Trójwymiarowa charakterystyka miejsc kontaktu między organellami w hepatocytach przy użyciu mikroskopii elektronowej o przekroju szeregowym

Od czasu ich wynalezienia w latach 30-tych, mikroskopy elektronowe pozwalają naukowcom na wizualizację składników strukturalnych komórek i tkanek^1,2. Większość badań dostarczyła informacji 2D, ponieważ budowanie modeli 3D wymaga żmudnego zbierania sekcji seryjnych, ręcznego fotografowania, obróbki negatywów, ręcznego śledzenia oraz tworzenia i składania modeli 3D z tafli szkła, plastiku lub styropianu^3,4. Prawie 70 lat później nastąpił znaczny postęp w wielu aspektach procesu, od wydajności mikroskopu, zbierania przekrojów seryjnych, zautomatyzowanego obrazowania cyfrowego, zaawansowanego oprogramowania i sprzętu do rekonstrukcji, wizualizacji i analizy 3D, po alternatywne podejścia do tego, co obecnie określa się zbiorczo jako objętość EM (vEM). Uważa się, że te techniki vEM dostarczają informacji ultrastrukturalnych 3D w rozdzielczościach nanometrowych w skalach mikronowych i obejmują transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM) oraz nowsze techniki skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM); Zobacz recenzje^5,6,7,8.

Na przykład, skupiona wiązka jonów SEM (FIB-SEM) wykorzystuje skupioną wiązkę jonów wewnątrz SEM do mielenia powierzchni bloku pomiędzy sekwencyjnymi skanami obrazowania SEM powierzchni bloku, umożliwiając wielokrotne automatyczne mielenie/obrazowanie próbki i tworzenie zestawu danych 3D do rekonstrukcji9^,10. W przeciwieństwie do tego, seryjna powierzchnia bloku SEM (SBF-SEM) wykorzystuje ultramikrotom wewnątrz SEM do usunięcia materiału z powierzchni bloku przed obrazowaniem^11,12, podczas gdy tomografia matrycowa jest procesem nieniszczącym, który wymaga zbierania odcinków seryjnych na szkiełkach nakrywkowych, płytkach lub taśmie, przed skonfigurowaniem zautomatyzowanego przepływu pracy obrazowania obszaru zainteresowania w sekwencyjnych sekcjach w SEM w celu wygenerowania zestawu danych 3D¹³. Podobnie jak tomografia matrycowa, TEM odcinka szeregowego (ssTEM) wymaga pobrania skrawków fizycznych przed obrazowaniem; jednak te sekcje są zbierane w siatkach TEM i obrazowane w TEM^14,15,16. ssTEM można rozszerzyć, wykonując tomografię wychylenia^17,18,19. Szeregowa tomografia wychylna zapewnia najlepszą rozdzielczość w zakresie x, y i z, i chociaż była używana do rekonstrukcji całych komórek²⁰, jest dość trudna. Protokół ten koncentruje się na praktycznych aspektach ssTEM jako najbardziej dostępnej techniki vEM dostępnej dla wielu laboratoriów EM, które mogą obecnie nie mieć dostępu do specjalistycznych narzędzi do sekcji lub vEM, ale skorzystałyby na generowaniu danych 3D vEM.

Seryjna ultramikrotomia do rekonstrukcji 3D była wcześniej uważana za wyzwanie. Trudno było ciąć proste wstęgi o równej grubości przekroju, być w stanie ułożyć i podnieść wstęgi o odpowiednim rozmiarze, we właściwej kolejności, na siatki z wystarczającym wsparciem, ale bez pasków siatki zasłaniających obszary zainteresowania, a co najważniejsze, bez utraty sekcji, ponieważ niekompletna seria może uniemożliwić pełną rekonstrukcję 3D²¹. Jednak ulepszenia komercyjnych ultramikrotomów, noże do cięcia i przycinania diamentów^22,23, przezroczyste folie nośne elektronów na siatkach^21,24, oraz kleje wspomagające przyleganie sekcji i konserwację wstążki^13,21 to tylko niektóre z postępów, które nastąpiły na przestrzeni lat, dzięki czemu technika ta stała się bardziej rutynowa w wielu laboratoriach. Po zebraniu odcinków seryjnych, obrazowanie seryjne w TEM jest proste i może dostarczyć obrazy EM o subnanometrowych rozmiarach px w x i y, umożliwiając badanie struktur subkomórkowych w wysokiej rozdzielczości - potencjalny wymóg dla wielu pytań badawczych. Przedstawione tutaj studium przypadku demonstruje zastosowanie ssTEM i rekonstrukcji 3D w badaniu kontaktów retikulum endoplazmatycznego (ER) z organellami w hepatocytach wątroby, gdzie po raz pierwszy zaobserwowano kontakty ER-organelle ^25,26.

Będąc w sąsiedztwie z otoczką jądrową, ER nawiązuje również bliskie kontakty z wieloma innymi organellami komórkowymi, w tym lizosomami, mitochondriami, kropelkami lipidów i błoną plazmatyczną²⁷. Kontakty ER-organelle są zaangażowane w metabolizm lipidów²⁸, fosfoinozytyd i sygnalizacja wapnia²⁹, regulacja autofagii i reakcja na stres^30,31. Kontakty ER-organelle i inne kontakty międzyorganellowe są wysoce dynamicznymi strukturami, które reagują na komórkowe potrzeby metaboliczne i sygnały zewnątrzkomórkowe. Wykazano, że różnią się morfologicznie pod względem wielkości i kształtu oraz odległości między błonami organelli^32,33. Uważa się, że te różnice ultrastrukturalne prawdopodobnie odzwierciedlają ich różny skład i funkcję białek/lipidów^34,35. Jednak zdefiniowanie kontaktów międzyorganellowych i ich analiza jest nadal trudnym zadaniem³⁶. W związku z tym do dalszych badań wymagany jest wiarygodny, ale prosty protokół do badania i charakteryzowania kontaktów międzyorganelli.

