Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowa charakterystyka miejsc kontaktu między organellami w hepatocytach przy użyciu mikroskopii elektronowej o przekroju szeregowym

5.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63496

⸱

9 czerwca 2022

 ,  ,  , 
1MRC Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London, 2NIHR Great Ormond Street Hospital Biomedical Research Centre, University College London

W tym artykule

Podsumowanie

Prosty i wszechstronny protokół do pozyskiwania trójwymiarowych szczegółów miejsc kontaktu błony między organellami w hepatocytach z wątroby lub komórek w innych tkankach.

Streszczenie

Transmisyjna mikroskopia elektronowa od dawna uważana jest za złoty standard w wizualizacji ultrastruktury komórkowej. Jednak analiza jest często ograniczona do dwóch wymiarów, co utrudnia pełne opisanie trójwymiarowej (3D) ultrastruktury i funkcjonalnego związku między organellami. Objętościowa mikroskopia elektronowa (vEM) opisuje zbiór technik, które umożliwiają badanie ultrastruktury komórkowej w 3D w rozdzielczościach mezoskalowych, mikroskalowych i nanoskalowych.

Ten protokół zapewnia przystępną i solidną metodę pozyskiwania danych vEM za pomocą transmisji sekcji szeregowej EM (TEM) i obejmuje techniczne aspekty przetwarzania próbek aż do cyfrowej rekonstrukcji 3D w jednym, prostym przepływie pracy. Aby zademonstrować przydatność tej techniki, przedstawiono ultrastrukturalny związek 3D między retikulum endoplazmatycznym a mitochondriami i ich miejscami kontaktu w hepatocytach wątroby. Kontakty międzyorganellowe odgrywają istotną rolę w przenoszeniu jonów, lipidów, składników odżywczych i innych małych cząsteczek między organellami. Jednak pomimo ich początkowego odkrycia w hepatocytach, wciąż jest wiele do nauczenia się o ich cechach fizycznych, dynamice i funkcjach.

Kontakty międzyorganelle mogą wykazywać różne morfologie, różniące się odległością dwóch organelli od siebie (zazwyczaj ~10-30 nm) i zasięgiem miejsca kontaktu (od kontaktów punktowych do większych kontaktów 3D przypominających cysternę). Badanie bliskich kontaktów wymaga obrazowania w wysokiej rozdzielczości, a TEM z odcinka seryjnego dobrze nadaje się do wizualizacji ultrastruktury 3D kontaktów międzyorganellowych podczas różnicowania hepatocytów, a także zmian w architekturze hepatocytów związanych z chorobami metabolicznymi.

Wprowadzenie

Od czasu ich wynalezienia w latach 30-tych, mikroskopy elektronowe pozwalają naukowcom na wizualizację składników strukturalnych komórek i tkanek1,2. Większość badań dostarczyła informacji 2D, ponieważ budowanie modeli 3D wymaga żmudnego zbierania sekcji seryjnych, ręcznego fotografowania, obróbki negatywów, ręcznego śledzenia oraz tworzenia i składania modeli 3D z tafli szkła, plastiku lub styropianu3,4. Prawie 70 lat później nastąpił znaczny postęp w wielu aspektach procesu, od wydajności mikroskopu, zbierania przekrojów seryjnych, zautomatyzowanego obrazowania cyfrowego, zaawansowanego oprogramowania i sprzętu do rekonstrukcji, wizualizacji i analizy 3D, po alternatywne podejścia do tego, co obecnie określa się zbiorczo jako objętość EM (vEM). Uważa się, że te techniki vEM dostarczają informacji ultrastrukturalnych 3D w rozdzielczościach nanometrowych w skalach mikronowych i obejmują transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM) oraz nowsze techniki skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM); Zobacz recenzje5,6,7,8.

Na przykład, skupiona wiązka jonów SEM (FIB-SEM) wykorzystuje skupioną wiązkę jonów wewnątrz SEM do mielenia powierzchni bloku pomiędzy sekwencyjnymi skanami obrazowania SEM powierzchni bloku, umożliwiając wielokrotne automatyczne mielenie/obrazowanie próbki i tworzenie zestawu danych 3D do rekonstrukcji9,10. W przeciwieństwie do tego, seryjna powierzchnia bloku SEM (SBF-SEM) wykorzystuje ultramikrotom wewnątrz SEM do usunięcia materiału z powierzchni bloku przed obrazowaniem11,12, podczas gdy tomografia matrycowa jest procesem nieniszczącym, który wymaga zbierania odcinków seryjnych na szkiełkach nakrywkowych, płytkach lub taśmie, przed skonfigurowaniem zautomatyzowanego przepływu pracy obrazowania obszaru zainteresowania w sekwencyjnych sekcjach w SEM w celu wygenerowania zestawu danych 3D13. Podobnie jak tomografia matrycowa, TEM odcinka szeregowego (ssTEM) wymaga pobrania skrawków fizycznych przed obrazowaniem; jednak te sekcje są zbierane w siatkach TEM i obrazowane w TEM14,15,16. ssTEM można rozszerzyć, wykonując tomografię wychylenia17,18,19. Szeregowa tomografia wychylna zapewnia najlepszą rozdzielczość w zakresie x, y i z, i chociaż była używana do rekonstrukcji całych komórek20, jest dość trudna. Protokół ten koncentruje się na praktycznych aspektach ssTEM jako najbardziej dostępnej techniki vEM dostępnej dla wielu laboratoriów EM, które mogą obecnie nie mieć dostępu do specjalistycznych narzędzi do sekcji lub vEM, ale skorzystałyby na generowaniu danych 3D vEM.

Seryjna ultramikrotomia do rekonstrukcji 3D była wcześniej uważana za wyzwanie. Trudno było ciąć proste wstęgi o równej grubości przekroju, być w stanie ułożyć i podnieść wstęgi o odpowiednim rozmiarze, we właściwej kolejności, na siatki z wystarczającym wsparciem, ale bez pasków siatki zasłaniających obszary zainteresowania, a co najważniejsze, bez utraty sekcji, ponieważ niekompletna seria może uniemożliwić pełną rekonstrukcję 3D21. Jednak ulepszenia komercyjnych ultramikrotomów, noże do cięcia i przycinania diamentów22,23, przezroczyste folie nośne elektronów na siatkach21,24, oraz kleje wspomagające przyleganie sekcji i konserwację wstążki13,21 to tylko niektóre z postępów, które nastąpiły na przestrzeni lat, dzięki czemu technika ta stała się bardziej rutynowa w wielu laboratoriach. Po zebraniu odcinków seryjnych, obrazowanie seryjne w TEM jest proste i może dostarczyć obrazy EM o subnanometrowych rozmiarach px w x i y, umożliwiając badanie struktur subkomórkowych w wysokiej rozdzielczości - potencjalny wymóg dla wielu pytań badawczych. Przedstawione tutaj studium przypadku demonstruje zastosowanie ssTEM i rekonstrukcji 3D w badaniu kontaktów retikulum endoplazmatycznego (ER) z organellami w hepatocytach wątroby, gdzie po raz pierwszy zaobserwowano kontakty ER-organelle 25,26.

