Wysoce skalowalne podejście do przeprowadzania badań ekologicznych nicieni Caenorhabditis

Ostatnie dwie dekady przyniosły wzrost zainteresowania ekologią nicieni Caenorhabditis. Z tych badań wiemy, że wolno żyjące gatunki Caenorhabditis mogą być izolowane z efemerycznych mikrosiedlisk zarówno w regionach umiarkowanych, jak i tropikalnych, gdzie żywią się zakwitami mikrobiologicznymi związanymi z rozkładającym się materiałem roślinnym, czasami w sympatrii1^,2,3,4,5^,6,7,8. Dowiedzieliśmy się również, że zbieżna ewolucja samozapłodnienia wystąpiła w rodzaju trzykrotnie, a samozapłodnienie jest dominującym sposobem rozmnażania C. briggsae, C. elegans i C. tropicalis^9,10. Wśród tych osobników C. elegans jest jednym z najczęściej badanych zwierząt na Ziemi i został wykorzystany przez naukowców do dokonania krytycznych postępów w biologii. Co ważne, inne gatunki Caenorhabditis mają wiele wspólnych zalet eksperymentalnych C. elegans i szybko się naprzód w badaniach porównawczych nad tym rodzajem. Jednak tajemnicza natura tych nicieni żyjących na wolności utrudnia badanie ich ekologii i naturalnej różnorodności, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia biologicznych funkcji ich genów i sposobów, w jakie ewolucja ukształtowała różnorodność genetyczną wśród gatunków^10,11.

Największym wyzwaniem dla badania ekologii nicieni Caenorhabditis na wolności jest ich mały rozmiar; dorosłe nicienie często mają 1 mm długości lub mniej. Wyzwanie to wymaga, aby naukowcy pobrali próbki substratów ze środowiska naturalnego i podjęli próbę oddzielenia interesujących nicieni od substratów w laboratorium bez możliwości obserwacji zwierząt na wolności. Ponieważ nawet wyszkoleni eksperci mają trudności z odróżnieniem nicieni Caenorhabditis od innych wolno żyjących nicieni pod mikroskopem, nicienie są zwykle usuwane z podłoża, izolowane i pozostawiane do namnażania się, zanim zostaną zidentyfikowane na podstawie tożsamości sekwencji przy użyciu ustalonych molekularnych kodów kreskowych^3,12,13,14. Czas i wysiłek wymagany do przetworzenia każdego nicienia w ten sposób stanowi wyzwanie organizacyjne, ponieważ naukowcy muszą być w stanie prześledzić tożsamość każdego nicienia wyizolowanego w laboratorium z powrotem do dokładnego substratu i powiązanych danych ekologicznych pobranych w terenie. W tym miejscu opisujemy krok po kroku proces skutecznego zbierania i identyfikowania samozaszczepiających się nicieni Caenorhabditis w terenie i wiernego łączenia tych izolatów z powiązanymi z nimi danymi przestrzennymi i ekologicznymi na dużą skalę.

Ta metoda zbierania zwiększa skalę i dokładność badań ekologicznych dzięki wykorzystaniu mobilnych platform zbierania danych, baz danych w chmurze i środowiska oprogramowania R. Fulcrum to konfigurowalna platforma gromadzenia danych, która współpracuje z większością urządzeń mobilnych i umożliwia użytkownikom tworzenie niestandardowych aplikacji do gromadzenia i organizowania danych opartych na lokalizacji (https://www.fulcrumapp.com). Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z niestandardowych aplikacji do gromadzenia danych w celu organizowania przestrzennie wyraźnych danych ekologicznych z terenu i dokładnego powiązania tych danych z tożsamością nicieni wyizolowanych w laboratorium. Protokół wyjaśnia również, jak skutecznie identyfikować nicienie Caenorhabditis za pomocą ustalonych molekularnych kodów kreskowych. Dane z tych metod mogą być przetwarzane w prosty i powtarzalny sposób za pomocą dołączonego pakietu oprogramowania R easyFulcrum¹⁵ w celu zbadania ekologii i różnorodności genetycznej naturalnych populacji Caenorhabditis.

1. Przygotowanie kolekcji

1. Zidentyfikuj lokalizację do zbadania nicieni Caenorhabditis.
   UWAGA: W większości regionów o klimacie umiarkowanym C. elegans i C. briggsae można łatwo wyizolować z siedlisk związanych z działalnością człowieka, takich jak pola uprawne lub ogrody wiejskie i miejskie¹. W regionach subtropikalnych i tropikalnych C. briggsae, C. elegans i C. tropicalis można znaleźć w siedliskach związanych z człowiekiem wymienionych powyżej, czasami w bliskiej odległości od siebie. Jednak C. elegans wydaje się preferować chłodniejsze, bardziej suche siedliska niż inne gatunki w siedliskach tropikalnych^7,8. Każdy z gatunków można również wyizolować z dzikich siedlisk, które nie są związane z ludźmi, ale te siedliska są rzadziej pobierane próbki.
2. Utwórz projekt Fulcrum, aby uporządkować zbieranie i izolowanie danych za pomocą mobilnych aplikacji do zbierania danych.
   1. Utwórz konto w Fulcrum online, korzystając z bezpłatnej umowy edukacyjnej¹⁶. Dodaj aplikację Nematode Field Sampling do konta Fulcrum, klikając przycisk DODAJ APLIKACJĘ¹⁷.
   2. Dodaj aplikację Izolacja Nicieni do konta, klikając przycisk DODAJ APLIKACJĘ¹⁸.
      UWAGA: Zaleca się, aby każda podróż do lokalizacji była organizowana jako projekt kolekcji przy użyciu konwencji nazewnictwa "YearMonthLocation", np. 2020FebruaryAustralia.
3. Dodaj użytkowników do konta Fulcrum, aby przyznać im dostęp do projektu kolekcji. Upewnij się, że każdy użytkownik pobrał aplikację mobilną Fulcrum, aby wziąć udział w projekcie.
4. Wydrukuj zestaw etykiet z kodami QR, aby śledzić kolekcje (etykiety C) i izolacje nicieni (etykiety S) za pomocą aplikacji mobilnej. Przymocuj etykiety C do plastikowych toreb z zamkiem błyskawicznym, zwiń oznaczone torby w grupy po 25 sztuk i owiń je gumką do pakowania. Zachowaj zestaw etykiet S do użytku w laboratorium.
   UWAGA: W całym tym protokole zbiory (substraty z terenu) znajdują się w workach lub na płytkach i są oznaczone etykietami C. Wyizolowane nicienie są oznaczone etykietami S. Etykiety C służą do identyfikacji unikalnych kolekcji, a etykiety S służą do identyfikacji unikalnych izolatów nicieni. Te dwa typy etykiet są używane do tworzenia połączenia między określoną kolekcją (etykieta C) a nicieniami wyizolowanymi z tej kolekcji (etykiety S) w bazie danych Fulcrum. Wydrukuj dwa razy więcej etykiet S niż etykiet C dla projektu zbiórki, ponieważ średnio dwa nicienie są izolowane w jednej kolekcji. W razie potrzeby można wydrukować więcej etykiet S później. W suplemencie znajduje się 2 500 unikalnych etykiet C (plik uzupełniający 1) i 5 000 unikalnych etykiet S (plik uzupełniający 2).
5. Przygotuj 10 cm płytki NGMA do zbierania i 3,5 cm płytki NGMA do izolowania nicieni. Zrób jedną płytkę o średnicy 10 cm i co najmniej dwie płytki o średnicy 3,5 cm na kolekcję²¹. Płytki te są wysiewane szczepem Escherichia coli OP50 zgodnie z ustalonymi protokołami. Płytki należy przechowywać przed użyciem w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 1 miesiąc.