Ponieważ kontakty ER-organelle mogą wynosić od 10 do 30 nm w separacji membrana-membrana, złotym standardem identyfikacji był historycznie TEM. Cienkoczęściowy TEM ujawnił specyficzną lokalizację subdomen dla rezydentnych białek ER w różnych kontaktach błonowych³⁷. Tradycyjnie, ujawniało to kontakty ER-organelle z rozdzielczością nm, ale często przedstawiało tylko widok 2D tych interakcji. Jednak podejścia vEM ujawniają ultrastrukturalną prezentację i kontekst tych miejsc kontaktu w 3D, umożliwiając pełną rekonstrukcję kontaktów i dokładniejszą klasyfikację kontaktów (punktowe vs. rurowe vs. cysternalne) oraz kwantyfikację^38,39. Oprócz tego, że są pierwszym typem komórki, w którym zaobserwowano kontakty ER-organella^25,26, hepatocyty mają rozbudowany system innych kontaktów międzyorganelli, które odgrywają istotną rolę w ich architekturze i fizjologii^28,40. Jednak nadal brakuje dokładnej charakterystyki morfologicznej ER-organelli i innych kontaktów międzyorganowych w hepatocytach. W związku z tym sposób, w jaki tworzą się i przebudowują kontakty międzyorganellowe podczas regeneracji i naprawy, ma szczególne znaczenie dla biologii hepatocytów i funkcji wątroby.

Wszystkie zwierzęta były trzymane zgodnie z wytycznymi brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych, a pobieranie tkanek zostało przeprowadzone zgodnie z brytyjską ustawą o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 roku.

1. Utrwalanie i przygotowanie próbki

1. Rozciąć tkankę wątroby na kawałki o odpowiedniej wielkości, około 8 mm x 8 mm x 3 mm, i umieścić je w ciepłym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS, 37 °C).
2. Wstrzyknąć utrwalacz o temperaturze pokojowej (20-25 °C) (1,5% aldehydu glutarowego w 1% sacharozy, 0,1 M kakodylanu sodu) do kawałków wątroby i przenieść je z PBS do utrwalacza na maksymalnie 20 minut w temperaturze pokojowej. Zawsze utrzymuj tkankę zanurzoną w roztworach, aby uniknąć wysuszenia.
   UWAGA: Aldehydy są substancjami drażniącymi, które są i potencjalnie rakotwórcze. Kakodylan sodu jest toksyczny w przypadku połknięcia lub wdychania. Ze wszystkimi utrwalaczami należy obchodzić się przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej, a eksperyment należy przeprowadzić w dygestorium. Dobre utrwalenie spowoduje jędrniejsze tkanki.
3. Ustaw wibrujący mikrotom z ostrzem, łaźnią lodową i tacką buforową wypełnioną zimnym PBS. Zamontuj pierwszy kawałek utrwalonej tkanki wątroby na uchwycie próbki za pomocą kleju cyjanoakrylowego i przenieś blok do wibrującego mikrotomu.
4. Postępując zgodnie z zaleceniami producenta, podejdź do tkanki i pokrój utrwaloną wątrobę na plastry o grubości 100 μm.
5. Zbierz plastry za pomocą szpatułki lub pędzla z naturalnego włosia i przenieś je do 12- lub 24-dołkowego naczynia zawierającego lodowaty fix (1,5% aldehydu glutarowego, 0,1 M kakodylanu sodu) na lodzie. Pozostaw plastry na lodzie, aż wszystkie próbki zostaną pokrojone w plastry i będą gotowe do dalszego przetwarzania.
6. Wybierz plastry zawierające obszary zainteresowania do dalszej obróbki i umyj je delikatnym mieszaniem. Wykonaj trzy, 5-minutowe mycie 0,1 M kakodylanu sodu w temperaturze pokojowej w naczyniu z 12 lub 24 dołkami, upewniając się, że plastry mają wystarczający bufor do swobodnego poruszania się.
   UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, obszary zainteresowania są wybierane na podstawie cech anatomicznych związanych z biologiczną kwestią badania i kierowane regionami tkanki, które prawdopodobnie są obecne w całej serii, np. nie na krawędzi przekroju, i które są dobrze zachowane.
7. W dygestorium zastąp 0,1 M kakodylan sodu świeżo przygotowanym 1% tetratlenkiem osmu/1,5% żelazocyjankiem potasu. Umieść 12- lub 24-dołkowe naczynie w szczelnie zamkniętym pojemniku i przenieś pojemnik do lodówki z niebezpiecznymi chemikaliami na 1 godzinę < / > UWAGA: Osm jest niezwykle niebezpieczny w przypadku spożycia, wdychania i kontaktu ze skórą. Żelazrycyjanek potasu działa drażniąco i jest szkodliwy przez drogi oddechowe i kontakt ze skórą. Zawsze należy obchodzić się z odpowiednimi środkami ochrony osobistej, a eksperyment należy przeprowadzać w dygestorium.
8. W dygestorii wyjąć tetratlenek osmu/żelazocyjanek potasu do specjalnej butelki na odpady osmu i myć próbki przez 5 minut trzykrotnie 0,1 M kakodylanem sodu. Pozostawić próbki w szczelnie zamkniętym pojemniku na noc w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Potencjalny punkt pauzy. Próbki mogą być przechowywane w 0,1 M kakodylanu sodu w szczelnie zamkniętym pojemniku w temperaturze 4 °C przez tygodnie bez większego uszczerbku dla konserwacji. Upewnij się, że jest wystarczający bufor, aby zapobiec wysuszeniu.
9. Próbki inkubować ze świeżo przygotowanym 1% kwasem garbnikowym w 0,05 M kakodylanu sodu przez 45 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Kwas garbnikowy działa drażniąco i może powodować uszkodzenie oczu. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i przeprowadzić eksperyment w dygestorium.
10. Wykonaj trzy 5-minutowe mycie ddH₂O przed odwodnieniem i zatopieniem.

