Wysoce skalowalne podejście do przeprowadzania badań ekologicznych nicieni Caenorhabditis

Podsumowanie

Ten protokół może być używany do przeprowadzania badań ekologicznych na dużą skalę nicieni Caenorhabditis. Podstawową zaletą tej metody jest sprawna organizacja i analiza danych ekologicznych i molekularnych związanych z nicieniami zebranymi z natury.

Streszczenie

Caenorhabditis elegans jest jednym z głównych organizmów modelowych w biologii, ale dopiero od niedawna badacze skupili się na jego naturalnej ekologii. Stosunkowo skąpe informacje na temat C. elegans w jego naturalnym kontekście wynikają z wyzwań związanych z identyfikacją małego nicienia w naturze. Pomimo tych wyzwań, rosnące skupienie się na ekologii C. elegans spowodowało bogactwo nowych informacji na temat jego życia poza laboratorium. Zintensyfikowane poszukiwania C. elegans w naturze przyczyniły się do odkrycia wielu nowych gatunków Caenorhabditis i ujawniły, że nicienie kongeneryczne często współżyją na wolności, gdzie żywią się zakwitami mikrobiologicznymi związanymi z gnijącym materiałem roślinnym. Identyfikacja nowych gatunków ujawniła również, że androdiopienny system godowy samców i samozapładniających się hermafrodytów wyewoluował trzy razy niezależnie w obrębie Caenorhabditis. Pozostałe dwa gatunki samozarodkowe, C. briggsae i C. tropicalis, dzielą eksperymentalne zalety C. elegans i umożliwiły badania porównawcze nad mechanistycznymi podstawami ważnych cech, w tym samozapłodnienia. Pomimo tych postępów wiele pozostaje do nauczenia się na temat ekologii i naturalnej różnorodności tych ważnych gatunków. Na przykład, wciąż brakuje nam informacji funkcjonalnych dla wielu ich genów, które można osiągnąć tylko poprzez zrozumienie ich naturalnej ekologii. Aby ułatwić badania ekologiczne nad samoistnymi nicieniami Caenorhabditis, opracowaliśmy wysoce skalowalną metodę zbierania nicieni ze środowiska naturalnego. Nasza metoda wykorzystuje mobilne platformy gromadzenia danych, bazy danych w chmurze i środowisko oprogramowania R, aby zwiększyć zdolność badaczy do zbierania nicieni z dzikiej przyrody, rejestrowania powiązanych danych ekologicznych i identyfikowania dzikich nicieni za pomocą molekularnych kodów kreskowych.

Wprowadzenie

Ostatnie dwie dekady przyniosły wzrost zainteresowania ekologią nicieni Caenorhabditis. Z tych badań wiemy, że wolno żyjące gatunki Caenorhabditis mogą być izolowane z efemerycznych mikrosiedlisk zarówno w regionach umiarkowanych, jak i tropikalnych, gdzie żywią się zakwitami mikrobiologicznymi związanymi z rozkładającym się materiałem roślinnym, czasami w sympatrii1^,2,3,4,5^,6,7,8. Dowiedzieliśmy się również, że zbieżna ewolucja samozapłodnienia wystąpiła w rodzaju trzykrotnie, a samozapłodnienie jest dominującym sposobem rozmnażania C. briggsae, C. elegans i C. tropicalis^9,10. Wśród tych osobników C. elegans jest jednym z najczęściej badanych zwierząt na Ziemi i został wykorzystany przez naukowców do dokonania krytycznych postępów w biologii. Co ważne, inne gatunki Caenorhabditis mają wiele wspólnych zalet eksperymentalnych C. elegans i szybko się naprzód w badaniach porównawczych nad tym rodzajem. Jednak tajemnicza natura tych nicieni żyjących na wolności utrudnia badanie ich ekologii i naturalnej różnorodności, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia biologicznych funkcji ich genów i sposobów, w jakie ewolucja ukształtowała różnorodność genetyczną wśród gatunków^10,11.

Największym wyzwaniem dla badania ekologii nicieni Caenorhabditis na wolności jest ich mały rozmiar; dorosłe nicienie często mają 1 mm długości lub mniej. Wyzwanie to wymaga, aby naukowcy pobrali próbki substratów ze środowiska naturalnego i podjęli próbę oddzielenia interesujących nicieni od substratów w laboratorium bez możliwości obserwacji zwierząt na wolności. Ponieważ nawet wyszkoleni eksperci mają trudności z odróżnieniem nicieni Caenorhabditis od innych wolno żyjących nicieni pod mikroskopem, nicienie są zwykle usuwane z podłoża, izolowane i pozostawiane do namnażania się, zanim zostaną zidentyfikowane na podstawie tożsamości sekwencji przy użyciu ustalonych molekularnych kodów kreskowych^3,12,13,14. Czas i wysiłek wymagany do przetworzenia każdego nicienia w ten sposób stanowi wyzwanie organizacyjne, ponieważ naukowcy muszą być w stanie prześledzić tożsamość każdego nicienia wyizolowanego w laboratorium z powrotem do dokładnego substratu i powiązanych danych ekologicznych pobranych w terenie. W tym miejscu opisujemy krok po kroku proces skutecznego zbierania i identyfikowania samozaszczepiających się nicieni Caenorhabditis w terenie i wiernego łączenia tych izolatów z powiązanymi z nimi danymi przestrzennymi i ekologicznymi na dużą skalę.

Ta metoda zbierania zwiększa skalę i dokładność badań ekologicznych dzięki wykorzystaniu mobilnych platform zbierania danych, baz danych w chmurze i środowiska oprogramowania R. Fulcrum to konfigurowalna platforma gromadzenia danych, która współpracuje z większością urządzeń mobilnych i umożliwia użytkownikom tworzenie niestandardowych aplikacji do gromadzenia i organizowania danych opartych na lokalizacji (https://www.fulcrumapp.com). Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z niestandardowych aplikacji do gromadzenia danych w celu organizowania przestrzennie wyraźnych danych ekologicznych z terenu i dokładnego powiązania tych danych z tożsamością nicieni wyizolowanych w laboratorium. Protokół wyjaśnia również, jak skutecznie identyfikować nicienie Caenorhabditis za pomocą ustalonych molekularnych kodów kreskowych. Dane z tych metod mogą być przetwarzane w prosty i powtarzalny sposób za pomocą dołączonego pakietu oprogramowania R easyFulcrum¹⁵ w celu zbadania ekologii i różnorodności genetycznej naturalnych populacji Caenorhabditis.

Protokół

1. Przygotowanie kolekcji

1. Zidentyfikuj lokalizację do zbadania nicieni Caenorhabditis.
   UWAGA: W większości regionów o klimacie umiarkowanym C. elegans i C. briggsae można łatwo wyizolować z siedlisk związanych z działalnością człowieka, takich jak pola uprawne lub ogrody wiejskie i miejskie¹. W regionach subtropikalnych i tropikalnych C. briggsae, C. elegans i C. tropicalis można znaleźć w siedliskach związanych z człowiekiem wymienionych powyżej, czasami w bliskiej odległości od siebie. Jednak C. elegans wydaje się preferować chłodniejsze, bardziej suche siedliska niż inne gatunki w siedliskach tropikalnych^7,8. Każdy z gatunków można również wyizolować z dzikich siedlisk, które nie są związane z ludźmi, ale te siedliska są rzadziej pobierane próbki.
2. Utwórz projekt Fulcrum, aby uporządkować zbieranie i izolowanie danych za pomocą mobilnych aplikacji do zbierania danych.
   1. Utwórz konto w Fulcrum online, korzystając z bezpłatnej umowy edukacyjnej¹⁶. Dodaj aplikację Nematode Field Sampling do konta Fulcrum, klikając przycisk DODAJ APLIKACJĘ¹⁷.
   2. Dodaj aplikację Izolacja Nicieni do konta, klikając przycisk DODAJ APLIKACJĘ¹⁸.
      UWAGA: Zaleca się, aby każda podróż do lokalizacji była organizowana jako projekt kolekcji przy użyciu konwencji nazewnictwa "YearMonthLocation", np. 2020FebruaryAustralia.
3. Dodaj użytkowników do konta Fulcrum, aby przyznać im dostęp do projektu kolekcji. Upewnij się, że każdy użytkownik pobrał aplikację mobilną Fulcrum, aby wziąć udział w projekcie.
4. Wydrukuj zestaw etykiet z kodami QR, aby śledzić kolekcje (etykiety C) i izolacje nicieni (etykiety S) za pomocą aplikacji mobilnej. Przymocuj etykiety C do plastikowych toreb z zamkiem błyskawicznym, zwiń oznaczone torby w grupy po 25 sztuk i owiń je gumką do pakowania. Zachowaj zestaw etykiet S do użytku w laboratorium.
   UWAGA: W całym tym protokole zbiory (substraty z terenu) znajdują się w workach lub na płytkach i są oznaczone etykietami C. Wyizolowane nicienie są oznaczone etykietami S. Etykiety C służą do identyfikacji unikalnych kolekcji, a etykiety S służą do identyfikacji unikalnych izolatów nicieni. Te dwa typy etykiet są używane do tworzenia połączenia między określoną kolekcją (etykieta C) a nicieniami wyizolowanymi z tej kolekcji (etykiety S) w bazie danych Fulcrum. Wydrukuj dwa razy więcej etykiet S niż etykiet C dla projektu zbiórki, ponieważ średnio dwa nicienie są izolowane w jednej kolekcji. W razie potrzeby można wydrukować więcej etykiet S później. W suplemencie znajduje się 2 500 unikalnych etykiet C (plik uzupełniający 1) i 5 000 unikalnych etykiet S (plik uzupełniający 2).
5. Przygotuj 10 cm płytki NGMA do zbierania i 3,5 cm płytki NGMA do izolowania nicieni. Zrób jedną płytkę o średnicy 10 cm i co najmniej dwie płytki o średnicy 3,5 cm na kolekcję²¹. Płytki te są wysiewane szczepem Escherichia coli OP50 zgodnie z ustalonymi protokołami. Płytki należy przechowywać przed użyciem w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 1 miesiąc.