Będąc w sąsiedztwie z otoczką jądrową, ER nawiązuje również bliskie kontakty z wieloma innymi organellami komórkowymi, w tym lizosomami, mitochondriami, kropelkami lipidów i błoną plazmatyczną27. Kontakty ER-organelle są zaangażowane w metabolizm lipidów28, fosfoinozytyd i sygnalizacja wapnia29, regulacja autofagii i reakcja na stres30,31. Kontakty ER-organelle i inne kontakty międzyorganellowe są wysoce dynamicznymi strukturami, które reagują na komórkowe potrzeby metaboliczne i sygnały zewnątrzkomórkowe. Wykazano, że różnią się morfologicznie pod względem wielkości i kształtu oraz odległości między błonami organelli32,33. Uważa się, że te różnice ultrastrukturalne prawdopodobnie odzwierciedlają ich różny skład i funkcję białek/lipidów34,35. Jednak zdefiniowanie kontaktów międzyorganellowych i ich analiza jest nadal trudnym zadaniem36. W związku z tym do dalszych badań wymagany jest wiarygodny, ale prosty protokół do badania i charakteryzowania kontaktów międzyorganelli.

Ponieważ kontakty ER-organelle mogą wynosić od 10 do 30 nm w separacji membrana-membrana, złotym standardem identyfikacji był historycznie TEM. Cienkoczęściowy TEM ujawnił specyficzną lokalizację subdomen dla rezydentnych białek ER w różnych kontaktach błonowych37. Tradycyjnie, ujawniało to kontakty ER-organelle z rozdzielczością nm, ale często przedstawiało tylko widok 2D tych interakcji. Jednak podejścia vEM ujawniają ultrastrukturalną prezentację i kontekst tych miejsc kontaktu w 3D, umożliwiając pełną rekonstrukcję kontaktów i dokładniejszą klasyfikację kontaktów (punktowe vs. rurowe vs. cysternalne) oraz kwantyfikację38,39. Oprócz tego, że są pierwszym typem komórki, w którym zaobserwowano kontakty ER-organella25,26, hepatocyty mają rozbudowany system innych kontaktów międzyorganelli, które odgrywają istotną rolę w ich architekturze i fizjologii28,40. Jednak nadal brakuje dokładnej charakterystyki morfologicznej ER-organelli i innych kontaktów międzyorganowych w hepatocytach. W związku z tym sposób, w jaki tworzą się i przebudowują kontakty międzyorganellowe podczas regeneracji i naprawy, ma szczególne znaczenie dla biologii hepatocytów i funkcji wątroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie zwierzęta były utrzymywane zgodnie z wytycznymi brytyjskiego Home Office, a pobieranie tkanek przeprowadzono zgodnie z brytyjską ustawą Animal (Scientific Procedures) Act 1986.

1. Fixacja i przygotowanie preparatu

  1. Podziel tkankę wątroby na kawałki o odpowiedniej wielkości, około 8 mm x 8 mm x 3 mm, i umieść je w ciepłym roztworze soli fosforanowej (PBS, 37 °C).
  2. Wstrzyknij utrwalacz o temperaturze pokojowej (20-25 °C) (1,5% glutaraldehydu w 1% sacharozie, 0,1 M kdakodylan sodu) do kawałków wątroby i przenieś je z PBS do utrwalacza na maksymalnie 20 min w temperaturze pokojowej. Tkanka musi być stale zanurzona w roztworach, aby zapobiec jej wysychaniu.
    UWAGA: Aldehydy są substancjami drażniącymi, żrącymi i potencjalnie rakotwórczymi. Kakodylan sodu jest toksyczny w przypadku połknięcia lub wdychania. Wszystkie utrwalacze należy obsługiwać w odpowiednich środkach ochrony indywidualnej, a eksperyment należy przeprowadzić w dygestorium. Prawidłowa fiksacja sprawi, że tkanka stanie się twardsza.
  3. Przygotuj wibrotom z nożem, łożem lodowym i chłodną tacą buforową wypełnioną PBS. Zamocuj pierwszy kawałek utrwalonej tkanki wątroby na uchwycie do próbek za pomocą kleju cyjanoakrylowego i przenieś blok na wibrotom.
  4. Zgodnie z zaleceniami producenta, zbliż nóż do tkanki i przetnij utrwaloną wątrobę na plastry o grubości 100 µm.
  5. Zbierz plastry za pomocą szpatułki lub pędzla z naturalnego włosia i przenieś je do płytki 12- lub 24-dołkowej zawierającej lodowaty utrwalacz (1,5% glutaraldehydu, 0,1 M kakodylanu sodu) w lodzie. Przechowuj plastry w lodzie, aż wszystkie próbki zostaną pocięte i będą gotowe do dalszej obróbki.
  6. Wybierz plastry zawierające obszary zainteresowania do dalszej obróbki i przemyj je przy delikatnym wytrząsaniu. Przeprowadź trzy 5-minutowe płukania 0,1 M kakodylanem sodu w temperaturze pokojowej w płytce 12- lub 24-dołkowej, upewniając się, że plastry mają wystarczającą ilość buforu, aby swobodnie się poruszać.
    UWAGA: Zazwyczaj obszary zainteresowania są wybierane na podstawie cech anatomicznych związanych z pytaniem badawczym badania oraz kierując się regionami tkanki, które prawdopodobnie występują w całej serii, np. nie na brzegu przekroju, i są dobrze zachowane.
  7. W dygestorium zastąp 0,1 M kakodylan sodu świeżo przygotowanym roztworem 1% tetroksydu osmu/1,5% żelazicyjanku potasu. Umieść płytkę 12- lub 24-dołkową w szczelnym pojemniku i przenieś go do lodówki na chemikalia niebezpieczne na 1 h.
    UWAGA: Osmi jest niezwykle niebezpieczny w przypadku połknięcia, wdychania i kontaktu ze skórą. Żelazicyjanek potasu jest substancją drażniącą i szkodliwą przy wdychaniu oraz kontakcie ze skórą. Zawsze obsługuj go w odpowiednich środkach ochrony indywidualnej i przeprowadzaj eksperyment w dygestorium.
  8. W dygestorium usuń tetroksyd osmu/żelazicyjanek potasu do dedykowanej butelki na odpady z osmem i trzykrotnie przemyj próbki 0,1 M kakodylanem sodu przez 5 min. Pozostaw próbki w szczelnym pojemniku przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Potencjalny punkt przerwania procesu. Próbki mogą być przechowywane w 0,1 M kakodylanie sodu w szczelnym pojemniku w temperaturze 4 °C przez wiele tygodni bez większego uszczerbku dla konserwacji. Upewnij się, że znajduje się wystarczająca ilość buforu, aby zapobiec wysychaniu.
  9. Inkubuj próbki ze świeżo przygotowanym 1% kwasem taninowym w 0,05 M kakodylanie sodu przez 45 min w ciemności w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Kwas taninowy jest substancją drażniącą i może uszkodzić oczy. Stosuj odpowiednie środki ochrony indywidualnej i przeprowadzaj eksperyment w dygestorium.
  10. Przeprowadź trzy 5-minutowe płukania ddH2O przed dehydratacją i zatopieniem.

