Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowa analiza niefotochemicznego hartowania w uprawach przy użyciu fluorometrii chlorofilu z modulacją amplitudy impulsów

DOI:

10.3791/63485

⸱

6 lipca 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Plant Biology, Morrill Hall, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Environmental Plant Physiology group, Department of Plant Sciences, University of Cambridge

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół wprowadza wysokoprzepustową metodę pomiaru relaksacji niefotochemicznego wygaszania za pomocą modulowanej amplitudą impulsów fluorometrii chlorofilu. Metodę tę stosuje się do Glycine max uprawianej na polu i można ją dostosować do innych gatunków w celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem różnorodności genetycznej lub populacji hodowlanych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotosynteza nie jest zoptymalizowana w nowoczesnych odmianach roślin uprawnych, dlatego daje możliwość poprawy. Przyspieszenie rozluźnienia niefotochemicznego wygaszania (NPQ) okazało się skuteczną strategią zwiększania wydajności fotosyntezy. Jednak potencjał hodowlany w celu poprawy NPQ i pełnego zrozumienia genetycznych podstaw rozluźnienia NPQ jest niewystarczający ze względu na ograniczenia związane z nadmiernym próbkowaniem i gromadzeniem danych z roślin uprawianych na polu. Opierając się na poprzednich raportach, przedstawiamy wysokoprzepustowy test do analizy współczynników relaksacji NPQ w Glycine max (soja) przy użyciu fluorometrii chlorofilu z modulacją amplitudy impulsów (PAM). Próbki krążków liściowych z nasion soi uprawianych na polu są pobierane przed transportem do laboratorium, gdzie relaksacja NPQ jest mierzona w zamkniętym fluorometrze PAM. Parametry relaksacji NPQ są obliczane poprzez dopasowanie funkcji dwuwykładniczej do zmierzonych wartości NPQ po przejściu od wysokiego do słabego oświetlenia. Za pomocą tej metody możliwe jest przetestowanie setek genotypów w ciągu jednego dnia. Procedura ta ma potencjał do badań przesiewowych paneli mutantów i różnorodności pod kątem zmienności relaksacji NPQ, a zatem może być stosowana zarówno do podstawowych, jak i stosowanych pytań badawczych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotosynteza składa się z absorpcji światła, pierwotnego transferu elektronów, stabilizacji energii oraz syntezy i transportu produktów fotosyntezy1. Zrozumienie każdego kroku ma kluczowe znaczenie dla ukierunkowania wysiłków na rzecz zwiększenia wydajności fotosyntezy upraw. Światło wpływa na tempo fotosyntezy, co wymaga zrównoważenia podaży energii w postaci fotonów z zapotrzebowaniem na redukujące równoważniki. Gdy podaż przewyższa popyt, na przykład przy silnym oświetleniu lub podczas zmniejszonego wiązania CO2 spowodowanego zamknięciem aparatów szparkowych, nagromadzenie mocy redukcyjnej zwiększa prawdopodobieństwo powstania reaktywnych form tlenu, które mogą uszkodzić aparat fotosyntetyczny i zakłócić transport elektronów. Dlatego, aby zapobiec uszkodzeniom, rośliny rozwinęły kilka mechanizmów fotoochronnych, w tym detoksykację reaktywnych form tlenu i niefotochemiczne wygaszanie wzbudzonych stanów chlorofilu (NPQ)2.

Utrzymanie wysokiego tempa fotosyntezy jest wyzwaniem w środowisku polowym. Zmiany sezonowe i dobowe, wraz z fluktuacjami środowiskowymi, takimi jak ruchy liści wywołane wiatrem i przejściowe zachmurzenie, powodują zmiany w ilości i intensywności światła odbieranego przez rośliny do fotosyntezy3. NPQ rozprasza nadmiar energii świetlnej i może pomóc w zapobieganiu uszkodzeniom fotologicznym, jednocześnie pozwalając na utrzymanie tempa fotosyntezy przy high-light4. Jednak przedłużone NPQ podczas przechodzenia między silnym a słabym oświetleniem nadal rozprasza energię, która mogłaby być wykorzystana do redukcji emisji dwutlenku węgla5. W rezultacie, przyspieszenie relaksacji NPQ może zwiększyć wydajność fotosyntezy6, co sprawia, że relaksacja NPQ staje się atrakcyjnym celem dla poprawy upraw.