2. Kolekcja pól

UWAGA: Nicienie Caenorhabditis są najczęściej izolowane z gnijącego materiału roślinnego, w tym owoców, orzechów, nasion, strąków, kwiatów, łodyg, ściółki roślinnej i kompostu1^,5,6,8. Najlepsze podłoża są zgniłe i prawie nierozpoznawalne jako owoce lub kwiaty; unikaj podłoży, które są zbyt suche lub mokre (Rysunek 1). Substraty najefektywniej zbiera się z pola, pracując w parach. Osoba z bezdotykowym termometrem na podczerwień wybierze podłoże do pobrania i pobierze próbkę, podczas gdy jej partner użyje aplikacji Nematode Field Sampling w Fulcrum do zapisania danych pobrania. Para kolektorów będzie powtarzać ten proces, aż do zebrania żądanej liczby próbek. Wykaz materiałów potrzebnych do pracy w terenie znajduje się w (Tabela uzupełniająca 1).

1. Otwórz aplikację mobilną Fulcrum i z menu rozwijanego wybierz opcję Próbkowanie pola nicieni. Naciśnij +, aby rozpocząć nowy rekord w projekcie (Rysunek 2A). Zrób zdjęcie podłoża.
2. Kliknij pole w górnej środkowej części, aby wybrać odpowiedni projekt kolekcji wykonany w kroku 1.2 (Rysunek 2B). Stuknij w pole C-label u dołu rekordu kolekcji i wybierz opcję Skanuj, gdy pojawi się monit. Zeskanuj kod kreskowy na worku zbiorczym za pomocą aparatu urządzenia mobilnego, a następnie dotknij Gotowe w prawym górnym rogu ekranu.
3. Stuknij w pole Podłoże i wybierz typ podłoża z menu rozwijanego. Dodaj notatki dotyczące podłoża, dotykając pola Uwagi dotyczące podłoża i ręcznie wprowadzając notatki.
4. Wybierz krajobraz z menu rozwijanego. Wybierz krajobraz, który najlepiej reprezentuje miejsce pobierania próbek.
5. Wybierz widok nieba. Wybierając widok nieba, opisz widoczność nieba w miejscu pobierania próbek (np. Widok całego nieba bez zasłoniętych widoków z drzew lub innych struktur = pełny).
6. Zmierz temperaturę powierzchni podłoża za pomocą termometru bezdotykowego i zapisz wartość w polu temperatury podłoża.
   UWAGA: Podczas rejestrowania temperatury trzymaj termometr bezdotykowy nie dalej niż 14 cali od podłoża.
7. Zmierz temperaturę i wilgotność otoczenia za pomocą urządzenia przenośnego i zapisz te dane w odpowiednich polach.
   UWAGA: Sprawdź, czy urządzenie do pomiaru temperatury i wilgotności otoczenia nie jest wstrzymane. Jednostka miary zmieni się po zwolnieniu przycisku. Trzymaj urządzenie w zewnętrznej kieszeni, aby uniknąć nieregularnych odczytów.
8. Zapisz rekord w Fulcrum, dotykając Zapisz w lewym górnym rogu ekranu.
9. Zbierz około łyżki stołowej podłoża bez patyczków lub innych twardych kawałków, odwracając worek zbiorczy, aby użyć go jako "rękawicy" do podniesienia podłoża, a następnie zamknij worek. Włóż ręcznik papierowy do torby, jeśli próbka jest szczególnie wilgotna.
   UWAGA: W gorącym klimacie umieść torby w miękkich chłodziarkach z chłodziarkami, aby kolekcje były chłodne.
10. Po pobraniu wszystkich próbek na dany dzień wyczyść sprzęt do pobierania, wyjmij baterie z sond, naładuj baterie, ponownie zamroź opakowania do zamrażania. Zsynchronizuj dane zbierania Fulcrum, dotykając przycisku Synchronizuj w lewym górnym rogu aplikacji Nematode Field Sampling application.
    UWAGA: Przesyłanie może potrwać kilka minut bez silnego połączenia komórkowego, więc najlepiej poczekać na dostęp do Wi-Fi. Dane pozostaną na urządzeniach mobilnych i zostaną zsynchronizowane z chmurą.
11. Wyślij próbki do instytucji macierzystej, umieszczając je w pudełku wysyłkowym na noc. Zminimalizuj czas, w którym próbki są wystawione na działanie temperatur niższych niż 11 °C lub wyższych niż 25 °C, wysyłając paczki w dni, w których ładunek jest transportowany.
    UWAGA: Większość obiektów spedycyjnych nie wysyła ładunków z dnia na dzień w weekendy w odległych lokalizacjach.

3. Gromadzenie zbiorów terenowych w laboratorium

UWAGA: Ta sekcja szczegółowo opisuje, jak zorganizować transfer próbek z oznaczonych worków na oznakowane talerze. Próbki mogą przybyć z transportu nocnego lub bezpośrednio z pola.

1. Odbierz przesyłkę z kolekcjami i sprawdź, czy nie ma uszkodzonych toreb lub innych dowodów uszkodzenia. Jeśli worki są uszkodzone, wyrzuć materiał i wyczyść nieuszkodzone worki zbiorcze 70% etanolem; unikaj etykiety C na torbie z etanolem, ponieważ spowoduje to odbarwienie etykiety i utrudni jej odczytanie.
2. Dla każdej torebki z zamkiem błyskawicznym zwróć uwagę na etykietę C na torbie i przymocuj pasującą etykietę C do wieczka 10-centymetrowej tabliczki nakrapianej bakteriami OP50.
   UWAGA: Oznaczone tabliczki o średnicy 10 cm są określane jako "tabliczki C" w pozostałej części protokołu. Najprostszym sposobem uporządkowania próbek jest umieszczenie worków do pobierania na stole laboratoryjnym z pasującą płytką C na górze (Rysunek 3).
3. Dla każdej kolekcji przenieś około jednej łyżki stołowej próbki z worka zbiorczego na płytkę C za pomocą czystej plastikowej łyżki. Dodaj próbkę wokół trawnika bakteryjnego w kształcie półksiężyca lub pierścienia, nie zakrywaj całkowicie trawnika bakteryjnego (Rysunek 4).
   UWAGA: Utrzymuj łyżkę stołową w czystości, umieszczając ją w zlewce z 95% etanolem, gdy nie jest używana. Użyj ręcznika papierowego, aby osuszyć łyżkę stołową przed przeniesieniem dodatkowych próbek.
4. Należy odnotować czas, w którym kolekcje zostały przeniesione z worków do pobierania próbek na płytki C i przechowywać płytki C w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej 24 godziny przed próbą wyizolowania nicieni w sekcji 4.

