Izolacja i charakterystyka komórek odpornościowych z mikropreparowanych splotów naczyniówkowych myszy

Summary

To badanie wykorzystuje cytometrię przepływową i dwie różne strategie bramkowania na izolowanych perfundowanych splotach naczyniówkowych mózgu myszy; ten protokół identyfikuje główne podzbiory komórek odpornościowych, które wypełniają tę strukturę mózgu.

Abstract

Mózg nie jest już uważany za organ funkcjonujący w izolacji; coraz więcej dowodów sugeruje, że zmiany w obwodowym układzie odpornościowym mogą pośrednio kształtować funkcjonowanie mózgu. Na granicy między mózgiem a krążeniem ogólnoustrojowym sploty naczyniówkowe (CP), które stanowią barierę krew-płyn mózgowo-rdzeniowy, zostały podkreślone jako kluczowe miejsce komunikacji peryferia-mózg. CP wytwarzają płyn mózgowo-rdzeniowy, czynniki neurotroficzne i cząsteczki sygnałowe, które mogą kształtować homeostazę mózgu. CP są również aktywną niszą immunologiczną. W przeciwieństwie do miąższu mózgu, który w warunkach fizjologicznych jest zamieszkiwany głównie przez mikroglej, niejednorodność komórek odpornościowych CP podsumowuje różnorodność występującą w innych narządach obwodowych. Różnorodność i aktywność komórek odpornościowych CP zmienia się wraz ze starzeniem się, stresem i chorobami oraz moduluje aktywność nabłonka CP, pośrednio kształtując w ten sposób funkcję mózgu. Celem tego protokołu jest wyizolowanie mysiego CP i zidentyfikowanie około 90% głównych podzbiorów immunologicznych, które je zasiedlają. Metoda ta jest narzędziem do scharakteryzowania komórek odpornościowych CP i zrozumienia ich funkcji w orkiestracji komunikacji peryferiologicznej z mózgiem. Proponowany protokół może pomóc w rozszyfrowaniu, w jaki sposób komórki odpornościowe CP pośrednio modulują funkcjonowanie mózgu w zdrowiu i w różnych stanach chorobowych.

Introduction

Od czasu odkrycia bariery krew-mózg przez Paula Erhlicha pod koniec^{XIX wieku,} mózg jest uważany za praktycznie oddzielony od innych organów i krwiobiegu. Jednak w ostatniej dekadzie pojawiła się koncepcja, że funkcja mózgu jest kształtowana przez różne czynniki biologiczne, takie jak mikrobiota jelitowa oraz ogólnoustrojowe komórki i sygnały odpornościowe^1,2,3,4. Równolegle inne granice mózgu, takie jak opony mózgowe i sploty naczyniówkowe (CP), zostały zidentyfikowane jako interfejsy aktywnej komunikacji immunologicznej i mózgowej, a nie jako obojętne tkanki barierowe^5,6,7,8.

CP stanowią barierę krew-płyn mózgowo-rdzeniowy, jedną z granic oddzielających mózg od peryferii. Znajdują się one w każdej z czterech komór mózgu, tj. trzeciej, czwartej i obu komorach bocznych i sąsiadują z obszarami zaangażowanymi w neurogenezę, takimi jak strefa podkomorowa i strefa subziarnista hipokampa³. Strukturalnie CP składają się z sieci naczyń włosowatych krwi otoczonych monowarstwą komórek nabłonkowych, które są połączone ścisłymi i przylegającymi połączeniami^9,10. Główne fizjologiczne role nabłonka CP obejmują produkcję płynu mózgowo-rdzeniowego, który wypłukuje mózg z metabolitów odpadowych i agregatów białkowych, a także produkcję i kontrolowane przechodzenie z krwi do mózgu różnych cząsteczek sygnałowych, w tym hormonów i czynników neurotroficznych^11,12,13. Cząsteczki wydzielane z CP kształtują aktywność mózgu, tj. poprzez modulację neurogenezy i funkcji mikrogleju^{14,15,16,17,18,19}, co sprawia, że CP ma kluczowe znaczenie dla homeostazy mózgu. CP angażują się również w różne działania immunologiczne; mając na uwadze, że głównym typem komórek odpornościowych w miąższu mózgu w warunkach niepatologicznych jest mikroglej, różnorodność populacji komórek odpornościowych CP jest tak szeroka, jak w narządach obwodowych^3,7, co sugeruje, że w CP działają różne kanały regulacji immunologicznej i sygnalizacji.