Analiza fluorescencji chlorofilu (PAM) z modulacją amplitudy impulsów może być użyta do obliczenia NPQ na podstawie mierzalnych parametrów (Tabela Uzupełniająca 1 i Tabela Uzupełniająca 2)7,8,9. Niniejszy artykuł koncentruje się na określeniu współczynników relaksacji NPQ w roślinach uprawianych na polu w celu badania przesiewowego naturalnej zmienności plazmy zarodkowej. Jednak analiza fluorometrii chlorofilu PAM może być również wykorzystywana do wielu różnych celów, stosowana do gatunków od glonów po rośliny wyższe, i jest recenzowana gdzie indziej7,8,9.

W liściu lub komórce przystosowanej do ciemności, centra reakcji fotosystemu II (PSII) są otwarte na odbiór elektronów i nie ma NPQ. Włączenie światła pomiarowego o niskim natężeniu wywołuje fluorescencję chlorofilu, unikając jednocześnie transportu elektronów przez PSII. Zarejestrowana minimalna fluorescencja w tym stanie przystosowanym do ciemności jest opisana przez parametr Fo. Zastosowanie impulsu świetlnego o dużej intensywności do przystosowanego do ciemności liścia może szybko zmniejszyć pierwszą stabilną pulę akceptorów elektronów chinonów związanych z miejscem chinonu A. To tymczasowo blokuje zdolność przenoszenia elektronów w centrach reakcji PSII, o których mówi się, że są zamknięte i niezdolne do odbierania elektronów z rozszczepienia wody. Używając krótkiego czasu trwania impulsu, nie ma wystarczająco dużo czasu na stymulację NPQ. Uzyskana fluorescencja chlorofilu jest równoważna maksymalnej wartości możliwej do uzyskania przy braku NPQ, czyli maksymalnej fluorescencji, Fm. Różnica między minimalną i maksymalną fluorescencją jest określana jako fluorescencja zmienna, Fv. Maksymalną fotochemiczną wydajność kwantową fotosystemu II (FV/FM) oblicza się na podstawie tych dwóch parametrów za pomocą następującego równania:

Fv/Fm = (Fm-F o)/Fm

To może dostarczyć ważnego wskaźnika funkcji fotosystemu i stresu. Włączenie światła aktynicznego (fotosyntetycznego) stymuluje wygaszanie niefotochemiczne, a późniejsze zastosowanie nasycającego błysku pozwala na pomiar maksymalnej fluorescencji dostosowanej do światła, Fm'. Porównując różnicę między maksymalną fluorescencją przystosowaną do ciemności i światła, NPQ można obliczyć zgodnie z równaniem Sterna-Volmera10:

NPQ = Fm/Fm' - 1

W wyższych zakładach NPQ zostało opisane jako składające się z co najmniej pięciu różnych składników, w tym qE, qT, qZ, qI i qH. Dokładne mechanizmy związane z NPQ nie są w pełni poznane; jednak qE jest uważany za główny składnik NPQ w większości roślin. Stwierdzono, że kluczowymi czynnikami dla pełnego zaangażowania qE są nagromadzenie gradientu protonów w poprzek błony tylakoidowej, aktywność podjednostki fotosystemu II S11,12 oraz odepsydowane ksantofile, antheraksantyna, luteina, a w szczególności zeaksantyna13. qE rozluźnia najszybciej ze wszystkich składowych NPQ (< 2 min)14, a odwracalna aktywacja qE jest zatem szczególnie ważna dla adaptacji do zmieniających się natężeń światła. Druga, wolniejsza faza relaksacji NPQ (~2-30 min) obejmuje zarówno qT, związaną z przejściami stanów, jak i qZ, polegającą na wzajemnej konwersji zeaksantyny do violaxanthin15. Powolne rozluźnianie (> 30 min) NPQ może obejmować zarówno wygaszanie fotoinhibitorów (qI)16, jak i procesy niezależne od fotouszkodzeń17,18, takie jak qH, które jest ciągłym wygaszaniem w obwodowych czułkach PSII, w którym pośredniczy białko lipokaliny plastydowej19,20.

