Artykuł metodologiczny

Badanie interakcji biomolekularnych między molekularnym chaperonem Hsp90 a jego klientem, kinazą białkową Cdc37, przy użyciu technologii biodetekcji z efektem polowym

DOI:

10.3791/63495

⸱

31 marca 2022

 ,  ,  ,  , 
1The Azrieli Faculty of Medicine in the Galilee, Bar-Ilan University, 2Asian Liver Center, Department of Surgery, Stanford University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biosensing (FEB) to bezznacznikowa technika wykrywania interakcji biomolekularnych. Mierzy prąd elektryczny przepływający przez bioczujnik grafenowy, do którego unieruchomione są cele wiążące. Do oceny interakcji biomolekularnych między Hsp90 i Cdc37 wykorzystano technologię FEB i wykryto silną interakcję między tymi dwoma białkami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje biomolekularne odgrywają wszechstronne role w licznych procesach komórkowych, regulując i koordynując funkcjonalnie istotne zdarzenia biologiczne. Biomolekuły, takie jak białka, węglowodany, witaminy, kwasy tłuszczowe, kwasy nukleinowe i enzymy, są podstawowymi elementami budulcowymi istot żywych; Łączą się w złożone sieci w biosystemach, aby zsynchronizować niezliczone wydarzenia życiowe. Białka zazwyczaj wykorzystują złożone sieci interaktomu do wykonywania swoich funkcji; Dlatego obowiązkowa jest ocena takich interakcji, aby rozwikłać ich znaczenie w komórkach zarówno na poziomie komórkowym, jak i organizmu. W tym celu wprowadzamy szybko rozwijającą się technologię, biodetekcję z efektem pola (FEB), w celu określenia określonych interakcji biomolekularnych. FEB to laboratoryjna, bezznacznikowa i niezawodna technika wykrywania biomolekularnego do określania określonych interakcji i wykorzystująca wysokiej jakości bioczujniki elektroniczne. Technologia FEB może monitorować interakcje w zakresie nanomolowym dzięki biokompatybilnym nanomateriałom zastosowanym na powierzchni bioczujnika. Jako dowód słuszności koncepcji, wyjaśniono interakcję białko-białko (PPI) między białkiem szoku cieplnego 90 (Hsp90) a cyklem podziału komórki 37 (Cdc37). Hsp90 jest zależnym od ATP molekularnym chaperonem, który odgrywa istotną rolę w fałdowaniu, stabilności, dojrzewaniu i kontroli jakości wielu białek, regulując w ten sposób wiele ważnych funkcji komórkowych. Cdc37 jest uważany za molekularny białkowy opiekuńczy specyficzny dla kinazy białkowej, ponieważ specyficznie rozpoznaje i rekrutuje kinazy białkowe do Hsp90 w celu regulacji ich dalszych szlaków transdukcji sygnału. W związku z tym Cdc37 jest uważany za współopiekuna Hsp90. Szlak kinazy opiekuńczej (kompleks Hsp90 / Cdc37) jest hiperaktywowany w wielu nowotworach złośliwych, sprzyjając wzrostowi komórek; W związku z tym jest potencjalnym celem terapii przeciwnowotworowej. Niniejsze badania demonstrują skuteczność technologii FEB z wykorzystaniem systemu modelu Hsp90/Cdc37. FEB wykrył silny PPI między tymi dwoma białkami (wartości KD 0,014 μM, 0,053 μM i 0,072 μM w trzech niezależnych eksperymentach). Podsumowując, FEB to bezetykietowa i ekonomiczna platforma do wykrywania PPI, która oferuje szybkie i dokładne pomiary.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje biomolekularne:
Białka są niezbędnymi częściami organizmów i uczestniczą w wielu szlakach molekularnych, takich jak metabolizm komórkowy, struktura komórki, sygnalizacja komórkowa, odpowiedzi immunologiczne, adhezja komórek i inne. Podczas gdy niektóre białka pełnią swoje funkcje niezależnie, większość białek oddziałuje z innymi białkami za pomocą interfejsu wiążącego w celu koordynowania prawidłowej aktywności biologicznej1.

Interakcje biomolekularne mogą być klasyfikowane głównie na podstawie odrębnych cech strukturalnych i funkcjonalnych zaangażowanych białek2, na przykład na podstawie powierzchni białek, złożonej stabilności lub trwałości interakcji3. Identyfikacja podstawowych białek i ich ról w interakcjach biomolekularnych jest niezbędna do zrozumienia mechanizmów biochemicznych na poziomie molekularnym4. Obecnie istnieją różne podejścia do wykrywania tych interakcji5: in vitro6, in silico7, in live cells8, ex vivo9, oraz in vivo10, z których każda ma swoje mocne i słabe strony.

Testy in vivo są wykonywane przy użyciu całego zwierzęcia jako narzędzia eksperymentalnego11, a testyex vivo są wykonywane na ekstraktach tkankowych lub całych organach (np. sercu, mózgu, wątrobie) w kontrolowanym środowisku zewnętrznym, zapewniając minimalne zmiany w warunkach naturalnych. Najczęstsze zastosowanie in vivo i ex vivo Badania mają na celu ocenę wpływu farmakokinetyki, farmakodynamiki i toksyczności potencjalnych środków farmakologicznych przed badaniami na ludziach poprzez zapewnienie ich ogólnego bezpieczeństwa i skuteczności12.