Przestrzeń między komórkami śródbłonka i nabłonka, zrąb CP, jest głównie zaludniona przez makrofagi związane z granicą (BAM), które wyrażają prozapalne cytokiny i cząsteczki związane z prezentacją antygenu w odpowiedzi na sygnały zapalne³. Inny podtyp makrofagów, komórki splotu Kolmera, są obecne na wierzchołkowej powierzchni nabłonka CP < sup class="xref">20. Zrąb CP jest również niszą dla komórek dendrytycznych, komórek B, komórek tucznych, bazofili, neutrofili, wrodzonych komórek limfoidalnych i limfocytów T, które są w większości limfocytami T pamięci efektorowej zdolnymi do rozpoznawania antygenów ośrodkowego układu nerwowego^{7,21,22,23,24}. Ponadto skład i aktywność populacji komórek odpornościowych w CP zmienia się w wyniku zaburzeń ogólnoustrojowych lub zaburzeń mózgu, na przykład podczas starzenia się^{10,14,15,21,25}, perturbacja mikrobioty⁷, stress^26, oraz choroba^27,28. Warto zauważyć, że zasugerowano, że zmiany te pośrednio kształtują funkcjonowanie mózgu, tj. przesunięcie limfocytów T CP CD4⁺ w kierunku zapalenia Th2 występuje w starzeniu się mózgu i wyzwala sygnalizację immunologiczną z CP, która może kształtować związany ze starzeniem się spadek funkcji poznawczych^{14,15,21,25,29}. Wyjaśnienie właściwości komórek odpornościowych CP miałoby zatem kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia ich funkcji regulacyjnej w fizjologii i wydzielaniu nabłonka CP, a tym samym dla rozszyfrowania ich pośredniego wpływu na funkcjonowanie mózgu w warunkach zdrowych i chorobowych.

CP to małe struktury, które zawierają tylko kilka komórek odpornościowych. Ich izolacja wymaga mikrodysekcji po wstępnym etapie perfuzji; W przeciwnym razie komórki odpornościowe w krwiobiegu stanowiłyby poważne zanieczyszczenia. Protokół ten ma na celu scharakteryzowanie podzbiorów limfocytów szpikowych i limfocytów T CP za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta identyfikuje około 90% populacji komórek odpornościowych, które tworzą CP myszy w warunkach niezapalnych, zgodnie z ostatnio opublikowanymi pracami wykorzystującymi inne metody do analizy heterogeniczności immunologicznego CP^7,10,28. Protokół ten można zastosować do scharakteryzowania zmian w kompartmencie komórek odpornościowych CP z chorobą i innymi paradygmatami eksperymentalnymi in vivo.

Protocol

Wszystkie procedury zgodne z wytycznymi Komisji Europejskiej dotyczącymi postępowania ze zwierzętami laboratoryjnymi, dyrektywa 86/609/EWG. Zostały one zatwierdzone przez komisje etyczne nr 59, CETEA/CEEA nr 089, pod numerem dap210067 oraz APAFIS #32382-2021070917055505 v1.

1. Przygotowanie materiałów

1. Wszystkie przeciwciała należy przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.
2. Roztwór podstawowy DAPI (1 mg/ml): Zawiesić proszek w PBS-^/- (tabela materiałów), podwielokrotność, i przechowywać w temperaturze -20 °C.
3. Roztwór roboczy DAPI (0,1 mg/ml): Rozcieńczyć roztwór podstawowy DAPI PBS-^/- w stosunku 1:10.
4. Bufor do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS): Przygotować 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (tabela materiałów) w PBS-^/-.
5. Roztwór podstawowy kolagenazy dożylnej (20 U/μL): Zawiesić proszek w PBS^+/+ (tabela materiałów), podwielokrotność, i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   UWAGA: Kolagenaza IV wymaga, aby MgCl₂ był w pełni aktywny; nie zamrażać i nie rozmrażać roztworu kolagenazy dożylnej.
6. Roztwór anestezjo-przeciwbólowy: Wymieszaj 150 μl ketaminy (150 mg/kg), 25 μl ksylazyny (5 mg/kg) i 330 μl buprecare (0,1 mg/kg) w 1 ml PBS-^/-.
   UWAGA: Roztwór znieczulająco-przeciwbólowy należy przygotować doraźnie i nie przechowywać go dłużej niż jeden dzień.
7. Roztwór heparyny (100 j./ml): Zawiesić proszek w PBS-^/-.
8. Przygotować zestaw do infuzji łączący rurkę z karafką Erlenmeyera wypełnioną PBS^-/-. Podłączyć igłę 23 G do końca rurki infuzyjnej. Otwórz wkładkę infuzyjną i pozwól PBS działać, aż w probówce nie będzie pęcherzyków powietrza.
9. Przygotuj lupę lornetkową wyposażoną w światło.