2. Odwadnianie próbek, zatapianie w żywicy Epon i montowanie

  1. Przygotować żywicę Epon zgodnie z poniższymi proporcjami wagowymi (patrz krok 2.2). Tarować wagę z jednorazowym plastikowym zlewkiem o pojemności 100 mL zawierającym mieszadło magnetyczne. Odciąć końcówki z 5 jednorazowych plastikowych pipet Pasteura i za ich pomocą przenieść lepkie składniki żywicy do zlewki.
  2. Do zlewki dodawaj sekwencyjnie 19,2 g żywicy resin-812, 7,6 g DDSA, 13,2 g MNA oraz 0,8 g akceleratora DMP-30. Używając piątej czystej plastikowej pipety Pasteura, dokładnie wymieszaj ręcznie składniki żywicy.
    UWAGA: Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza, zapewniając jednocześnie wystarczające wymieszanie żywicy dolnej z górną, aby uzyskać zmianę koloru i wstępne wymieszanie warstw komponentów. Wszystkie składniki żywicy są substancjami drażniącymi i są szkodliwe w przypadku inhalacji oraz kontaktu ze skórą. DMP-30 ma właściwości żrące i może powodować oparzenia skóry. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.
  3. Umieść zlewkę na mieszadle magnetycznym i pozostaw do delikatnego mieszania, okresowo mieszając żywicę ręcznie.
  4. Przemyć próbki w 70% etanolu przez 5 min przy łagodnym mieszaniu; powtórzyć czynność raz.
  5. Przemyć próbki w 90% etanolu przez 5 min przy łagodnym wytrząsaniu; powtórzyć raz.
  6. Próbki należy przemyć 100% etanolem przez 5 min przy łagodnym mieszaniu; czynność powtórzyć raz.
  7. Podczas gdy próbki znajdują się w dygestorium w 100% etanolu do przemywania, przygotować w szklanej fiolce z plastikową zakrętką odporną na tlenek propylenu (PO) mieszaninę tlenku propylenu (PO) i Eponu w stosunku 50:50 (v/v). Ostrożnie, lecz szczelnie zamknąć zakrętkę fiolki, a następnie, trzymając jednocześnie zakrętkę i fiolkę, wymieszać zawartość poprzez wstrząsanie lub użycie wibratora laboratoryjnego (vortex).
    UWAGA: Tlenek propylenu jest silnie toksyczną, łatwopalną substancją drażniącą, która rozpuszcza niektóre rodzaje tworzyw sztucznych. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej i przeprowadzać eksperyment w dygestorium.
  8. Po kroku 2.6 inkubować próbki w PO:Epon przez 1 h w naczyniu odpornym na PO (np.., tace aluminiowe lub fiolki szklane), przy delikatnym kołysaniu/mieszaniu w dygestorium.
  9. W komorze dyfuzyjnej przenieś próbki do 100% Epon. Inkubuj przez 2 h w temperaturze pokojowej w komorze dyfuzyjnej przy zastosowaniu kołysania/rotacji/mieszania. Przenieś mieszaninę PO:Epon do dedykowanej szklanej butelki na odpady Epon.
  10. Powtórz krok 2.9 raz.
  11. Zamocuj próbki do zatopienia. W zależności od wielkości przekrojów i obszaru zainteresowania, zamocuj przekroje bezpośrednio na wstępnie spolimeryzowanych bloczkach żywicznych lub zatop je płasko w celu przeprowadzenia sekcjonowania, a następnie zatop je ponownie w późniejszym terminie.
    UWAGA: W przypadku zatapiania na płasko można użyć formy do szkiełek („cast-a slide”), aby zatopić wiele przekrojów jednocześnie. Pozostałą żywicę można wykorzystać do wypełnienia kapsułek wiązki i utwardzić w celu przygotowania wstępnie spolimeryzowanych kikutów lub zamrozić do późniejszego użycia.
  12. Po zamontowaniu i pokryciu wystarczającą ilością żywicy w celu wypełnienia otworu w podstawce „cast-a slide”, próbki należy piec przez noc w 60 °C piec.
    UWAGA: Potencjalny punkt przerwania procedury. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej przez wiele lat.
  13. W celu ponownego zatopienia należy wyznaczyć obszar zainteresowania w płaskich, zatopionych plastrach tkanki. Używając piłki jubilerskiej, należy wyciąć fragment tkanki o odpowiedniej wielkości (1 mm2 do 4 mm2) i ponownie zatopić w żywicy przygotowanej zgodnie z krokiem 2.2, na górnej powierzchni wstępnie spolimeryzowanego bloku, a następnie utwardzać w piecu przez noc w 60 °C piekarnik
    UWAGA: Alternatywnie fragment tkanki można przykleić do podstawki lub pinu za pomocą dwuskładnikowej żywicy epoksydowej. Pozostawić do utwardzenia na noc. Potencjalny punkt przerwania pracy.

3. Przycinanie i seryjne cięcie zatopionych próbek

UWAGA: Przygotowywanie skrawków jest umiejętnością nabytą; użytkownicy powinni biegle opanować technikę cięcia ultracienkich skrawków przed przystąpieniem do cięcia seryjnego. Ponieważ precyzyjne sterowanie mikrotomem różni się w zależności od producenta, należy stosować się do instrukcji i wytycznych producenta.

  1. Po zablokowaniu próbki w adaptorze do przycinania, należy użyć żyletki, aby ostrożnie przyciąć tkankę zatopioną w żywicy tak, aby spełniała następujące kryteria (patrz Rysunek 1A,B):
    1. Należy upewnić się, że tkanka wokół obszaru zainteresowania posiada płaską górną powierzchnię.
    2. Należy zapewnić kształt trapezu z czystymi i równoległymi krawędziami górną i dolną.
    3. Upewnij się, że całkowite wymiary wynoszą 200-500 µm w Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia., 100-500 µm w y.
    4. Zapewnij asymetryczną powierzchnię bloku, np.., prawe górne i dolne narożniki ~90 °lewy górny róg rozwarty, a lewy dolny róg ostry.
      UWAGA: Alternatywnym narzędziem zamiast żyletki może być nóż kriostatyczny do przycinania. Pozostałe zalecenia służą wygodzie użytkownika podczas ustawiania sekcji do obrazowania. Opcjonalnie: Jeśli sekcje nie tworzą stabilnych taśm, na przednią krawędź powierzchni bloku można nałożyć klej kontaktowy, aby wspomóc formowanie taśm. Żyletki są ostre; należy trzymać żyletkę w taki sposób, aby przypadkowe ześlizgnięcie się narzędzia nie doprowadziło do obrażeń ciała.