Interakcje biomolekularne mogą być również wykrywane w żywych komórkach. Obrazowanie żywych komórek pozwala nam obserwować dynamiczne interakcje, gdy wykonują one reakcje określonego szlaku biochemicznego13. Co więcej, techniki detekcji, takie jak bioluminescencja lub transfer energii rezonansu fluorescencyjnego, mogą dostarczyć informacji o tym, gdzie i kiedy te interakcje zachodzą w komórce14. Chociaż wykrywanie w żywych komórkach dostarcza kluczowych szczegółów, te metodologie wykrywania opierają się na optyce i etykietach, które mogą nie odzwierciedlać rodzimej biologii; Są one również mniej kontrolowane niż metody in vitro i wymagają specjalistycznej wiedzy specjalistycznej do wykonania15.

Metody obliczeniowe in silico są przede wszystkim używane do badań przesiewowych na dużą skalę docelowych cząsteczek przed eksperymentami in vitro. Obliczeniowe metody predykcyjne, komputerowe bazy danych, dokowanie molekularne, ilościowe zależności struktura-aktywność i inne podejścia do symulacji dynamiki molekularnej należą do dobrze ugruntowanych narzędzi in silico16. W porównaniu z pracochłonnymi technikami eksperymentalnymi, narzędzia in silico mogą z łatwością tworzyć prognozy z dużą czułością, ale z ograniczoną dokładnością w zakresie wydajności predykcyjnej17.

Testy in vitro są wykonywane na mikroorganizmach lub cząsteczkach biologicznych poza ich standardowym kontekstem biologicznym. Przedstawienie interakcji biomolekularnych za pomocą metod in vitro ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia funkcji białek i biologii stojącej za złożoną siecią funkcjonowania komórek. Preferowana metodologia oznaczania jest wybierana na podstawie wewnętrznych właściwości białka, wartości kinetycznych oraz trybu i intensywności interakcji18,19.

Interakcja Hsp90/Cdc37:
Szlak kinazy opiekuńczej, łączący Hsp90 i Cdc37, jest obiecującym celem terapeutycznym w biologii nowotworów20. Hsp90 odgrywa kluczową rolę w kontroli cyklu komórkowego, składaniu białek, przeżywalności komórek i szlakach sygnałowych. Białka, które opierają swoje funkcje na Hsp90, są dostarczane do Hsp90 w celu kompleksowania przez ko-chaperon, taki jak Cdc37. Kompleks Hsp90/Cdc37 kontroluje fałdowanie większości kinaz białkowych i służy jako centrum dla wielu wewnątrzkomórkowych sieci sygnalizacyjnych21. Jest to obiecujący cel przeciwnowotworowy ze względu na podwyższoną ekspresję w różnych nowotworach złośliwych, w tym w ostrej białaczce mieloblastycznej, szpiczaku mnogim i raku wątrobowokomórkowym22,23.

Powszechnie stosowane techniki wykrywania interakcji biomolekularnych in vitro
Koimmunoprecypitacja (co-IP) to technika polegająca na swoistości antygen-przeciwciało w celu identyfikacji biologicznie istotnych interakcji24. Podstawową wadą tej metody jest jej niezdolność do wykrywania interakcji o niskim powinowactwie i wartości kinetycznych24. Do określania wartości kinetycznych preferowane są metody biofizyczne, takie jak izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC), powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), interferometria biowarstwowa (BLI) i technologia FEB.

ITC to biofizyczna metoda wykrywania oparta na określeniu energii wiązania wraz z pełną analizą termodynamiczną w celu scharakteryzowania oddziaływań biomolekularnych25. Podstawową zaletą ITC jest to, że nie wymaga żadnego znakowania ani utrwalania białka docelowego. Głównymi trudnościami napotykanymi przez ITC są wysokie stężenie białka docelowego wymagane w jednym eksperymencie oraz trudności w analizie kompleksów niekowalencyjnych spowodowane małymi entalpiami wiązania26. Zarówno SPR, jak i BLI są technikami biofizycznymi bez znaczników, które polegają na unieruchomieniu cząsteczki docelowej na powierzchni czujnika, a następnie na kolejnych wstrzyknięciach analitu na unieruchomiony cel27,28. W SPR mierzy się zmiany współczynnika załamania światła podczas oddziaływań biomolekularnych27; w BLI interferencja w odbitym świetle jest rejestrowana w czasie rzeczywistym jako zmiana długości fali w funkcji czasu28. Zarówno SPR, jak i BLI mają wspólne zalety polegające na oferowaniu wysokiej swoistości, czułości i możliwości wykrywania29. W obu metodach białko docelowe jest unieruchomione na powierzchniach biosensora, a co za tym idzie, może dojść do pewnej utraty natywnej konformacji celu, co utrudnia rozróżnienie między oddziaływaniami specyficznymi i niespecyficznymi30. BLI wykorzystuje drogie jednorazowe biosensory światłowodowe do unieruchomienia celu, a zatem jest kosztowną techniką31. W porównaniu z tymi dobrze znanymi narzędziami do wykrywania biomolekularnego, technologia FEB oferuje niezawodną i bezznacznikową platformę wykorzystującą niskie stężenia nanomolowe do wykrywania biomolekularnego w czasie rzeczywistym z charakterystyką kinetyczną. Technologia FEB pokonuje również wyzwania związane z bulgoczącymi technologiami informacyjno-komunikacyjnymi i jest bardziej opłacalna w porównaniu z SPR lub BLI.