NPQ wzrasta podczas ekspozycji na silne światło. Późniejsze przejście do słabego oświetlenia może spowodować obniżenie NPQ. Zanik szybkich, pośrednich i powolnych faz relaksu można uchwycić w parametrach funkcji dwuwykładniczej15,21,22,23

NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3

Teoretyczne podstawy funkcji dwuwykładniczej opierają się na założeniu wykorzystania pierwszego rzędu hipotetycznych czynników gaszących, w tym qE (Aq1), połączonej relaksacji qZ i qT (Aq2), z odpowiednimi stałymi czasowymi τq1 i τq2, oraz długoterminowego NPQ, który obejmuje qI i niezależne procesy fotouszkodzeń (Aq3). W związku z tym funkcja dwuwykładnicza zapewnia bardziej realistyczną reprezentację wielu połączonych procesów biologicznych zaangażowanych w wygaszanie fluorescencji chlorofilu w porównaniu z prostszym równaniem Hilla, które nie ma podstaw teoretycznych24.

NPQ można mierzyć za pomocą różnych dostępnych na rynku fluorometrów PAM25,26, od prostych urządzeń przenośnych27 do bardziej zaawansowanych systemów zamkniętych28. Jednak ograniczeniem niektórych z tych podejść jest stosunkowo niska przepustowość, co sprawia, że badanie przesiewowe dużych kolekcji roślin jest trudne bez wielu urządzeń i zespołu badaczy. Aby rozwiązać ten problem, McAusland i in. opracowali procedurę opartą na wyciętej tkance liści i wykorzystali ją do zidentyfikowania różnic we fluorescencji chlorofilu między dwiema odmianami pszenicy29. Atrakcyjność tego podejścia polega na tym, że obrazowanie dysków liściowych, pobranych z wielu roślin za pomocą jednego urządzenia, może ułatwić badanie przesiewowe setek genotypów w ciągu jednego dnia. Umożliwia to ocenę zmienności relaksacji NPQ w ramach badań asocjacyjnych całego genomu lub w celu przeprowadzenia badań przesiewowych populacji hodowlanych, które mogą zwiększyć wydajność fotosyntezy upraw i ostatecznie plon.

Opierając się na wynikach McAusland et al.29, używamy analizy fluorescencji chlorofilu PAM dysków liściowych do wysokoprzepustowego badania przesiewowego wskaźników relaksacji NPQ w Glycine max (G. max; soja). Protokół ten wykorzystuje klasę CF Imager25, która jest porównywalna z innymi dostępnymi na rynku systemami zamkniętymi PAM, takimi jak popularny FluorCam26. Dzięki ciemnemu pomieszczeniu do adaptacji próbek, użytkownicy mogą obrazować 96-dołkowe płytki, szalki Petriego i małe rośliny. Kluczową zaletą tego podejścia jest wzrost przepustowości zapewnianej przez zastosowanie dysków liściowych w porównaniu z sekwencyjną analizą pojedynczych roślin. W niniejszym artykule przedstawiono reprezentatywne wyniki oraz metodę pobierania próbek, pomiarów i analiz NPQ w roślinach uprawianych na polu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sadzenie nasion

  1. Wybierz pole z żyzną, przepuszczalną, ale nie piaszczystą glebą i o pH prawie 6,5. Wytyczyć działki rzędowe o długości 1,2 m w rozstawie 0,75 m, nacinając ziemię motyką.
  2. Posadzić 50 nasion/m G. max odmiany IA3023 na głębokości 3 cm wzdłuż każdej działki na początku sezonu wegetacyjnego, gdy temperatura gleby wynosi od 25 do 30 °C.
    UWAGA: Do celów badań przesiewowych różnorodności genetycznej oczekuje się, że hodowanych i porównywanych jest wiele różnych genotypów. Posadź 2-5 rzędów na genotyp ułożonych w losowy wzór blokowy. Należy wziąć pod uwagę, czy warunki klimatyczne sprzyjają wzrostowi soi, w tym rodzaj gleby, temperaturę i długość dnia.