Schemat obrazowania TEM: zatopiona próbka, przycinanie, seryjne przekroje, pobieranie, wyrównywanie, rekonstrukcja 3D.
Rysunek 1: Schemat pracy przy seryjnym przekrojeniu w TEM. (A) Schemat preparatu w bloku żywicznym. (B) Przycinanie bloku w celu uzyskania kształtu trapezu z krawędziami odpowiednimi do seryjnego przekrojenia oraz asymetryczną powierzchnią bloku dla zapewnienia znanej orientacji. (C) Schemat przedstawiający wstęgi seryjnych przekrojów, unoszące się na powierzchni wody w łódeczce z nożem diamentowym. (D) Schemat przedstawiający organizację przekrojów i wstęgi, określającą kolejność przekrojów, na siatce TEM z otworami o średnicy 3 mm. (E) Obrazowanie i nawigacja w TEM. Przedstawienie kolejności wstęg i przekrojów oraz użycie „żółtych naklejek-gwiazdek” na monitorze jako punktów odniesienia ekranu, aby zapewnić ponowne obrazowanie tego samego obszaru zainteresowania w kolejnych przekrojach. (F) Wyrównywanie i przycinanie obrazów. (G) Segmentacja, rekonstrukcja 3D i wizualizacja. Skrót: TEM = transmisyjna mikroskopia elektronowa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Po przycięciu przenieś łuk uchwytu z zamocowanym uchwytem i próbką na ramię mikrotomu, ustawiając łuk w taki sposób, aby zakres jego ruchu przebiegał z góry na dół; następnie zabezpiecz łuk uchwytu w tej pozycji.
  2. Umieść i zablokuj nóż diamentowy w uchwycie noża, upewniając się, że kąt cięcia jest odpowiednio ustawiony względem noża. Stabilnie zamocuj uchwyt noża w stole.
  3. Przy włączonym dolnym oświetleniu stolika należy wysuwać nóż, nieustannie kontrolując położenie powierzchni bloczka względem krawędzi noża. Nóż należy ostrożnie przysuwać do preparatu, stale korygując kąt boczny noża, pochylenie oraz rotację preparatu za pomocą odpowiednich pokręteł, aż do momentu wyrównania bloczka z krawędzią noża.
  4. Wyłączyć oświetlenie dolne stolika; włączyć oświetlenie górne stolika; ustawić górną i dolną krawędź okna cięcia ramienia próbki; pozostawić próbkę tuż poniżej krawędzi noża.
  5. Napełnić łódeczkę do krojenia czystą wodą ddH2Następnie należy upewnić się, że powierzchnia wody znajduje się na poziomie krawędzi noża i jest lekko wklęsła.
  6. Opcjonalnie: Zanurzyć rzęsę w 0,1% Triton X-100, a następnie w wodzie w łódce nożowej, aby zmniejszyć napięcie powierzchniowe wody, co ułatwi chloroformowanie i pobieranie wstążki.
  7. Przygotować stanowisko pracy z rzęsami (rzęsa przyklejona do wykałaczki), siatkami w slotach pokrytymi formwarem, oznakowanymi pęsetami do przenoszenia próbek, chloroformem, 0,1% roztworem Triton X-100, wodą destylowaną, papierem filtracyjnym oraz pudełkiem na siatki wraz z notatkami do pudełka.
  8. Ustaw prędkość cięcia na 1 mm/s, a początkową grubość cięcia na 100 nm, i uruchom cykl cięcia.
  9. Po wycięciu pierwszej sekcji należy zmienić parametry cięcia na prędkość cięcia 0,8 mm/s oraz grubość cięcia 70 nm, a następnie kontynuować cięcie, pozwalając na formowanie się sekcji w postaci wstęgi przesuwającej się po powierzchni wody w łódce noża (Rysunek 1C).
    UWAGA: Ważne jest zwrócenie uwagi na kolor przygotowywanych skrawków, ponieważ często stanowi on dokładniejszy wskaźnik grubości sekcji żywicznych. Skrawki srebrne mają zazwyczaj grubość około 70 nm, podczas gdy skrawki szare są cieńsze, a złote grubsze.
  10. Należy pozwolić mikrotomowi na dalsze wycinanie skrawków, aż wstęga stanie się dłuższa.
    UWAGA: Należy unikać silnych wibracji oraz zakłóceń fizycznych w pomieszczeniu. Przeciągi mogą spowodować przemieszczanie się przekrojów na powierzchni wody w kąpieli kąpielowej, a wibracje fizyczne mogą prowadzić do nierównomiernego cięcia przez mikrotom.
  11. Gdy zostanie zebrana odpowiednia liczba skrawków, a przed dotarciem wstęgi do końca łódki, należy przerwać cięcie (bezpośrednio po przejściu próbki przez krawędź noża).
    UWAGA: Liczba potrzebnych przekrojów zależy od wielkości powierzchni bloku oraz rozmiaru zbioru danych do pobrania. W związku z tym warto monitorować zależność między rozmiarem bloku a siatką slotów w trakcie odcinania przekrojów.
  12. Używając pęsety w każdej dłoni, ostrożnie podziel wstęgę na mniejsze fragmenty, które zmieszczą się w długości siatki szczelin, dbając o odnotowanie ich wzajemnego położenia w obrębie próbki.
    UWAGA: Jeśli ich łączna szerokość jest odpowiednia, kilka wstążek można delikatnie ułożyć obok siebie i pobrać wspólnie za pomocą jednej siatki do szczelin. Podczas pobierania kilku wstążek za pomocą jednej siatki do szczelin należy zwrócić uwagę na kolejność oraz wzajemne położenie wstążek. Na przykład, zawsze umieszczaj wstążki głębiej w próbce, na prawo od wstążki już znajdującej się w próbce (Rycina 1D).
  13. Opcjonalnie: przy użyciu szklanej bagietki należy zawisnąć kroplą chloroformu nad skrawkami, aby je wyprostować.
    UWAGA: Chloroform jest toksyczny i działa drażniąco. Należy dopilnować, aby chloroform nie miał kontaktu z powierzchnią wody ani z przekrojami. W przypadku przypadkowego kontaktu należy usunąć wodę i umyć nóż przed wznowieniem procesu skrawania. Chloroform może uszkodzić przekroje oraz zdegradować klej mocujący diament w uchwycie noża.
  14. Używając pierwszej numerowanej pęsety, wyjmij pierwszą pustą siatkę do slotów (znajdującą się po prawej stronie slotu, stroną z formvarem skierowaną w dół), delikatnie zanurz ją w Triton X-100, a następnie dwukrotnie w wodzie destylowanej, po czym usuń nadmiar wody z krawędzi pęsety za pomocą kawałka papieru filtracyjnego.
  15. Trzymając rzęsę w jednej ręce, a pęsetę w drugiej, ostrożnie opuść około 2/3rd siatkę z otworami powleczoną formvarem do wody w łódce noża (z dala od przekrojów) w taki sposób, aby strona z formvarem była skierowana w dół, a prawa długa krawędź otworu znajdowała się na powierzchni wody i była równoległa do brzegu wody.
  16. Delikatnie przemieszczaj siatkę w wodzie w kierunku wstążek, tak aby podczas ruchu powrotnego sekcje dryfowały w stronę siatki. Kontynuuj tę czynność, wykonując coraz mniejsze ruchy, aż prawa krawędź wstążek wyrówna się z prawą krawędzią szczeliny. Następnie, podczas ostatniego ruchu, ostrożnie unieś siatkę, aby przenieść sekcje do siatki szczeliny.
  17. Pozostaw siatkę w pęsecie do wyschnięcia przed przechowywaniem jej w pudełku na siatki, odpowiednio opisując ją na arkuszu referencyjnym pudełka na siatki.
  18. Powtarzać krok 3.16 do momentu zebrania wszystkich wstążek, dbając o zachowanie ich kolejności.
  19. Jeśli wymagane jest wykonanie kolejnych przekrojów, wycofać nóż o około 150 nm, sprawdzić poziom wody w łódce i w razie potrzeby dolać wody. Ponowić proces cięcia, postępując zgodnie z krokami 3.11–3.18.
  20. Po zebraniu wszystkich skrawków należy upewnić się, że krawędź noża jest wolna od resztek materiału, odsunąć nóż od powierzchni bloczka, a następnie wyjąć i wyczyścić nóż.

