Artykuł metodologiczny

Rozszyfrowanie molekularnego mechanizmu składania histonów za pomocą techniki kurtyny DNA

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63501

⸱

9 marca 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Ulsan National Institute of Science and Technology, 2Center for Genomic Integrity, Institute for Basic Science (IBS)

W tym artykule

Podsumowanie

Kurtyna DNA, wysokoprzepustowa technika obrazowania pojedynczych cząsteczek, stanowi platformę do wizualizacji w czasie rzeczywistym różnych interakcji białko-DNA. Niniejszy protokół wykorzystuje technikę kurtyny DNA do zbadania biologicznej roli i mechanizmu molekularnego Abo1, ATPazy AAA + zawierającej bromodomenę Schizosaccharomyces pombe.

Streszczenie

Chromatyna to struktura wyższego rzędu, która zawiera eukariotyczne DNA. Chromatyna ulega dynamicznym zmianom w zależności od fazy cyklu komórkowego i w odpowiedzi na bodźce środowiskowe. Zmiany te są niezbędne dla integralności genomu, regulacji epigenetycznej i reakcji metabolicznych DNA, takich jak replikacja, transkrypcja i naprawa. Składanie chromatyny ma kluczowe znaczenie dla dynamiki chromatyny i jest katalizowane przez białka opiekuńcze histonów. Pomimo szeroko zakrojonych badań, mechanizmy, za pomocą których białka opiekuńcze histonów umożliwiają składanie chromatyny, pozostają nieuchwytne. Co więcej, globalne cechy nukleosomów zorganizowanych przez opiekuńcze histony są słabo poznane. Aby rozwiązać te problemy, w niniejszej pracy opisano unikalną technikę obrazowania pojedynczych cząsteczek o nazwie kurtyna DNA, która ułatwia badanie molekularnych szczegółów składania nukleosomów przez opiekuńcze histony. Kurtyna DNA to technika hybrydowa, która łączy płynność lipidów, mikrofluidykę i mikroskopię fluorescencyjną z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM), aby zapewnić uniwersalną platformę do obrazowania w czasie rzeczywistym różnych interakcji białko-DNA. Za pomocą kurtyny DNA bada się funkcję opiekuńczą histonów Abo1, ATPazy AAA+ zawierającej bromodomenę Schizosaccharomyces pombe, a także ujawnia się mechanizm molekularny leżący u podstaw składania histonów Abo1. Kurtyna DNA zapewnia unikalne podejście do badania dynamiki chromatyny.

Wprowadzenie

eukariotyczne DNA jest upakowane w strukturę wyższego rzędu znaną jako chromatyna1,2. Nukleosom jest podstawową jednostką chromatyny, która składa się z około 147 pz DNA owiniętego wokół histonów rdzenia oktamerycznego3,4. Chromatyna odgrywa kluczową rolę w komórkach eukariotycznych; na przykład zwarta struktura chroni DNA przed czynnikami endogennymi i zagrożeniami egzogennymi5. Struktura chromatyny zmienia się dynamicznie w zależności od fazy cyklu komórkowego i bodźców środowiskowych, a zmiany te kontrolują dostęp białek podczas transakcji DNA, takich jak replikacja, transkrypcja i naprawa6. Dynamika chromatyny jest również ważna dla stabilności genomu i informacji epigenetycznej.

Chromatyna jest dynamicznie regulowana przez różne czynniki, w tym modyfikacje ogona histonu i organizatory chromatyny, takie jak remodelery chromatyny, białka grupy polycomb i białka opiekuńcze histonów7. Białka opiekuńcze histonów koordynują montaż i demontaż nukleosomów poprzez osadzanie lub odłączanie histonów rdzeniowych8,9. Defekty w białkach opiekuńczych histonów wywołują niestabilność genomu i powodują zaburzenia rozwojowe oraz raka9,10. Różne białka opiekuńcze histonów nie wymagają chemicznego zużycia energii, takiego jak hydroliza ATP, do składania lub demontażu nukleosomów9,11,12,13. Niedawno naukowcy poinformowali, że ATPazy AAA+ zawierające bromodomenę (ATPaza związana z różnorodną aktywnością komórkową) odgrywają rolę w dynamice chromatyny jako białka opiekuńcze histonów14,15,16,17. Ludzki ATAD2 (białko 2 zawierające domenę AAA z rodziny ATPazy) wspomaga dostęp do chromatyny w celu zwiększenia ekspresji genów18. Jako koregulator transkrypcji, ATAD2 reguluje chromatynę onkogennych czynników transkrypcyjnych14, a nadekspresja ATAD2 jest związana ze złym rokowaniem w wielu typach raka19. Yta7, homolog Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) ATAD2, zmniejsza gęstość nukleosomów w chromatynie15. W przeciwieństwie do tego, Abo1, homolog Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) ATAD2, zwiększa gęstość nukleosomów16. Korzystając z unikalnej techniki obrazowania pojedynczych cząsteczek, kurtyna DNA, czy Abo1 przyczynia się do składania lub rozkładu nukleosomów, jest adresowana17,20.