2. Odwadnianie próbki, osadzanie i montaż żywicy Epon

1. Przygotować żywicę Epon zgodnie z następującymi proporcjami wagowymi (patrz krok 2.2). Wytaruj wagę za pomocą jednorazowej plastikowej zlewki o pojemności 100 ml zawierającej mieszadło. Odetnij końce z 5 jednorazowych plastikowych pipet Pasteura i użyj ich do przeniesienia lepkich składników żywicy do zlewki.
2. Do zlewki dodaj kolejno 19,2 g żywicy-812, 7,6 g DDSA, 13,2 g MNA i 0,8 g akceleratora DMP-30. Używając piątej pipety Pasteura z czystego tworzywa sztucznego, dokładnie wymieszaj ręcznie składniki żywicy.
   UWAGA: Unikaj wprowadzania pęcherzyków, ale upewnij się, że dolna żywica jest wystarczająco wymieszana z górną, aby uzyskać zmianę koloru i zgrubne wymieszanie warstw składowych. Wszystkie składniki żywicy działają drażniąco i są szkodliwe przez drogi oddechowe i kontakt ze skórą. DMP-30 jest i może powodować korozję skóry. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
3. Umieść zlewkę na mieszadle magnetycznym i pozostaw do delikatnego mieszania, od czasu do czasu mieszając żywicę ręcznie.
4. Przemyć próbki delikatnym mieszaniem przez 5 minut 70% etanolem; powtórzyć jednokrotnie.
5. Przemyć próbki delikatnym mieszaniem przez 5 minut 90% etanolem; powtórzyć raz.
6. Płukać próbki delikatnym mieszaniem przez 5 minut 100% etanolem; powtórzyć raz.
7. Podczas gdy próbki znajdują się w 100% etanolowym płuczkach w dygestorium, przygotuj mieszaninę tlenku propylenu (PO):Epon w proporcji 50:50 (v/v) w szklanej fiolce z plastikową pokrywką odporną na tlenek propylenu (PO). Ostrożnie, ale pewnie przypiąć szklaną pokrywkę fiolki i trzymając pokrywkę i fiolkę, wstrząsnąć lub przemieszać, aby wymieszać.
   UWAGA: Tlenek propylenu jest silnie toksycznym, łatwopalnym środkiem drażniącym, który rozpuszcza niektóre tworzywa sztuczne. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i przeprowadzić eksperyment w dygestorium.
8. Po kroku 2.6 inkubować próbki z PO:Epon przez 1 godzinę w pojemniku odpornym na PO (np. tace aluminiowe lub szklane fiolki), delikatnie kołysząc/mieszając w dygestorium.
9. W dygestorium przenieść próbki do 100% Epon. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w dygestoriach z kołysaniem/obrotem/mieszaniem. Przenieś mieszaninę PO:Epon do specjalnej szklanej butelki na odpady epon.
10. Powtórz krok 2.9 raz.
11. Zamontuj próbki do osadzenia. W zależności od wielkości plastrów i obszaru zainteresowania, plastry należy bezpośrednio zamontować na prepolimeryzowanych kikutach żywicy lub zagrodzić je na płasko w celu rozcięcia i ponownie zasadzić w późniejszym terminie.
    UWAGA: W przypadku osadzania na płasko można użyć "suwaka odlewanego na raz" do osadzania wielu plasterków jednocześnie. Resztki żywicy można wykorzystać do wypełnienia kapsułek belkowych i upiec w celu uzyskania prepolimeryzowanych kikutów lub zamrozić do późniejszego wykorzystania.
12. Po zamontowaniu i pokryciu żywicą w ilości wystarczającej do wypełnienia wnęki "odlewanego szkiełka", próbki piec przez noc w piecu o temperaturze 60 °C.
    UWAGA: Potencjalny punkt pauzy. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej przez lata.
13. W celu ponownego osadzenia zidentyfikuj obszar zainteresowania w płaskich osadzonych wycinkach tkanki. Za pomocą piły jubilerskiej wyciąć kawałek chusteczki o odpowiedniej wielkości (1 mm² do 4 mm²) i ponownie zatopić za pomocą żywicy przygotowanej, jak w kroku 2.2, na wierzchu prepolimeryzowanego bloku i piec przez noc w piekarniku o temperaturze 60 °C.
    UWAGA: Alternatywnie kawałek tkanki można przykleić do klocka lub szpilki za pomocą dwuskładnikowej żywicy epoksydowej. Pozostaw na noc do zastygnięcia. Potencjalny punkt pauzy.

3. Przycinanie i seryjne cięcie osadzonych próbek

UWAGA: Cięcie na sekcje to umiejętność, której można się nauczyć; użytkownicy powinni być biegli w ultracienkim cięciu przed próbą seryjnego cięcia. Ponieważ dokładne kontrole mikrotomowe różnią się w zależności od producenta, postępuj zgodnie z instrukcjami i wytycznymi producenta.