4. Barwienie siatek

  1. Po wyschnięciu należy zabarwić przekroje cytrynianem ołowiu według metody Reynoldsa, wykonując to bezpośrednio na parafilmie na blacie lub w szalce Petriego. Pod przykrywkę szalki Petriego należy umieścić kilka granulek wodorotlenku sodu, aby zapewnić środowisko wolne od dwutlenku węgla. Następnie, ostrożnie, w pewnej odległości od granulek, należy nanieść pipetą 40 µL krople cytrynianu ołowiu Reynoldsa na parafilmie, po jednej dla każdej siateczki.
    UWAGA: Nie barwić zbyt wielu siatek jednocześnie; np..maksymalnie do 6. Należy unikać oddychania bezpośrednio nad tacką do barwienia. Dwutlenek węgla może zareagować z cytrynianem ołowiu i spowodować powstanie niepożądanych osadów na siatkach.
  2. Odwróć każdą siatkę (stroną sekcji do dołu) na kroplę cytrynianu ołowiu i pozostaw pod przykryciem szalki Petriego na 7 do 10 min. Podczas barwienia siatek przygotuj na blacie drugi, większy kawałek parafilmu z pięcioma 300 µL krople wody destylowanej na każdą siatkę.
  3. Po zakończeniu inkubacji w cytrynianie ołowiu przenieś każdą siatkę do kropli wody destylowanej w celu przemycia przez 1 minutę, unikając bezpośredniego oddychania nad siatkami.
  4. Powtórz krok 4.3 łącznie pięć razy.
  5. Za pomocą numerowanych pęset krzyżowych podnieść pierwszą siatkę, dotknąć jej krawędzi do papieru filtracyjnego, aby odsączyć większość wody, a następnie pozostawić do wyschnięcia w pęsecie (przez co najmniej 20 min). Powtórzyć czynność dla każdej siatki.

5. Pozyskiwanie obrazów za pomocą TEM

UWAGA: Ponieważ dokładne sterowniki TEM różnią się w zależności od producenta, należy stosować się do instrukcji i wytycznych producenta. Poniższe kroki powinny być wykonywane przez użytkowników, którzy biegle posługują się TEM.

  1. Przed obrazowaniem przeprowadź rutynowe sprawdzenia, np. wyrównanie wiązki, referencje wzmocnienia oraz ekscentryczność próbki.
  2. Ostrożnie włóż pierwszą siatkę z serii przekrojów do uchwytu na próbki, dbając o to, aby szczelina (a tym samym przekroje) była wyrównana z osią pionową stolika mikroskopu.
    UWAGA: Precyzja ta nie jest niezbędna, ale pozwala zaoszczędzić czas podczas akwizycji i przyszłych etapów przetwarzania danych. Podczas wkładania siatki (stroną z przekrojem w dół lub w górę), zadbaj o obrazowanie wszystkich siatek w tej samej orientacji.
  3. Przy niskim powiększeniu sprawdź kolejność, lokalizację i położenie seryjnych przekrojów (Rycina 1E). Przejdź do środkowego przekroju serii na siatce.
    UWAGA: W zależności od dokładnego celu badania podejścia do obrazowania mogą się różnić; jednak poniższe kroki stanowią przydatny punkt wyjścia. Kształt przekrojów i układ taśm (zgodnie z krokiem 3.14) określają, który przekrój był pierwszy, a który ostatni na siatce.
  4. Przejrzyj próbkę i zidentyfikuj obszar zainteresowania. Obserwuj próbkę przy pożądanym powiększeniu i rozważ zbieranie serii przy nieco mniejszym powiększeniu, ponieważ przekroje często nie są idealnie wyrównane, a obrazy mogą wymagać późniejszego przycięcia.
  5. Wykonaj obrazy referencyjne przy niższych powiększeniach, aby ocenić kontekst obszaru zainteresowania, jego przybliżoną lokalizację przy różnych powiększeniach w stosunku do granic przekroju oraz charakterystyczne punkty orientacyjne w próbce. Wykorzystaj je do wyznaczania obszaru zainteresowania na pozostałych przekrojach.
  6. Opcjonalnie: w celu referencji ekranu użyj wielorazowej masy mocującej, naklejek lub kawałka folii do rzutnika nadglowego (OHP), przyklejonego do ekranu, aby umieścić tymczasowe znaczniki pozwalające na rutynowe ponowne obrazowanie tych samych cech obszaru zainteresowania w centrum obrazu w całym zbiorze danych (patrz żółte gwiazdki na Rycynie 1E).
  7. Korzystając z obrazów referencyjnych, przejdź do obszaru zainteresowania na pierwszym przekroju siatki i wykonaj obraz przy pożądanym powiększeniu.
    UWAGA: Podczas zapisywania obrazów zanotuj nazwę pierwszego pliku pierwszego obrazu z serii i stosuj sekwencyjną nomenklaturę nazewnictwa, aby wszystkie nazwy obrazów odpowiadały kolejności seryjnych przekrojów.
  8. Przejdź do następnego przekroju i powtarzaj krok 5.7, aż wszystkie przekroje dla danego obszaru zainteresowania zostaną zobrazowane.

6. Eksport obrazów i rejestracja dopasowania sekcji seryjnych

  1. Wyeksportuj pliki obrazów należące do tego samego stosu do jednego folderu. Upewnij się, że folder jest posortowany według nazw plików.
    UWAGA: Obrazy powinny w idealnym przypadku mieć tę samą nazwę główną i zachowywać kolejność, w której zostały pozyskane.
  2. Otwórz program Fiji i kliknij File | Import | Image Sequence.
  3. Kliknij pierwszy obraz w folderze, a następnie kliknij Open. Poczekaj na pojawienie się okna pop-up Sequence Options (Rycina 2A).