2. Kolekcja pól

UWAGA: Nicienie Caenorhabditis są najczęściej izolowane z gnijącego materiału roślinnego, w tym owoców, orzechów, nasion, strąków, kwiatów, łodyg, ściółki roślinnej i kompostu1^,5,6,8. Najlepsze podłoża są zgniłe i prawie nierozpoznawalne jako owoce lub kwiaty; unikaj podłoży, które są zbyt suche lub mokre (Rysunek 1). Substraty najefektywniej zbiera się z pola, pracując w parach. Osoba z bezdotykowym termometrem na podczerwień wybierze podłoże do pobrania i pobierze próbkę, podczas gdy jej partner użyje aplikacji Nematode Field Sampling w Fulcrum do zapisania danych pobrania. Para kolektorów będzie powtarzać ten proces, aż do zebrania żądanej liczby próbek. Wykaz materiałów potrzebnych do pracy w terenie znajduje się w (Tabela uzupełniająca 1).

1. Otwórz aplikację mobilną Fulcrum i z menu rozwijanego wybierz opcję Próbkowanie pola nicieni. Naciśnij +, aby rozpocząć nowy rekord w projekcie (Rysunek 2A). Zrób zdjęcie podłoża.
2. Kliknij pole w górnej środkowej części, aby wybrać odpowiedni projekt kolekcji wykonany w kroku 1.2 (Rysunek 2B). Stuknij w pole C-label u dołu rekordu kolekcji i wybierz opcję Skanuj, gdy pojawi się monit. Zeskanuj kod kreskowy na worku zbiorczym za pomocą aparatu urządzenia mobilnego, a następnie dotknij Gotowe w prawym górnym rogu ekranu.
3. Stuknij w pole Podłoże i wybierz typ podłoża z menu rozwijanego. Dodaj notatki dotyczące podłoża, dotykając pola Uwagi dotyczące podłoża i ręcznie wprowadzając notatki.
4. Wybierz krajobraz z menu rozwijanego. Wybierz krajobraz, który najlepiej reprezentuje miejsce pobierania próbek.
5. Wybierz widok nieba. Wybierając widok nieba, opisz widoczność nieba w miejscu pobierania próbek (np. Widok całego nieba bez zasłoniętych widoków z drzew lub innych struktur = pełny).
6. Zmierz temperaturę powierzchni podłoża za pomocą termometru bezdotykowego i zapisz wartość w polu temperatury podłoża.
   UWAGA: Podczas rejestrowania temperatury trzymaj termometr bezdotykowy nie dalej niż 14 cali od podłoża.
7. Zmierz temperaturę i wilgotność otoczenia za pomocą urządzenia przenośnego i zapisz te dane w odpowiednich polach.
   UWAGA: Sprawdź, czy urządzenie do pomiaru temperatury i wilgotności otoczenia nie jest wstrzymane. Jednostka miary zmieni się po zwolnieniu przycisku. Trzymaj urządzenie w zewnętrznej kieszeni, aby uniknąć nieregularnych odczytów.
8. Zapisz rekord w Fulcrum, dotykając Zapisz w lewym górnym rogu ekranu.
9. Zbierz około łyżki stołowej podłoża bez patyczków lub innych twardych kawałków, odwracając worek zbiorczy, aby użyć go jako "rękawicy" do podniesienia podłoża, a następnie zamknij worek. Włóż ręcznik papierowy do torby, jeśli próbka jest szczególnie wilgotna.
   UWAGA: W gorącym klimacie umieść torby w miękkich chłodziarkach z chłodziarkami, aby kolekcje były chłodne.
10. Po pobraniu wszystkich próbek na dany dzień wyczyść sprzęt do pobierania, wyjmij baterie z sond, naładuj baterie, ponownie zamroź opakowania do zamrażania. Zsynchronizuj dane zbierania Fulcrum, dotykając przycisku Synchronizuj w lewym górnym rogu aplikacji Nematode Field Sampling application.
    UWAGA: Przesyłanie może potrwać kilka minut bez silnego połączenia komórkowego, więc najlepiej poczekać na dostęp do Wi-Fi. Dane pozostaną na urządzeniach mobilnych i zostaną zsynchronizowane z chmurą.
11. Wyślij próbki do instytucji macierzystej, umieszczając je w pudełku wysyłkowym na noc. Zminimalizuj czas, w którym próbki są wystawione na działanie temperatur niższych niż 11 °C lub wyższych niż 25 °C, wysyłając paczki w dni, w których ładunek jest transportowany.
    UWAGA: Większość obiektów spedycyjnych nie wysyła ładunków z dnia na dzień w weekendy w odległych lokalizacjach.

3. Gromadzenie zbiorów terenowych w laboratorium

UWAGA: Ta sekcja szczegółowo opisuje, jak zorganizować transfer próbek z oznaczonych worków na oznakowane talerze. Próbki mogą przybyć z transportu nocnego lub bezpośrednio z pola.

1. Odbierz przesyłkę z kolekcjami i sprawdź, czy nie ma uszkodzonych toreb lub innych dowodów uszkodzenia. Jeśli worki są uszkodzone, wyrzuć materiał i wyczyść nieuszkodzone worki zbiorcze 70% etanolem; unikaj etykiety C na torbie z etanolem, ponieważ spowoduje to odbarwienie etykiety i utrudni jej odczytanie.
2. Dla każdej torebki z zamkiem błyskawicznym zwróć uwagę na etykietę C na torbie i przymocuj pasującą etykietę C do wieczka 10-centymetrowej tabliczki nakrapianej bakteriami OP50.
   UWAGA: Oznaczone tabliczki o średnicy 10 cm są określane jako "tabliczki C" w pozostałej części protokołu. Najprostszym sposobem uporządkowania próbek jest umieszczenie worków do pobierania na stole laboratoryjnym z pasującą płytką C na górze (Rysunek 3).
3. Dla każdej kolekcji przenieś około jednej łyżki stołowej próbki z worka zbiorczego na płytkę C za pomocą czystej plastikowej łyżki. Dodaj próbkę wokół trawnika bakteryjnego w kształcie półksiężyca lub pierścienia, nie zakrywaj całkowicie trawnika bakteryjnego (Rysunek 4).
   UWAGA: Utrzymuj łyżkę stołową w czystości, umieszczając ją w zlewce z 95% etanolem, gdy nie jest używana. Użyj ręcznika papierowego, aby osuszyć łyżkę stołową przed przeniesieniem dodatkowych próbek.
4. Należy odnotować czas, w którym kolekcje zostały przeniesione z worków do pobierania próbek na płytki C i przechowywać płytki C w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej 24 godziny przed próbą wyizolowania nicieni w sekcji 4.