2. Pobieranie próbek liści z pola

  1. Pobrać próbki z roślin na polu 30 dni po wykiełkowaniu.
    UWAGA: Po 30 dniach rośliny soi znajdą się w fazie wegetatywnej. Liczba dni po wykiełkowaniu przed pobraniem próbek zależy od kwestii biologicznej, którą się zajmujemy.
  2. Napełnij studzienki 24-dołkowej płytki do 1/3rd wodą destylowaną. Na wieczku i boku płytki należy oznaczyć kontrpróby, z których należy pobrać próbki.
  3. Wybierz najmłodszy, w pełni rozwinięty liść na szczycie rośliny, z której chcesz pobrać próbki. Przytrzymaj liść przy gumowym korku.
  4. Wciśnij świdrowiec korkowy Humboldta #2 przez liść i przekręć, aby przeciąć krążek, unikając nerwu środkowego. Kolejno zbierz 5 dysków z tego samego liścia w celu przeprowadzenia replik technicznych. Na każdą działkę należy pobrać około 30% więcej krążków liściowych niż jest to wymagane w przypadku uszkodzenia tkanki liścia podczas transportu lub pobierania próbek.
    UWAGA: Liczba kontrprób biologicznych (poletka lub rośliny) oraz liczba kontrprób technicznych (krążki liściowe z tej samej rośliny lub działki) mogą się różnić w zależności od projektu doświadczalnego.
  5. Wypchnij krążki liściowe z omacnicy korkowej do pojedynczego dołka na 24-dołkowej płytce za pomocą bawełnianego wacika. Sprawdź, czy wszystkie krążki liściowe unoszą się w wodzie. Jeśli nie, delikatnie przesuń krążki liściowe przyklejone do boku studni do pozycji pływającej za pomocą bawełnianego wacika.
  6. Przejdź do następnego wykresu i powtórz kroki od 2.3 do 2.5. Wypchnij krążki liściowe z omacnicy korkowej do osobnej studzienki w 24-dołkowej płytce za pomocą bawełnianego wacika. Powtórz ten krok, aby zebrać trzecią kontrpróbę biologiczną.
  7. Powtarzać krok 2.6 do momentu pobrania próbek z pełnej płytki 24-dołkowej. Umieść pokrywkę i zamknij półprzezroczystą, elastyczną folią. Przechowuj talerz z dala od bezpośredniego światła słonecznego, w torbie, pudełku lub pustej lodówce (bez lodu).

3. Przygotowanie próbek do analizy

  1. Po pobraniu próbek powrócić do czystej przestrzeni laboratoryjnej. Postukaj w pokrywę uszczelnionej płytki, aby usunąć krążki liści przyklejone do pokrywy podczas transportu. Rozwiń folię i zdejmij pokrywkę.
  2. Przenieść krążek liściowy z pierwszego położenia płytki 24-dołkowej na świeżą płytkę 96-dołkową, tak aby krążek liściowy był skierowany płasko w dół na dnie studzienki.
  3. Przetnij filtr aspiratora do nosa na pół. Zanurz powstały filtr do połowy w wodzie i przetrzyj ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar płynu. Włóż filtr do studzienki z dyskiem liściowym, aby utrzymać wilgotność.
  4. Wziąć drugi krążek liściowy z pierwszej pozycji płytki 24-dołkowej i umieścić ją stroną zadrukowaną do dołu w następnej dostępnej pozycji płytki 96-dołkowej. Zanurz pozostałą połowę filtra nosowego wytworzonego w kroku 3.3 w wodzie i przetrzyj ręcznik papierowy przed włożeniem go do studzienki z drugim krążkiem liściowym.
  5. Powtórzyć kroki od 3.3 do 3.4 dla trzeciego krążka liściowego od pierwszego położenia płytki 24-dołkowej.
  6. Przejdź do drugiej pozycji płytki 24-dołkowej i powtórz kroki od 3.3 do 3.5.
  7. Umieść pokrywkę na talerzu, gdy wszystkie studzienki mają włożone dyski liściowe i filtry aspiratora do nosa. Przyklej taśmą prawy górny róg, aby ułatwić orientację płytki w ciemności w celu obrazowania.
  8. Uszczelnij płytki półprzezroczystą, elastyczną folią i zawiń płytkę w folię aluminiową. Napisz numery działek i identyfikatory tabliczki na folii aluminiowej.
  9. Umieść płytki w ciemnym pudełku lub szafce na co najmniej 30 minut, aby umożliwić rozluźnienie pierwszych dwóch faz NPQ (qE, qT, qZ). Należy zastosować dłuższy, ciemny okres inkubacji wynoszący 1 godzinę przed obrazowaniem, jeśli interesujące są długoterminowe fazy NPQ.
  10. Przygotuj dodatkową atrapę płytki do ustawiania ostrości podczas analizy. Aby to zrobić, umieść krążek liściowy w każdym z rogów świeżej 96-dołkowej płytki i jeden pośrodku. Zabezpiecz dyski liściowe filtrami do nosa, tak jak w przypadku poprzednich płytek. Uszczelnij płytkę i inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej (24 °C), ~50% wilgotności względnej.