Biosensory oparte na tranzystorach polowych (FET) to rozwijająca się dziedzina wykrywania interakcji biomolekularnych, oferująca różnorodne zastosowania biomedyczne. W systemie FET cele są unieruchomione na chipach biosensorów, a interakcje są wykrywane przez zmiany przewodności32. Unikalną cechą, którą należy wziąć pod uwagę przy opracowywaniu wydajnego biosensora elektronicznego, są właściwości fizykochemiczne, takie jak półprzewodzący charakter i stabilność chemiczna materiału powłokowego użytego do wytworzenia powierzchni czujnika33. Konwencjonalne materiały, takie jak krzem używany do FET, ograniczyły czułość czujników, ponieważ do prawidłowego działania wymagają warstw tlenkowych umieszczonych między kanałem tranzystora a określonym środowiskiem34. Co więcej, tranzystory krzemowe są wrażliwe na środowisko o wysokiej zawartości soli, co utrudnia pomiar interakcji biologicznych w ich naturalnym środowisku. Bioczujnik na bazie grafenu jest przedstawiany jako alternatywa, ponieważ zapewnia doskonałą stabilność chemiczną i pole elektryczne. Ponieważ grafen jest pojedynczą warstwą atomową węgla, jest zarówno niezwykle czuły jako półprzewodnik, jak i chemicznie kompatybilny z roztworami biologicznymi; Obie te cechy są pożądane do generowania kompatybilnych biosensorów elektronicznych35. Niezwykły ultrawysoki potencjał ładowania biomolekuł oferowany przez biosensory pokryte grafenem doprowadził do opracowania technologii FEB na bazie grafenu.

Zasada technologii FEB: FEB to bezznacznikowa technika detekcji biomolekularnej, która mierzy prąd elektryczny przez biosensor grafenowy, do którego unieruchomione są cele wiążące. Interakcje między unieruchomionym białkiem a analitem powodują zmiany prądu, które są monitorowane w czasie rzeczywistym, umożliwiając dokładne pomiary kinetyczne36.

Oprzyrządowanie: System FEB składa się z grafenowego tranzystora polowego (gFET) i elektronicznego czytnika, który stosuje stałe napięcie przez cały czas trwania eksperymentu (Rysunek 1). Analit aplikuje się w roztworze do białka docelowego unieruchomionego na powierzchni biosensora. Kiedy dochodzi do interakcji, zmiana prądu jest mierzona i rejestrowana w czasie rzeczywistym. Wraz ze wzrostem stężenia analitu frakcja związanego analitu również wzrośnie, powodując większe zmiany prądu. Korzystając z oprogramowania do automatycznej analizy dostarczonego z urządzeniem (Tabela materiałów), I-Response jest mierzony i rejestrowany w jednostkach biosensorycznych (BU)37. I-Response definiuje się jako zmianę prądu (I) przez chip biosensora mierzoną w czasie rzeczywistym po interakcji unieruchomionego celu z analitem. Oprogramowanie do automatycznej analizy FEB może analizować zarówno I-Response, jak i C-Response do zdarzeń interakcji dynamicznych, w których C-Response rejestruje zmiany pojemności (C). Zmiany zarówno w I-Response, jak i C-Response odpowiadają bezpośrednio frakcji związanego analitu i mogą być dalej analizowane w celu wygenerowania wartościKD. Domyślną preferencją oprogramowania do automatycznej analizy jest I-Response.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Przegląd konfiguracji eksperymentalnej. (A) Chip na bazie grafenu i czytnik elektroniczny. (B) Przegląd komponentów chipa. Chip jest przymocowany do dwóch elektrod, które dostarczają prąd do systemu. Powierzchnia chipa pokryta jest grafenem, który po aktywacji może związać cel. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Metodologia:
Początkowo aktywowany chip biosensora jest wprowadzany do urządzenia FEB (Rysunek 1), a następnie wykonywane są kroki opisane poniżej: (1) Kalibracja: Eksperyment rozpoczyna się od kalibracji systemu przy użyciu 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS; pH = 7,4) w celu wytworzenia podstawowej odpowiedzi równoważącej. (2) Asocjacja: Analit jest wprowadzany do chipa, a I-Response jest monitorowany aż do osiągnięcia nasycenia wiązaniem. (3) Dysocjacja: Analit jest dysocjowany za pomocą 1x PBS. (4) Regeneracja: Pozostałości analitu są usuwane za pomocą 1x PBS. (5) Mycie: W sumie wykonuje się pięć płukań przy użyciu 1x PBS w celu dokładnego usunięcia związanych i niezwiązanych analitów z chipa.

Analiza:
Analiza danych odbywa się za pomocą w pełni zautomatyzowanego oprogramowania dostarczonego wraz z urządzeniem. Zautomatyzowane oprogramowanie analityczne generuje wykres dopasowania wzgórza z wartością KD. Wykres dopasowania Hilla opisuje związek analitu z białkiem docelowym w funkcji stężeń analitu. Stężenie, przy którym uzyskuje się odpowiedź połówkową, jest proporcjonalne do wartościKD. Niska wartośćK D oznacza wysokie powinowactwo wiązania i na odwrót.