4. Izolowanie nicieni z kolekcji

1. Otwórz aplikację Fulcrum na urządzeniu mobilnym i wybierz Izolacja nicieni z menu aplikacji (Rysunek 5A). Utwórz nowy rekord izolacji, dotykając ikony + w prawym dolnym rogu (Rysunek 5B).
2. Na nowym ekranie rekordu izolacji potwierdź poprawny projekt zbiórki, zaznaczając nazwę projektu wyświetlaną w polu pośrodku w górnym środku. Jeśli wyświetlany jest niewłaściwy projekt, stuknij nazwę projektu, aby przełączyć się na właściwy projekt (Rysunek 5C).
3. Stuknij w przycisk Wybierz pod polem C-label, aby znaleźć etykietę C powiązaną z próbką, z której izolowane są nicienie (Rysunek 5D). Stuknij ikonę wyszukiwania, a następnie stuknij ikonę skanowania, aby zeskanować kod QR etykiety C na tabliczce C za pomocą aparatu urządzenia. Po zeskanowaniu kodu QR w polu C-label pojawi się rekord C-label.
4. Stuknij ikonę aparatu w polu Zdjęcia, aby otworzyć kamerę urządzenia i użyj jej do zrobienia zdjęcia próbki na tabliczce C z widocznym kodem QR (Rysunek 5E). Stuknij w Gotowe, aby powrócić do ekranu izolacji.
   UWAGA: Te zdjęcia z zapisu izolacji mogą być wykorzystane do zbadania określonych atrybutów podłoża w późniejszym czasie.
5. Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby poszukać nicieni na płytce C. Stuknij w pole Robaki na próbce, aby zarejestrować obecność nicieni w próbce (Rysunek 5F). Stuknij w Tak, jeśli nicienie są obecne na tabliczce C i stuknij w Nie, jeśli nicienie nie są obecne.
6. Stuknij w Utwory, jeśli obecne są tylko ślady nicieni. Jeśli nicienie nie są obecne, należy sparafilmować płytkę C i wyrzucić ją do pojemnika na zagrożenia biologiczne.
   UWAGA: Odwróć płytkę C nad pojemnikiem na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne i delikatnie postukaj w tylną część płytki, aby usunąć wszystkie pobrane substraty. Ten krok ułatwia znalezienie i wyizolowanie nicieni, które mogą znajdować się pod podłożem na płytce C.
7. Jeśli nicienie są obecne, należy wyizolować do pięciu nicieni z płytki C. Aby wyizolować nicienie, przenieś jednego nicienia z płytki C na płytkę S za pomocą szpikulca z drutu platynowego. Jeśli to możliwe, odizoluj zdrowych, ciężarnych dorosłych. Jednak odizoluj inne etapy, jeśli nie zostaną znalezione dorosłe osobniki.
   UWAGA: Po izolacji, na maksymalnie pięciu płytkach S będzie znajdować się pojedynczy nicień. Trzymaj te S-płytki z izolowanymi nicieniami z tej samej płytki C zorganizowane razem w schludny stos z dala od innych płytek S, dopóki nie zostaną wprowadzone do Fulcrum.
8. Stuknij w pole Tabliczki z oznaczeniem S, aby wprowadzić płytę (płyty) S używaną do tej izolacji. Stuknij w + w prawym dolnym rogu. Stuknij w S-label, a następnie kliknij Skanuj, aby otworzyć kamerę urządzenia. Użyj aparatu urządzenia, aby zeskanować kod QR S-label na tabliczce S.
   UWAGA: Upewnij się, że kod etykiety S jest zgodny z kodem na tabliczce. Jeśli pasuje, dotknij Gotowe. Jeśli tak się nie stanie, dotknij Anuluj i skanuj ponownie, aż będzie pasować, a następnie kliknij Gotowe. Czasami kody QR pobliskich tablic są przypadkowo skanowane.
9. Po wprowadzeniu każdej płyty S zapisz wpis za pomocą przycisku Zapisz w prawym górnym rogu. Wpis zostanie utracony, jeśli nie zostanie zapisany. Stuknij w + w prawym dolnym rogu, aby w razie potrzeby dodać więcej płytek z oznaczeniem S, aż wszystkie nicienie wyizolowane z płytki C zostaną wprowadzone. Po dodaniu wszystkich płytek oznaczonych literą S dla rekordu izolacji, dotknij przycisku < w lewym górnym rogu, aby wrócić do ekranu nagrywania izolacji.
   UWAGA: Aby anulować rekord izolacji, ponieważ nie można usunąć błędów, kliknij Anuluj w lewym górnym rogu. Ten krok otworzy okno dialogowe z pytaniem, czy rekord można odrzucić bez zapisywania. W razie potrzeby kliknij Tak, odrzuć.
10. Stuknij w przycisk Zapisz w prawym górnym rogu, gdy rekord izolacji zostanie poprawnie dodany do wszystkich informacji. Następnie sparafilmować płytki S z wyizolowanymi nicieniami i odłożyć je na bok w miejscu przeznaczonym do przechowywania płytek S z nicieniami.
11. Parafilmować płytkę C i wyrzucać ją do pojemnika na zagrożenia biologiczne. Stuknij w ikonę Synchronizuj, aby przesłać wszystkie dane do Fulcrum.
12. Posortuj wszystkie tabliczki S w kolejności alfanumerycznej, a następnie umieść tabliczki S w kartonowych pudełkach. Upewnij się, że płytki S są pokrywą do dołu i sfilmowane. Ułóż do czterech płytek S w jednym miejscu w pudełku i oznacz karton nazwą projektu, datą, godziną i unikalnym numerem pudełka.
13. Przechowuj oznaczone pudełka w RT. Izolaty te zostaną sprawdzone pod kątem proliferacji po 48 godzinach, a w razie potrzeby ponownie po 168 godzinach.

5. Eksport płyt S z Fulcrum

UWAGA: Ta sekcja szczegółowo opisuje, jak eksportować etykiety S używane w procesie izolacji z bazy danych projektu Fulcrum. Te znaczniki S będą używane do śledzenia proliferujących linii izożeńskich, podczas gdy są one identyfikowane na podstawie tożsamości sekwencji w sekcjach 6-9.

1. Zaloguj się na stronie internetowej Fulcrum i wybierz aplikację Izolacja nicieni. Kliknij Eksporter po lewej stronie ekranu. Kliknij, aby wybrać żądany projekt i zaznacz pole Izolacja nicieni. Kliknij przycisk Dalej, aby pobrać plik .zip, który zawiera plik "nematode_isolation_s_labeled_plates.csv".
2. Otwórz plik "nematode_isolation_s_labeled_plates.csv" i posortuj go według kolumny "S-label" w kolejności rosnącej (najmniejsza etykieta S będzie na górze). Zaznacz wszystkie etykiety S i skopiuj je z arkusza kalkulacyjnego.
3. Przejdź do arkusza Google szablonu genotypowania dzikiej izolacji (wild_isolate_genotyping_template) za pomocą przeglądarki internetowej¹⁹.
   1. Utwórz kopię tego arkusza Google, klikając prawym przyciskiem myszy kartę Szablon genotypowania, a następnie wybierając opcję Kopiuj do nowego arkusza kalkulacyjnego. Wybierz Otwórz arkusz kalkulacyjny, aby wyświetlić nowy arkusz Google.
   2. Nazwij ten nowy arkusz nazwą projektu punktu podparcia, po której następuje "wild_isolate_genotyping", np. "2020FebruaryAustralia_wild_isolate_genotyping."
      UWAGA: Ten arkusz jest określany jako "arkusz genotypowania" w pozostałej części protokołu.
4. Wklej etykiety S skopiowane z kolumny "nematode_isolation_s_labeled_plates.csv" "s_label" do kolumny arkusza genotypowania zatytułowanej "s_label". Sprawdź, czy w kolumnie "s_label_repeat_error" znajdują się cyfry "1". Wartość "1" w tej kolumnie oznacza, że etykieta S jest zduplikowana gdzieś na arkuszu genotypowania. Jeśli zostaną wykryte duplikaty, zbadaj je i popraw przed przejściem dalej.
5. Wypełnij kolumnę "isolation_box_number" w arkuszu genotypowania dla wszystkich etykiet S.

