenia. Procedura barwienia jest pracochłonnym procesem obejmują....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem zwierząt przeprowadzono na utrwalonych, pociętych przekrojach mózgów myszych o grubości 200 µm, zgodnie z protokołem (# 4395-01) zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Waszyngtońskiego. Myszy typu dzikiego (szczep C57BL/6J) poddano eutanazji za pomocą CO2. Następnie wykonano kraniotomię w celu wyjęcia mózgów i ich utrwalenia w 4% paraformaldehydzie w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym. Mózgi zatopiono w mieszaninie 3% agarozy i 0,3% żelatyny, a następnie pocięto na plastry o grubości 200 μm przy użyciu wibratomu.
1. Wstępne....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Optymalizacja rozdzielczości spektralnej:
Dyspersja w materiale zależy od ośrodka dyspersyjnego (długości i rodzaju materiału) oraz długości fali. Zmiana długości pręta dyspersyjnego wpływa na rozdzielczość spektralną oraz wielkość sygnału. Jest to zależność kompromisowa, którą można różnie wyważyć w zależności od zastosowania. Pręty rozciągają impuls wiązki z postaci szerokiej w częstotliwości i wąskiej w czasie do postaci wąskiej w częstotliwości i szerokiej w czasie. Rysunek 7.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Dwukolorowy schemat obrazowania SRS przedstawiony w tym protokole opiera się na prawidłowej implementacji jednokolorowego obrazowania SRS. W jednokolorowym obrazowaniu SRS krytycznymi etapami są wyrównanie przestrzenne, wyrównanie czasowe, głębokość modulacji i przesunięcie fazowe. Przestrzenne połączenie dwóch wiązek odbywa się za pomocą zwierciadła dichroicznego. Kilka lusterek kierowniczych służy do precyzyjnej regulacji podczas wysyłania wiązek światła do lusterka dichroicznego. Po połączeniu wiązki z lustrem dichroi.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez NIH R35 GM133435 do D.F.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Soczewka achromatyczna 100 mm | THORLABS | AC254-100-B | szerokopasmowa, 650 - 1,050 nm, ogniskowa obiektywu achromatycznego |
| filtr pasmowo-przepustowy | Miniukłady | BBP-21.4 + | Lumped LC Band Pass Filter, 19,2 - 23,6 MHz, 50 Ω |
| Soczewka achromatyczna 200 mm | THORLABS | AC254-200-B | Szerokopasmowa, 650 - 1,050 nm, ogniskowa soczewki achromatycznej, 200 mm |
| Achromatyczna półfalowa | Union Optic | WPA2210-650-1100-M25.4 | Szerokopasmowa półfalowa |
| Achromatyczna ćwierćfalowa | płyta optyczna | Union Optic WPA4210-650-1100-M25.4 | Szerokopasmowa ćwierćfalowa |
| Beam Sampler | THORLABS | BSN11 | 10:90 Płytowy rozdzielacz wiązki |
| Lustro dichroiczne | THORLABS | DMSP1000 | Można stosować inne dichroiki o środkowej długości fali około 1,000 nm. |
| DMSO (dimetylosulfotlenek) | Sigma Aldrich | 472301 | Rozpuszczalnik do kalibracji przesunięcia Ramana. Można stosować inne rozpuszczalniki o znanych pikach Ramana. |
| Elektrooptyczny modulator amplitudy | THORLABS | EO-AM-NR-C1 | Do modulacji ortogonalnej i obrazowania dwukanałowego potrzebne są dwa EOM. Zalecana jest wersja rezonansowa, aby można było zastosować niższe napięcie sterujące. |
| Fałszywy H& E Staining Script | Matlab | https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining | |
| Fanout Buffer | PRL-414B | Pulse Research Lab | 1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, do generowania częstotliwości sterującej EOM i odniesienia do blokady |
| Szybka fotodioda | THORLABS | DET10A2 | Si Detector, 1 ns Increase |
| Time Frequency Divider | PRL-220A | Laboratorium | Badań ImpulsówDzielnik częstotliwości TTL (f/2, f/4, f/8, f/16), do generowania 20MHz z wyjścia laserowego. |
| Pręty szklane o wysokiej dyspersji | Union Optic | CYLROD01 | Soczewka prętowa H-ZF52A o wysokiej dyspersji 120 mm, soczewka prętowa SF11 100 mm |
| Insight DS+ | Newport | System laserowy zdolny do wysyłania dwóch zsynchronizowanych laserów impulsowych (jeden o stałej wiązce o długości fali 1,040 nm i jedna przestrajalna wiązka w zakresie 680-1,300 nm) z częstotliwością powtarzania 80 MHz. | |
| Wzmacniacz typu lock-in | Liquid Instruments | Moku Lab | Wzmacniacz typu lock-in do ekstrakcji sygnału SRS z fotodiody. Można również użyć instrumentu Zurich HF2LI lub podobnego instrumentu. |
| Lustra | THORLABS | BB05-E03-10 | Szerokopasmowe zwierciadło dielektryczne, 750 - 1 100 nm. Można również użyć srebrnych luster. |
| Zmotoryzowany stopień opóźniający | Zaber | X-DMQ12P-DE52 | Stopień opóźniający do precyzyjnej kontroli czasowego nakładania się pompy i laserów Stokesa. Każdy inny zmotoryzowany etap powinien działać. |
| Kondensator zanurzeniowy olejowy | Nikon | CSC1003 | 1.4 NA. Można stosować inne skraplacze z NA>1.2. |
| Oscyloskop | Tektronix | TDS7054 | Każdy inny oscyloskop o paśmie 400 MHz lub wyższym powinien działać. |
| Przesuwnik fazowy | SigaTek | SF50A2 | Do przesuwania fazy częstotliwości modulacji |
| Fotodioda | Hamamatsu Corp | S3994-01 | Krzemowa dioda PIN o dużej powierzchni (10 x 10 cm2). Można stosować inne diody o dużej powierzchni i niskiej pojemności. |
| Rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej | Union Optic | PBS9025-620-1000 | Szerokopasmowy rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej |
| Baza danych | refractiveindex.info | ||
| Odbłyśnik | Edmund Optics | 34-408 | BBAR Pryzmat kątowy. Można zastosować inne pryzmaty lub retroreflektor. |
| Miniukłady | wzmacniacza mocy RF | ZHL-1-2W+ | Blok wzmocnienia, 5 - 500 MHz, 50 Ω |
| Lustra skanujące | Cambridge Technologies | 6215H | Użyliśmy zestawu luster 5 mm z powłoką srebrną |
| ScanImage | Vidrio | ScanImage Basic | Oprogramowanie sterujące laserowym mikroskopem skaningowym |
| Filtr krótkoprzepustowy | THORLABS | FESH1000 | 25,0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Długość fali: 1,000 nm. Do skutecznego tłumienia Stokesa mogą być konieczne dwa filtry. |
| Mikroskop pionowy | Nikon | Eclipse FN1 | Można użyć dowolnej innej ramy mikroskopu. Jeśli dostępny jest laserowy mikroskop skaningowy, można go używać bezpośrednio. W przeciwnym razie do mikroskopu trzeba było dodać skaner galvo i soczewkę skanującą. |
| Obiektyw do zanurzenia w wodzie | Olympus | XLPLN25XWMP2 | Wielofotonowy obiektyw 25X ma NA 1,05. Można zastosować inne podobne cele. |
Bibliografia
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Cui, M., Zhang, D. Y. Artificial intelligence and computational pathology. Laboratory Investigation. ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