1. Po zablokowaniu próbki w adapterze do przycinania, użyj żyletki, aby ostrożnie przyciąć tkankę zatopioną w żywicy, aby spełnić następujące kryteria (patrz Rysunek 1A,B):
   1. Upewnij się, że istnieje płaska, górna powierzchnia odsłaniająca tkankę wokół obszaru zainteresowania.
   2. Upewnij się, że kształt trapezu jest czysty i równoległy, a górna i dolna krawędź.
   3. Zapewnij wymiary całkowite 200-500 μm w x, 100-500 μm w y.
   4. Upewnij się, że powierzchnia bloku jest asymetryczna, np. prawe rogi boczne ~90 °, lewy górny róg rozwarty i lewy dolny róg ostry.
      UWAGA: Krionóż do przycinania może być alternatywnym narzędziem dla żyletki. Pozostałe zalecenia mają na celu wygodę użytkownika w zakresie porządkowania sekcji podczas obrazowania. Opcjonalnie: Jeśli sekcje nie tworzą stabilnych wstęg, na krawędź czołową powierzchni bloku można nałożyć cement kontaktowy, aby ułatwić tworzenie wstęgi. Żyletki są ostre; Uważaj, aby trzymać żyletkę w taki sposób, aby przypadkowe poślizgnięcie się prawdopodobnie nie spowodowało obrażeń ciała.

Rysunek 1: Przepływ pracy TEM w sekcji szeregowej. (A) Schemat próbki w bloku żywicy. (B) Blok przycinania w celu wygenerowania kształtu trapezu z krawędziami odpowiednimi do szeregowego przekroju i asymetryczną powierzchnią bloku w celu zapewnienia znanej orientacji. (C) Schemat pokazujący wstęgi sekcji szeregowych, unoszących się na powierzchni wody w łodzi z nożem diamentowym. (D) Schemat przedstawiający organizację sekcji i wstążki, dyktujący kolejność sekcji, na siatce szczelin TEM o średnicy 3 mm. (E) Obrazowanie i nawigacja TEM. Pokazywanie kolejności wstążek i sekcji oraz używanie "naklejek z żółtą gwiazdką" na monitorze do odwoływania się do ekranu, aby zapewnić ponowne zobrazowanie tego samego obszaru zainteresowania w kolejnych sekcjach. (F) Wyrównanie i kadrowanie obrazu. (G) Segmentacja, rekonstrukcja 3D i wizualizacja. Skrót: TEM = transmisyjna mikroskopia elektronowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Po przycięciu przenieś łuk próbki wraz z uchwytem i próbką do ramienia próbki mikrotomu, ustawiając łuk próbki tak, aby zakres ruchu łuku przebiegał od góry do dołu; zabezpiecz łuk próbki na miejscu.
3. Umieść i zablokuj nóż diamentowy w uchwycie noża, upewniając się, że kąt cięcia jest odpowiednio ustawiony do noża. Bezpiecznie zablokuj uchwyt noża w scenie.
4. Przy włączonym oświetleniu sceny użyj posuwu noża, stale sprawdzając relację między powierzchnią bloku a krawędzią noża. Ostrożnie przesuwaj nóż w kierunku próbki, stale regulując kąt boczny noża, nachylenie próbki i obrót próbki, regulując odpowiednie pokrętła, aż blok zostanie wyrównany z krawędzią noża.
5. Wyłącz oświetlenie sceny w górę, włącz oświetlenie sceny w dół, ustaw górną i dolną część okienka tnącego ramienia próbki i pozostaw próbkę tuż poniżej krawędzi noża.
6. Napełnij łódkę noża czystym ddH₂O i upewnij się, że powierzchnia wody jest równa z krawędzią noża i tylko lekko wklęsła.
7. Opcjonalnie: Zanurz rzęsę w 0,1% Triton X-100, a następnie w wodzie z nożem, aby zmniejszyć napięcie powierzchniowe wody, aby ułatwić chloroformowanie i pobieranie wstążki.
8. Przygotuj stanowisko pracy z rzęsami (rzęsy przyklejone do patyczka koktajlowego), siatkami szczelinowymi pokrytymi formvarem, oznaczonymi kleszczami krzyżowymi, chloroformem, 0,1% roztworem Triton X-100, wodą destylowaną, bibułą filtracyjną i siatką z notatkami do siatki.
9. Ustaw prędkość cięcia na 1 mm/s, a początkową grubość cięcia na 100 nm i rozpocznij cykl cięcia.
10. Po przecięciu pierwszej sekcji zmień parametry cięcia na prędkość cięcia 0,8 mm/s, a grubość cięcia na 70 nm i kontynuuj cięcie, pozwalając sekcjom uformować wstęgę przesuwającą się po powierzchni wypełnionej wodą łodzi nożowej (Rysunek 1C).
    UWAGA: Ważne jest, aby zdawać sobie sprawę z koloru produkowanych sekcji, ponieważ często jest to dokładniejszy przewodnik po grubości odcinków żywicy. Sekcje srebrne mają zwykle grubość około 70 nm, podczas gdy sekcje szare są cieńsze, a sekcje złote są grubsze.
11. Pozwól, aby mikrotom kontynuował cięcie sekcji, a taśma wydłużyła się.
    UWAGA: Ważne jest, aby unikać dużych wibracji i zakłóceń fizycznych w pomieszczeniu. Przeciągi mogą powodować przesuwanie się sekcji po powierzchni wody w łodzi z nożem, a wibracje fizyczne mogą powodować nierównomierne cięcie mikrotomu.
12. Po zebraniu wystarczającej liczby odcinków i zanim wstęga dotrze do końca łodzi, przerwij cięcie (tuż po tym, jak próbka przejdzie przez krawędź noża).
    UWAGA: Liczba potrzebnych sekcji zależy od rozmiaru powierzchni bloku i rozmiaru zestawu danych, który ma zostać zebrany. Dlatego warto zdawać sobie sprawę z zależności między rozmiarem bloku a siatką szczelin, gdy wycięte sekcje schodzą.
13. Używając rzęsy w każdej ręce, delikatnie podziel wstążkę na mniejsze wstążki, które zmieszczą się na całej długości siatki szczeliny, zwracając uwagę na zanotowanie ich względnego położenia w próbce.
    UWAGA: Jeśli ich łączna szerokość pasuje, wiele taśm można delikatnie umieścić obok siebie i podnieść razem w jednej siatce szczelin. W przypadku pobierania wielu wstążek na jednej siatce szczelin należy zwrócić uwagę na kolejność i względne położenie wstążek. Na przykład, wstążki należy zawsze umieszczać głębiej w próbce, po prawej stronie wstążki znajdującej się już w próbce (Rysunek 1D).
14. Opcjonalnie: Za pomocą szklanego pręta aplikatora najedź kroplą chloroformu na sekcje, aby je spłaszczyć.
    UWAGA: Chloroform jest toksyczny i drażniący. Nie pozwól, aby chloroform dotykał powierzchni wody lub sekcji. Jeśli zdarzy się to przypadkowo, należy usunąć wodę i umyć nóż przed powrotem do krojenia. Chloroform może uszkodzić sekcje i zdegradować klej, który mocuje diament do łodzi z nożem.
15. Używając pierwszych ponumerowanych kleszczy, podnieś pierwszą pustą siatkę szczeliny (po prawej stronie szczeliny, formvar stroną do dołu), delikatnie zanurz Triton X-100, a następnie dwukrotnie w wodzie destylowanej, a następnie usuń nadmiar wody z krawędzi kleszczy za pomocą kawałka bibuły filtracyjnej.
16. Trzymając rzęsę w jednej ręce i kleszcze w drugiej, delikatnie opuść około 2/3 siatki szczelinowej pokrytej formvarem do wody łodzi nożowej (z dala od sekcji), tak aby strona formvar była skierowana w dół, a prawa długa krawędź szczeliny znajdowała się na powierzchni wody i równolegle do krawędzi wody.
17. Delikatnie odchyl siatkę w wodzie w kierunku wstęg, tak aby po skoku powrotnym sekcje dryfowały w kierunku siatki. Kontynuuj to w coraz mniejszych falach, aż prawa krawędź wstążki zrówna się z prawą krawędzią szczeliny. Następnie, ostatnim machnięciem, delikatnie podnieś siatkę do góry, aby podnieść sekcje do siatki szczeliny.
18. Pozostaw siatkę w kleszczach do wyschnięcia przed umieszczeniem jej w skrzynce siatki, odpowiednio oznaczoną na arkuszu referencyjnym siatki.
19. Powtarzaj krok 3.16, aż wszystkie taśmy zostaną zebrane, upewniając się, że kolejność wstążek jest zachowana.
20. Jeśli potrzebne są dalsze sekcje, cofnij nóż na około 150 mil morskich, sprawdź poziom wody w łodzi i w razie potrzeby dodaj więcej. Rozpocznij proces cięcia ponownie, wykonując kroki 3.11-3.18.
21. Po zebraniu wszystkich sekcji upewnij się, że krawędź noża jest wolna od zanieczyszczeń sekcji, cofnij nóż z powierzchni bloku, a następnie wyjmij i wyczyść nóż.