Schemat działania TrackEM2: tworzenie stosu, wyrównywanie przekrojów, etapy eksportu; wyrównywanie obrazów mikroskopowych.
Rycina 2: Tworzenie stosu seryjnego i wyrównywanie sekcji seryjnych przy użyciu programu Fiji. (A) Zrzut ekranu przedstawiający opcje sekwencji (Sequence Options) podczas ładowania obrazów w celu utworzenia stosu seryjnego. (B) Zrzut ekranu wtyczki TrackEM2 oraz głównych okien wtyczki. Należy zatwierdzić przyciskiem OK w oknie separacji przekrojów (Slice separation), aby przejść do wyrównywania. (C) Zrzut ekranu po pomyślnym załadowaniu stosu seryjnego do panelu wizualizacji. Po wybraniu opcji Align stack slices pojawią się trzy kolejne okna z parametrami wyrównywania. Po zakończeniu wyrównywania należy wyeksportować wyrównany stos. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Kliknij opcję Sort names numerically | Convert to 8-bit. Naciśnij OK.
    UWAGA: Konwersja do 8 bitów ułatwia import danych do programu Amira i zmniejsza rozmiar pliku, co pozwala na szybsze przetwarzanie w kolejnych krokach.
  2. Sprawdź kompletność, kolejność i powiększenie utworzonego stosu (stack). Zapisz utworzony stos jako plik .tif.
    UWAGA: Obrazy powinny zostać pozyskane przy tym samym powiększeniu.
  3. Uruchom wtyczkę TrakEM241. Przejdź do File | New | TrackEM2 (blank).
    UWAGA: Wtyczka poprosi użytkownika o zapisanie plików TrackEM2. W razie potrzeby zapisz pliki TrackEM2 w folderze z obrazami. Powinny pojawić się trzy okna: okno projektu, okno nawigacji po stosie (po lewej stronie) oraz panel wizualizacji stosu (Rysunek 2B).
  4. Kliknij prawym przyciskiem myszy w czarnym panelu wizualizacji. Wybierz Import | Import stack i zaznacz wcześniej utworzony stos.
  5. Kliknij OK , aby załadować stos do okna nawigacji po stosie.
    UWAGA: Pojawi się okno Slice separation z prośbą o określenie zależności między pikselami a wymiarami. W przypadku potrzeby jedynie wyrównania stosu kliknij OK , aby pominąć ten krok.
  6. Użyj suwaka, aby sprawdzić wszystkie przekroje stosu. Znajdź załadowany przekrój, który pojawi się jako fragment w planie nawigacji. Zaznacz fragmenty, które mają zostać uwzględnione w następnym wyrównaniu.
    UWAGA: Wybrane fragmenty zmienią kolor na niebieski.
  7. Ustaw kursor myszy nad panelem podglądu. Kliknij prawym przyciskiem myszy na obrazie i wybierz Align | Align stack slices (Rysunek 2C-1).
  8. Określ parametry wyrównania w trzech kolejnych oknach.
    UWAGA: W przypadku większości danych zacznij od wyrównania sztywnego (rigid alignment), które pozwala na rotację i translację, ale nie na transformację, i pozostaw pozostałe parametry domyślne (Rysunek 2C-2).
  9. Pozostaw proces wyrównania do momentu, aż w dzienniku odczytów pojawi się komunikat Montage done.
    UWAGA: Czas wykonania zależy od liczby wokseli oraz szybkości komputera.
  10. Sprawdź wyrównany stos w panelu podglądu. Naciśnij klawisze Alt i - (w systemie PC) lub Ctrl i - (w systemie Mac), aby oddalić widok wyrównanego stosu.
  11. Jeśli wyrównany stos jest prawidłowy, kliknij prawym przyciskiem myszy Export | Make flat image, aby zapisać wyrównany stos.
  12. Wybierz pierwszy obraz jako początek stosu, a ostatni obraz jako koniec stosu, kliknij OK (Rysunek 2C-3). Zapisz wyrównany stos jako plik .tif.
    UWAGA: Aby zmniejszyć rozmiar pliku, przytnij dane tak, aby zawierały tylko niezbędny obszar zainteresowania.
  13. W razie potrzeby wykonaj wyrównanie afiniczne na wyrównanym stosie. Otwórz wyrównany stos w programie Fiji i wybierz Plugin | Registration | StackReg.
  14. Wybierz opcję affine i naciśnij OK. Poczekaj na zakończenie pracy programu.
  15. Zapisz stos wyrównany afinicznie pod inną nazwą pliku.

7. Segmentacja i rekonstrukcja 3D

  1. Otwórz program Amira42. Kliknij File | Open Data, aby wczytać wyrównany stos obrazów.
  2. Określ wymiary wokseli w nowym oknie wyskakującym (Rysunek 3A).

Schemat segmentacji wokseli; interfejs projektu, użycie narzędzi do analizy obiektów obrazowych w mikroskopii.
Rysunek 3: Segmentacja seryjnego stosu obrazów przy użyciu programu Amira. (A) Okno pop-up definicji wokseli przed załadowaniem wyrównanego stosu. (B) Zrzut ekranu interfejsu projektu po imporcie stosu. Wybierz zakładkę Segmentation, aby rozpocząć obrysowywanie obiektów w panelu Segmentation Editor. (C) Kluczowe funkcje zakładki segmentacji. Zdefiniuj obiekty do segmentacji w sekcji Segmentation Editor w zakładce Segmentation. Użyj funkcji powiększenia (zoom), aby ułatwić identyfikację obiektów. Wybierz narzędzie Brush (Pędzel) i obrysuj granicę obiektu. Kliknij symbol + w sekcji Selection, aby przypisać obrys. Przypisany obiekt będzie widoczny z czerwoną granicą w oknie podglądu ortogonalnego (orthoslice). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

UWAGA: W interfejsie projektu pojawi się węzeł stosu obrazów, a w oknie podglądu po prawej stronie pojawi się ortoprzekrój (Rycina 3B).

  1. Aby rozpocząć segmentację, wybierz Karta Segmentacji (Segmentation Tab)(Rysunek 3B).
    UWAGA: Zaleca się zapisywanie postępów segmentacji przed i w trakcie jej wykonywania. Przejdź do Model | Zapisz model jako (Save Model As) i wybierz odpowiednią nazwę pliku .am.
  2. Kliknij Nowy (New) w panelu edytora segmentacji, aby zdefiniować nowe obiekty na liście materiałów. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zmienić kolor obiektu, i dwukrotnie kliknij, aby zmienić nazwę obiektu.
  3. W przypadku segmentacji ręcznej wybierz narzędzie segmentacji (segmentation) poniżej listy materiałów. Wybierz domyślne narzędzie Pędzel (Brush), aby zaznaczyć piksele (Rysunek 3C).
    UWAGA: Alternatywnie można użyć narzędzia pędzel (brush) do obrysowania krawędzi obiektu, a następnie nacisnąć Shift + F, aby wypełnić obiekt.
  4. Aby zmienić narzędzie pędzel (brush) w gumkę (eraser), przytrzymaj klawisz Ctrl podczas zaznaczania pikseli do korekty. Opisz każdy przekrój w stosie obrazów.
  5. Po potwierdzeniu przypisz zaznaczenie do etykiety, klikając znak +. Kliknij znak -, aby usunąć zaznaczenie.
  6. Po zakończeniu segmentacji powróć do interfejsu projektu. Znajdź węzeł z rozszerzeniem „.label” połączony ze stosem obrazów.
  7. Kliknij prawym przyciskiem myszy na rozszerzenie „.label” i wybierz Generuj powierzchnię | Zastosuj (Generate Surface | Apply), aby utworzyć plik .surf.
  8. Aby wyrenderować model 3D segmentowanego obiektu, kliknij prawym przyciskiem myszy plik .surf i wybierz Widok powierzchni (Surface view), aby wygenerować model 3D w oknie podglądu.
  9. Zapisz model 3D do wizualizacji lub dalszych analiz ilościowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tej technice obszary zainteresowania są wybierane na podstawie celu badań biologicznych i identyfikowane przed przycinaniem i sekcjonowaniem zatopionej tkanki. Podobnie wielkość powierzchni bloku może być podyktowana pytaniem badawczym; w tym przypadku próbka została przycięta tak, aby powierzchnia bloku wynosiła około 0,3 mm x 0,15 mm (Rysunek 4A). Pozwoliło to na przygotowanie dwóch siatek po 9 sekcji seryjnych na każdą siatkę, co dostarczyło 18 sekcji seryjnych i objęło objętość tkanki ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dostępna technika vEM do wizualizacji struktury organelli i interakcji w 3D jest opisana w tym protokole. Morfologia kontaktów międzyorganellowych w hepatocytach została przedstawiona jako studium przypadku. Jednak podejście to zostało również zastosowane do zbadania wielu innych próbek i obszarów badawczych, w tym interakcji komórek Schwanna i śródbłonka w nerwach obwodowych45, biogenezy ciała Weibel Palade w komórkach śródbłonka46, wydzielania ładunku w komórkach nerki