2. Obudowa myszy C57BL/6

1. Do analizy limfocytów szpikowych lub limfocytów T CP użyj czterech myszy dla każdej i połącz cztery CP (po dwie z każdej komory bocznej, trzeciej komory i czwartej komory CP; w sumie dla ośmiu myszy). Brak łączenia CP niesie ze sobą ryzyko niewykrycia rzadkich populacji immunologicznych w CP ze względu na ich niską liczebność.
2. Pozwól myszom zaaklimatyzować się przez co najmniej 7 dni przed jakimkolwiek eksperymentem. Trzymaj myszy w warunkach wolnych od patogenów w stałej temperaturze i wilgotności, w cyklu 12/12 godzin lub 14/10 godzin światło/ciemność, z wodą i standardowym granulem pokarmu ad libitum.

3. Perfuzja PBS i sekcja mózgu

1. Zważyć każdą mysz i wstrzyknąć dootrzewnowo 10 μl/g roztworu mieszanki znieczulającej i przeciwbólowej (krok 1.6).
2. Odczekaj około 30 minut, aby uzyskać skuteczne działanie przeciwbólowe (sprawdź głębokość znieczulenia, ściskając palce myszy).
3. Umieść znieczuloną mysz płasko na plecach, na wsporniku do sekcji i przyklej jej dłonie do wspornika do sekcji.
4. Szczypiąc skórę zwierzęcia kleszczami i nożyczkami, otwórz brzuch, przeponę i klatkę piersiową, aby odsłonić serce.
   UWAGA: Kiedy klatka piersiowa jest otwarta, mózg staje się niedotleniony. Trzeba precyzyjnie i szybko przechodzić przez kolejne etapy perfuzji.
5. Wstrzyknąć 20 μl 100 j/ml roztworu heparyny bezpośrednio do lewej komory.
6. Cienkimi nożyczkami wykonaj nacięcie co najmniej 3 mm w prawym przedsionku, aby krew mogła wypłynąć z organizmu.
7. Bezpośrednio po tym należy wprowadzić igłę 23 G umieszczoną na końcu rurki infuzyjnej przez końcówkę lewej komory.
8. Otwórz system infuzyjny na maksimum i poczekaj na pełną perfuzję: Za pomocą igły 23 G, przy natężeniu przepływu około 6 ml/min, perfuzja jest zakończona w ciągu 3 minut.
   UWAGA: Równomierne przebarwienia narządów, takich jak wątroba, świadczą o skuteczności perfuzji.
9. Zamknąć system infuzyjny i wyjąć igłę z komory serca.
10. Usuń taśmę z dłoni myszy. Umieść mysz w pozycji brzusznej.
11. Szczypiąc skórę zwierzęcia kleszczami i nożyczkami, usuń skórę czubka głowy od oczu do uszu.
12. Za pomocą nożyczek przeciąć czaszkę najpierw między oczami, a następnie bocznie od każdego oka do rdzenia kręgowego tuż nad mięśniami żwaczy. W tym celu użyj kończyny nożyczek i postępuj delikatnie, aby uniknąć uszkodzenia mózgu nożyczkami.
13. Otwórz czaszkę kleszczami, ściskając ją od końca między oczami.
14. Użyj nożyczek, aby przeciąć rdzeń kręgowy i wydobyć mózg za pomocą kleszczy, umieszczając ich dwa punkty po bocznej stronie mózgu, aby go przechylić i umieścić na szalce Petriego wypełnionej lodowatym PBS^+/+. CP są następnie natychmiast zbierane.
    UWAGA: Sprawdź, czy mózg nie ma przebarwień, aby zweryfikować skuteczność perfuzji.