4. Izolowanie nicieni z kolekcji

1. Otwórz aplikację Fulcrum na urządzeniu mobilnym i wybierz Izolacja nicieni z menu aplikacji (Rysunek 5A). Utwórz nowy rekord izolacji, dotykając ikony + w prawym dolnym rogu (Rysunek 5B).
2. Na nowym ekranie rekordu izolacji potwierdź poprawny projekt zbiórki, zaznaczając nazwę projektu wyświetlaną w polu pośrodku w górnym środku. Jeśli wyświetlany jest niewłaściwy projekt, stuknij nazwę projektu, aby przełączyć się na właściwy projekt (Rysunek 5C).
3. Stuknij w przycisk Wybierz pod polem C-label, aby znaleźć etykietę C powiązaną z próbką, z której izolowane są nicienie (Rysunek 5D). Stuknij ikonę wyszukiwania, a następnie stuknij ikonę skanowania, aby zeskanować kod QR etykiety C na tabliczce C za pomocą aparatu urządzenia. Po zeskanowaniu kodu QR w polu C-label pojawi się rekord C-label.
4. Stuknij ikonę aparatu w polu Zdjęcia, aby otworzyć kamerę urządzenia i użyj jej do zrobienia zdjęcia próbki na tabliczce C z widocznym kodem QR (Rysunek 5E). Stuknij w Gotowe, aby powrócić do ekranu izolacji.
   UWAGA: Te zdjęcia z zapisu izolacji mogą być wykorzystane do zbadania określonych atrybutów podłoża w późniejszym czasie.
5. Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby poszukać nicieni na płytce C. Stuknij w pole Robaki na próbce, aby zarejestrować obecność nicieni w próbce (Rysunek 5F). Stuknij w Tak, jeśli nicienie są obecne na tabliczce C i stuknij w Nie, jeśli nicienie nie są obecne.
6. Stuknij w Utwory, jeśli obecne są tylko ślady nicieni. Jeśli nicienie nie są obecne, należy sparafilmować płytkę C i wyrzucić ją do pojemnika na zagrożenia biologiczne.
   UWAGA: Odwróć płytkę C nad pojemnikiem na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne i delikatnie postukaj w tylną część płytki, aby usunąć wszystkie pobrane substraty. Ten krok ułatwia znalezienie i wyizolowanie nicieni, które mogą znajdować się pod podłożem na płytce C.
7. Jeśli nicienie są obecne, należy wyizolować do pięciu nicieni z płytki C. Aby wyizolować nicienie, przenieś jednego nicienia z płytki C na płytkę S za pomocą szpikulca z drutu platynowego. Jeśli to możliwe, odizoluj zdrowych, ciężarnych dorosłych. Jednak odizoluj inne etapy, jeśli nie zostaną znalezione dorosłe osobniki.
   UWAGA: Po izolacji, na maksymalnie pięciu płytkach S będzie znajdować się pojedynczy nicień. Trzymaj te S-płytki z izolowanymi nicieniami z tej samej płytki C zorganizowane razem w schludny stos z dala od innych płytek S, dopóki nie zostaną wprowadzone do Fulcrum.
8. Stuknij w pole Tabliczki z oznaczeniem S, aby wprowadzić płytę (płyty) S używaną do tej izolacji. Stuknij w + w prawym dolnym rogu. Stuknij w S-label, a następnie kliknij Skanuj, aby otworzyć kamerę urządzenia. Użyj aparatu urządzenia, aby zeskanować kod QR S-label na tabliczce S.
   UWAGA: Upewnij się, że kod etykiety S jest zgodny z kodem na tabliczce. Jeśli pasuje, dotknij Gotowe. Jeśli tak się nie stanie, dotknij Anuluj i skanuj ponownie, aż będzie pasować, a następnie kliknij Gotowe. Czasami kody QR pobliskich tablic są przypadkowo skanowane.
9. Po wprowadzeniu każdej płyty S zapisz wpis za pomocą przycisku Zapisz w prawym górnym rogu. Wpis zostanie utracony, jeśli nie zostanie zapisany. Stuknij w + w prawym dolnym rogu, aby w razie potrzeby dodać więcej płytek z oznaczeniem S, aż wszystkie nicienie wyizolowane z płytki C zostaną wprowadzone. Po dodaniu wszystkich płytek oznaczonych literą S dla rekordu izolacji, dotknij przycisku < w lewym górnym rogu, aby wrócić do ekranu nagrywania izolacji.
   UWAGA: Aby anulować rekord izolacji, ponieważ nie można usunąć błędów, kliknij Anuluj w lewym górnym rogu. Ten krok otworzy okno dialogowe z pytaniem, czy rekord można odrzucić bez zapisywania. W razie potrzeby kliknij Tak, odrzuć.
10. Stuknij w przycisk Zapisz w prawym górnym rogu, gdy rekord izolacji zostanie poprawnie dodany do wszystkich informacji. Następnie sparafilmować płytki S z wyizolowanymi nicieniami i odłożyć je na bok w miejscu przeznaczonym do przechowywania płytek S z nicieniami.
11. Parafilmować płytkę C i wyrzucać ją do pojemnika na zagrożenia biologiczne. Stuknij w ikonę Synchronizuj, aby przesłać wszystkie dane do Fulcrum.
12. Posortuj wszystkie tabliczki S w kolejności alfanumerycznej, a następnie umieść tabliczki S w kartonowych pudełkach. Upewnij się, że płytki S są pokrywą do dołu i sfilmowane. Ułóż do czterech płytek S w jednym miejscu w pudełku i oznacz karton nazwą projektu, datą, godziną i unikalnym numerem pudełka.
13. Przechowuj oznaczone pudełka w RT. Izolaty te zostaną sprawdzone pod kątem proliferacji po 48 godzinach, a w razie potrzeby ponownie po 168 godzinach.

5. Eksport płyt S z Fulcrum

UWAGA: Ta sekcja szczegółowo opisuje, jak eksportować etykiety S używane w procesie izolacji z bazy danych projektu Fulcrum. Te znaczniki S będą używane do śledzenia proliferujących linii izożeńskich, podczas gdy są one identyfikowane na podstawie tożsamości sekwencji w sekcjach 6-9.

1. Zaloguj się na stronie internetowej Fulcrum i wybierz aplikację Izolacja nicieni. Kliknij Eksporter po lewej stronie ekranu. Kliknij, aby wybrać żądany projekt i zaznacz pole Izolacja nicieni. Kliknij przycisk Dalej, aby pobrać plik .zip, który zawiera plik "nematode_isolation_s_labeled_plates.csv".
2. Otwórz plik "nematode_isolation_s_labeled_plates.csv" i posortuj go według kolumny "S-label" w kolejności rosnącej (najmniejsza etykieta S będzie na górze). Zaznacz wszystkie etykiety S i skopiuj je z arkusza kalkulacyjnego.
3. Przejdź do arkusza Google szablonu genotypowania dzikiej izolacji (wild_isolate_genotyping_template) za pomocą przeglądarki internetowej¹⁹.
   1. Utwórz kopię tego arkusza Google, klikając prawym przyciskiem myszy kartę Szablon genotypowania, a następnie wybierając opcję Kopiuj do nowego arkusza kalkulacyjnego. Wybierz Otwórz arkusz kalkulacyjny, aby wyświetlić nowy arkusz Google.
   2. Nazwij ten nowy arkusz nazwą projektu punktu podparcia, po której następuje "wild_isolate_genotyping", np. "2020FebruaryAustralia_wild_isolate_genotyping."
      UWAGA: Ten arkusz jest określany jako "arkusz genotypowania" w pozostałej części protokołu.
4. Wklej etykiety S skopiowane z kolumny "nematode_isolation_s_labeled_plates.csv" "s_label" do kolumny arkusza genotypowania zatytułowanej "s_label". Sprawdź, czy w kolumnie "s_label_repeat_error" znajdują się cyfry "1". Wartość "1" w tej kolumnie oznacza, że etykieta S jest zduplikowana gdzieś na arkuszu genotypowania. Jeśli zostaną wykryte duplikaty, zbadaj je i popraw przed przejściem dalej.
5. Wypełnij kolumnę "isolation_box_number" w arkuszu genotypowania dla wszystkich etykiet S.

6. Sprawdź, czy nie ma proliferacji na płytach S

1. Sprawdź, czy na tabliczkach S nie ma rozmnażających się zwierząt 48 godzin po izolacji (użyj daty i godziny ostatniej izolacji na pudełku z kroku 4.11, aby wskazać czas).
   UWAGA: Nicienie rozmnażające się charakteryzują się potomstwem na płytce S.
2. Jeżeli tabliczka S ulega namnażeniu, wpisz "1" w kolumnie proliferation_48 na arkuszu genotypowania, a następnie przenieś płytkę S do pola oznaczonego "48 godzin proliferacji, pole 1". Umieścić maksymalnie 88 płytek S w pudełku do proliferacji, a następnie rozpocząć napełnianie nowego pudełka z napisem "48 h proliferation, box 2". Upewnij się, że etykiety S są uporządkowane w porządku alfanumerycznym w skrzynkach proliferacji 48 godzin.
   UWAGA: Nie wyrzucaj nierozwierających się płytek S; Tabliczki te zostaną ponownie sprawdzone po 168 godzinach od izolacji. W razie potrzeby należy skonsolidować te tabliczki S w kolejności numerycznej w polach oznaczonych jako "48 h non-proliferating, box X", ale pamiętaj, aby odnotować, kiedy na nowym pudełku musi nastąpić sprawdzenie 168 godzin.
3. Po zidentyfikowaniu wszystkich proliferujących etykiet S po 48 godzinach, przejdź do sekcji 7 dla płytek S z proliferacją po 48 godzinach.
4. Sprawdź płytki S, które nie rozmnażały się po 48 godzinach od izolacji, ponownie po 168 godzinach od izolacji.
   1. Jeśli tabliczka S jest obecnie w trakcie namnażania, wpisz "1" w kolumnie proliferation_168 na arkuszu genotypowania, a następnie przenieś tabliczkę S do pola oznaczonego "168 godzin proliferacji, pole 1".
   2. Umieścić maksymalnie 88 płytek S w pudełku do proliferacji, a następnie rozpocząć napełnianie nowego pudełka oznaczonego jako "168 godzin proliferacji, pole 2". Pamiętaj, aby uporządkować etykiety S w kolejności alfanumerycznej w pudełkach proliferacji 168 godzin.
5. Wyrzuć płytki S, które nie mają proliferacji po 168 godzinach. Przejdź do sekcji 7 dla płytek S z proliferacją po 168 godzinach.

7. Liza linii izożeńskich

UWAGA: Ten krok użyje narzędzia do filtrowania danych w arkuszach Google, aby pomóc w wydrukowaniu arkuszy lizy dla płyt S w skrzynkach proliferacji. Celem arkuszy do lizy jest zapewnienie personelowi prawidłowych pozycji etykiet S w probówkach z paskami do lizy na stanowisku pracy.