Aby zweryfikować dane uzyskane z eksperymentu Feb, I-Responses są wyodrębniane z każdego punktu odczytu dla każdego stężenia analitu za pomocą oprogramowania do przeglądu/eksportu danych i mogą być eksportowane do innego oprogramowania do analizy statystycznej (patrz Tabela materiałów), jak wyjaśniono poniżej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Rekombinowane białka użyte w tym badaniu, Hsp90 i Cdc37, zostały uzyskane komercyjnie (patrz Tabela Materiałów).

1. Aktywacja chipa

UWAGA: Wszystkie materiały, które mają być użyte w eksperymencie, są wymienione w Tabeli Materiałów. Wszystkie przygotowane roztwory przefiltrować przez sterylny filtr 0,2 μm.

  1. Przygotować roztwór 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karmodiimidu (EDC), dodając 2 mg EDC do 2,5 ml 1 M buforu kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) (pH = 6,0) w probówce o pojemności 15 ml. Przygotować roztwory N-hydroksysulfosukcynimidu (sulfo-NHS), dodając 6 mg sulfo-NHS do 2,5 ml 1 M buforu MES (pH = 6,0) w oddzielnej probówce o pojemności 15 ml. Podamy 50 μl każdego roztworu w niezależnych probówkach i przechowuj w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.
  2. Wymieszać równe objętości roztworu sulfo-NHS piasku EDC (50 μl EDC + 50 μl sulfo-NHS), pipetując w górę iw dół (nie wirować).
    UWAGA: Zmieszany roztwór EDC/sulfo-NHS należy zużyć w ciągu 30 minut, aby utrzymać skuteczne sieciowanie w celu prawidłowej funkcjonalności chipa.
  3. Umieść chip biosensora (5,7 cm x 2,4 cm; patrz tabela materiałów) dostarczony przez firmę na szklanej szalce Petriego z dopasowaną pokrywką. Sugeruje się, że wszystkie etapy funkcjonalizacji związane z aktywacją chipa są wykonywane na szalce Petriego. Nanieść 50 μl 1 M buforu MES (pH = 6,0) na chip bioczujnika, inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie odessać bufor.
  4. Natychmiast nanieść 50 μl roztworu EDC/sulfo-NHS na chip czujnika. Przykryj szalkę Petriego i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór EDC/sulfo-NHS z chipa.
  5. Przepłukać chip jednorazowo 50 μl 1 M buforu MES (pH = 6,0); odessać bufor MES.

2. Docelowe unieruchomienie białka

  1. Wypłucz chip 2x 50 μl 1x PBS (pH = 7,4). Odessać PBS z chipa i dodać cząsteczkę docelową, Hsp90 (50 μL; 500 nM).
    UWAGA: Niezgodność bufora może zrujnować cały eksperyment; dlatego przed eksperymentem ważne jest, aby upewnić się, że cząsteczka docelowa znajduje się w tym samym buforze, który jest używany do kalibracji (np. 1x PBS (pH = 7,4)). W razie potrzeby przed eksperymentem należy przeprowadzić wymianę buforu poprzez dializę przez noc. W tym eksperymencie przeprowadzono całonocną dializę dla obu rekombinowanych białek, Hsp90 i Cdc37, przeciwko 1x PBS (pH = 7,4; patrz tabela materiałów) przy prawidłowej wymianie buforu w temperaturze 4 °C. Stężenie materiału docelowego (w tym przypadku Hsp90) może się różnić w zależności od różnych protokołów doświadczalnych i charakteru materiałów docelowych (białko/peptyd/ligandy).
  2. Przykryj szklaną szalkę Petriego i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór zawierający cząsteczkę docelową i przepłukać 3x 50 μl 1x PBS (pH = 7,4). Odessać 1x roztwór PBS (pH = 7,4) z chipa.
  3. Dodać 50 μl roztworu Quench 1 (3,9 mM alkoholu amino-PEG5 w 1x PBS (pH = 7,4)) do chipa. Przykryć szklaną szalkę Petriego i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Zassać roztwór Quench 1 z chipa.
  4. Dodać 50 μl roztworu Quench 2 (1 M etanoloaminy (pH = 8,5)) do chipa. Przykryj szklaną szalkę Petriego i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór Quench 2 z chipa i przepłukać chip 5x za pomocą 50 μL 1x PBS, pozostawiając ostatnią kroplę PBS na czujniku.

3. Przygotowanie próbek analitu

  1. Przygotować serię rozcieńczeń analitu dla Cdc37 w żądanym zakresie stężeń. W pierwszym eksperymencie zastosowano następujące stężenia: 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1000 nM, 2000 nM, 3000 nM i 5000 nM. W drugim eksperymencie zastosowano inny zestaw stężeń w zakresie od 0,4 nM do 200 nM.
  2. Zaplanuj eksperyment tak, aby obejmował co najmniej osiem różnych stężeń analitu w celu uzyskania wiarygodnej wartościKD. Przygotować różne rozcieńczenia białka analitu w tym samym buforze, który jest używany do kalibracji i białka docelowego; tutaj jest to 1x PBS (pH = 7,4).