6. Sprawdź, czy nie ma proliferacji na płytach S

1. Sprawdź, czy na tabliczkach S nie ma rozmnażających się zwierząt 48 godzin po izolacji (użyj daty i godziny ostatniej izolacji na pudełku z kroku 4.11, aby wskazać czas).
   UWAGA: Nicienie rozmnażające się charakteryzują się potomstwem na płytce S.
2. Jeżeli tabliczka S ulega namnażeniu, wpisz "1" w kolumnie proliferation_48 na arkuszu genotypowania, a następnie przenieś płytkę S do pola oznaczonego "48 godzin proliferacji, pole 1". Umieścić maksymalnie 88 płytek S w pudełku do proliferacji, a następnie rozpocząć napełnianie nowego pudełka z napisem "48 h proliferation, box 2". Upewnij się, że etykiety S są uporządkowane w porządku alfanumerycznym w skrzynkach proliferacji 48 godzin.
   UWAGA: Nie wyrzucaj nierozwierających się płytek S; Tabliczki te zostaną ponownie sprawdzone po 168 godzinach od izolacji. W razie potrzeby należy skonsolidować te tabliczki S w kolejności numerycznej w polach oznaczonych jako "48 h non-proliferating, box X", ale pamiętaj, aby odnotować, kiedy na nowym pudełku musi nastąpić sprawdzenie 168 godzin.
3. Po zidentyfikowaniu wszystkich proliferujących etykiet S po 48 godzinach, przejdź do sekcji 7 dla płytek S z proliferacją po 48 godzinach.
4. Sprawdź płytki S, które nie rozmnażały się po 48 godzinach od izolacji, ponownie po 168 godzinach od izolacji.
   1. Jeśli tabliczka S jest obecnie w trakcie namnażania, wpisz "1" w kolumnie proliferation_168 na arkuszu genotypowania, a następnie przenieś tabliczkę S do pola oznaczonego "168 godzin proliferacji, pole 1".
   2. Umieścić maksymalnie 88 płytek S w pudełku do proliferacji, a następnie rozpocząć napełnianie nowego pudełka oznaczonego jako "168 godzin proliferacji, pole 2". Pamiętaj, aby uporządkować etykiety S w kolejności alfanumerycznej w pudełkach proliferacji 168 godzin.
5. Wyrzuć płytki S, które nie mają proliferacji po 168 godzinach. Przejdź do sekcji 7 dla płytek S z proliferacją po 168 godzinach.

7. Liza linii izożeńskich

UWAGA: Ten krok użyje narzędzia do filtrowania danych w arkuszach Google, aby pomóc w wydrukowaniu arkuszy lizy dla płyt S w skrzynkach proliferacji. Celem arkuszy do lizy jest zapewnienie personelowi prawidłowych pozycji etykiet S w probówkach z paskami do lizy na stanowisku pracy.

1. Otwórz arkusz genotypowania dla żądanego projektu i zaznacz wszystkie komórki, wpisując Cmd+A. Kliknij pozycję Dane > Utwórz filtr, aby dodać przycisk filtru do każdego nagłówka kolumny. Użyj przycisków Filtr, aby wyświetlić tylko te płytki S, które zostaną zgenotypowane. Na przykład, jeśli wszystkie płytki S z proliferacją po 48 godzinach mają być poddawane lizie: Kliknij przycisk Filtruj w kolumnie "proliferation_48" i wybierz "1".
2. Po przefiltrowaniu arkusza Google genotypowania przejrzyj listę wyświetlanych etykiet S, aby upewnić się, że są to etykiety S, które mają zostać wydrukowane w arkuszu.
   1. W kolumnie "strip_tube_number" w arkuszu Google dotyczącym genotypowania wprowadź unikalny numer co 11 wierszy.
   2. Wprowadź numery rurek paskowych dla projektu w kolejności kolejnej, zaczynając od 1 i nigdy nie duplikuj. W polu "strip_tube_position" wprowadź liczby od 2 do 12 dla każdego numeru rurki paskowej.
      UWAGA: Do lizy należy używać 12-rurowych probówek paskowych. Pierwszą pozycją (strip_tube_position 1) będzie kontrola, ale kontrolki nie są dodawane do arkuszy lizy (dodawane są tylko strip_tube_positions, 2-12). W czasie lizy szczep kontroli dodatniej "N2" zostanie dodany do pozycji 1 każdej parzystej probówki paskowej jako kontrola dodatnia. Do pozycji 1 każdej nieparzystej tubki paskowej nie dodaje się żadnych robaków jako kontroli ujemnej.
3. Przefiltruj arkusz Google dotyczący genotypowania, aby uwzględnić tylko etykiety S w jednym polu proliferacji, które mają być poddawane lizie, a następnie wybierz kolumny od s_label do "lysis_notes". Wydrukuj arkusz lizy dla każdego pudełka do lizy.
4. Kliknij menu rozwijane w polu Drukuj i wybierz Wybrane komórki. Kliknij Dalej w prawym górnym rogu, a następnie użyj okna dialogowego, aby wydrukować arkusz lizy dla pola proliferacji.
5. Powtórz kroki 7.3-7.5, aby wydrukować arkusz lizy dla każdego pudełka proliferacji.
   UWAGA: Każde pudełko proliferacyjne mieści do 88 płytek S, co odpowiada ośmiu 12-dołkowym probówkom paskowym.
6. Przygotuj 12-dołkowe probówki paskowe dla wszystkich próbek, które będą poddawane lizie. Oznacz probówkę paskową unikalnym "strip_tube_number" przypisanym w arkuszu lizy. Etykieta ta musi być napisana na pasku z nakrętką i tubie paska, aby uniknąć pomyłek w przypadku ich rozdzielenia. Probówki paskowe EVEN mają kontrolę pozytywną (ślimaki N2) w pozycji 1. Rurki paskowe napędu optycznego mają kontrolę ujemną (brak robaków) w pozycji 1.
7. Uzupełnić wystarczającą ilość buforu do lizy (100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8,2, 5 mM MgCl₂, 0,9% IGEPAL, 0,9% Tween 20, 0,02% żelatyny z proteinazą K dodaną do końcowego stężenia 0,4 mg/ml) dla wszystkich próbek i dodać 5% więcej w przypadku błędu pipetowania. Skaluj zgodnie z potrzebami.
   UWAGA: Bufor do lizy najlepiej przygotować łącząc wszystkie składniki z wyjątkiem proteinazy K i zamrażając w 10-50 ml podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Rozmrozić porcje i przechowywać w temperaturze 4 °C przed użyciem; bezpośrednio przed użyciem dodać proteinazę K i dokładnie wymieszać. Podczas pracy utrzymuj bufor do lizy na lodzie.
8. Ułóż płytki S dla konkretnej probówki paskowej w kolejności, korzystając z wydrukowanego arkusza lizy jako przewodnika.
9. Odkręć jedną probówkę z paskiem i dodaj 8 μl buforu do lizy do każdej nakrętki za pomocą powtarzalnego pipetora. Dodaj bufor do lizy do jednego paska nakrętek na raz, ponieważ bufor do lizy wyparuje, jeśli zostanie pozostawiony w temperaturze pokojowej i odkryty. Wybierz 3-5 zwierząt z płytek źródłowych (płytka S lub płytka podstawowa N2 do kontroli pozytywnych) do odpowiednich pozycji nasadek wskazanych na arkuszu lizy. Zapisz notatki dla dowolnej płytki S z mniej niż 5 robakami wybranymi do lizy w lysis_notes sekcji arkusza lizy.
10. Po załadowaniu nicieni do każdej pozycji tubki z paskiem, umieść pasek nasadki z powrotem na tubce z paskiem. Dopasuj oznaczoną nasadkę (pozycja 1) do oznaczonej rurki (pozycja 1). Po zamknięciu odwiruj krótko probówkę paskową, aż nicienie znajdą się na dnie probówki.
11. Umieść pasek w zamrażarce w temperaturze -80 °C do całkowitego zamrożenia (co najmniej 10 minut). Powtarzać kroki od 7.9 do 7.11, aż do momentu, gdy do wszystkich pasków zostaną dodane nicienie w celu lizy. Uporządkuj paski rur w kolejności numerycznej.
12. Wyjąć zestawy probówek paskowych i uruchomić program lizy w termocyklerze: 1 h w 60 °C, 15 min w 95 °C, trzymać w temperaturze 12 °C. Po zakończeniu programu lizy należy odwirowywać próbki w temperaturze 300 x g przez 15 s w temperaturze pokojowej i przechowywać lizaty w temperaturze -80 °C przez okres do 1 tygodnia.
13. Uporządkuj paski probówek w kolejności numerycznej za pomocą 96-dołkowych uchwytów na płytki i dołącz etykietę z numerem pudełka do proliferacji, zakresem numerów probówek paskowych, datą i inicjałami badacza. Zaktualizuj kolumny arkusza genotypowania "lysis_date" i "lysis_notes" o informacje z arkusza lizy.