4. Pomiar niefotochemicznego wygaszania za pomocą kamery fluorescencyjnej chlorofilu

  1. Włącz imager i otwórz oprogramowanie do obrazowania. Kliknij Ustawienia > Protokół, aby otworzyć okno wprowadzania kroków w eksperymentalnym protokole PAM. Dane techniczne maszyny znajdują się w tabeli uzupełniającej 3.
  2. Ustaw program tak, aby rozpoczynał się od impulsu nasycającego, aby zmierzyć maksymalną wydajność kwantową fotosyntezy przystosowanej do ciemności, wprowadzając 20 s w polu: Po opóźnieniu. Kliknij pole Zastosuj impuls i wprowadź 1 w polu: Tyle razy.
  3. Ustaw impuls PPFD na 6152, długość impulsu na 800 ms i zaznacz pole Wykonaj obrazy F' i Fm' ze wszystkimi impulsami. Kliknij przycisk Wstaw po, aby dodać drugi krok do protokołu.
  4. Wprowadź 30 s w polu: Po opóźnieniu. Wybierz opcję Zmień aktynikę i wpisz 50 w polu: Actinic PPFD, aby ustawić natężenie światła w komorze na 50 PPFD.
  5. Kliknij przycisk Wstaw po, aby dodać nowy krok do protokołu. Wprowadź 150 s w polu: Po upływie czasu wybierz Zastosuj impuls i wprowadź 4 w polu: Ta liczba razy, aby zastosować impulsy pomiarowe co 150 s, 4 razy z rzędu, gdy światło aktyniczne jest utrzymywane na poziomie 50 PPFD.
  6. Pełne informacje o protokole znajdują się w Tabeli 1, należy wykonać kroki 4.2 i 4.3, aby zmienić natężenie światła, a kroki 4.4 i 4.5, aby przejść do cykli impulsów nasycenia. Dostosuj opóźnienie i natężenie światła dla każdego kroku zgodnie z wartościami podanymi w Tabeli 1. Zapisz protokół jako plik .pcl w znanej lokalizacji.
  7. Wyłącz światło, umieść atrapę płytki na stoliku na próbkę i ustaw wysokość stolika na próbkę tak, aby krążki liściowe znajdowały się 140 mm nad podstawą przyrządu. Używana jest atrapa płytki, ponieważ światło będzie wielokrotnie migać na płytę podczas ustawiania ostrości; Będzie to wymagało adaptacji wszystkich mierzonych próbek do ponownego zaciemnienia i może spowodować fotouszkodzenia.
  8. Kliknij ikonę Połącz/Rozłącz z kamerą termowizora i kamerą sprzętową, aby uruchomić kamerę. Kliknij symbol ostrości (fluorescencji) reprezentowany przez czerwoną ikonę dwustronnej strzałki z dwiema zielonymi liniami u podstawy. Dostosuj obiektyw i ekspozycję, aby ustawić ostrość na płycie.
  9. Kliknij ponownie ikonę Ostrość (fluorescencja), aby wyłączyć światło. Pracując w ciemności, zastąp atrapę płytki płytką do analizy.
  10. Kliknij ikonę kamery obrazu mapy. Dostosuj ekspozycję obrazu, otwierając lub zamykając przysłonę, aż pasek w wyskakującym okienku znajdzie się w zielonej strefie.
  11. Klikaj przycisk Spróbuj ponownie po każdej regulacji przysłony, aż ekspozycja zostanie prawidłowo wyregulowana, a instrument wykona zdjęcie. Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i wybierz Zastosuj izolację obrazu, aby zablokować sygnały tła. Skoncentrowany obszar liścia będzie wyświetlany w kolorze szarym, a tło w kolorze niebieskim.
  12. Wybierz interesujący obszar/piksele, aby uwzględnić tylko dyski liści, dostosowując histogram i poziom gamma z menu rozwijanego modyfikuj obraz, klikając obraz prawym przyciskiem myszy.
  13. Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Usuń wysokie i niskie cięcia (mapa kolorów), aby usunąć jasnoniebieski podświetlony obszar. Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i wybierz Usuń zabłąkane (ciężkie), aby usunąć wszystkie piksele, które nie stykają się z co najmniej trzema innymi pikselami.
    UWAGA: Wszystkie obszary na obrazie, które pojawiają się jako odizolowane wyspy, zostaną przeanalizowane oddzielnie i uwzględnione w końcowych danych wyjściowych. Izolacja obrazu i usuwanie zabłąkanych pikseli zapewnia czyste, zrozumiałe dane.
  14. Kliknij ikonę Uruchom protokół, aby uruchomić program, u dołu ekranu pojawi się licznik czasu informujący, ile czasu pozostało do działania protokołu.
  15. Poczekaj, aż protokół zostanie zakończony, kliknij Plik > Zapisz jako i zapisz dane jako plik .igr. Zamknij okno, klikając czerwony krzyżyk w prawym górnym rogu okna, zanim zaczniesz uruchamiać kolejną płytkę próbną.
  16. Otwórz nowy plik dla następnej próbki, wybierając opcję Plik > Nowy i powtarzaj kroki od 4.10 do 4.15, aż wszystkie płytki zostaną zmierzone.
    UWAGA: Zaleca się mierzenie płytek w okresie 4 godzin lub krótszym, aby zminimalizować potencjalny wpływ regulacji okołodobowej na wyniki