4. Wczytywanie aktywowanego chipa biosensora do urządzenia FEB

UWAGA: Urządzenie FEB składa się z czytnika wyposażonego w sygnalizację świetlną LED oraz wkładu do wkładania chipa biosensora.

  1. Po unieruchomieniu białka docelowego należy włożyć aktywowany chip do wkładu urządzenia, który jest podłączony przez USB do komputera. Po włożeniu chipa na czytniku zaświeci się zielona dioda LED wskazująca, że urządzenie FEB jest gotowe do eksperymentu. Zainstaluj zautomatyzowane oprogramowanie (patrz tabela materiałów) dostarczone przez firmę na komputerze, do którego podłączone jest urządzenie FEB, aby monitorować eksperyment krok po kroku, jak opisano poniżej.

5. Uruchom eksperyment

  1. Naciśnij moduł Uruchom eksperyment w zautomatyzowanym oprogramowaniu i wybierz 10 punktów z regeneracją lub dowolny inny żądany protokół. Wypełnij następujące dane: nazwę operatora, nazwę eksperymentu, datę (np. Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); bufor regeneracyjny (np. bufor PBS); unieruchomiony cel (np. Hsp90); analitu w roztworze (np. Cdc37). Szczegółowe informacje można znaleźć na rysunku uzupełniającym S1.
  2. Naciśnij przycisk Rozpocznij eksperyment wyświetlany na oprogramowaniu i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi przez automatyczne oprogramowanie, jak opisano poniżej.
    UWAGA: Oprogramowanie jest w pełni zautomatyzowane, przyjazne dla użytkownika i prowadzi użytkownika przez eksperyment krok po kroku. Na ekranie pojawi się wyskakujące okienko z instrukcjami, jak przejść dalej na każdym kroku eksperymentu. Oprogramowanie dostarczy instrukcje dla każdego powtarzalnego kroku kolejno od kalibracji, asocjacji analitu, dysocjacji, regeneracji i płukania (5x) dla każdego stężenia analitu przez cały czas trwania eksperymentu.
  3. Wykonaj kalibrację przyrządu. W tym celu należy odessać pozostały roztwór PBS z chipa i zastosować 50 μl buforu kalibracyjnego (1x PBS; pH = 7,4). Naciśnij przycisk Kontynuuj i poczekaj 5 minut, aż etap kalibracji zostanie zakończony. Oprogramowanie wyświetla punkt końcowy określony dla etapu kalibracji (5 minut) z alarmem ostrzegawczym w celu podjęcia dalszych działań.
  4. Następnie wykonaj asocjację analitu. W tym celu należy odessać bufor kalibracyjny z chipa i zastosować 50 μl najniższego stężenia analitu (25 nM Cdc37). Naciśnij przycisk Kontynuuj i poczekaj 5 minut, aż krok asocjacji zostanie zakończony. Oprogramowanie wyświetla punkt końcowy dla kroku asocjacji (5 minut) z alarmem ostrzegawczym, aby kontynuować.
  5. Wykonaj dysocjację analitu. W tym celu należy odessać roztwór analitu z chipa i nanieść 50 μl buforu dysocjacyjnego (1x PBS; pH = 7,4). Naciśnij przycisk Kontynuuj i poczekaj 5 minut, aż czas trwania etapu dysocjacji (5 minut) zostanie zakończony. Oprogramowanie wyświetla punkt końcowy dla etapu dysocjacji (5 minut) z alarmem ostrzegawczym w celu podjęcia dalszych działań.
  6. Następnie należy przeprowadzić regenerację wiórów. Odessać roztwór dysocjacyjny z chipa i zastosować 50 μl buforu regeneracyjnego (1x PBS; pH = 7,4). Naciśnij przycisk Kontynuuj i poczekaj 30 sekund, aż czas trwania kroku regeneracji (30 s) zostanie zakończony. Oprogramowanie wyświetla punkt końcowy dla etapu regeneracji (30 s) z alarmem ostrzegawczym w celu podjęcia dalszych działań.
  7. Na koniec umyj frytkę. Odessać roztwór regeneracyjny z chipa i nałożyć 50 μl buforu do przemywania (1x PBS; pH = 7,4) na chip. Odessać roztwór z chipa i powtórzyć to 5 razy. Pozostaw ostatnią kroplę bufora myjącego na chipie, naciśnij przycisk Kontynuuj i poczekaj 30 sekund, aż czas trwania kroku prania zakończy się na wyświetlaczu oprogramowania.
    UWAGA: Oprogramowanie wyświetla punkt końcowy dla etapu prania (30 s) z alarmem ostrzegawczym, aby kontynuować następny cykl eksperymentu.
  8. Powtórz kroki dla każdego użytego stężenia analitu; pięć etapów kalibracji, asocjacji analitu, dysocjacji, regeneracji i płukania (5x) stanowi jeden cykl. W przedstawionym tutaj eksperymencie przeprowadziliśmy 10 cykli dla 10 stężeń analitu (w zakresie od 25 nM do 5 000 nM lub od 0,4 nM do 200 nM; Rysunek 2).