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Joannie Hanley, Rebecce Fiadeiro i Ani Straatman-Iwanowskiej za fachową pomoc techniczną. Dziękujemy również członkom laboratorium Stefana i Ianowi J. White'owi za pomocne dyskusje. J.J.B. jest wspierany przez MRC Laboratory of Molecular Cell Biology na UCL, kod nagrody MC_U12266B. C.J.S. jest wspierany przez MRC z funduszy MRC dla MRC Laboratory of Molecular Cell Biology University Unit na UCL, kod grantu MC_UU_00012/6. Projekt P.G. jest finansowany przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych, kod grantu ERC-2013-StG-337057.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &mikro; m filtr strzykawkowySarstedt83.1826.001
Tace aluminioweAgar ScientificAGG3912
Amira v6ThermoFisherhttps://www.thermofisher.com
ChloroformFisherC/4960/PB08
DDSA/Dodecenyl Bezwodnik bursztynowyTAABT027Składnik Epon
Nóż diamentowyDiaTOMEultra 45°
DMP-30/2,4,6-tri (dimetyloaminometylo)fenolTAABD032Składnik Epon
Pęseta Dumont N5Agar ScientificAGT5293
Fidżihttps://imagej.net/
Fidżi Wtyczkahttps://imagej.net/
Roztwór formaldehydu 36%TAABF003
Formvar powlekana siatka szczelinowaDomowaalternatywa: EMS diasum (FF2010-Cu)
Szklana butelka z prętem aplikatoraMedisca6258
Fiolki szklaneFisher Scientific15364769
Roztwór aldehydu gluteraldehydu 25%TAABG011
MNA/bezwodnik metylowo-nadicTAABM011Składnik Epon
Tetratlenek osmu 2% roztwórTAABO005
Żelazocyjanek potasuSigma-AldrichP-8131
Tlenek propylenuFisher ScientificE/0050/PB08
Klej wielokrotnego użytkuBlue Tack
Reynolds Cytrynian ołowiuTAABL037Barwnik przekrojowy
Kakodylan soduSigma-AldrichC-0250do zrobić 0,1 M Bufor Caco
Super GlueRS Components918-6872Klej cyjanoakrylowy, Krok 1.3
TAAB 812 ŻywicaTAABT023Składnik Epon
Kwas garbnikowyTAABT046
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
Dwuskładnikowa żywica epoksydowaRS Components132-605Alternatywa: Krok 2.13
UltramikrotomLeicaUC7
Wibracyjny mikrotomLeica100 µ m grube plastry, 0,16 mm/s cięcie przy amplitudzie 1 mm .
Weldwood Original Contact cementDAP107Klej kontaktowy: Krok 3.1.4
TrakEM2