1. Otwórz arkusz genotypowania dla żądanego projektu i zaznacz wszystkie komórki, wpisując Cmd+A. Kliknij pozycję Dane > Utwórz filtr, aby dodać przycisk filtru do każdego nagłówka kolumny. Użyj przycisków Filtr, aby wyświetlić tylko te płytki S, które zostaną zgenotypowane. Na przykład, jeśli wszystkie płytki S z proliferacją po 48 godzinach mają być poddawane lizie: Kliknij przycisk Filtruj w kolumnie "proliferation_48" i wybierz "1".
2. Po przefiltrowaniu arkusza Google genotypowania przejrzyj listę wyświetlanych etykiet S, aby upewnić się, że są to etykiety S, które mają zostać wydrukowane w arkuszu.
   1. W kolumnie "strip_tube_number" w arkuszu Google dotyczącym genotypowania wprowadź unikalny numer co 11 wierszy.
   2. Wprowadź numery rurek paskowych dla projektu w kolejności kolejnej, zaczynając od 1 i nigdy nie duplikuj. W polu "strip_tube_position" wprowadź liczby od 2 do 12 dla każdego numeru rurki paskowej.
      UWAGA: Do lizy należy używać 12-rurowych probówek paskowych. Pierwszą pozycją (strip_tube_position 1) będzie kontrola, ale kontrolki nie są dodawane do arkuszy lizy (dodawane są tylko strip_tube_positions, 2-12). W czasie lizy szczep kontroli dodatniej "N2" zostanie dodany do pozycji 1 każdej parzystej probówki paskowej jako kontrola dodatnia. Do pozycji 1 każdej nieparzystej tubki paskowej nie dodaje się żadnych robaków jako kontroli ujemnej.
3. Przefiltruj arkusz Google dotyczący genotypowania, aby uwzględnić tylko etykiety S w jednym polu proliferacji, które mają być poddawane lizie, a następnie wybierz kolumny od s_label do "lysis_notes". Wydrukuj arkusz lizy dla każdego pudełka do lizy.
4. Kliknij menu rozwijane w polu Drukuj i wybierz Wybrane komórki. Kliknij Dalej w prawym górnym rogu, a następnie użyj okna dialogowego, aby wydrukować arkusz lizy dla pola proliferacji.
5. Powtórz kroki 7.3-7.5, aby wydrukować arkusz lizy dla każdego pudełka proliferacji.
   UWAGA: Każde pudełko proliferacyjne mieści do 88 płytek S, co odpowiada ośmiu 12-dołkowym probówkom paskowym.
6. Przygotuj 12-dołkowe probówki paskowe dla wszystkich próbek, które będą poddawane lizie. Oznacz probówkę paskową unikalnym "strip_tube_number" przypisanym w arkuszu lizy. Etykieta ta musi być napisana na pasku z nakrętką i tubie paska, aby uniknąć pomyłek w przypadku ich rozdzielenia. Probówki paskowe EVEN mają kontrolę pozytywną (ślimaki N2) w pozycji 1. Rurki paskowe napędu optycznego mają kontrolę ujemną (brak robaków) w pozycji 1.
7. Uzupełnić wystarczającą ilość buforu do lizy (100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8,2, 5 mM MgCl₂, 0,9% IGEPAL, 0,9% Tween 20, 0,02% żelatyny z proteinazą K dodaną do końcowego stężenia 0,4 mg/ml) dla wszystkich próbek i dodać 5% więcej w przypadku błędu pipetowania. Skaluj zgodnie z potrzebami.
   UWAGA: Bufor do lizy najlepiej przygotować łącząc wszystkie składniki z wyjątkiem proteinazy K i zamrażając w 10-50 ml podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Rozmrozić porcje i przechowywać w temperaturze 4 °C przed użyciem; bezpośrednio przed użyciem dodać proteinazę K i dokładnie wymieszać. Podczas pracy utrzymuj bufor do lizy na lodzie.
8. Ułóż płytki S dla konkretnej probówki paskowej w kolejności, korzystając z wydrukowanego arkusza lizy jako przewodnika.
9. Odkręć jedną probówkę z paskiem i dodaj 8 μl buforu do lizy do każdej nakrętki za pomocą powtarzalnego pipetora. Dodaj bufor do lizy do jednego paska nakrętek na raz, ponieważ bufor do lizy wyparuje, jeśli zostanie pozostawiony w temperaturze pokojowej i odkryty. Wybierz 3-5 zwierząt z płytek źródłowych (płytka S lub płytka podstawowa N2 do kontroli pozytywnych) do odpowiednich pozycji nasadek wskazanych na arkuszu lizy. Zapisz notatki dla dowolnej płytki S z mniej niż 5 robakami wybranymi do lizy w lysis_notes sekcji arkusza lizy.
10. Po załadowaniu nicieni do każdej pozycji tubki z paskiem, umieść pasek nasadki z powrotem na tubce z paskiem. Dopasuj oznaczoną nasadkę (pozycja 1) do oznaczonej rurki (pozycja 1). Po zamknięciu odwiruj krótko probówkę paskową, aż nicienie znajdą się na dnie probówki.
11. Umieść pasek w zamrażarce w temperaturze -80 °C do całkowitego zamrożenia (co najmniej 10 minut). Powtarzać kroki od 7.9 do 7.11, aż do momentu, gdy do wszystkich pasków zostaną dodane nicienie w celu lizy. Uporządkuj paski rur w kolejności numerycznej.
12. Wyjąć zestawy probówek paskowych i uruchomić program lizy w termocyklerze: 1 h w 60 °C, 15 min w 95 °C, trzymać w temperaturze 12 °C. Po zakończeniu programu lizy należy odwirowywać próbki w temperaturze 300 x g przez 15 s w temperaturze pokojowej i przechowywać lizaty w temperaturze -80 °C przez okres do 1 tygodnia.
13. Uporządkuj paski probówek w kolejności numerycznej za pomocą 96-dołkowych uchwytów na płytki i dołącz etykietę z numerem pudełka do proliferacji, zakresem numerów probówek paskowych, datą i inicjałami badacza. Zaktualizuj kolumny arkusza genotypowania "lysis_date" i "lysis_notes" o informacje z arkusza lizy.

8. PCR sekwencji SSU i ITS2

UWAGA: Ta sekcja zawiera instrukcje, jak wykonać dwa oddzielne PCR dla każdej zlizowanej płytki S. Pierwszy zestaw starterów amplifikuje 500-pz fragment genu małej podjednostki 18S rDNA (SSU); oECA1271 = starter do przodu TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = starter do tyłu CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA ¹². Ten PCR służy do sprawdzenia jakości matrycowego DNA. PCR amplifikuje region SSU dla prawie wszystkich gatunków nicieni. Jeśli SSU PCR nie zdoła się amplifikować, wynik ten sugeruje, że jakość lizy jest słaba i lizę należy powtórzyć dla tej płytki S. Drugi zestaw starterów amplifikuje fragment o długości 2,000 pz wewnętrznego transkrybowanego regionu dystansowego między genami 5,8S i 28S rDNA (ITS2); oECA1687 = starter do przodu CTGCGTTACTTACCACGAATTGCARAC, oECA202 = starter do przodu GCGGTATTTGCTACTACCAYYAMGATCTGC³. Produkt ITS2 PCR jest sekwencjonowany metodą Sangera, a sekwencja służy do identyfikacji nicieni z rodzaju Caenorhabditis na poziomie gatunku na podstawie podobieństwa sekwencji.