4. Barwienie siatki

1. Po wyschnięciu zabarwić skrawki cytrynianem ołowiu Reynoldsa na parafilmie na ławce lub na szalce Petriego. Umieść kilka granulek wodorotlenku sodu pod pokrywką szalki Petriego, aby zapewnić środowisko wolne od dwutlenku węgla. Następnie, ostrożnie, z dala od granulek, odpipetować 40 μl kropli cytrynianu ołowiu Reynoldsa na parafilm, po jednej na każdą siatkę.
   UWAGA: Nie plamij zbyt wielu kratek na raz; Na przykład maksimum powinno wynosić 6. Staraj się nie oddychać bezpośrednio na naczynie do barwienia. Dwutlenek węgla może reagować z cytrynianem ołowiu i powodować niepożądane wytrącanie się osadu na siatkach.
2. Odwróć każdą siatkę (sekcją do dołu) na kroplę cytrynianu ołowiu i pozostaw zabezpieczoną pokrywką szalki Petriego na 7 do 10 minut. Podczas gdy kratki się barwią, przygotuj większy drugi kawałek parafilmu na stole z pięcioma kroplami wody destylowanej o pojemności 300 μl na każdą siatkę.
3. Pod koniec inkubacji cytrynianu ołowiu przenieść każdą siatkę do kropli wody destylowanej, aby myć przez 1 minutę bez wdychania bezpośrednio na siatkach.
4. Powtórz krok 4.3 w sumie pięć razy.
5. Używając ponumerowanych kleszczyków krzyżowych, podnieś pierwszą siatkę, dotknij krawędzi siatki, aby przefiltrować bibułę, aby odprowadzić większość wody i pozostaw do wyschnięcia w kleszczach (przez co najmniej 20 minut). Powtórz te czynności dla każdej siatki.