8. PCR sekwencji SSU i ITS2

UWAGA: Ta sekcja zawiera instrukcje, jak wykonać dwa oddzielne PCR dla każdej zlizowanej płytki S. Pierwszy zestaw starterów amplifikuje 500-pz fragment genu małej podjednostki 18S rDNA (SSU); oECA1271 = starter do przodu TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = starter do tyłu CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA ¹². Ten PCR służy do sprawdzenia jakości matrycowego DNA. PCR amplifikuje region SSU dla prawie wszystkich gatunków nicieni. Jeśli SSU PCR nie zdoła się amplifikować, wynik ten sugeruje, że jakość lizy jest słaba i lizę należy powtórzyć dla tej płytki S. Drugi zestaw starterów amplifikuje fragment o długości 2,000 pz wewnętrznego transkrybowanego regionu dystansowego między genami 5,8S i 28S rDNA (ITS2); oECA1687 = starter do przodu CTGCGTTACTTACCACGAATTGCARAC, oECA202 = starter do przodu GCGGTATTTGCTACTACCAYYAMGATCTGC³. Produkt ITS2 PCR jest sekwencjonowany metodą Sangera, a sekwencja służy do identyfikacji nicieni z rodzaju Caenorhabditis na poziomie gatunku na podstawie podobieństwa sekwencji.

1. Użyj narzędzia filtrującego w arkuszu genotypowania, aby wyświetlić tylko znaczniki S, które mają być używane do PCR.
   1. Zaktualizuj kolumny pcr_plate_number i pcr_well w arkuszu genotypowania. Aby zapobiec degradacji materiału do lizy, PCR SSU i ITS2 są przeprowadzane w tym samym czasie.
   2. Użyj tej samej pcr_plate_number dla PCR ITS2 i SSU, mimo że są to oddzielne reakcje na oddzielnych płytkach. Będą one wyróżnione oznaczeniami "SSU" lub "ITS2".
2. Przypisz pcr_plate_number do ośmiu lub mniej probówek paskowych (jedna probówka paskowa na rząd 96-dołkowej płytki PCR, ułożona w porządku rosnącym, np. najniższy numer probówki paskowej na górze). Następnie przypisz pcr_plate_well do każdej etykiety S w tubkach paskowych.
   UWAGA: Rury paskowe są ułożone w porządku rosnącym, przy czym najniższy numer rury paskowej jest przypisany do rzędu A, a najwyższy numer w rzędzie H. Pozycja 1 wszystkich rur paskowych jest przypisana do kolumny 1. W związku z tym probówka paskowa nr 1, pozycja 1 zostanie przypisana do płytki PCR nr 1, studzienka A01.
3. Oznaczyć 96-dołkową płytkę (płytki) do PCR, aby pomieścić próbki, które zostaną użyte do PCR. Oznacz każdą płytkę PCR następującymi informacjami: nazwą projektu, typem PCR, numerem tabliczki PCR i datą PCR (np. 2020FebruaryAustralia_SSU_1_20200304). Oznacz również tabliczkę numerami rurek paskowych, które zostaną załadowane do każdego rzędu.
4. Wyjąć materiał do lizy z zamrażarki o temperaturze -80 °C i rozmrozić probówki paskowe zawierające materiał do lizy na lodzie. Podczas rozmrażania materiału do lizy przygotuj główne mieszanki ITS2 i SSU w oddzielnych probówkach na lodzie. Receptury PCR SSU i ITS2 znajdują się w tabeli uzupełniającej 2.
   UWAGA: Przygotuj 100 reakcji głównej mieszanki PCR dla każdej płytki 96-dołkowej, aby umożliwić błąd pipetowania. Użyj stożka o pojemności 15 ml lub 50 ml do przytrzymania mieszanki głównej, jeśli mają być używane duże objętości.
5. Delikatnie mieszaj mieszankę główną, aż Taq zostanie rozprowadzony w całej mieszance. Po wymieszaniu podwielokrotność 38 μl mieszanki wzorcowej należy umieścić w odpowiednich dołkach płytek PCR na lodzie. Użyj sterylnych, jednorazowych koryt z dnem w kształcie litery V i 12-dołkowej pipety wielokanałowej, aby przenieść mieszankę wzorcową na płytki PCR.
6. Zakręć rozmrożone probówki z paskiem do lizy, aby usunąć materiał do lizy z nakrętek. Ostrożnie zdejmij pokrywki ze wszystkich probówek z paskami, które zostaną załadowane do pierwszej płytki PCR. Użyj pipety wielokanałowej o małej objętości (12-dołkowej lub 8-dołkowej), aby dodać 2 μl lizatu do odpowiedniego dołka na płytce PCR. Delikatnie odpipetować lizat w górę i w dół raz przed wyjęciem 2 μl.
   UWAGA: Sprawdź końcówki, aby upewnić się, że zawierają lizę przed transferem. Pamiętaj, aby zmieniać wskazówki między wierszami lub kolumnami.
7. Przykryj płytkę PCR folią samoprzylepną do PCR i użyj wałka, aby uzyskać szczelne uszczelnienie. Po nałożeniu folii na krótko odwiruj płytki PCR w wirówce. Trzymaj płytkę na lodzie, aż będzie gotowa do pracy w termocyklerze.
8. Uruchom PCR z odpowiednim programem termocyklera. Szczegółowe informacje na temat programów SSU i ITS2 PCR można znaleźć w Tabeli Uzupełniającej 2.
9. Powtarzaj kroki 8.4-8.8, aż wszystkie PCR zostaną uruchomione.
10. Podczas trwania reakcji PCR wlej 100 ml 1,5% żelu agarozowego. Każdy żel będzie zawierał próbki lub pojedynczą płytkę PCR.
    1. Dodać 1,5 g agarozy do kolby o pojemności 500 ml, następnie dodać 100 ml 1x buforu TAE (tabela uzupełniająca 3) i mieszać do wymieszania. Kuchenka mikrofalowa do rozpuszczenia i schłodzenia żelu.
    2. Po schłodzeniu roztworu dodać 5 μl roztworu bromku etydyny o stężeniu 10 mg/ml i wymieszać do połączenia. Wlej roztwór do tacki odlewniczej z czterema 25-dołkowymi grzebieniami, tak aby żel mógł pomieścić 96 próbek oraz drabinkę dla każdego rzędu żelu.
       UWAGA: Bromek etydyny jest silnym mutagenem. Podczas pracy z bromkiem etydyny należy używać fartucha laboratoryjnego, rękawic odpornych na chemikalia i okularów ochrony chemicznej.
11. Tuż przed zakończeniem PCR dodaj 6x barwnika ładującego do jednorazowego koryta i użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 2 μl 6x barwnika ładującego do każdego dołka nowej 96-dołkowej płytki PCR. Ta płytka będzie używana do ładowania próbek do żelu. Zrób tyle tych płytek, aby pomieścić wszystkie próbki.
12. Po zakończeniu PCR wyjmij płytki PCR i krótko je odwiruj przy 300 x g przez 15 s w temperaturze pokojowej. Przechowuj płytki PCR na lodzie, aż produkty PCR będą mogły wypłynąć na żel.
    1. Aby wypuścić produkty na żel, użyj 12-dołkowej pipety wielokanałowej, aby dodać 5 μl każdej próbki do odpowiedniego dołka 96-dołkowej płytki zawierającej 2 μl 6-krotnego barwnika ładującego.
    2. Następnie załadować 6 μl tej mieszaniny do każdej studzienki niedawno odlanego żelu. Załaduj 6 μl 1 KB plus drabinkę do pierwszego dołka z każdego rzędu żelu.
       UWAGA: Aby napełnić dołki żelu, może być konieczne przeplatanie rzędów A i B z płytki PCR w pierwszym rzędzie żelu. Aby uniknąć nieporozumień, należy zapisać gel_number i gel_position w arkuszu genotypowania dla każdej próbki PCR.
13. Nałożyć nową foliową pokrywkę na pozostały PCR na płytce (płytkach) i przechowywać je w temperaturze 4 °C. Te produkty reakcji zostaną wykorzystane do sekwencjonowania w kroku 9.
14. Umieść produkty PCR na żelu pod napięciem 120 V przez 20 minut. Zobrazuj żel i zapisz, które znaczniki S dają produkty ITS2 i/lub SSU PCR w kolumnach "pcr_product_its2" i "prc_product_ssu" arkusza genotypowania. Oznacz obecność pasma za pomocą "1"; Zaznacz "0" dla braku pasma.