1. Użyj narzędzia filtrującego w arkuszu genotypowania, aby wyświetlić tylko znaczniki S, które mają być używane do PCR.
   1. Zaktualizuj kolumny pcr_plate_number i pcr_well w arkuszu genotypowania. Aby zapobiec degradacji materiału do lizy, PCR SSU i ITS2 są przeprowadzane w tym samym czasie.
   2. Użyj tej samej pcr_plate_number dla PCR ITS2 i SSU, mimo że są to oddzielne reakcje na oddzielnych płytkach. Będą one wyróżnione oznaczeniami "SSU" lub "ITS2".
2. Przypisz pcr_plate_number do ośmiu lub mniej probówek paskowych (jedna probówka paskowa na rząd 96-dołkowej płytki PCR, ułożona w porządku rosnącym, np. najniższy numer probówki paskowej na górze). Następnie przypisz pcr_plate_well do każdej etykiety S w tubkach paskowych.
   UWAGA: Rury paskowe są ułożone w porządku rosnącym, przy czym najniższy numer rury paskowej jest przypisany do rzędu A, a najwyższy numer w rzędzie H. Pozycja 1 wszystkich rur paskowych jest przypisana do kolumny 1. W związku z tym probówka paskowa nr 1, pozycja 1 zostanie przypisana do płytki PCR nr 1, studzienka A01.
3. Oznaczyć 96-dołkową płytkę (płytki) do PCR, aby pomieścić próbki, które zostaną użyte do PCR. Oznacz każdą płytkę PCR następującymi informacjami: nazwą projektu, typem PCR, numerem tabliczki PCR i datą PCR (np. 2020FebruaryAustralia_SSU_1_20200304). Oznacz również tabliczkę numerami rurek paskowych, które zostaną załadowane do każdego rzędu.
4. Wyjąć materiał do lizy z zamrażarki o temperaturze -80 °C i rozmrozić probówki paskowe zawierające materiał do lizy na lodzie. Podczas rozmrażania materiału do lizy przygotuj główne mieszanki ITS2 i SSU w oddzielnych probówkach na lodzie. Receptury PCR SSU i ITS2 znajdują się w tabeli uzupełniającej 2.
   UWAGA: Przygotuj 100 reakcji głównej mieszanki PCR dla każdej płytki 96-dołkowej, aby umożliwić błąd pipetowania. Użyj stożka o pojemności 15 ml lub 50 ml do przytrzymania mieszanki głównej, jeśli mają być używane duże objętości.
5. Delikatnie mieszaj mieszankę główną, aż Taq zostanie rozprowadzony w całej mieszance. Po wymieszaniu podwielokrotność 38 μl mieszanki wzorcowej należy umieścić w odpowiednich dołkach płytek PCR na lodzie. Użyj sterylnych, jednorazowych koryt z dnem w kształcie litery V i 12-dołkowej pipety wielokanałowej, aby przenieść mieszankę wzorcową na płytki PCR.
6. Zakręć rozmrożone probówki z paskiem do lizy, aby usunąć materiał do lizy z nakrętek. Ostrożnie zdejmij pokrywki ze wszystkich probówek z paskami, które zostaną załadowane do pierwszej płytki PCR. Użyj pipety wielokanałowej o małej objętości (12-dołkowej lub 8-dołkowej), aby dodać 2 μl lizatu do odpowiedniego dołka na płytce PCR. Delikatnie odpipetować lizat w górę i w dół raz przed wyjęciem 2 μl.
   UWAGA: Sprawdź końcówki, aby upewnić się, że zawierają lizę przed transferem. Pamiętaj, aby zmieniać wskazówki między wierszami lub kolumnami.
7. Przykryj płytkę PCR folią samoprzylepną do PCR i użyj wałka, aby uzyskać szczelne uszczelnienie. Po nałożeniu folii na krótko odwiruj płytki PCR w wirówce. Trzymaj płytkę na lodzie, aż będzie gotowa do pracy w termocyklerze.
8. Uruchom PCR z odpowiednim programem termocyklera. Szczegółowe informacje na temat programów SSU i ITS2 PCR można znaleźć w Tabeli Uzupełniającej 2.
9. Powtarzaj kroki 8.4-8.8, aż wszystkie PCR zostaną uruchomione.
10. Podczas trwania reakcji PCR wlej 100 ml 1,5% żelu agarozowego. Każdy żel będzie zawierał próbki lub pojedynczą płytkę PCR.
    1. Dodać 1,5 g agarozy do kolby o pojemności 500 ml, następnie dodać 100 ml 1x buforu TAE (tabela uzupełniająca 3) i mieszać do wymieszania. Kuchenka mikrofalowa do rozpuszczenia i schłodzenia żelu.
    2. Po schłodzeniu roztworu dodać 5 μl roztworu bromku etydyny o stężeniu 10 mg/ml i wymieszać do połączenia. Wlej roztwór do tacki odlewniczej z czterema 25-dołkowymi grzebieniami, tak aby żel mógł pomieścić 96 próbek oraz drabinkę dla każdego rzędu żelu.
       UWAGA: Bromek etydyny jest silnym mutagenem. Podczas pracy z bromkiem etydyny należy używać fartucha laboratoryjnego, rękawic odpornych na chemikalia i okularów ochrony chemicznej.
11. Tuż przed zakończeniem PCR dodaj 6x barwnika ładującego do jednorazowego koryta i użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 2 μl 6x barwnika ładującego do każdego dołka nowej 96-dołkowej płytki PCR. Ta płytka będzie używana do ładowania próbek do żelu. Zrób tyle tych płytek, aby pomieścić wszystkie próbki.
12. Po zakończeniu PCR wyjmij płytki PCR i krótko je odwiruj przy 300 x g przez 15 s w temperaturze pokojowej. Przechowuj płytki PCR na lodzie, aż produkty PCR będą mogły wypłynąć na żel.
    1. Aby wypuścić produkty na żel, użyj 12-dołkowej pipety wielokanałowej, aby dodać 5 μl każdej próbki do odpowiedniego dołka 96-dołkowej płytki zawierającej 2 μl 6-krotnego barwnika ładującego.
    2. Następnie załadować 6 μl tej mieszaniny do każdej studzienki niedawno odlanego żelu. Załaduj 6 μl 1 KB plus drabinkę do pierwszego dołka z każdego rzędu żelu.
       UWAGA: Aby napełnić dołki żelu, może być konieczne przeplatanie rzędów A i B z płytki PCR w pierwszym rzędzie żelu. Aby uniknąć nieporozumień, należy zapisać gel_number i gel_position w arkuszu genotypowania dla każdej próbki PCR.
13. Nałożyć nową foliową pokrywkę na pozostały PCR na płytce (płytkach) i przechowywać je w temperaturze 4 °C. Te produkty reakcji zostaną wykorzystane do sekwencjonowania w kroku 9.
14. Umieść produkty PCR na żelu pod napięciem 120 V przez 20 minut. Zobrazuj żel i zapisz, które znaczniki S dają produkty ITS2 i/lub SSU PCR w kolumnach "pcr_product_its2" i "prc_product_ssu" arkusza genotypowania. Oznacz obecność pasma za pomocą "1"; Zaznacz "0" dla braku pasma.

9. Identyfikacja nicieni za pomocą sekwencjonowania Sangera i sekwencji BLAST

UWAGA: Ta sekcja zawiera instrukcje dotyczące sekwencjonowania amplikonów ITS2 z etykiet S, dopasowywania tych sekwencji do bazy danych National Center for Biotechnology Information (NCBI) za pomocą algorytmu BLAST i analizowania wyników BLAST w celu identyfikacji nicieni na płytkach S.

1. Dla każdej próbki, która jest ITS2-dodatnia, należy użyć pozostałego produktu ITS2 PCR do sekwencjonowania Sangera przy użyciu startera przedniego oECA306 (CACTTTCAAGCAACCCGAC). Zorganizuj pliki wyjściowe sekwencjonowania tak, aby można je było łatwo połączyć z etykietą S, zapisując kolumny "sequencing_plate" i "sequencing_well" każdej etykiety S w arkuszu genotypowania.
2. Uzyskaj pliki wyjściowe .seq dla każdej etykiety S z platformy sekwencjonowania. Rozmieść pliki .seq dla projektu w jednym katalogu z plikami .seq dla każdej partii sekwencjonowania znajdującymi się w podkatalogach.
3. Otwórz narzędzie interfejsu wiersza poleceń i przejdź do górnego katalogu zawierającego pliki .seq, wpisując polecenie: cd . Jeśli jeszcze nie istnieje, utwórz scaloną FASTA dla wszystkich plików .seq, wprowadzając następujące polecenie: for dir in */; do cd $dir; for file in *.seq; do echo ">"$file; cat $file; done >>. /all_seqs.fa; płyta CD..; gotowe.
   UWAGA: Ten kod utworzy scalony plik FASTA o nazwie "all_seqs.fa" ze wszystkich plików .seq w katalogu projektu. Plik ten może być używany w internetowym narzędziu NCBI nucleotide BLAST w celu szybkiego dopasowania sekwencji ITS2 każdej etykiety S do bazy danych sekwencji NCBI.
4. W przeglądarce internetowej przejdź do witryny NBCI BLAST²⁰ i kliknij przycisk Wybierz plik. Wybierz plik all_seqs.fa, który właśnie został utworzony, a następnie kliknij przycisk Nieco podobne sekwencje (BLASTn). Kliknij przycisk BLAST u dołu strony, aby rozpocząć wyszukiwanie BLAST.
5. Zaktualizuj arkusz genotypowania o wyniki BLAST dla każdej etykiety S. Użyj narzędzia filtrującego, aby ułatwić aktualizację arkusza Google do genotypowania. Kliknij pozycję Dane > Utwórz filtr, aby dodać przycisk filtru do każdego nagłówka kolumny. Przefiltruj kolumnę sequencing_plate, aby wybrać płytki sekwencjonowania, które mają zostać zaktualizowane o wyniki BLAST.
6. Użyj menu rozwijanego na stronie wyników NCBI BLAST, aby sprawdzić wyniki dla każdej sekwencji ITS2 płytki S (Rysunek 6).
7. Sprawdź, czy nie ma trafień BLAST. Identyfikator sekwencji na liście rozwijanej poprzedzony znakiem * nie ma trafień wybuchu. W przypadku tych etykiet S w kolumnie manual_blast_notes arkusza genotypowania należy wpisać "brak trafienia .
8. Sprawdź, czy nie ma możliwego nowego gatunku Caenorhabditis. Kliknij link w górnym trafieniu, aby wyświetlić wyrównanie (Rysunek 6). Jeśli najwyższym trafieniem jest (1) gatunek Caenorhabditis, (2) wyrównanie zawiera więcej niż pięć niezgodności w środku sekwencji i (3) pokrycie zapytania jest większe niż 50%, wynik ten sugeruje, że izolat może być nowym gatunkiem Caenorhabditis (Rysunek 7). Dla tych tabliczek S należy wpisać gatunek najwyższego trafienia BLAST w kolumnie "species_id", w kolumnie "possible_new_caeno_sp" wprowadzić cyfrę 1, a w kolumnie "manual_blast_notes" "możliwe nowe Caeno sp." wraz z procentem identyczności (np. "możliwa nowa tożsamość Caeno sp. 89%").
9. W przypadku sekwencji na płytce S, które WYBUCHAJĄ do gatunku Caenorhabditis, wprowadź pełną nazwę rodzaju i gatunku najwyższego trafienia BLAST w kolumnie "species_id". Na przykład "Caenorhabditis elegans".
10. W przypadku sekwencji S-plate, które BLAST do gatunku innego niż Caenorhabditis, należy wprowadzić tylko rodzaj najwyższego trafienia BLAST, a następnie "sp." w kolumnie "species_id". Ten zapis oznacza, że izolat jest nieznanym gatunkiem w obrębie nazwanego rodzaju. Na przykład 'Oscheius sp.'.
    UWAGA: Sekwencja ITS2 nie może być używana do wiarygodnej identyfikacji izolatów na poziomie gatunku poza rodzajem Caenorhabditis^3,13.
11. W kolumnie "make_strain_name" arkusza genotypowania wpisać 1, jeżeli "species_id" = "Caenorhabditis elegans", "Caenorhabditis briggsae" lub "Caenorhabditis tropicalis" LUB "possible_new_caeno_sp" = 1.
12. Nazwij szczepy unikalnymi nazwami zgodnie z konwencjami nomenklatury Caenorhabditis, tj. unikalnym oznaczeniem laboratoryjnym składającym się z 2-3 wielkich liter, po których następuje numer dla każdego unikalnego szczepu²³. Wprowadź nazwy szczepów w kolumnie "strain_name".
13. Po nazwaniu szczepów można je kriokonserwować przy użyciu ustalonych protokołów ²⁴.