4. Wycięcie splotu naczyniówkowego z mózgu

1. Umieść mózg grzbietową stroną do góry na szalce Petriego i poniżej celów lup obuocznych.
2. Za pomocą kleszczy, aby utrzymać mózg na miejscu, włóż dwa końce innych kleszczy w dół przez linię środkową między półkulami.
3. Użyj kleszczy, aby odciągnąć korę z modzelem i hipokampem od przegrody, odsłaniając komorę boczną i część trzeciej komory.
4. Zidentyfikuj boczny CP jako długą zasłonę wyściełającą boczną komorę, która rozszerza się na obu końcach. Użyj dwóch końców cienkich kleszczy, aby złapać boczne CP. Uważaj, aby zebrać trójkątną tylną część, która może być ukryta przez tylny fałd hipokampa.
5. Odciągnij korę z ciałem modzelowatym i hipokampem przeciwległej półkuli od przegrody, aby odsłonić całą trzecią komorę i przeciwległą komorę boczną.
6. Zbierz cienkimi kleszczami trzeci punkt kontrolny, który można zidentyfikować jako krótką strukturę o ziarnistym wyglądzie powierzchni.
7. Zbierz drugi boczny CP.
8. Włóż dwa końce kleszczy między móżdżek a śródmózgowie. Odłącz móżdżek od mostu i rdzenia, aby odsłonić czwartą komorę.
9. Zidentyfikuj czwarty CP jako długą kulistą strukturę o ziarnistym aspekcie powierzchni, która wyściela czwartą komorę od bocznego prawego końca do lewego końca między móżdżkiem a rdzeniem. Zbierz czwarte CP za pomocą cienkich kleszczy.
   UWAGA: Powłoka kleszczy na bazie silanu może zapobiegać lepkości CP na kleszczach.
10. Powtórz kroki 3.1-4.9 dla każdej z pozostałych siedmiu myszy. W międzyczasie zebrane CP można tymczasowo przechowywać w tubie umieszczonej na lodzie.