9. Identyfikacja nicieni za pomocą sekwencjonowania Sangera i sekwencji BLAST

UWAGA: Ta sekcja zawiera instrukcje dotyczące sekwencjonowania amplikonów ITS2 z etykiet S, dopasowywania tych sekwencji do bazy danych National Center for Biotechnology Information (NCBI) za pomocą algorytmu BLAST i analizowania wyników BLAST w celu identyfikacji nicieni na płytkach S.

1. Dla każdej próbki, która jest ITS2-dodatnia, należy użyć pozostałego produktu ITS2 PCR do sekwencjonowania Sangera przy użyciu startera przedniego oECA306 (CACTTTCAAGCAACCCGAC). Zorganizuj pliki wyjściowe sekwencjonowania tak, aby można je było łatwo połączyć z etykietą S, zapisując kolumny "sequencing_plate" i "sequencing_well" każdej etykiety S w arkuszu genotypowania.
2. Uzyskaj pliki wyjściowe .seq dla każdej etykiety S z platformy sekwencjonowania. Rozmieść pliki .seq dla projektu w jednym katalogu z plikami .seq dla każdej partii sekwencjonowania znajdującymi się w podkatalogach.
3. Otwórz narzędzie interfejsu wiersza poleceń i przejdź do górnego katalogu zawierającego pliki .seq, wpisując polecenie: cd . Jeśli jeszcze nie istnieje, utwórz scaloną FASTA dla wszystkich plików .seq, wprowadzając następujące polecenie: for dir in */; do cd $dir; for file in *.seq; do echo ">"$file; cat $file; done >>. /all_seqs.fa; płyta CD..; gotowe.
   UWAGA: Ten kod utworzy scalony plik FASTA o nazwie "all_seqs.fa" ze wszystkich plików .seq w katalogu projektu. Plik ten może być używany w internetowym narzędziu NCBI nucleotide BLAST w celu szybkiego dopasowania sekwencji ITS2 każdej etykiety S do bazy danych sekwencji NCBI.
4. W przeglądarce internetowej przejdź do witryny NBCI BLAST²⁰ i kliknij przycisk Wybierz plik. Wybierz plik all_seqs.fa, który właśnie został utworzony, a następnie kliknij przycisk Nieco podobne sekwencje (BLASTn). Kliknij przycisk BLAST u dołu strony, aby rozpocząć wyszukiwanie BLAST.
5. Zaktualizuj arkusz genotypowania o wyniki BLAST dla każdej etykiety S. Użyj narzędzia filtrującego, aby ułatwić aktualizację arkusza Google do genotypowania. Kliknij pozycję Dane > Utwórz filtr, aby dodać przycisk filtru do każdego nagłówka kolumny. Przefiltruj kolumnę sequencing_plate, aby wybrać płytki sekwencjonowania, które mają zostać zaktualizowane o wyniki BLAST.
6. Użyj menu rozwijanego na stronie wyników NCBI BLAST, aby sprawdzić wyniki dla każdej sekwencji ITS2 płytki S (Rysunek 6).
7. Sprawdź, czy nie ma trafień BLAST. Identyfikator sekwencji na liście rozwijanej poprzedzony znakiem * nie ma trafień wybuchu. W przypadku tych etykiet S w kolumnie manual_blast_notes arkusza genotypowania należy wpisać "brak trafienia .
8. Sprawdź, czy nie ma możliwego nowego gatunku Caenorhabditis. Kliknij link w górnym trafieniu, aby wyświetlić wyrównanie (Rysunek 6). Jeśli najwyższym trafieniem jest (1) gatunek Caenorhabditis, (2) wyrównanie zawiera więcej niż pięć niezgodności w środku sekwencji i (3) pokrycie zapytania jest większe niż 50%, wynik ten sugeruje, że izolat może być nowym gatunkiem Caenorhabditis (Rysunek 7). Dla tych tabliczek S należy wpisać gatunek najwyższego trafienia BLAST w kolumnie "species_id", w kolumnie "possible_new_caeno_sp" wprowadzić cyfrę 1, a w kolumnie "manual_blast_notes" "możliwe nowe Caeno sp." wraz z procentem identyczności (np. "możliwa nowa tożsamość Caeno sp. 89%").
9. W przypadku sekwencji na płytce S, które WYBUCHAJĄ do gatunku Caenorhabditis, wprowadź pełną nazwę rodzaju i gatunku najwyższego trafienia BLAST w kolumnie "species_id". Na przykład "Caenorhabditis elegans".
10. W przypadku sekwencji S-plate, które BLAST do gatunku innego niż Caenorhabditis, należy wprowadzić tylko rodzaj najwyższego trafienia BLAST, a następnie "sp." w kolumnie "species_id". Ten zapis oznacza, że izolat jest nieznanym gatunkiem w obrębie nazwanego rodzaju. Na przykład 'Oscheius sp.'.
    UWAGA: Sekwencja ITS2 nie może być używana do wiarygodnej identyfikacji izolatów na poziomie gatunku poza rodzajem Caenorhabditis^3,13.
11. W kolumnie "make_strain_name" arkusza genotypowania wpisać 1, jeżeli "species_id" = "Caenorhabditis elegans", "Caenorhabditis briggsae" lub "Caenorhabditis tropicalis" LUB "possible_new_caeno_sp" = 1.
12. Nazwij szczepy unikalnymi nazwami zgodnie z konwencjami nomenklatury Caenorhabditis, tj. unikalnym oznaczeniem laboratoryjnym składającym się z 2-3 wielkich liter, po których następuje numer dla każdego unikalnego szczepu²³. Wprowadź nazwy szczepów w kolumnie "strain_name".
13. Po nazwaniu szczepów można je kriokonserwować przy użyciu ustalonych protokołów ²⁴.