10. Przetwarzanie danych kolekcji za pomocą pakietu easyFulcrum w R

UWAGA: Ten krok opisuje, jak połączyć ze sobą dane kolekcji (etykiety C) i dane izolacji nicieni (etykiety S) za pomocą pakietu easyFulcrum R. Oprogramowanie zawiera funkcje, które dodatkowo połączą dane Fulcrum z danymi genotypowania z arkusza genotypowania, tak aby tożsamości gatunków i nazwy szczepów z etykietą S były zorganizowane w jednej ramce danych.

1. Utwórz nowy katalog o nazwie odpowiadającej projektowi kolekcji. Ułóż strukturę folderów w katalogu tak, aby odpowiadała wymaganiom opisanym w pakiecie języka R easyFulcrum¹⁵.
2. Przejdź do witryny Fulcrum i zaloguj się. Wyeksportuj surowe dane projektu z bazy danych Fulcrum za pomocą narzędzia do eksportu danych na stronie internetowej Fulcrum po lewej stronie i zaznacz następujące pola wyboru: projekt, dołącz zdjęcia, dołącz dane GPS, pobieranie próbek w terenie i izolacja.
   UWAGA: Dane punktu podparcia dla projektu zostaną wyeksportowane jako pięć plików z wartościami rozdzielanymi przecinkami (.csv). Kompletne dane projektu zostaną połączone w jedną ramkę danych za pomocą pakietu easyFulcrum w języku R.
3. Przenieś pięć .csv plików wyeksportowanych z Fulcrum do katalogu projektu utworzonego w kroku 10.1 zgodnie z instrukcjami w easyFulcrum vignette²¹.
4. Otwórz sesję Rstudio i zainstaluj pakiet easyfulcrum w języku R, wprowadzając następujące polecenia w konsoli języka R: "install.packages("devtools")" i "devtools::install_github("AndersenLab/easyfulcrum")".
5. Otwórz nowy skrypt języka R i postępuj zgodnie ze wskazówkami w winiecie easyfulcrum, aby przetworzyć dane kolekcji²¹.

Wyniki

Niniejszy protokół był wykorzystywany do pobierania nicieni z rodzaju Caenorhabditis z wielu lokalizacji, w tym z Hawajów i Kalifornii. Skuteczność izolacji nicieni Caenorhabditis różni się w zależności od miejsca poboru, klimatu, doświadczenia w pobieraniu próbek oraz analizowanych rodzajów podłoża. Protokół ten służył do szeroko zakrojonego próbkowania na wyspach Hawajów, gdzie w ciągu wielu lat i pór roku przeprowadzono dziewięć projektów kolekcjonerskich. Skuteczność izolacji samozapylnych gatunków Caenorhabditis jest niemal identyczna dla C. briggsae (162 z 4 506 próbek, 3,6%) i C. elegans (163 z 4 506 próbek, 3,6%), a znacznie niższa dla C. tropicalis (26 z 4 506 próbek, 0,58%)⁸. Każdy z samozapylnych gatunków jest bardziej liczny w podłożach z gnijących owoców i kwiatów w porównaniu do innych kategorii podłoży. Należy pobierać próbki z gnijących owoców i kwiatów, jeśli badacz dąży do maksymalizacji skuteczności izolacji, a nie do charakterystyki preferencji podłoża. Należy jednak pamiętać, że skuteczność zależy od jakości wybranego podłoża. Na przykład wśród podłoży z owoców i kwiatów te, które są zbyt suche, mokre lub świeże, prawdopodobnie nie dostarczą nicieni Caenorhabditis.

Skalowalność tego protokołu pobierania jest widoczna w liczbie próbek, które pojedyncza para badaczy może zebrać z terenu. Przykładowo, w październiku 2018 roku para badaczy stosująca ten protokół była w stanie zebrać łącznie ponad 1 000 próbek w ciągu 7 dni z wielu lokalizacji na dwóch hawajskich wyspach. Zespół terenowy wysłał próbki nocnym transportem do laboratorium, gdzie zespół ośmiu badaczy izolował ponad 2 000 nicieni z próbek na bieżąco po ich otrzymaniu. Kluczową zaletą tego protokołu jest minimalizacja kosztów związanych z pobieraniem próbek w odległych lokalizacjach poprzez ograniczenie ilości sprzętu i personelu wymaganego w terenie. Dzięki zastosowaniu tego protokołu niewielki zespół terenowy może skupić się na pobieraniu próbek, podczas gdy zespół izolujący może przetwarzać je w swojej macierzystej instytucji, korzystając z delikatnego i ciężkiego sprzętu, takiego jak mikroskopy stereoskopowe i płytki agarowe do izolacji nicieni. Ponadto wdrożenie mobilnej aplikacji do zbierania danych pozwala na bezpośrednie powiązanie wszystkich danych terenowych związanych z próbkami z etykietą C, co umożliwia zespołowi izolującemu niezależną od zespołu terenowego pracę podczas przetwarzania próbek.

Badacze stosujący ten protokół pobierania próbek muszą wziąć pod uwagę nakład pracy wymagany do izolacji nicieni przed rozpoczęciem projektu kolekcjonerskiego. Etapy izolacji i identyfikacji są etapami ograniczającymi szybkość procesu, a niewielki zespół pobierający próbki może szybko przeciążyć osoby odpowiedzialne za izolację liczbą próbek. Co więcej, przestrzeń laboratoryjna niezbędna do przetworzenia wielu kolekcji może kolidować z prowadzonymi badaniami (Rysunek 3). Ponadto niektóre izolowane nicienie wymagają dodatkowego nakładu pracy w celu genotypowania. Na przykład około 2% izolatów nie ulega amplifikacji przy użyciu zestawu starterów SSU PCR po pierwszej próbie lizy i musi zostać poddanych ponownej lizie, aby upewnić się, że materiał po lizie nadaje się do amplifikacji z zestawem starterów ITS2 (Rysunek 8). Ponadto około 3% izolatów nie daje wysokiej jakości sekwencji po pierwszej rundzie sekwencjonowania metodą Sangera. W przypadku tych izolatów często wymagana jest kolejna runda lizy, PCR ITS2 oraz sekwencjonowania metodą Sangera, co może zwiększyć czas pracy zespołu izolacyjnego. Co ważne, sama tożsamość sekwencji nie jest wystarczającym dowodem do uzasadnienia uznania gatunku za nowy gatunek Caenorhabditis (Rysunek 7). Aby właściwie uzasadnić uznanie izolatu za nowy gatunek Caenorhabditis, należy podjąć dodatkowe starania w celu przeprowadzenia eksperymentów krzyżowych i ustanowienia okazu typowego¹³. Preferowany, choć nie jest wymagany, jest również formalny opis morfologiczny okazu typowego³. Wszystkie te rozważania sugerują, że badacze przyjmujący ten protokół pobierania próbek skorzystają z testów próbnych etapów izolacji i identyfikacji, aby upewnić się, że zasoby zostały właściwie przydzielone przed rozpoczęciem projektu kolekcjonerskiego. Co istotne, nawet niewielkie projekty kolekcjonerskie mogą odnieść korzyści z tego protokołu, ponieważ proces ten jest wysoce powtarzalny, a dane mogą być łatwo audytowane w celach kontroli jakości pomiędzy grupami laboratoryjnymi.