5. Przetwarzanie danych fluorescencyjnych chlorofilu

  1. Otwórz plik .igr w oprogramowaniu do obrazowania. Wyeksportuj dane, klikając Plik > Eksportuj do folderu, aby utworzyć nowy folder ze wszystkimi niezbędnymi plikami.
  2. Skopiuj następujące trzy pliki MATLAB do folderu wynikowego: MapAndLabelDiscs.m (plik uzupełniający 1), ProcessFoFm.m (plik uzupełniający 2) i ProcessNPQdata.m (plik uzupełniający 3) oraz plik R: create_file_to_process. R (plik uzupełniający 4).
  3. Otwórz MapAndLabelDiscs.m (plik uzupełniający 1) w programie MATLAB i uruchom. Zapisz mapę ponumerowanych dysków liści wygenerowanych w oknie podręcznym jako plik .png, aby później sprawdzić numerację dysków liści
    4. .
  4. Otwórz plik ProcessFoFm.m (Plik uzupełniający 2) w programie MATLAB i uruchom, aby obliczyć wartości Fo i F m dla każdego dysku liścia. Uruchom ProcessNPQdata.m (plik uzupełniający 3), aby obliczyć wartości NPQ w każdym punkcie czasowym.
  5. Otwórz plik create_file_to_process. R (Plik uzupełniający 4) w Rstudio i dodaj datę do kodu w wierszu 5. Dodaj numer rejestracyjny do wiersza 8 w create_file_to_process.R.
  6. Uruchom create_file_to_process. R, aby skonsolidować wartości Fv/Fm i dane NPQ w jednym pliku, którego nazwa pochodzi od danych z przyrostkiem -cf-summary.csv. Sprawdź numerację dysków liści w pliku cf-summary z kroku 5.5, korzystając z pliku .png z kroku 5.3. Dodatkowe informacje dotyczące numeru działki i przystąpienia.
  7. Otwórz skrypt języka R CF-data-processing_2.R (plik uzupełniający 5) i zmień wiersz 13 na ścieżkę katalogu roboczego. Zmień wiersz 16 w CF-data-processing_2.R na nazwę pliku z kroku 5.5.
  8. Zmień wiersz 48 w CF-data-processing_2.R na nazwę pliku wyjściowego. Uruchom skrypt CF-data-processing_2.R, aby ponownie sformatować dane do dopasowania krzywej.
  9. Otwórz skrypt MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m (Plik uzupełniający 6) w programie MATLAB i zmień wiersz 5 na nazwę pliku wyjściowego z kroku 5.8. Zmień wiersz 85 w MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m na nową nazwę pliku wyjściowego. Uruchom skrypt MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m, aby obliczyć parametry relaksacji NPQ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1A przedstawia typowy pomiar NPQ w soi uprawianej na polu. Rośliny uprawiano w Urbana, IL (szerokość geograficzna 40.084604°, długość geograficzna -88.227952°) latem 2021 r., a nasiona posadzono 5 czerwca. 2021. Pobrano próbki z krążków liściowych po 30 dniach od posadzenia nasion, a pomiary wykonano zgodnie z dostarczonym protokołem (tabela 1). Wartości F, v/F, m i NPQ obliczono dla każdego dysku liścia (tabela uzupełniająca 4), a ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Staranny wybór i obchodzenie się z dyskami liściowymi ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych pomiarów NPQ. Po pierwsze, uszkodzenie tkanki, takie jak nieostrożne obchodzenie się z pęsetą, wprowadzi stres, co spowoduje niskie wartości maksymalnej wydajności kwantowej fotosyntezy. Rośliny niezestresowane zazwyczaj mają wartości Fv/Fm wynoszące około 0,8318, przy czym znaczne spadki wskazują na zmniejszenie wydajności fotosyntezy9