5. Akwizycja obrazowania za pomocą TEM

UWAGA: Ponieważ dokładne kontrolki TEM różnią się w zależności od producenta, postępuj zgodnie z instrukcjami i wytycznymi producenta. Poniższe kroki powinny być wykonane przez użytkowników, którzy są już biegli w korzystaniu z TEM.

1. Przed obrazowaniem należy przeprowadzić zwykłe kontrole, np. wyrównanie wiązki, odniesienia wzmocnienia i eucentryczność próbki.
2. Ostrożnie załadować pierwszą siatkę odcinków szeregowych do uchwytu próbki, uważając, aby wyrównać szczelinę (a tym samym sekcje) do pionowej osi stolika mikroskopu.
   UWAGA: Ta dokładność nie jest niezbędna, ale oszczędza czas na etapach akwizycji i przyszłej obsługi danych. Podczas wstawiania siatki (stroną do sekcji do dołu lub stroną do sekcji), należy pamiętać, aby wszystkie siatki były wyświetlane w tej samej orientacji.
3. Przy małym powiększeniu obserwuj kolejność, położenie i położenie sekcji szeregowych (Rysunek 1E). Przejdź do środkowej sekcji serii na siatce.
   UWAGA: W zależności od dokładnego celu badawczego, podejścia do obrazowania mogą się różnić; Jednak poniżej znajduje się przydatny punkt wyjścia. Kształt sekcji i relacja wstęg (zgodnie z opisem w kroku 3.14) decydują o tym, która sekcja była pierwsza, a która ostatnia na siatce.
4. Przejrzyj przykład i zidentyfikuj obszar zainteresowania. Obserwuj próbkę w pożądanym powiększeniu i rozważ zebranie serii w nieco mniejszym powiększeniu, ponieważ sekcje często nie są idealnie wyrównane, a obrazy mogą wymagać późniejszego przycięcia.
5. Wykonuj zdjęcia referencyjne przy mniejszych powiększeniach, aby docenić kontekst obszaru zainteresowania, jego przybliżoną lokalizację przy różnych powiększeniach w stosunku do granic sekcji oraz cechy charakterystyczne w próbce. Użyj ich, aby oznaczyć interesujący Cię obszar w innych sekcjach.
6. Opcjonalnie: do odniesień do ekranu użyj szpachli samoprzylepnej wielokrotnego użytku, naklejek lub kawałka papieru do rzutnika (OHP), przyklejonego do ekranu, aby umieścić tymczasowe znaczniki na ekranie, aby umożliwić rutynowe ponowne zobrazowanie tych samych cech obszaru zainteresowania w środku obrazu, w całym zestawie danych (patrz żółte gwiazdki w Rysunek 1E).
7. Korzystając z obrazów referencyjnych, przejdź do obszaru zainteresowania w pierwszej sekcji siatki i uzyskaj obraz w żądanym powiększeniu.
   UWAGA: Podczas zapisywania obrazów zanotuj pierwszą nazwę pliku pierwszego obrazu z serii i użyj nomenklatury nazewnictwa sekwencyjnego, tak aby wszystkie nazwy obrazów były zgodne z kolejnością sekcji serii.
8. Przejdź do następnej sekcji i powtarzaj krok 5.7, aż wszystkie sekcje zostaną zobrazowane dla tego obszaru zainteresowania.

6. Eksport obrazów i rejestracja wyrównania sekcji szeregowej

1. Eksportuj pliki obrazów należące do tego samego stosu do jednego folderu. Upewnij się, że folder jest posortowany według nazwy pliku.
   UWAGA: Najlepiej, aby obrazy miały tę samą nazwę główną i były zgodne z kolejnością, w jakiej zostały pozyskane.
2. Otwórz Fidżi i kliknij Plik | Import | Sekwencja obrazów.
3. Kliknij pierwszy obraz folderu i kliknij przycisk Otwórz. Poczekaj, aż pojawi się wyskakujące okienko z opcjami sekwencji (Rysunek 2A).