Rycina 1: Przykłady podłoża. (A) W centrum obrazu pokazano idealnie zgniły owoc (1), który jest niemal nierozpoznawalny. Obok widoczny jest owoc w mniejszym stopniu rozłożony; należy unikać pobierania próbek ze świeżo opadłych owoców (2). (B) Na górze pokazano idealnie rozłożony kwiat (3). Należy unikać pobierania próbek ze świeżo opadłych kwiatów (4). (C) Ciemna ściółka liściowa pod górną warstwą suchych liści jest idealna podczas pobierania próbek w poszukiwaniu samookreślających się nicieni Caenorhabditis (5). Należy unikać pobierania próbek z suchej ściółki liściowej (6). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 2: Mobilna aplikacja Nematode Field Sampling. (A) Ekran początkowy po otwarciu aplikacji Nematode Field Sampling na urządzeniu Apple w programie Fulcrum. Czerwona strzałka w prawym dolnym rogu wskazuje przycisk + służący do tworzenia nowego rekordu pobierania. (B) Przykład nowego rekordu pobierania wyświetlonego na urządzeniu Apple. Czerwona strzałka wskazuje pole „Project” u góry ekranu rekordu pobierania. Podczas pobierania próbek w terenie należy upewnić się, że wybrano właściwy projekt. Pole projektu będzie domyślnie ustawione na ostatnio używany projekt podczas tworzenia kolejnych rekordów pobierania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Worki do pobierania i płytki do pobierania zorganizowane przed wysiewaniem próbek.Na tym rysunku po lewej stronie widoczne są próbki w workach do pobierania oznaczonych literą C. Każdy worek do pobierania ma przypisaną odpowiadającą mu płytkę 10 cm również oznaczoną literą C, znajdującą się na górze. Po prawej stronie znajdują się płytki do pobierania 10 cm zawierające materiał z próbek po przeniesieniu go z worków do pobierania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Płytka kolekcjonerska (płytka C) z prawidłowo przeniesioną próbką. 10 cm płytka C z rozkładającymi się owocami umieszczonymi na krawędzi trawnika bakteryjnego. Do pokrywki płytki przytwierdzona jest etykieta C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Mobilna aplikacja do izolacji nicieni. (A) Ekran wyboru aplikacji w mobilnej aplikacji Fulcrum. Czerwona strzałka wskazuje aplikację Nematode Isolation. (B) Ekran początkowy po otwarciu aplikacji Nematode Isolation na urządzeniu Apple w systemie Fulcrum. Czerwona strzałka w prawym dolnym rogu wskazuje przycisk + służący do tworzenia nowego rekordu izolacji. (C) Przykład nowego rekordu izolacji wyświetlonego na urządzeniu Apple. Czerwona strzałka wskazuje pole „Project” na górze ekranu rekordu izolacji. Należy upewnić się, że podczas izolacji wybrano właściwy projekt. Pole projektu domyślnie będzie wskazywać ostatni użyty projekt przy tworzeniu kolejnych rekordów izolacji. (D) Po dotknięciu pola Select pod etykietą C, użytkownicy dotykają przycisku wyszukiwania (czerwona strzałka), aby znaleźć etykietę C, z której izolują nicienie. (E) Po wybraniu etykiety C, użytkownicy fotografują płytkę C za pomocą aparatu w urządzeniu. (F) Następnie użytkownicy wprowadzają informację, czy na płytce C znajdują się nicienie. Jeśli istnieją nicienie do wyizolowania, do rekordu izolacji dodawane są etykiety S. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Strona wyników NCBI BLAST. (1) Menu rozwijane służące do wyświetlania wyników BLAST dla wszystkich sekwencji. (2) Opis aktualnie wybranej sekwencji z menu rozwijanego. W tym przypadku pokazano wyniki dla etykiety S-05554. (3) Pokazano najlepsze dopasowanie BLAST dla S-05554. Fioletowy tekst wskazuje, że kliknięto łącze do wizualizacji tego dopasowania. Należy dokładnie sprawdzić dopasowania wzrokowo w celu zidentyfikowania potencjalnie nowych gatunków Caenorhabditis, patrz krok 9.8 powyżej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 7: Przykłady wizualizacji dopasowania NCBI BLAST. (A) Przykład sekwencji zapytania ITS2 izolatu dopasowanej do sekwencji obiektu C. kamaaina. (1) Procent tożsamości dopasowania (89%), który jest niski dla najlepszego trafienia w BLAST. (2) Niedopasowanie między sekwencją zapytania a sekwencją obiektu (G na A). (3) Luka o długości czterech par zasad w sekwencji obiektu utworzona przez algorytm dopasowania; luki w zapytaniu lub obiekcie wskazują na słabe dopasowanie. (4) Uogólniony region w centrum dopasowania z wieloma niedopasowaniami i lukami. Region tego typu sugeruje, że sekwencja zapytania może pochodzić od nowego gatunku Caenorhabditis. Przedstawiono rzeczywisty przykład dopasowania nowego gatunku, C. oiwi, odkrytego w 2017 roku. (B) Przykład dobrego dopasowania między sekwencją zapytania ITS2 izolatu a sekwencją obiektu. (5) Procent tożsamości dopasowania (99%), co zazwyczaj oznacza, że sekwencja zapytania pochodzi od izolatu tego samego gatunku co obiekt. (6) Centralny region dopasowania z idealną tożsamością. Region tego typu sugeruje, że izolat zapytania prawdopodobnie należy do tego samego gatunku co obiekt. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 8: Produkty PCR SSU i ITS2. Górny żel przedstawia produkty PCR uzyskane przy użyciu zestawu starterów SSU dla 12 reprezentatywnych próbek. Po lewej stronie, w celach referencyjnych, naniesiono drabinę DNA. Produkty PCR SSU dla nicieni Caenorhabditis mają długość około 500 bp. Próbki 2-12 uległy amplifikacji z zestawem starterów SSU, natomiast próbka pierwsza nie. Brak amplikonu SSU o długości 500 bp dla próbki pierwszej sugeruje, że materiał po lizie był słabej jakości i próbka musi zostać poddana ponownej lizie. Dolny żel przedstawia produkty PCR uzyskane przy użyciu zestawu starterów ITS2 dla tych samych 12 próbek, które widnieją na górnym żelu. Drabina i próbki znajdują się w tej samej orientacji na obu żelach. Sześć z 12 próbek nie uległo amplifikacji z zestawem starterów ITS2. Próbki z prążkami SSU i ITS2 zostały poddane sekwencjonowaniu metodą Sangera i zidentyfikowane na podstawie podobieństwa sekwencji przy użyciu algorytmu NCBI BLAST. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Plik uzupełniający 1: Etykiety C. Plik PDF zawierający 2500 unikalnych etykiet C. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Etykiety S. Plik PDF zawierający 5000 unikalnych etykiet S. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Materiały terenowe. Lista pakowa materiałów używanych w terenie do pobierania próbek nicieni. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 2: Składy mieszanin PCR i warunki termocyklerowe. Tabela zawierająca składy mieszanin PCR i warunki termocyklerowe dla PCR regionów ITS2 oraz SSU. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 3: Przepisy na bufory do elektroforezy. Przepis na 0,5 M roztwór kwasu etylendiaminotetraoctowego (EDTA) o pH 8,0 oraz roztwór buforu TRIS-octan-EDTA (TAE). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Ten protokół zawiera krytyczne kroki, które należy wykonywać z ostrożnością. Na przykład ważne jest, aby zespoły terenowe i izolacyjne starannie wybrały odpowiedni projekt pobierania w aplikacji przed pobraniem próbek z terenu lub wyizolowaniem nicieni z próbek w laboratorium. W przypadku wybrania niewłaściwego projektu windykacji, błędne rekordy danych najlepiej poprawić w bazie danych Fulcrum za pomocą narzędzi do edycji rekordów online. Ten proces może być żmudny w przypadku wielu zagubionych rekordów. Jednak baza danych zachowuje wszelkie zmiany w rekordach, dzięki czemu możliwa jest pełna inspekcja rekordów kolekcji i izolacji. Inne krytyczne etapy tego protokołu obejmują obchodzenie się z próbkami z terenu i nicieniami wyizolowanymi z tych próbek. Aby zapewnić przetrwanie nicieni Caenorhabditis na etapie pobierania próbek i transportu, temperatura próbek powinna być utrzymywana w zakresie od 4 °C do 25 °C. Temperatury powyżej 25 °C mogą powodować bezpłodność C. elegans¹⁴. Upewnij się, że próbki są przenoszone z worków do pobierania na płytki w ciągu pięciu dni, gdy tylko jest to możliwe, aby zminimalizować straty nicieni. Po wyizolowaniu nicieni bardzo ważne jest, aby zostały one zgenotypowane i kriokonserwowane, zanim zginą. Trudno jest znaleźć żywe nicienie na płytkach S, które mają więcej niż dwa do trzech tygodni, ponieważ zanieczyszczenie grzybami i bakteriami może sprawić, że płytki S staną się niegościnne.

Protokół ten można łatwo modyfikować, aby uwzględnić różne typy danych, które badacze mogą chcieć zbierać w terenie. Na przykład, łatwo jest dostosować aplikację "Próbkowanie pól nicieni" za pomocą nowych pól wprowadzania danych za pomocą internetowego interfejsu użytkownika Fulcrum do edycji aplikacji. Co więcej, pakiet do analizy danych, easyFulcrum, może dostosować się do tych zmian podczas przetwarzania nowych danych¹⁵. Inną modyfikacją, która może być atrakcyjna dla użytkowników, jest użycie innej metody pobierania próbek w terenie. Zamiast pobierać próbki z dyskretnych substratów, badacze mogą chcieć pobrać próbki z większych obszarów zawierających wiele typów substratów. Te większe próbki najlepiej przetwarzać w laboratorium przy użyciu metod ekstrakcji lejkowej lub tacowej^{Baermanna 13}. Co ważne, stosowanie etykiet C i S nadal ma zastosowanie do tych technik i dlatego są one kompatybilne z aplikacjami mobilnymi.