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez projekt badawczy Realizing Increased Photosynthetic Efficiency (RIPE), który jest finansowany przez Fundację Billa i Melindy Gatesów, Fundację Badań nad Żywnością i Rolnictwem oraz Brytyjskie Biuro Spraw Zagranicznych, Wspólnoty Narodów i Rozwoju w ramach grantu numer OPP1172157.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
24-dołkowa płytka do hodowli tkankowejFisher Scientific FB012929Kraj pochodzenia: Stany Zjednoczone Ameryki
96-dołkowa płytka do hodowli tkankowejFisher ScientificFB012931Kraj pochodzenia: Stany Zjednoczone
Ameryki Folia aluminiowaAntylia Scientific  61018-56Kraj pochodzenia: Stany Zjednoczone Ameryki
markerSharpieSAN30001Kraj pochodzenia: Stany Zjednoczone Ameryki
CF imagerTechnologica Ltd.Nie dotyczyfluorescencji chlorofilu
Kraj pochodzenia: Wielka Brytania
Borowiec, 7mmHumboldt Mfg CoH9665Kraj pochodzenia: Stany Zjednoczone Ameryki
FluorImager V2.305 SoftwareTechnologica Ltd.Nie dotyczyoprogramowania do obrazowania
Kraj pochodzenia: Wielka Brytania
iHank-Nose 100-pak wysokiej jakości filtrów higienicznych do aspiratora do nosaAmazon  B07P6XCTGVKraj pochodzenia: Stany Zjednoczone Ameryki
ZnacznikiHenry CompanyKN0151Kraj pochodzenia: Stany Zjednoczone Ameryki
Nożyczki do papieruVWR82027-596Kraj pochodzenia: Stany Zjednoczone Ameryki
ParafilmBemis Company Inc.  S3-594-6Półprzezroczysta elastyczna folia
Kraj pochodzenia: Stany Zjednoczone
Ameryki Korki z litej gumyFisher Scientific14-130MKraj pochodzenia: Stany Zjednoczone Ameryki
John