6. Analiza

  1. Naciśnij przycisk Analiza widoczny w górnej części oprogramowania do automatycznej analizy po zakończeniu eksperymentu. Pojawi się okno wyświetlania zawierające wszystkie punkty eksperymentalne. W okienku upewnij się, że stężenia analitu użyte w zalecanym protokole są prawidłowe.
  2. Naciśnij przycisk Uruchom analizę, aby automatycznie wygenerować wartośćKD. Oprogramowanie generuje wykres dopasowania Hilla, wykreślając stężenia analitu w stosunku do odpowiednich odpowiedzi I, na podstawie których obliczana jest stała dysocjacji w stanie równowagi, wartośćKD.
  3. Eksportuj nieprzetworzone dane do analizy w innym oprogramowaniu do analizy statystycznej za pomocą oprogramowania do przeglądania/eksportowania danych, jak opisano poniżej.
    1. Skopiuj plik R1R utworzony automatycznie po zakończeniu eksperymentu (np. Hsp90 + Cdc37 14.03.2021) do nowego folderu na pulpicie. Otwórz oprogramowanie do przeglądania/eksportu danych dostarczone przez firmę (patrz rysunek uzupełniający S2A).
    2. Kliknij Przetwarzanie danych > Przetwarzaj pliki R1R > OK na ekranie głównym oprogramowania do przeglądania/eksportu danych.
    3. Wybierz folder zawierający pliki R1R utworzone na pulpicie w kroku 6.3.1. i naciśnij przycisk OK. Spowoduje to utworzenie kopii oryginalnych danych R1R w celu przejrzenia i edytowania danych bez zastępowania oryginalnego pliku.
    4. Naciśnij ikonę przetwarzania danych widoczną na ekranie głównym oprogramowania do przeglądania/eksportu danych. Naciśnij przycisk Załaduj przetworzone pliki R1R > OK. Wybierz ten sam folder utworzony w kroku 6.3.1, który zawiera przetworzone pliki R1R. Naciśnij przycisk OK. Na tym etapie folder zawierający pliki eksperymentu jest gotowy do przejrzenia.
    5. Na ekranie głównym oprogramowania do przeglądania/eksportu danych naciśnij Analiza danych. Wybierz Kalibracja > Kalibruj edytowane pliki R1R > OK (patrz Rysunek uzupełniający S2B). Ten krok kalibruje wszystkie punkty danych zgodnie z pierwszym krokiem kalibracji w celu utworzenia linii bazowej.
    6. Na ekranie głównym oprogramowania do przeglądania/eksportu danych naciśnij Analiza danych. Wybierz opcję Przejrzyj i edytuj pliki R1R > OK. Przejrzyj punkty danych, usuń punkty lub dodaj kroki przy użyciu przycisku Usuń/Dodaj krok. Upewnij się, że wszystkie kroki znajdują się we właściwym miejscu, np. krok kalibracji znajduje się na linii bazowej, krok asocjacji jest na szczycie (patrz rysunek uzupełniający S3), a następnie naciśnij przycisk Zapisz, aby zapisać wszystkie wprowadzone zmiany.
    7. Na ekranie głównym oprogramowania do przeglądania/eksportu danych naciśnij Analiza danych. Wybierz opcję Analizuj/Kreśl dane, wybierz kroki do wyeksportowania (patrz Rysunek uzupełniający S4). Dodaj każdy krok skojarzenia (np. krok 2, krok 7 itd.) po odjęciu kroku kalibracji (np. krok 1, krok 6 itd.) do listy eksportu przed wyeksportowaniem danych.
    8. Naciśnij przycisk Eksportuj te dane. Oprogramowanie generuje plik arkusza kalkulacyjnego zawierający I-Response dla każdego punktu danych stężenia analitu z każdego tranzystora (jeśli wszystkie tranzystory działają, będziemy mieli trzy różne wartości I-odpowiedzi dla każdego punktu stężenia). Użyj tego pliku arkusza kalkulacyjnego, aby dalej analizować dane w oprogramowaniu statystycznym.
  4. Otwórz oprogramowanie do analizy statystycznej. Utwórz tabelę XY z trzema wartościami Y; naciśnij Utwórz. Dane dla tej tabeli (wartości X, Y) są kopiowane z pliku arkusza kalkulacyjnego utworzonego w kroku 6.3.8. Oś x odpowiada stężeniu analitu (w zależności od zastosowanego stężenia), a trzy wartości Y odpowiadają I-Responses, uzyskanym z oprogramowania Data Review/Export dostarczonego przez firmę.
  5. Naciśnij przycisk Analizuj te dane. Wybierz analizy XY > regresji nieliniowej (dopasowanie krzywej) > nasycenia wiązania > jednym miejscu > sumy. Oprogramowanie automatycznie przeanalizuje dane, wygeneruje wartośćK D i utworzy wykres punktów danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki eksperymentu 1:
Docelowe białko Hsp90 (500 nM) zostało unieruchomione na chipie zgodnie z protokołem immobilizacji celu, jak opisano powyżej. Do pierwszego eksperymentu przygotowano 10 stężeń białka analitu Cdc37 w zakresie od 25 nM do 5 000 nM na podstawie danych dostępnych w literaturze (patrz tabela 1).