Podstawowe ograniczenia tego protokołu dotyczą czasu postępowania z nicieniami przed izolacją w laboratorium. Po pierwsze, czas opóźnienia między pobraniem próbki a izolacją nicieni uniemożliwia zarejestrowanie etapów rozwojowych nicieni na danej próbce w momencie pobrania. Po drugie, częstotliwość występowania samców i krzyżowanie się w naturze są kluczowymi kwestiami ewolucyjnymi dla samodzielności nicieni Caenorhabditis ¹⁰. Ta metoda nie jest dobrze dopasowana do odpowiedzi na te pytania, ponieważ nicienie prawdopodobnie przeszły przez wiele pokoleń przed izolacją. Opóźniona izolacja oznacza, że bezpośrednie dowody na występowanie samców w przyrodzie są niemożliwe. Co więcej, wielopokoleniowe opóźnienie na etapach genotypowania oznacza, że genomowe dowody krzyżowania (heterozygotyczność) zostaną zerodowane, zanim będzie można zsekwencjonować szczep nicienia. Aby zidentyfikować heterozygotyczność w przyrodzie, do sekwencjonowania wykorzystuje się potomstwo wyprodukowane przez nicienie bezpośrednio odizolowane od natury². Innym potencjalnym ograniczeniem tego protokołu jest to, że jest on stronniczy w kierunku identyfikacji samoistnego Caenorhabditis. Dzieje się tak, ponieważ izolowane nicienie gatunków samozaszczepiających mają większą szansę na rozmnażanie się niż obowiązkowe krzyżówki, które będą się rozmnażać tylko wtedy, gdy zapłodniona samica zostanie odizolowana.

Ta metoda zbierania opiera się na istniejących protokołach zbiórki^13,14. Głównym osiągnięciem tej techniki jest wykorzystanie technologii mobilnej i dostosowanego oprogramowania w celu ułatwienia organizacji ogromnych ilości danych ekologicznych i molekularnych związanych z projektami gromadzenia na dużą skalę. Dane ekologiczne wygenerowane za pomocą tego protokołu gromadzenia mogą być wykorzystane do odpowiedzi na nierozstrzygnięte kwestie dotyczące naturalnych populacji gatunków Caenorhabditis. Na przykład dane wygenerowane tą metodą zostały wykorzystane do odkrycia niszowych preferencji dla tego gatunku na Wyspach Hawajskich. Co więcej, sekwencjonując genomy nicieni krioprezerwowanych, naukowcy mogą zbadać, w jaki sposób wzorce zmienności genetycznej są skorelowane z danymi ekologicznymi. Badania tego rodzaju mogą odkryć oznaki lokalnej adaptacji w populacjach Caenorhabditis i dostarczyć ważnych informacji na temat znaczenia zmienności genetycznej w kontekstach naturalnych⁸. Aby uzyskać funkcjonalne zrozumienie wielu genów nicieni Caenorhabditis, prawdopodobnie konieczne będą badania ekologiczne¹¹. Nawet w przypadku C. elegans duża część genów nie ma funkcjonalnych adnotacji, mimo że jest to pierwsze zwierzę wielokomórkowe, które zostało zsekwencjonowane i jedno z najdokładniej przebadanych zwierząt na Ziemi. Niniejszy protokół zbierania został opracowany, aby pomóc wypełnić tę lukę w wiedzy poprzez ułatwienie zbierania dzikich nicieni Caenorhabditis oraz badania ich ekologii i naturalnej różnorodności genetycznej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Etykiety samoprzylepne	Avery	61533	Drukowanie etykiet C i etykiet
S Agarose	Thomas Scientific	C748D75	przygotowanie żelu agarozowego
Plecak			Plecak dla każdego członka zespołu do przechowywania sprzętu, próbek, jedzenia i wody na cały dzień.
Pudełka kartonowe	Fisher Scientific	AS261	Przechowywanie płytek S
Wirówka	NA	NA	Liza neamtody, SSU i ITS2 PCR
Worki zbiorcze	Zip-lock	NA	Kolekcja podłoży
Cyfrowy miernik temperatury/wilgotności	Preciva	HT-86	Pomiar temperatury i wilgotności otoczenia
Luneta sekcyjna	NA	NA	Izolacja nicieni, liza
Zbiorniki jednorazowego	USA Scientific	1306-1010	Porcjowanie głównych mieszanek PCR i ładowanie drabinki DNA barwnika
, 1 KB plus	Thermo Scientific	SM0243	Wizualizacja produktów SSU i ITS2 PCR
dNTPs	Thomas Scientific	CB4430-2	PCR master mix component
easyFulcrum R pakiet	NA	NA NA	Pakiet R do przetwarzania danych o pobieraniu http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html
roztworu EDTA (0,5 M pH 8,0)	NA	NA	Patrz tabela uzupełniająca 3, aby zapoznać się z przepisem
Etanol (95%)	NA		NA Posiewanie próbek, sterylizacja łyżką
Roztwór bromku etydyny (10 mg/ml)	VWR	97064-602	Wizualizacja produktów
PCR SSU i ITS2Zewnętrzna ładowarka do urządzeń mobilnych	NA	NA	Zewnętrzna ładowarka i ładujący do iPhone'a lub Androida
Kolba (500 mL)	Fisher Scientific	FB501500	preparat żelu agarozowego
Żywność	NA		NA Zapakuj odpowiednio
Aparatura do elektroforezy żelowej	Thermo Scientific	B2	Wizualizacja produktów SSU i ITS2 PCR
Żel Zasilacz do elektroforezy	BioRad	1645050	Wizualizacja produktów SSU i ITS2 PCR
Barwnik w żelu, 6x	NEB	B7022S	Wizualizacja produktów do PCR SSU i ITS2
Zestaw starterów ITS2	NA	NA	oECA1687 = starter do przodu CTGCGTTACTTACCACGAATTG CARAC, oECA202 = starter odwrotny GCGGTATTTGCTACTACCAYYAM GATCTGC
Starter sekwencjonowania ITS2	NA	NA	oECA306 = starter do przodu CACTTTCAAGCAACCCGAC
Bufor do lizy	NA	NA	Liza nicieni, patrz protokół dla przepisu
Kuchenka mikrofalowa	NA	NA	przygotowanie żelu agarozowego
Urządzenie mobilne	NA	NA	Naładowany telefon w trybie samolotowym. Pozycje GPS w aplikacji Fulcrum są niedokładne w porównaniu z pozycjami GPS wyodrębnionymi ze zdjęć. To ustawienie zapewnia mniejsze zużycie energii i dokładniejsze pomiary GPS.
Płytki NGMA, 10 cm	Fisher Scientific	FB0875713	C-plates, patrz Andersen et al. 2014 dla protokołu płytki NGMA.
Płytki NGMA, 3,5 cm	Greiner Bio-One	5662-7102Q	S-plates, patrz Andersen et al. 2014 dla protokołu płytki NGMA.
Bezdotykowy termometr na podczerwień	Etekcity	B00837ZGRY	Pomiar temperatury podłoża
Ręczniki papierowe	NA	NA	Ręczniki papierowe do pochłaniania nadmiaru wilgoci w próbce zapakowanej w worki.
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12
Folia samoprzylepna do PCR	VWR	60941-126	Folia samoprzylepna do PCR
Bufor PCR (10x)	Thomas Scientific	CB3702-7	Płytki PCR do PCR z mieszanką mieszaną (
96-dołkowa)	Thomas Scientific	1149K04	Ołówek do PCR SSU i ITS2
	NA	NA
Łyżki plastikowe	NA		NA Pobieranie próbek
Platynowy pick	NA	NA	Izolacja nicieni, liza
Wstępnie oznakowane torby do zbierania strunowego	NA	NA Pakiety	plastikowych torebek z zamkiem błyskawicznym wstępnie oznaczone kodami kreskowymi C-label. Każda paczka powinna zawierać 25 torebek z kodami kreskowymi owiniętych gumką recepturki.
Proteinaza K	Sigma	3115879001	Liza nicieni, dodana do bufora do lizy tuż przed użyciem
Oprogramowanie R	NA		NA Oprogramowanie R: Język i środowisko do obliczeń statystycznych https://www.R-project.org/
Miękka torba chłodząca i okład z lodu	Chłodziarki i wkłady chłodzące NA NA Collection, aby utrzymać próbki w chłodzie, gdy temperatura otoczenia przekracza 25 stopni Celsjusza.
Zapasowe baterie	NA	NA	Dodatkowe baterie do sprzętu do pobierania próbek
Zestaw starterów SSU	NA	NIE OECA1271 = starter do przodu TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = starter wsteczny CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA
Nasadki do probówek paskowych (12-dołkowe)	Thomas Scientific	1159V29	lizy nicieni
(12-dołkowe)	Thomas Scientific	1159V31	Liza nicieni
Bufor TAE (1x)	NA	NA	Wizualizacja produktów PCR SSU i ITS2. Zobacz tabelę uzupełniającą 3, aby zapoznać się z przepisem
Polimeraza Taq	Thomas Scientific	C775Y45	Składnik mieszanki głównej PCR
Termocykler	NA	NA	Liza neamtody, SSU i ITS2 PCR
Woda	NA	NA	Opakowanie odpowiednio

użytku do uszczelniania płytek Probówki paskowe do