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blankenship, R. E. Molecular Mechanisms of Photosynthesis. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2021).
  2. Murchie, E. H., Niyogi, K. K. Manipulation of photoprotection to improve plant photosynthesis. Plant Physiology. 155 (1), 86-92 (2011).
  3. Horton, P. Optimization of light harvesting and photoprotection: molecular mechanisms and physiological consequences. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 367 (1608), 3455-3465 (2012).
  4. Slattery, R. A., Ort, D. R. Photosynthesis: photosynthetic efficiency improvement. Encyclopedia of Biological Chemistry III (Third Edition). , 256-267 (2021).
  5. Zhu, X. -G., Ort, D. R., Whitmarsh, J., Long, S. P. The slow reversibility of photosystem II thermal energy dissipation on transfer from high to low light may cause large losses in carbon gain by crop canopies: a theoretical analysis. Journal of Experimental Botany. 55 (400), 1167-1175 (2004).
  6. Kromdijk, J., et al. Improving photosynthesis and crop productivity by accelerating recovery from photoprotection. Science. 354 (6314), 857-861 (2016).
  7. Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence-a practical guide. Journal of Experimental Botany. 51 (345), 659-668 (2000).
  8. Murchie, E. H., Lawson, T. Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to good practice and understanding some new applications. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3983-3998 (2013).
  9. Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology. 59 (1), 89-113 (2008).
  10. Bilger, W., Björkman, O. Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canariensis. Photosynthesis Research. 25 (3), 173-185 (1990).
  11. Li, X. -P., et al. A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).
  12. Niyogi, K. K. PHOTOPROTECTION REVISITED: genetic and molecular approaches. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 50 (1), 333-359 (1999).
  13. Ruban, A. V. Nonphotochemical Chlorophyll fluorescence quenching: mechanism and effectiveness in protecting plants from photodamage. Plant physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).
  14. Krause, G. H., Vernotte, C., Briantais, J. -M. Photoinduced quenching of chlorophyll fluorescence in intact chloroplasts and algae. Resolution into two components. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 679 (1), 116-124 (1982).
  15. Nilkens, M., et al. Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).
  16. Krause, G. H. Photoinhibition of photosynthesis. An evaluation of damaging and protective mechanisms. Physiologia Plantarum. 74 (3), 566-574 (1988).
  17. Brooks, M. D., Sylak-Glassman, E. J., Fleming, G. R., Niyogi, K. K. A thioredoxin-like/β-propeller protein maintains the efficiency of light harvesting in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (29), 2733-2740 (2013).
  18. Demmig, B., Björkman, O. Comparison of the effect of excessive light on chlorophyll fluorescence (77K) and photon yield of O2 evolution in leaves of higher plants. Planta. 171 (2), 171-184 (1987).
  19. Malnoë, A., et al. The plastid lipocalin LCNP is required for sustained photoprotective energy dissipation in Arabidopsis. The Plant Cell. 30 (1), 196-208 (2018).
  20. Amstutz, C. L., et al. An atypical short-chain dehydrogenase-reductase functions in the relaxation of photoprotective qH in Arabidopsis. Nature Plants. 6 (2), 154-166 (2020).
  21. Dall'Osto, L., Cazzaniga, S., Wada, M., Bassi, R. On the origin of a slowly reversible fluorescence decay component in the Arabidopsis npq4 mutant. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1640), 20130221(2014).
  22. Chekanov, K., et al. Non-photochemical quenching in the cells of the carotenogenic chlorophyte Haematococcus lacustris under favorable conditions and under stress. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1863 (10), 1429-1442 (2019).
  23. Allorent, G., et al. A dual strategy to cope with high light in Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Cell. 25 (2), 545-557 (2013).
  24. Holzwarth, A. R., Lenk, D., Jahns, P. On the analysis of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching curves: I. Theoretical considerations. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1827 (6), 786-792 (2013).
  25. Barbagallo, R. P., Oxborough, K., Pallett, K. E., Baker, N. R. Rapid, noninvasive screening for perturbations of metabolism and plant growth using chlorophyll fluorescence imaging. Plant physiology. 132 (2), 485-493 (2003).
  26. Nedbal, L., Soukupová, J., Kaftan, D., Whitmarsh, J., Trtílek, M. Kinetic imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light. Photosynthesis Research. 66 (1), 3-12 (2000).
  27. Kuhlgert, S., et al. MultispeQ Beta: a tool for large-scale plant phenotyping connected to the open PhotosynQ network. Royal Society Open Science. 3 (10), 160592(2016).
  28. Cruz, J. A., et al. Dynamic environmental photosynthetic imaging reveals emergent phenotypes. Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).
  29. McAusland, L., Atkinson, J. A., Lawson, T., Murchie, E. H. High throughput procedure utilising chlorophyll fluorescence imaging to phenotype dynamic photosynthesis and photoprotection in leaves under controlled gaseous conditions. Plant Methods. 15 (1), 109(2019).
  30. Woo, N. S., Badger, M. R., Pogson, B. J. A rapid, non-invasive procedure for quantitative assessment of drought survival using chlorophyll fluorescence. Plant Methods. 4 (1), 27(2008).
  31. Bielczynski, L. W., Łącki, M. K., Hoefnagels, I., Gambin, A., Croce, R. Leaf and plant age affects photosynthetic performance and photoprotective capacity. Plant Physiology. 175 (4), 1634-1648 (2017).
  32. Niyogi, K. K., Truong, T. B. Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis. Physiology and metabolism. 16 (3), 307-314 (2013).
  33. Delosme, R., Olive, J., Wollman, F. -A. Changes in light energy distribution upon state transitions: an in vivo photoacoustic study of the wild type and photosynthesis mutants from Chlamydomonas reinhardtii. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1273 (2), 150-158 (1996).
  34. Quick, W. P., Stitt, M. An examination of factors contributing to non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in barley leaves. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 977 (3), 287-296 (1989).
  35. Horton, P., Hague, A. Studies on the induction of chlorophyll fluorescence in isolated barley protoplasts. IV. Resolution of non-photochemical quenching. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 932, 107-115 (1988).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przesiewy wysokoprzepustowerelaksacja NPQfotosynteza soipobieranie pr bek wycink w li cianaliza zmienno ci genetycznejuprawy polowewydajno fotosyntetyczna

Powiązane artykuły