10. Przetwarzanie danych kolekcji za pomocą pakietu easyFulcrum w R

UWAGA: Ten krok opisuje, jak połączyć ze sobą dane kolekcji (etykiety C) i dane izolacji nicieni (etykiety S) za pomocą pakietu easyFulcrum R. Oprogramowanie zawiera funkcje, które dodatkowo połączą dane Fulcrum z danymi genotypowania z arkusza genotypowania, tak aby tożsamości gatunków i nazwy szczepów z etykietą S były zorganizowane w jednej ramce danych.

1. Utwórz nowy katalog o nazwie odpowiadającej projektowi kolekcji. Ułóż strukturę folderów w katalogu tak, aby odpowiadała wymaganiom opisanym w pakiecie języka R easyFulcrum¹⁵.
2. Przejdź do witryny Fulcrum i zaloguj się. Wyeksportuj surowe dane projektu z bazy danych Fulcrum za pomocą narzędzia do eksportu danych na stronie internetowej Fulcrum po lewej stronie i zaznacz następujące pola wyboru: projekt, dołącz zdjęcia, dołącz dane GPS, pobieranie próbek w terenie i izolacja.
   UWAGA: Dane punktu podparcia dla projektu zostaną wyeksportowane jako pięć plików z wartościami rozdzielanymi przecinkami (.csv). Kompletne dane projektu zostaną połączone w jedną ramkę danych za pomocą pakietu easyFulcrum w języku R.
3. Przenieś pięć .csv plików wyeksportowanych z Fulcrum do katalogu projektu utworzonego w kroku 10.1 zgodnie z instrukcjami w easyFulcrum vignette²¹.
4. Otwórz sesję Rstudio i zainstaluj pakiet easyfulcrum w języku R, wprowadzając następujące polecenia w konsoli języka R: "install.packages("devtools")" i "devtools::install_github("AndersenLab/easyfulcrum")".
5. Otwórz nowy skrypt języka R i postępuj zgodnie ze wskazówkami w winiecie easyfulcrum, aby przetworzyć dane kolekcji²¹.

Ten protokół został użyty do zbierania nicieni Caenorhabditis z wielu miejsc, w tym z Hawajów i Kalifornii. Wskaźnik powodzenia izolacji nicieni Caenorhabditis różni się w zależności od miejsca zbioru, klimatu, doświadczenia w pobieraniu próbek i rodzaju pobranego substratu. Protokół został wykorzystany do obszernego pobierania próbek z Wysp Hawajskich, gdzie na przestrzeni wielu lat i sezonów przeprowadzono dziewięć projektów pobrań. Wskaźniki sukcesu izolacji dla samoizolujących się gatunków Caenorhabditis są prawie identyczne dla C. briggsae (162 z 4 506 próbek, 3,6%) i C. elegans (163 z 4 506 próbek, 3,6%) i znacznie niższe dla C. tropicalis (26 z 4 506 próbek, 0,58%)8. Każdy z gatunków samoprzynastujących jest wzbogacany na gnijące podłoża owocowe i kwiatowe w stosunku do innych kategorii substratów. Pobieraj próbki podłoży z gnijących owoców i kwiatów, jeśli badacz próbuje zmaksymalizować wskaźnik sukcesu, a nie scharakteryzować preferencje dotyczące substratów. Jednak wskaźnik sukcesu różni się w zależności od jakości wybranego podłoża. Na przykład wśród podłoży owocowych i kwiatowych te podłoża, które są zbyt suche, mokre lub świeże, prawdopodobnie nie dadzą nicieni Caenorhabditis.

Skalowalność tego protokołu zbierania jest widoczna w liczbie kolekcji, które pojedyncza para badaczy może zebrać z natury. Na przykład w październiku 2018 r. para badaczy korzystających z tego protokołu zbierania była w stanie zebrać łącznie ponad 1000 próbek w ciągu 7 dni z wielu miejsc na dwóch Hawajach. Ten zespół terenowy wysłał próbki w nocy do laboratorium, gdzie zespół ośmiu badaczy wyizolował ponad 2000 nicieni z próbek po ich przybyciu. Kluczową zaletą tego protokołu jest to, że minimalizuje on koszty związane z pobieraniem próbek w odległych lokalizacjach poprzez zmniejszenie ilości sprzętu i personelu wymaganego w terenie. Korzystając z tego protokołu, mały zespół terenowy może skupić się na pobieraniu próbek, podczas gdy zespół izolacyjny może przetwarzać próbki w swojej instytucji macierzystej przy użyciu delikatnego i ciężkiego sprzętu, takiego jak mikroskopy preparacyjne i płytki agarowe do izolowania nicieni. Co więcej, wdrożenie mobilnej aplikacji do gromadzenia danych pozwala na bezpośrednie powiązanie wszystkich danych terenowych związanych z próbkami do etykiety C, co umożliwia zespołowi izolacyjnemu niezależną pracę od zespołu terenowego podczas przetwarzania próbek.

Badacze, którzy korzystają z tego protokołu zbierania, muszą rozważyć wysiłek, który jest wymagany do wyizolowania nicieni przed rozpoczęciem projektu zbierania. Etapy izolacji i identyfikacji są ograniczone szybkością, a mały zespół zbierający próbki może szybko przytłoczyć izolatory próbkami. Co więcej, przestrzeń laboratoryjna wymagana do przetwarzania wielu zbiorów może zakłócać trwające badania (Rysunek 3). Ponadto niektóre izolowane nicienie wymagają dodatkowego wysiłku w celu genotypu. Na przykład około 2% izolatów nie ulega amplifikacji za pomocą zestawu starterów SSU PCR po pierwszej próbie lizy i musi zostać ponownie zlozanych, aby upewnić się, że materiał do lizy nadaje się do amplifikacji za pomocą zestawu starterów ITS2 (Rysunek 8). Co więcej, około 3% izolatów nie jest w stanie wytworzyć wysokiej jakości sekwencji po początkowej rundzie sekwencjonowania Sangera. W przypadku tych izolatów często wymagana jest kolejna runda lizy, ITS2 PCR i sekwencjonowanie Sangera, co może wydłużyć czas przekazania zespołowi izolacyjnemu. Co ważne, sama identyczność sekwencji nie jest wystarczającym dowodem, aby uzasadnić nowy gatunek Caenorhabditis (Rysunek 7). Aby właściwie uzasadnić hodowlę izolatu jako nowego gatunku Caenorhabditis, należy podjąć dodatkowe wysiłki w celu przeprowadzenia eksperymentów godowych i ustalenia typizowanego okazu13. Formalny opis morfologiczny typowego okazu jest również preferowany, ale nie jest wymagany3. Podsumowując, rozważania te sugerują, że badacze przyjmujący ten protokół zbierania skorzystają z testów próbnych etapów izolacji i identyfikacji, aby upewnić się, że zasoby są odpowiednio alokowane przed rozpoczęciem projektu zbierania. Co ważne, nawet małe projekty zbierania danych mogą skorzystać z tego protokołu, ponieważ proces jest wysoce powtarzalny, a dane można łatwo skontrolować w celu kontroli jakości w różnych grupach laboratoryjnych.