5. Przygotowanie próbek do analizy metodą cytometrii przepływowej

1. Napełnij probówkę zawierającą wszystkie wypreparowane CP do 750 μl PBS^+/+.
   UWAGA: Osadzanie wypreparowanego CP za pomocą cienkich kleszczy w probówce przynosi niewielką objętość PBS^+/+. Raczej uzupełnij istniejącą objętość do 750 μl niż usuń ją i zastąp świeżymi 750 μl PBS^+/+, aby uniknąć możliwej utraty tkanki CP.
2. Dodać 15 μl 20 j./μl roztworu podstawowego kolagenazy dożylnej (patrz krok 1.5), aby uzyskać końcowe stężenie 400 j./mL.
   UWAGA: DNAza I (150 μg/ml) może zapobiegać nadmiernemu zlepianiu się komórek.
3. Inkubować CP z kolagenazą IV w temperaturze 37 °C przy łagodnym mieszaniu (300 obr./min) przez 45 min.
4. Delikatnie pipetuj w górę i w dół około 10 razy, aby sfinalizować dysocjację CP.
5. Napełnij probówkę CP do 1,5 ml buforem MACS (patrz krok 1.4 przepisu), aby zatrzymać aktywność kolagenazy dożylnie.
   UWAGA: Aktywność kolagenazy dożylnej zostaje zatrzymana w niskiej temperaturze i zahamowana przez albuminę surowicy.
6. Odwirować komórki w temperaturze 500 x g, przez 5 minut, w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i przemyć komórki 1,5 ml buforu MACS.
7. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 220 μl buforu MACS.
8. Oddzielić podwielokrotność 10 μl od zawiesiny komórek, która ma być użyta jako niebarwiona kontrola (następny krok 5.18).
9. Oddzielić podwielokrotność 10 μl od zawiesiny komórek, która ma być użyta jako kontrola wybarwiona mono DAPI (następny krok 5.12).
10. Pozostałe 200 μl należy wstępnie inkubować z przeciwciałem blokującym anty-mysie CD16/CD32 (1:100) przez 20 minut, w temperaturze 4 °C, w celu zablokowania niespecyficznych oddziaływań, w których pośredniczy Fc.
11. Podziel komórki na dwie probówki o pojemności 100 μl (jedna do analizy komórek szpikowych, druga do analizy limfocytów T) (następny krok 5.14).
12. Pobrać próbkę z 10 μl komórek do kontroli wybarwionej mono DAPI (krok 5.9) i wypełnić ją do 100 μl buforem MACS (następny krok 5.14).
13. Przygotować jedenaście nowych probówek zawierających 100 μl MACS dla przeciwciała barwionego mono (krok 5.14.4) i całkowicie barwionego (krok 5.14.5) i dodać kroplę kulek kompensacyjnych do każdej z nich.
    UWAGA: Elementy sterujące kompensacją pozwolą ustawić napięcie lasera do wykrywania fluorescencji i ocenić potencjalną detekcję niespecyficznego sygnału barwnika fluorescencyjnego w innych kanałach, które będą dalej kompensowane.
14. Inkubacja przeciwciał w próbkach:
    1. Próbka szpiku: Dodaj 0,1 mg/ml DAPI (1:100) (patrz krok 1.3), FITC anty-mysz CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 anty-mysz CD11b (1:100), APC anty-mysz CX₃CR1 (1:100), BV711 anty-mysz Ly6C (1:100), PE anty-mysz F4/80 (1:100) i APC-Cy7 anty-mysz IA-IE (1:100).
    2. Próbka limfocytów T: Dodaj 0,1 mg / ml DAPI (1:100), FITC anty-mysie CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 anty-mysie CD11b (1:100), APC anty-mysie TCRβ (1:100), PE anty-mysie CD8a (1:100) i APC-Cy7 anty-mysie CD4 (1:50).
    3. Kontrola wybarwiona mono DAPI (od kroku 5.12): Dodać 0,1 mg/ml DAPI (1:100).
    4. Monobarwione kulki kompensacyjne przeciwciała: Dodaj każde z dziewięciu wcześniej stosowanych przeciwciał dla próbek limfocytów szpikowych i limfocytów T (to samo rozcieńczenie), oddzielnie (po jednym dla każdej probówki) do dziewięciu probówek zawierających kulki.
       UWAGA: Kontrole kompensacji monobarwionej pozwolą na określenie dodatnich pików fluorescencji dla każdego z użytych markerów fluorescencyjnych podczas etapu kompensacji. Analizator porówna je z sygnałem ujemnym obserwowanym w niebarwionych komórkach kontrolnych CP.
    5. Całkowicie barwione kulki kompensacyjne przeciwciał: Dodaj wszystkie przeciwciała używane do barwienia szpiku do jednej probówki, a te używane do barwienia limfocytów T do drugiej.
       UWAGA: Całkowicie zabarwione elementy sterujące kompensacją pozwolą ustawić napięcie każdej detekcji lasera fluorescencyjnego i ocenić potencjalną detekcję niespecyficznego sygnału barwnika fluorescencyjnego w innych kanałach.
    6. Inkubować przez 30-45 minut na lodzie, chronić przed światłem.
15. Napełnij wszystkie probówki do 1,5 ml buforem MACS. Odwirować komórki i kulki kompensacyjne w temperaturze 500 x g, przez 5 minut, w temperaturze 4 °C.
16. Odrzucić supernatant i przemyć komórki i kulki kompensacyjne w 1,5 ml buforu MACS.
17. Odwirować komórki i kulki kompensacyjne w temperaturze 500 x g, przez 5 minut, w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
18. Ponownie zawiesić ogniwa i kulki kompensacyjne w 500 μl buforu MACS. Napełnij niezabarwioną kontrolę (krok 5.8) do 500 μl buforem MACS.
19. Przefiltruj każdą probówkę z komórkami CP przez sitko o wielkości 70 μm (niebarwione CP, mono-barwione kontrole DAPI oraz próbki komórek szpikowych i T).

6. Cytometria przepływowa

UWAGA: Cytometr przepływowy używany w tym protokole jest wyposażony w następujące 5 laserów: laser UV 355 nm, laser fioletowy 405 nm, laser niebieski 488 nm, laser żółto-zielony 561 nm i laser czerwony 637 nm.