Bibliografia

  1. Knoll, M., Ruska, E. Das elektronenmikroskop. Zeitschrift für Physik. 78 (5), 318-339 (1932).
  2. von Ardenne, M. Daselektronen-rastermikroskop. Zeitschrift für Physik. 109 (9), 553-572 (1938).
  3. Bang, B. H., Bang, F. B. Graphic reconstruction of the third dimension from serial electron microphotographs. Journal of Ultrastructure Research. 1 (2), 138-139 (1957).
  4. Birch-Andersen, A. Reconstruction of the nuclear sites of Salmonella typhimurium from electron micrographs of serial sections. Journal of General Microbiology. 13 (2), 327-329 (1955).
  5. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).
  6. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  7. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  8. Kornfeld, J., Denk, W. Progress and remaining challenges in high-throughput volume electron microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 50, 261-267 (2018).
  9. Heymann, J. A., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2006).
  10. Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. Journal of Neuroscience. 28 (12), 2959-2964 (2008).
  11. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).
  12. Martone, M. E., Deerinck, T. J., Yamada, N., Bushong, E., Ellisman, M. H. Correlated 3D light and electron microscopy: use of high voltage electron microscopy and electron tomography for imaging large biological structures. Journal of Histotechnology. 23 (3), 261-270 (2000).
  13. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
  14. Sjostrand, F. S. Ultrastructure of retinal rod synapses of the guinea pig eye as revealed by three-dimensional reconstructions from serial sections. Journal of Ultrastructure Research. 2 (1), 122-170 (1958).
  15. Ware, R. W. Three-dimensional reconstruction from serial sections. International Review of Cytology. 40, 325(1975).
  16. Stevens, J. K., Davis, T. L., Friedman, N., Sterling, P. A systematic approach to reconstructing microcircuitry by electron microscopy of serial sections. Cognitive Brain Research. 2 (3), 265-293 (1980).
  17. Hoppe, W. Three-dimensional electron microscopy. Annual Review of Biophysics. 10, 563-592 (1981).
  18. Frank, J. Electron tomography: methods for three-dimensional visualization of structures in the cell. , Springer. New York, NY. (2008).
  19. Baumeister, W. Electron tomography: towards visualizing the molecular organization of the cytoplasm. Current Opinion in Structural Biology. 12 (5), 679-684 (2002).
  20. Hoog, J. L., Schwartz, C., Noon, A. T., O'Toole, E. T. Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography. Developmental Cell. 12 (3), 349-361 (2007).
  21. Harris, K. M., Perry, E., Bourne, J., Feinberg, M., Ostroff, L., Hurlburt, J. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12101-12103 (2006).
  22. Jesior, J. C. Use of low-angle diamond knives leads to improved ultrastructural preservation of ultrathin sections. Scanning Microscopy Supplement. 3, 147-152 (1989).
  23. Studer, D., Gnaegi, H. Minimal compression of ultrathin sections with use of an oscillating diamond knife. Journal of Microscopy. 197, 94-100 (2000).
  24. Gay, H., Anderson, T. F. Serial sections for electron microscopy. Science. 120 (3130), 1071-1073 (1954).
  25. Bernhard, W., Rouiller, C. Close topographical relationship between mitochondria and ergastoplasm of liver cells in a definite phase of cellular activity. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 2, 73-78 (1956).
  26. Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 1 (4), 188-211 (1953).
  27. Wu, H., Carvalho, P., Voeltz, G. K. Here, there, and everywhere: The importance of ER membrane contact sites. Science. 361 (6401), (2018).
  28. Vance, J. E. Inter-organelle membrane contact sites: implications for lipid metabolism. Biology Direct. 15 (1), 24(2020).
  29. Stefan, C. J. Endoplasmic reticulum-plasma membrane contacts: Principals of phosphoinositide and calcium signaling. Current Opinion in Cell Biology. 63, 125-134 (2020).
  30. Zaman, M. F., Nenadic, A., Radojicic, A., Rosado, A., Beh, C. T. Sticking with it: ER-PM membrane contact sites as a coordinating nexus for regulating lipids and proteins at the cell cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 675(2020).
  31. van Vliet, A. R., Sassano, M. L., Agostinis, P. The unfolded protein response and membrane contact sites: tethering as a matter of life and death. Contact. 1, 1-15 (2018).
  32. Cohen, S., Valm, A. M., Lippincott-Schwartz, J. Interacting organelles. Current Opinion in Cell Biology. 53, 84-91 (2018).
  33. Hariri, H., et al. Lipid droplet biogenesis is spatially coordinated at ER-vacuole contacts under nutritional stress. EMBO Reports. 19 (1), 57-72 (2018).
  34. Stefan, C. J., Trimble, W. S., Grinstein, S., Drin, G. Membrane dynamics and organelle biogenesis-lipid pipelines and vesicular carriers. BMC Biology. 15 (1), 102(2017).
  35. Eisenberg-Bord, M., Shai, N., Schuldiner, M., Bohnert, M. A tether is a tether is a tether: tethering at membrane contact sites. Developmental Cell. 39 (4), 395-409 (2016).
  36. Scorrano, L., De Matteis, M. A., Emr, S., Giordano, F. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10 (1), 1287(2019).
  37. Lak, B., Li, S., Belevich, I., Sree, S. Specific subdomain localization of ER resident proteins and membrane contact sites resolved by electron microscopy. European Journal of Cell Biology. 100 (7), 151180(2021).
  38. Collado, J., Kalemanov, M., Campelo, F., Bourgoint, C. Tricalbin-mediated contact sites control ER curvature to maintain plasma membrane integrity. Developmental Cell. 51 (4), 476-487 (2019).
  39. West, M., Zurek, N., Hoenger, A., Voeltz, G. K. A 3D analysis of yeast ER structure reveals how ER domains are organized by membrane curvature. Journal of Cell Biology. 193 (2), 333-346 (2011).
  40. Ilacqua, N., Anastasia, I., Raimondi, A., Lemieux, P. A three-organelle complex made by wrappER contacts with peroxisomes and mitochondria responds to liver lipid flux changes. Journal of Cell Science. 135 (5), 259091(2022).
  41. Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011(2012).
  42. Stalling, D., Westerhoff, M., Hege, H. -C. Amira: A highly interactive system for visual data analysis. The Visualization Handbook. 38, 749-767 (2005).
  43. Hsieh, T. S., Chen, Y. J., Chang, C. L., Lee, W. R., Liou, J. Cortical actin contributes to spatial organization of ER-PM junctions. Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3171-3180 (2017).
  44. Anastasia, I., Ilacqua, N., Raimondi, A., Lemieux, P. Mitochondria-rough-ER contacts in the liver regulate systemic lipid homeostasis. Cell Reports. 34 (11), 108873(2021).
  45. Cattin, A. L., Burden, J. J., Van Emmenis, L., Mackenzie, F. E. Macrophage-Induced Blood Vessels Guide Schwann Cell-Mediated Regeneration of Peripheral Nerves. Cell. 162 (5), 1127-1139 (2015).
  46. Lopes-da-Silva, M., et al. A GBF1-dependent mechanism for environmentally responsive regulation of ER-Golgi transport. Developmental Cell. 49 (5), 786-801 (2019).
  47. Banushi, B., Forneris, F., Straatman-Iwanowska, A., Strange, A. Regulation of post-Golgi LH3 trafficking is essential for collagen homeostasis. Nature Communications. 7, 12111(2016).
  48. Rey, S. A., et al. Ultrastructural and functional fate of recycled vesicles in hippocampal synapses. Nature Communications. 6, 8043(2015).
  49. Belicova, L., Repnik, U., Delpierre, J., Gralinska, E. Anisotropic expansion of hepatocyte lumina enforced by apical bulkheads. Journal of Cell Biology. 220 (10), 202303003(2021).
  50. Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
  51. Xu, C. S., Hayworth, K. J., Lu, Z., Grob, P. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. Elife. 6, 1-36 (2017).
  52. Parlakgül, G., Arruda, A. P., Cagampan, E., Pang, S. High resolution 3D imaging of liver reveals a central role for subcellular architectural organization in metabolism. bioRxiv. , (2020).
  53. Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy. The Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59480(2019).
  54. Kremer, A., et al. A workflow for 3D-CLEM investigating liver tissue. Journal of Microscopy. 281 (3), 231-242 (2021).
  55. Hayat, M. Principles and techniques of electron microscopy: biological applications. , Cambridge University Press. (2000).
  56. Wisse, E., Braet, F., Duimel, H., Vreuls, C. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  57. Hanley, J., Dhar, D. K., Mazzacuva, F., Fiadeiro, R. Vps33b is crucial for structural and functional hepatocyte polarity. Journal of Hepatology. 66 (5), 1001-1011 (2017).
  58. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. Microscopy. 1, 6-8 (2010).
  59. Miranda, K., Girard-Dias, W., Attias, M., de Souza, W., Ramos, I. Three dimensional reconstruction by electron microscopy in the life sciences: An introduction for cell and tissue biologists. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 530-547 (2015).
  60. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. The Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56235(2018).
  61. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
  62. Hagler, H. K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 369, 67-96 (2007).
  63. Arganda-Carreras, I., et al. Consistent and elastic registration of histological sections using vector-spline regularization. Computer vision approaches to medical image analysis, CVAMIA 2006, Lecture Notes in Computer Science. Beichel, R. R., Sonka, M., et al. 4241, Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 85-95 (2006).
  64. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: a platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1002340(2016).
  65. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, 52-61 (2005).
  66. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD). Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  67. Iudin, A., Korir, P. K., Salavert-Torres, J., Kleywegt, G. J., Patwardhan, A. EMPIAR: a public archive for raw electron microscopy image data. Nature Methods. 13 (5), 387-388 (2016).
  68. Xu, C. S., Pang, S., Shtengel, G., Muller, A. An open-access volume electron microscopy atlas of whole cells and tissues. Nature. 599 (7883), 147-151 (2021).
  69. Karabag, C., et al. Semantic segmentation of HeLa cells: An objective comparison between one traditional algorithm and four deep-learning architectures. PLoS One. 15 (10), 0230605(2020).
  70. Heinrich, L., Bennett, D., Ackerman, D., Park, W. Whole-cell organelle segmentation in volume electron microscopy. Nature. 599 (7883), 141-146 (2021).
  71. Kim, J. S., Greene, M. J., Zlateski, A., Lee, K. Space-time wiring specificity supports direction selectivity in the retina. Nature. 509 (7500), 331-336 (2014).
  72. Spiers, H., Songhurst, H., Nightingale, L., de Folter, J. Deep learning for automatic segmentation of the nuclear envelope in electron microscopy data, trained with volunteer segmentations. Traffic. 22 (7), 240-253 (2021).
  73. Hasan, N. M., Gupta, A., Polishchuk, E., Yu, C. H. Molecular events initiating exit of a copper-transporting ATPase ATP7B from the trans-Golgi network. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 36041-36050 (2012).
  74. Stoeck, I. K., Lee, J. Y., Tabata, K., Romero-Brey, I. Hepatitis C virus replication depends on endosomal cholesterol homeostasis. The Journal of Virology. 92 (1), 01196(2018).
  75. Ma, X., Qian, H., Chen, A., Ni, H. M., Ding, W. X. Perspectives on mitochondria-ER and mitochondria-lipid droplet contact in hepatocytes and hepatic lipid metabolism. Cells. 10 (9), 2273(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wolumetryczna mikroskopia elektronowaultrastruktura hepatocytówrekonstrukcja 3Dretikulum endoplazmatycznemitochondriamorfologia organellitransmisyjna mikroskopia elektronowatomografia z odchyleniemmiejsca kontaktu błon
Trójwymiarowa charakterystyka miejsc kontaktu między organellami w hepatocytach przy użyciu mikroskopii elektronowej o przekroju szeregowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.