Etapy eksperymentu mogą być monitorowane w czasie rzeczywistym, śledząc zmiany zachodzące w I-Response (Rysunek 3A). Można so...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu oceniono możliwość zastosowania technologii FEB (podejście do charakterystyki kinetycznej w czasie rzeczywistym) w celu określenia interakcji biomolekularnej między Hsp90 i Cdc37. Wstępny eksperyment eksploracyjny (pierwszy eksperyment) sugerował, że wybór odpowiednich stężeń analitu jest krytyczną częścią eksperymentu i że eksperyment powinien być zaprojektowany z uwzględnieniem punktów stężeń powyżej i poniżej wartościKD , które zostały przewidziane na podstawie danych dostępnych w literaturze....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktów interesów, finansowych lub innych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez grant z Binational Science Foundation (BSF) dla S.K.S. i N.Q.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Oprogramowanie do automatycznej analizyOprogramowanie Agile plus, Cardea (Nanomed)NA
Numer CAS: NA		Określany w tekście jako oprogramowanie do automatycznej analizy dostarczone z urządzeniem. Generuje zautomatyzowaną analizę.
COOH-BPU (Biosensing Processing Unit)Oprogramowanie Agile plus, Cardea (Nanomed)NA
Numer CAS: NA		biosensor chip
Oprogramowanie do przeglądu danychDatalign 1.0, Cardea (Nanomed)NA
Numer CAS: NA		Określany w tekście jako dostarczone oprogramowanie do przeglądu danych. Dostarczany z urządzeniem i umożliwia przeglądanie i eksport punktów danych informacyjnych.
Worek do dializyCelluSep,  Produkty filtracji membranowejT2-10-15
Numer CAS: NA		Przewody T2 (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm Ø, 0.32ml/cm, 15m)
EDC (1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiiimid)Cardea (Nanomed)EDC160322-02
Numer CAS: 25952-53-8		System
ITC (kalorymetria miareczkowa izotermiczna)Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, Wielka Brytania)NA
Numer CAS: Bufor NA
MES (kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy)MerckM3671-50G
Numer CAS: 4432-31-9
Chipsy NHS (N-hydroksysulfosuccinimid)Cardea (Nanomed)NA
Numer CAS: NA		Chip na bazie grafenu
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) X 10Bio-Lab001623237500 
Numer CAS: 7758-11-4		Płynny przezroczysty roztwór
PipeteThermo Scientific11855231
Numer CAS: NA		Finnpipette F3 5-50 µ L, żółty
Quench 1 (3,9 mM amino-PEG5-alcohol w 1 X PBS)Cardea (Nanomed)0105-001-002-001
Numer CAS: NA		Płynny, przezroczysty roztwór
Quench 2 (1 M etanoloamina (pH = 8,5))Cardea (Nanomed)0105-001-003-001
Numer CAS: NA		Płynny, przezroczysty roztwór
Rekombinowane białko Cdc37Abcamab256157
Numer CAS: NA
Rekombinowane białko Hsp90 betaAbcamab80033
Numer CAS: NA
Arkusz kalkulacyjnyExcel, Microsoft officeNA
Numer CAS: NA
Oprogramowanie statystyczneGraphPad, PrismNA
Numer CAS: NA		Określany jako inne oprogramowanie statystyczne. Można również użyć wykresu Sigma, fitonu lub innych programów statystycznych
Sulfo-NHSCardea (Nanomed)NHS160321-07
Numer CAS: 106627-54-7		Biały proszek
KońcówkiAlex czerwonyLC 1093-800-000
Numer CAS: NA		Końcówka 1-200 &mikro; l, luzem, 1 000 szt
w postaci białego proszku w postaci białego proszku