1. Wykonuj codzienne kontrole jakości cytometru za pomocą konfiguracji cytometru, interfejsu śledzenia (CST) i kulek kontrolnych CST, aby zapewnić spójność między analizami, jakością przyrządu i stałą docelową intensywnością fluorescencji.
2. Aby skonfigurować eksperyment z cytometrią przepływową, utwórz nowy eksperyment z wykresami dwuwymiarowymi i histogramami. Upewnij się, że uwzględniono wykresy obszaru rozproszenia do przodu (FSC-A) i obszaru rozproszonego bocznego (SSC-A), a także wykresy histogramu dla każdego koloru, aby monitorować akwizycję.
3. Zdefiniuj morfologię komórki, ustawiając napięcie PMT dla parametrów FSC-A i SSC-A na niebarwionych kontrolnych komórkach CP.
4. Zdefiniuj napięcia każdego markera fluorescencyjnego, ustawiając ujemne piki fluorochromów na niebarwionych kontrolnych komórkach CP i dodatnie piki fluorochromów za pomocą kulek kompensacyjnych wybarwionych wszystkimi przeciwciałami i upewniając się, że sygnały detektora nie wykraczają poza skalę i nie są zbyt silnie wykrywane krzyżowo w innych kanałach.
5. Utwórz macierz kompensacji, aby przeanalizować każdą z kontrolek kompensacji jednokolorowej. Po bramkowaniu na odpowiednich populacjach FSC-A/SSC-A sprawdź pojedyncze barwione kontrole na wykresach histogramu i zapisuj kontrole kompensacji. Po zarejestrowaniu wszystkich pojedynczo barwionych próbek obliczyć matrycę kompensacji.
6. Rejestruj wszystkie zdarzenia wykryte zarówno dla populacji limfocytów szpikowych, jak i T.

7. Bramkowanie komórek szpikowych CP

1. Wybierz FSC-A vs. SSC-A i bramkę dla komórek (w zależności od rozmiaru).
2. Utwórz bramkę potomną dla pojedynczych komórek z FSC-A w funkcji wysokości rozproszenia do przodu (FSC-H).
3. Utwórz bramkę potomną dla aktywnych komórek z DAPI i FSC-A, aby wykluczyć komórki DAPI⁺.
4. Utwórz bramkę potomną dla komórek odpornościowych CD45⁺ z CD45 vs. FSC-A.
5. Utwórz bramkę potomną z komórek CD45⁺ i wybierz CD11b vs. F4/80, zidentyfikuj następujące dwie grupy: populacje CD11b⁺ F4/80⁺ i CD11b⁺ F4/80^- (następny krok 7.8).
6. Utwórz bramkę potomną dla komórek CD11b⁺ F4/80⁺ i wybierz CX₃CR1 vs. IA-IE. Zidentyfikuj zarówno makrofagi CX₃CR1⁺ IA-IE⁺ BAM, które są dalej określane jako CD11b⁺ F4/80^high CX₃CR1⁺ IA-IE⁺ BAM, jak i CX₃CR1⁺ IA-IE-IE^-.
7. Utwórz bramkę potomną dla makrofagów CD11b⁺, F4/80⁺, CX_{, 3}CR1⁺, IA-IE^- i wybierz F4/80 vs. CD11b. Zidentyfikuj zarówno populacje^pośrednie CD11b^{o wysokim F4}/80, jak i CD11b⁺ F4/80, które są dalej nazywane CD11b^high F4/80^intermediate CX₃CR1⁺ IA-IE- Epiplexus macrophages Kolmera i CD11b⁺ F4/80^high CX₃CR1⁺ IA-IE^- BAM, odpowiednio.
   UWAGA: Ogniwa CD11b^high F4 / 80^intermediate CX₃CR1 ⁺ IA-IE- i CD11b⁺ F4 / 80^high CX₃CR1 ⁺ IA-IE^- wydawały się nieco wymieszane między F4 / 80^{pośrednim wysokim} poziomem F4 / 80 a CD11b^wysokim poziomem CD11b ⁺.
8. Z populacji CD11b⁺ F4/80^- (krok 7.5), bramka dla Ly6C vs. IA-IE. Wybierz zarówno IA-IE⁺ Ly6C^{- populacji,} jak ^{i IA-IE-} Ly6C+ komórki, które głównie odpowiadają monocytom/neutrofilom.
   UWAGA: Wysoka obecność komórek IA-IE-Ly6C⁺ prawdopodobnie odzwierciedla problemy ze skutecznością perfuzji zwierząt bez stanu zapalnego; Ich liczebność powinna być niska.
9. Utwórz bramkę potomną dla populacji CD11b⁺ F4^/80- IA-IE⁺ Ly6C^- i wybierz CD11b vs. CX₃CR1, zidentyfikuj zarówno populacje CD11b^{o wysokim} CX₃CR1, jak i CD11b⁺ CX₃CR1^-.