Rysunek 2: Tworzenie stosu szeregowego i wyrównanie sekcji szeregowej za pomocą Fiji. (A) Zrzut ekranu pokazujący opcje sekwencji podczas wczytywania obrazów do tworzenia stosu szeregowego. (B) Zrzut ekranu wtyczki TrackEM2 i kluczowych okien wtyczki. Naciśnij OK w rozdzielaniu plasterków, aby kontynuować wyrównywanie. (C) Zrzut ekranu po pomyślnym załadowaniu stosu szeregowego do okienka wizualizacji. Po wybraniu opcji Wyrównaj plasterki stosu pojawią się trzy sekwencyjne okna parametrów wyrównania. Wyeksportuj wyrównany stos po zakończeniu wyrównywania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Kliknij opcję Sortuj nazwy numerycznie | Konwertuj na opcję 8-bitową. Naciśnij przycisk OK.
   UWAGA: Konwersja do wersji 8-bitowej ułatwia importowanie danych do programu Amira i zmniejsza rozmiar pliku, umożliwiając szybsze przetwarzanie w późniejszych krokach.
5. Sprawdź kompletność, kolejność i powiększenie utworzonego stosu. Zapisz utworzony stos jako plik .tif.
   UWAGA: Obrazy powinny być rejestrowane w tym samym powiększeniu.
6. Uruchom wtyczkę TrakEM2⁴¹. Przejdź do punktu menu Plik | Nowość | TrackEM2 (pusty).
   UWAGA: Wtyczka poprosi użytkownika o zapisanie plików TrackEM2. W razie potrzeby zapisz pliki TrackEM2 w folderze obrazów. Powinny pojawić się trzy okna: okno projektu, okno nawigacji po stosie (po lewej) i okienko wizualizacji stosu (Rysunek 2B).
7. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby przejść do czarnego okienka wizualizacji. Kliknij opcję Importuj | Zaimportuj stos i wybierz wcześniej utworzony stos.
8. Kliknij przycisk OK, aby załadować stos do okna nawigacji po stosie.
   UWAGA: Pojawi się okno separacji plasterków z prośbą o podanie relacji między pikselami i wymiarami. W przypadku tylko wyrównania stosu kliknij przycisk OK, aby pominąć ten krok.
9. Użyj suwaka, aby sprawdzić wszystkie wycinki stosu. Poszukaj załadowanego wycinka, który pojawi się jako poprawka w planie nawigacji. Wybierz łaty, które zostaną uwzględnione w następującym wyrównaniu.
   UWAGA: Wybrane łatki zmienią kolor na niebieski.
10. Najedź kursorem myszy na okienko wyświetlania. Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy, wybierz polecenie Wyrównaj | Wyrównaj plasterki stosu (Rysunek 2C-1).
11. Określ parametry wyrównania za pomocą zestawu trzech kolejnych okien.
    UWAGA: W przypadku większości danych zacznij od sztywnego wyrównania (pozwala na obrót i translację, ale nie transformację) i zachowaj inne parametry jako domyślne (Rysunek 2C-2).
12. Pozwól, aby wyrównanie działało, aż w dzienniku odczytu pojawi się komunikat Montaż zakończony.
    UWAGA: Czas działania zależy od liczby wokseli i szybkości komputera.
13. Sprawdź wyrównany stos w okienku wyświetlania. Naciśnij Alt i - (na komputerze PC) lub Ctrl i - (na komputerze Mac), aby pomniejszyć widok wyrównanego stosu.
14. Jeśli wyrównany stos jest zadowalający, kliknij prawym przyciskiem myszy pozycję Eksportuj | Utwórz płaski obraz, aby zapisać wyrównany stos.
15. Wybierz pierwszy obraz jako początek stosu, a ostatni obraz jako koniec stosu, kliknij OK (Rysunek 2C-3). Zapisz wyrównany stos jako .tif.
    UWAGA: Aby zmniejszyć rozmiar pliku, przytnij dane tak, aby zawierały tylko niezbędny obszar zainteresowania.
16. W razie potrzeby wykonaj wyrównanie afiniczne na wyrównanym stosie. Otwórz wyrównany stos na Fidżi, wybierz Wtyczka | Rejestracja | Reg. stosu.
17. Wybierz opcję afiniczną i naciśnij OK. Poczekaj, aż program zostanie zakończony.
18. Zapisz stos wyrównany afinicznie pod inną nazwą pliku.

7. Segmentacja i rekonstrukcja 3D

1. Otwórz klasę Amira⁴². Kliknij pozycję Plik | Otwórz pozycję Dane, aby załadować wyrównany stos.
2. Określ wymiary wokseli w nowym wyskakującym oknie (Rysunek 3A).

Rysunek 3: Segmentacja stosu szeregowego za pomocą Amiry. (A) Wyskakujące okienko definicji woksela przed załadowaniem wyrównanego stosu. (B) Zrzut ekranu interfejsu projektu po zaimportowaniu stosu. Wybierz kartę Segmentacja, aby rozpocząć śledzenie obiektów w panelu Edytor segmentacji. (C) Najważniejsze cechy zakładki segmentacji. Zdefiniuj obiekty do segmentacji w sekcji Edytor segmentacji na karcie Segmentacja. Użyj funkcji powiększania, aby ułatwić identyfikację obiektów. Wybierz narzędzie Pędzel i obrysuj granicę obiektu. Kliknij symbol + w obszarze Zaznaczenie, aby przypisać obrys. Przypisany obiekt będzie wyglądał tak, jakby miał czerwoną obwódkę w panelu podglądu ortoplasterka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

UWAGA: W interfejsie projektu pojawi się węzeł stosu obrazów, a w panelu podglądu po prawej stronie pojawi się ortoplasterek (Rysunek 3B).

3. Aby rozpocząć segmentację, wybierz zakładkę Segmentacja (Rysunek 3B).
   UWAGA: Zaleca się zapisywanie postępu segmentacji przed i w trakcie segmentacji. Przejdź do Modelu | Zapisz model jako dowolny plik .am, który pasuje.
4. Kliknij przycisk Nowy w panelu edytora segmentacji, aby zdefiniować nowe obiekty na liście materiałów. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zmienić kolor obiektu, a następnie kliknij dwukrotnie, aby zmienić nazwę obiektu.
5. W przypadku segmentacji ręcznej wybierz narzędzie do segmentacji znajdujące się pod listą materiałów. Wybierz domyślne narzędzie Pędzel, aby podświetlić piksele ( Rysunek 3C).
   UWAGA: Możesz też użyć narzędzia pędzel, aby obrysować kontur obiektu i nacisnąć Shift + F, aby wypełnić obiekt.
6. Aby przekonwertować narzędzie pędzla na gumkę, naciskaj Ctrl podczas wybierania pikseli do korekty. Dodaj adnotacje do każdego wycinka w stosie.
7. Po potwierdzeniu przypisz wybór do etykiety, klikając znak +. Kliknij znak -, aby usunąć zaznaczenie.
8. Wróć do interfejsu projektu po zakończeniu segmentacji. Poszukaj węzła z rozszerzeniem ".label" połączonego ze stosem obrazów.
9. Kliknij prawym przyciskiem myszy rozszerzenie ".label" i wybierz Generuj powierzchnię | Zastosuj, aby utworzyć plik .surf.
10. Aby wyrenderować model 3D obiektu podzielonego na segmenty, kliknij prawym przyciskiem myszy plik .surf i wybierz polecenie Widok powierzchni, aby wygenerować model 3D w okienku wyświetlania.
11. Zapisz model 3D do wizualizacji lub dalszych analiz ilościowych.