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tuncbag, N., Gursoy, A., Guney, E., Nussinov, R., Keskin, O. Architectures and functional coverage of protein-protein interfaces. Journal of Molecular Biology. 381 (3), 785-802 (2008).
  2. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein–protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  3. Magliery, T. J., et al. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: Scope and mechanism. Journal of the American Chemical Society. 127 (1), 146-157 (2005).
  4. Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
  5. Nguyen, T. N., Goodrich, J. A. Protein-protein interaction assays: Eliminating false positive interactions. Nature Methods. 3 (2), 135-139 (2006).
  6. Fernández-Suárez, M., Chen, T. S., Ting, A. Y. Protein-protein interaction detection in vitro and in cells by proximity biotinylation. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9251-9253 (2008).
  7. Jiang, M., Niu, C., Cao, J., Ni, D. -A., Chu, Z. In silico-prediction of protein–protein interactions network about MAPKs and PP2Cs reveals a novel docking site variants in Brachypodium distachyon. Scientific Reports. 8 (1), 15083(2018).
  8. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nature Biotechnology. 27 (10), 941-945 (2009).
  9. Wang, W., Goodman, M. T. Antioxidant property of dietary phenolic agents in a human LDL-oxidation ex vivo model: Interaction of protein binding activity. Nutrition Research. 19 (2), 191-202 (1999).
  10. Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
  11. Qvit, N., Disatnik, M. -H., Sho, E., Mochly-Rosen, D. Selective phosphorylation inhibitor of delta protein kinase C–Pyruvate dehydrogenase kinase protein–protein interactions: Application for myocardial injury in vivo. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7626-7635 (2016).
  12. Alam, M. N., Bristi, N. J., Rafiquzzaman, M. Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity. Saudi Pharmaceutical Journal. 21 (2), 143-152 (2013).
  13. Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Novel fusion protein approach for efficient high-throughput screening of small molecule–mediating protein-protein interactions in cells and living animals. Cancer Research. 65 (16), 7413-7420 (2005).
  14. Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET. Trends in Pharmacological Sciences. 23 (8), 351-354 (2002).
  15. Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51438(2014).
  16. Ekins, S., Mestres, J., Testa, B. In silico pharmacology for drug discovery: Methods for virtual ligand screening and profiling. British Journal of Pharmacology. 152 (1), 9-20 (2007).
  17. Valerio, L. G. Application of advanced in silico methods for predictive modeling and information integration. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (4), 395-398 (2012).
  18. Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Current Opinion in Structural Biology. 15 (1), 4-14 (2005).
  19. Ideker, T., Sharan, R. Protein networks in disease. Genome Research. 18 (4), 644-652 (2008).
  20. Lu, H., et al. Recent advances in the development of protein–protein interactions modulators: mechanisms and clinical trials. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 213(2020).
  21. Jarosz, D. Hsp90: A global regulator of the genotype-to-phenotype map in cancers. Advances in Cancer Research. 129, 225-247 (2016).
  22. Johnson, V. A., Singh, E. K., Nazarova, L. A., Alexander, L. D., McAlpine, S. R. Macrocyclic inhibitors of Hsp90. Current Topics in Medicinal Chemistry. 10 (14), 1380-1402 (2010).
  23. Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
  24. Stewart, A., Fisher, R. A. Co-Immunoprecipitation: Isolation of protein signaling complexes from native tissues. Methods in Cell Biology. 112, 33-54 (2012).
  25. Pierce, M. M., Raman, C. S., Nall, B. T. Isothermal titration calorimetry of protein-protein interactions. Methods. 19 (2), San Diego, Calif. 213-221 (1999).
  26. Paketurytė, V., et al. Inhibitor binding to carbonic anhydrases by isothermal titration calorimetry. Carbonic Anhydrase as Drug Target. , Springer International Publishing. 79-95 (2019).
  27. Grote, J., Dankbar, N., Gedig, E., Koenig, S. Surface plasmon resonance/mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 77 (4), 1157-1162 (2005).
  28. Kumaraswamy, S., Tobias, R. Label-free kinetic analysis of an antibody–antigen interaction using biolayer interferometry. Methods in Molecular Biology. , 165-182 (2015).
  29. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 72, 150-154 (2013).
  30. Singh, A. N., Ramadan, K., Singh, S. Experimental methods to study the kinetics of protein–protein interactions. Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods. , 115-124 (2022).
  31. Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic titration series with biolayer interferometry. PLoS One. 9 (9), 106882(2014).
  32. Vu, C. -A., Chen, W. -Y. Field-effect transistor biosensors for biomedical applications: Recent advances and future prospects. Sensors. 19 (19), 4214(2019).
  33. Bergveld, P. A critical evaluation of direct electrical protein detection methods. Biosensors & Bioelectronics. 6 (1), 55-72 (1991).
  34. Lowe, B. M., Sun, K., Zeimpekis, I., Skylaris, C. K., Green, N. G. Field-effect sensors – from pH sensing to biosensing: sensitivity enhancement using streptavidin–biotin as a model system. The Analyst. 142 (22), 4173-4200 (2017).
  35. Goldsmith, B. R., et al. Digital biosensing by foundry-fabricated graphene sensors. Scientific Reports. 9 (1), 434(2019).
  36. Afsahi, S., et al. Novel graphene-based biosensor for early detection of Zika virus infection. Biosensors and Bioelectronics. 100, 85-88 (2018).
  37. Afsahi, S. J., et al. Towards novel graphene-enabled diagnostic assays with improved signal-to-noise ratio. MRS Advances. 2 (60), 3733-3739 (2017).
  38. Roe, S. M., et al. The mechanism of Hsp90 regulation by the protein kinase-specific cochaperone p50cdc37. Cell. 116 (1), 87-98 (2004).
  39. Gaiser, A. M., Kretzschmar, A., Richter, K. Cdc37-Hsp90 complexes are responsive to nucleotide-induced conformational changes and binding of further cofactors. The Journal of Biological Chemistry. 285 (52), 40921-40932 (2010).
  40. Popescu, A. I., Găzdaru, D. M., Chilom, C. G., Bacalum, M. Biophysical interactions: Their paramount importance for life. Romanian Reports in Physics. 65 (3), 1063-1077 (2013).
  41. Surya, S., Abhilash, J., Geethanandan, K., Sadasivan, C., Haridas, M. A profile of protein-protein interaction: Crystal structure of a lectin-lectin complex. International Journal of Biological Macromolecules. 87, 529-536 (2016).
  42. Velazquez-Campoy, A., Freire, E. ITC in the post-genomic era...? Priceless. Biophysical Chemistry. 115 (23), 115-124 (2005).
  43. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using bioLayer interferometry for kinetic characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
  44. Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: A laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist. Reviews. 33 (4), 161-173 (2012).
  45. Jacob, N. T., et al. Synthetic molecules for disruption of the MYC protein-protein interface. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 26 (14), 4234-4239 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Interakcja Hsp90 Cdc37interakcja bia ko bia kodetekcja bez znakowaniachip biosensorycznysta a dysocjacjifunkcjonalizacja chipu

Powiązane artykuły