8. Bramkowanie limfocytów T CP

1. Wybierz FSC-A vs. SSC-A i bramkę dla komórek (w zależności od rozmiaru).
2. Utwórz bramkę potomną dla pojedynczych komórek z FSC-A w funkcji wysokości rozproszenia do przodu (FSC-H).
3. Utwórz bramkę potomną dla aktywnych komórek z DAPI i FSC-A, aby wykluczyć komórki DAPI⁺.
4. Utwórz bramkę potomną dla komórek odpornościowych CD45⁺ z CD45 vs. FSC-A.
5. Utwórz bramkę potomną z komórek CD45 ⁺ i wybierz TCRβ vs. CD11b. Wyklucz komórki szpikowe CD11b ⁺ i wybierz populację limfocytów T TCRβ ⁺ CD11b^.
6. Utwórz bramkę potomną dla populacji TCRβ⁺ CD11b^- i wybierz CD4 zamiast CD8a. Zidentyfikuj zarówno limfocyty T CD8-CD4+, jak i limfocyty T CD8⁺ CD4^-.

Results

Przedstawione tutaj analizy cytometrii przepływowej z powodzeniem ujawniły główne podzbiory limfocytów szpikowych i limfocytów T (Rysunek 1 i Rysunek 2, odpowiednio), oraz ich względną całkowitą liczbę na mysz w wysoce powtarzalny sposób (Rysunek 3).

Analiza cytometrii przepływowej komórek szpikowych wykazała, że CP są wypełnione przez CD11b⁺ CX₃CR1⁺ F4/80^wysoki BAM, ...

Discussion

Badania mające na celu zrozumienie immunologicznego wkładu w homeostazę mózgu i choroby koncentrowały się głównie na komórkach znajdujących się w miąższu mózgu, zaniedbując granice mózgu, takie jak CP, które mimo to są kluczowymi czynnikami przyczyniającymi się do funkcjonowania mózgu ^2,3. Analiza populacji komórek odpornościowych w CP jest trudna ze względu na mały rozmiar CP, małą liczbę rezydentnych komórek odpornościowych i skomplikowany dostęp do tej tkanki....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
anty-mysie CD16/CD32	BD Biosciences	553142	Przeciwciało cytometrii przepływowej
Albumina bydlęca	MP Biomedicals	160069	Odczynnik blokujący
APC anty-mysie CX3CR1	BioLegend	149008	Przeciwciało do cytometrii przepływowej
APC anty-mysie TCRb	BioLegend	109212	Przeciwciało do cytometrii przepływowej
APC-Cy7 anty-mysie CD4	BioLegend	100414	Przeciwciało do cytometrii przepływowej
APC-Cy7 przeciwko mysim IA-IE	BioLegend	107628	Przeciwciało do cytometrii przepływowej
BD FACSymphony A5 Analizator komórek	BD Biosciences	Analizator cytometrii
BV711 przeciw myszom Ly6C	BioLegend	128037	Przeciwciało cytometrii przepływowej
Kolagenaza IV	Gibco	17104-019	Enzym do dysocjacja tkanki CP
DAPI	Thermo Scientific	62248	Żywy/martwy marker
EDTA			do chelatora jonów
	FST	14058-11	Narzędzie do preparowania
FITC anty-mysie CD45	BioLegend	103108	Przeciwciało cytometrii przepływowej
Wkładka infuzyjna kontrolera przepływu	CareFusion	RG-3-C	Perfuzja krwi wstawka
Oprogramowanie FlowJo	do oprogramowania	BD Biosciences
	FST	11018-12	Narzędzie do preparacji
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149-10KU	Antykoagulant
Imalgene	Boehringer Ingelheim		Ketamina, znieczulenie
OneComp eBeads	Invitrogen	01-1111-42	Koraliki kontrolne do realizacji kompensacja
PBS-/-	Gibco	14190-094	Bufor
PBS+/+	Gibco	14040-091	Bufor
PE anty-mysie CD8a	BioLegend	100708	Przeciwciało cytometrii przepływowej
PE anty-mysie F4/80	BioLegend	123110	Przeciwciało cytometrii przepływowej
PE-Dazzle 594 anty-mysie CD11b	BioLegend	101256	Cytometria przepływowa przeciwciało
Rompun	Bayer		Ksylazyna,
cienkie kleszcze	Dumoxel Biology	11242-40	Narzędzie do preparowania
Vetergesic	Ceva		Buprenorfina, przeciwbólowe