Dla tej techniki, obszary zainteresowania są wybierane na podstawie celu badań biologicznych i identyfikowane przed przycięciem i przekrojeniem osadzonej tkanki. Podobnie, wielkość lica bloku może być podyktowana pytaniem badawczym; w tym przypadku próbka została przycięta tak, aby pozostawić powierzchnię bloku o wymiarach około 0,3 mm x 0,15 mm (Rysunek 4A). Pozwoliło to na stworzenie dwóch siatek po 9 odcinków szeregowych na siatkę, co dawało 18 odcinków szeregowych i zawierało objętość tkanki wątroby o objętości około 62μm3 (316 μm x 150 μm x 1,3 μm). Objętość ta była wystarczająca, aby umożliwić pełną rekonstrukcję 3D poszczególnych mitochondriów w tkance wątroby.

Rysunek 4: Segmentacja i rekonstrukcja 3D przegląd morfologii ER i powiązanych kontaktów ER-mitochondriów. (A) Przegląd wstęgi sekcji szeregowych w TEM. (B) Widok obszaru zainteresowania w małym powiększeniu i kontekstowych punktów orientacyjnych do przeniesienia. Podziałka = 40 μm (i), 20 μm (ii), 5 μm (iii), 1 μm (iv). (C) Po lewej: tomogram EM dwóch ustawionych hepatocytów. Po prawej: segmentowa wersja tego samego tomogramu. Ślad ER (żółty), mitochondriów (cyjan) i kontaktów międzybłonowych między ER a mitochondriami o różnej przestrzeni: 0-20 nm (magenta); 21-100 nm (niebieski). (D) Ortoplaster wyizolowany ze zrekonstruowanego modelu, pokazujący tylko ER i różne styki membrany, odpowiadające obszarowi z adnotacją strzałkową we wstawce. (E) Rekonstrukcja 3D segmentowanych organelli i kontaktów ER-mitochondriów pod różnymi kątami. Skróty: ER = retikulum endoplazmatyczne; TEM = transmisyjna mikroskopia elektronowa; mt = mitochondria. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wizualizacja odcinków szeregowych za pomocą TEM przy małym powiększeniu pomaga zidentyfikować wyznaczony obszar zainteresowania i jego kontekst w pozostałej części tkanki (Rysunek 4B). Obrazy te mogą być używane do znajdowania tego samego obszaru zainteresowania w kolejnych sekcjach. Wybrano i zaprezentowano interesujący nas obszar wykazujący dobre zachowanie na granicy dwóch ustawionych hepatocytów. Obrazowanie w większym powiększeniu pozwala na obserwację szczegółów morfologicznych różnych organelli (Rysunek 4C) z rozdzielczością nm. Aby zilustrować dwa typy asocjacji ER-organelli, wybrane mitochondria i ER podzielono na segmenty, ręcznie śledząc krawędź błon o zwiększonej gęstości elektronów. Następnie narzędzie pędzla zostało ustawione na stałą grubość nm/px (Rysunek 3B) i użyte do śledzenia granicy organelli będącej przedmiotem zainteresowania, aby podkreślić regiony między dwoma docelowymi organellami, które znajdowały się w określonej odległości kontaktu od siebie i mogły być oznaczone jako określona klasa kontaktów organelli. Rysunek 4D pokazuje pochylony ortoryt pokryty śladami segmentacji i jego względnym położeniem (grot strzałki w modelu 3D wlotu) w całym mitochondrium.

Ślady zostały przypisane do różnych kolorów, zrekonstruowane do modelu 3D po segmentacji i wyświetlane w różnych orientacjach (Rysunek 4E). Wykazano, że struktura ER (żółta) jest częściowo przezroczysta w środkowych panelach, aby uwidocznić kontakty ER-mitochondria i mitochondria (cyjan) pod spodem. Widok z przodu i z tyłu modelu ujawnia asymetryczny rozkład kontaktów międzyorganellowych o różnych odstępach międzybłonowych. Przestrzeń międzybłonowa mniejsza niż 21 nm została przypisana jako kontakt ER-mitochondria (różowy), ponieważ funkcje takie jak transfer lipidów zostały uznane za możliwe do zrealizowania w tej odległości43. Przestrzeń międzybłonowa (niebieska) między 21 a 100 nm została również opisana, ponieważ ten region może reprezentować niedawno zgłoszone powiązania mitochondria-szorstko-ER44. W modelu 3D zaobserwowano zawijanie struktur ER o podobnej krzywiźnie (Rysunek 4E). Rysunek 4D pokazuje przykład zmiany odległości międzybłonowej (~40 nm → ~20 nm → ~40 nm) między owijającymi się CISTERNAE a mitochondriami. Metoda ta pozwala na dalszą analizę plam tych dwóch odrębnych przestrzeni międzybłonowych, dzięki czemu możliwa jest analiza ilościowa ich obfitości, rozmieszczenia i topologii.

Tabela 1: Przegląd technik objętościowej mikroskopii elektronowej. Skróty: EM = mikroskopia elektronowa; TEM = transmisja EM; FIB-SEM = skupiona wiązka jonów SEM; SBF-SEM = blok szeregowy czołowy SEM; SEM + AT = SEM z tomografią matrycową.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.