Rysunek 1: Przykłady substratów. (A) Idealny gnijący owoc jest pokazany w centrum obrazu (1), owoc jest prawie nie do rozpoznania. W pobliżu pokazano mniej zgniłych owoców; Unikaj pobierania próbek świeżo opadłych owoców (2). (B) Idealnie rozłożony kwiat pokazany jest na górze (3). Unikaj pobierania próbek świeżo opadłych kwiatów (4). (C) Ciemna ściółka z liści pod wierzchnią warstwą suchych liści jest idealna do pobierania próbek na obecność samozasiegających się nicieni Caenorhabditis (5). Unikaj pobierania próbek suchej ściółki z liści (6). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Aplikacja mobilna do pobierania próbek z pola nicieni. (A) Ekran początkowy po otwarciu aplikacji Nematode Field Sampling na urządzeniu Apple w Fulcrum. Czerwona strzałka w prawym dolnym rogu wskazuje przycisk + służący do tworzenia nowego rekordu kolekcji. (B) Przykład nowego rekordu kolekcji wyświetlanego na urządzeniu Apple. Czerwona strzałka wskazuje pole "Projekt" w górnej części ekranu rekordu kolekcji. Upewnij się, że wybrałeś właściwy projekt podczas pobierania próbek w terenie. W polu projektu domyślnie zostanie ustawiony ostatni projekt używany podczas tworzenia kolejnych rekordów kolekcji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Worki i płytki do zbierania zorganizowane przed pobraniem próbek. Rysunek przedstawia próbki w workach zbiorczych z oznaczeniem C po lewej stronie. Na każdej torbie zbiorczej znajduje się pasująca tabliczka o średnicy 10 cm z oznaczeniem C. Po prawej stronie znajdują się 10-centymetrowe płytki zbiorcze, które zawierają materiał próbki po jego przeniesieniu z worków zbiorczych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Płytka zbiorcza (C-plate) z prawidłowo przeniesioną próbką. Talerz C o średnicy 10 cm z rozkładającymi się owocami umieszczony na skraju trawnika bakteryjnego. Etykieta C jest przymocowana do pokrywy płytki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Aplikacja mobilna do izolacji nicieni. (A) Ekran wyboru aplikacji w aplikacji mobilnej Fulcrum. Czerwona strzałka wskazuje aplikację Izolacja nicieni. (B) Ekran początkowy po otwarciu aplikacji Nematode Isolation na urządzeniu Apple w Fulcrum. Czerwona strzałka w prawym dolnym rogu wskazuje przycisk + używany do tworzenia nowego rekordu izolacji. (C) Przykład nowego rekordu izolacji wyświetlanego na urządzeniu Apple. Czerwona strzałka wskazuje pole "Projekt" w górnej części ekranu rekordu izolacji. Upewnij się, że wybrałeś właściwy projekt podczas izolacji. Pole projektu będzie domyślnie ustawione na ostatni projekt używany podczas tworzenia kolejnych rekordów izolacji. (D) Po dotknięciu pola Wybierz pod etykietą C, użytkownicy dotkną przycisku wyszukiwania (czerwona strzałka), aby znaleźć etykietę C, z której izolują nicienie. (E) Po wybraniu etykiety C użytkownicy będą fotografować tabliczkę C za pomocą aparatu urządzenia. (F) Następnie użytkownicy wprowadzają, czy na płytce C znajdują się nicienie, czy nie. Etykiety S są dodawane do rekordu izolacji, jeśli istnieją nicienie do wyizolowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Strona z wynikami NCBI BLAST. (1) Rozwijane menu używane do przeglądania wyników BLAST dla wszystkich sekwencji. (2) Opis bieżącej sekwencji wybranej z listy rozwijanej. W tym przypadku pokazane są wyniki dla etykiety S S-05554. (3) Pokazane jest najwyższe trafienie BLAST dla S-05554. Fioletowy tekst oznacza, że kliknięto łącze do wizualizacji tego wyrównania. Pamiętaj, aby sprawdzić wyrównanie na oko, aby zidentyfikować możliwe nowe gatunki Caenorhabditis, patrz krok 9.8 powyżej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Przykłady wizualizacji wyrównania NCBI BLAST. (A) Przykład sekwencji zapytania ITS2 izolatora dopasowanej do sekwencji tematycznej C. kamaaina. (1) Procentowa identyczność wyrównania (89%), która jest niska dla trafienia w górę BLAST. (2) Rozbieżność między sekwencją zapytania i tematu (od G do A). (3) Przerwa między czterema parami zasad w sekwencji obiektowej wykonana przez algorytm wyrównania; Luki w zapytaniu lub temacie wskazują na słabe wyrównanie. (4) Uogólniony obszar w środku wyrównania z wieloma niezgodnościami i przerwami. Region taki jak ten sugeruje, że sekwencja zapytań może pochodzić od nowego gatunku Caenorhabditis. Pokazany jest rzeczywisty przykład ułożenia nowego gatunku, C. oiwi, który został odkryty w 2017 roku. (B) Przykład dobrego dopasowania między sekwencją zapytań ITS2 izolatu a sekwencją tematyczną. (5) Procent identyczności dopasowania (99%), co zwykle oznacza, że sekwencja zapytania pochodzi z izolatu tego samego gatunku co podmiot. (6) Centralny obszar zestrojenia z doskonałą tożsamością. Region taki jak ten sugeruje, że zapytanie izolować jest prawdopodobnie tym samym gatunkiem, co podmiot. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Produkty SSU i ITS2 PCR. Górny żel przedstawia produkty PCR wygenerowane za pomocą zestawu starterów SSU dla 12 reprezentatywnych próbek. Drabina DNA znajduje się po lewej stronie jako odniesienie. Produkty SSU PCR przeciwko nicieniom Caenorhabditis mają około 500 pz długości. Próbki 2-12 amplifikowane zestawem starterów SSU, ale próbka pierwsza nie. Brak amplikonu SSU o sile 500 pz dla pierwszej próbki sugeruje, że materiał do lizy był złej jakości i próbka musi zostać ponownie zmielona. Dolny żel pokazuje produkty PCR wygenerowane za pomocą zestawu starterów ITS2 dla tych samych 12 próbek, które pokazano w górnym żelu. Drabinka i próbki są w tej samej orientacji dla obu żeli. Sześć z 12 próbek nie amplifikowało się zestawem starterów ITS2. Próbki z pasmami SSU i ITS2 są sekwencjonowane metodą Sangera i identyfikowane na podstawie podobieństwa sekwencji przy użyciu algorytmu NCBI BLAST. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: C-labels. Plik PDF zawierający 2500 unikalnych etykiet C. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Etykiety S. Plik PDF zawierający 5000 unikalnych etykiet S. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Materiały terenowe. Lista przewozowa materiałów używanych w terenie do pobierania próbek nicieni. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 2: Przepisy PCR i warunki termocyklera. Tabela receptur PCR i warunków termocyklera dla PCR ITS2 i SSU. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 3: Receptury do elektroforezy. Przepis na 0,5 M pH 8,0 roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i roztwór buforowy octanu TRIS (TAE). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.