Tradycyjnie, właściwości biochemiczne biomolekuł były badane za pomocą masowych eksperymentów, takich jak test przesunięcia mobilności elektroforetycznej (EMSA) lub koimmunoprecypitacji (co-IP), w których badana jest duża liczba cząsteczek i charakteryzowane są ich średnie właściwości21,22. W eksperymentach masowych podstany molekularne są zasłonięte efektem średniej zespołowej, a sondowanie interakcji biomolekularnych jest ograniczone. W przeciwieństwie do tego, techniki jednocząsteczkowe omijają ograniczenia eksperymentów masowych i umożliwiają szczegółową charakterystykę oddziaływań biomolekularnych. W szczególności techniki obrazowania pojedynczych cząsteczek są szeroko stosowane do badania interakcji DNA-białko i białko-białko23. Jedną z takich technik jest kurtyna DNA, unikalna technika obrazowania pojedynczych cząsteczek oparta na mikrofluidyce i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRFM)24,25. W kurtynie DNA setki pojedynczych cząsteczek DNA są zakotwiczone w dwuwarstwie lipidowej, która umożliwia dwuwymiarowy ruch cząsteczek DNA dzięki płynności lipidów. Po zastosowaniu przepływu hydrodynamicznego cząsteczki DNA poruszają się wzdłuż przepływu na dwuwarstwie i utknęły w barierze dyfuzyjnej, gdzie są wyrównywane i rozciągane. Podczas gdy DNA jest barwione środkami interkalującymi, wstrzykiwane są białka znakowane fluorescencyjnie, a TIRFM służy do wizualizacji interakcji białko-DNA w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczej cząsteczki23. Platforma kurtyny DNA ułatwia obserwację ruchów białek, takich jak dyfuzja, translokacja i zderzenie26,27,28. Co więcej, kurtyna DNA może być używana do mapowania białek w DNA o zdefiniowanych pozycjach, orientacjach i topologiach lub stosowana do badania separacji faz białek i kwasów nukleinowych29,30,31.

W tej pracy technika kurtyny DNA jest używana do dostarczenia dowodów na funkcję białek opiekuńczych poprzez bezpośrednią wizualizację określonych białek. Co więcej, ze względu na to, że kurtyna DNA jest platformą o wysokiej przepustowości, ułatwia gromadzenie danych w zakresie wystarczającym do uzyskania wiarygodności statystycznej. W tym miejscu opisano, jak szczegółowo przeprowadzić test kurtynowy DNA w celu zbadania molekularnej roli Abo1 S. pombe zawierającej bromodomenę AAA+

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie komory przepływowej

  1. Przygotuj oczyszczoną szkiełko z topionej krzemionki zawierające wzory nano-rowów zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem25.
    1. Wywierć dwa otwory o średnicy 1 mm w oczyszczonym szkiełku z topionej krzemionki (Rysunek 1A) za pomocą wiertła z powłoką diamentową (patrz tabela materiałów).
    2. Umieść 250 nm grubego aluminium (Al) na szkiełku za pomocą DC sputter32 (patrz Tabela Materiałów) z 10 mTorr argonu.
    3. Warstwę poli(metakrylanu metylu 950K) (PMMA) o grubości 310 nm o grubości 310 nm (PMMA) (patrz tabela materiałów) pod prędkością 4 000 obr./min przez 1 minutę i piec na płycie grzejnej w temperaturze 180 °C przez 3 minuty.
    4. Narysuj wzory nanorowów na warstwie PMMA między dwoma otworami za pomocą litografii wiązką elektronów (ebeam) 33 z prądem 0,724 nA przy 80 kV.
      UWAGA: Architektura i wymiary wzorów nano-rowów są pokazane w Rysunek 1A.
    5. Usunąć PMMA wystawiony na działanie wiązki elektromagnetycznej, mocząc szkiełka w roztworze rozwijającym (stosunek 1:3 ketonu metylowo-izobutylowego i izopropanolu, patrz tabela materiałów) przez 2 minuty.
    6. Wytrawianie warstw Al za pomocą indukcyjnie sprzężonego plazmowo-reaktywnego wytrawiania jonowego (ICP-RIE) przy użyciu chloru (Cl2) i trichlorku boru (BCl 3).
      UWAGA: Te dwa gazy mogą usunąć Al z obszarów narażonych na działanie wiązki elektromagnetycznej.
    7. Wydrąż nano-rowy na zjeżdżalniach, używając tetrafluorku siarki (SF4), tetrafluorometanu (CF4) i tlenu (O2) (patrz tabela materiałów).
    8. Usuń pozostałą warstwę Al, mocząc szkiełka w wytrawiaczu Al (wywoływacz AZ 300 MIF, patrz Tabela Materiałów) przez 10 minut.
    9. Po wytworzeniu przepłukać szkiełka wodą dejonizowaną i sonikować w acetonie przez 30 minut za pomocą sonikatora typu kąpielowego.
    10. Szkiełka należy czyścić w 2% roztworze Hellmanex III (patrz Tabela Materiałów) przez co najmniej 1 dzień z mieszaniem magnetycznym.
    11. Sonikować szkiełka w acetonie przez 30 minut i 1 M NaOH przez kolejne 30 minut.
    12. Przepłukać szkiełka wodą dejonizowaną i osuszyć gazowym azotem (N2).
  2. Połóż czysty papier (5 mm x 35 mm) na środku taśmy dwustronnej. Przymocuj taśmę do szkiełka, aby zakryć papierem dwa otwory i nanowzory.
  3. Wytnij papier za pomocą czystego ostrza (Rysunek 1A).
  4. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na wierzchu taśmy dwustronnej i przetrzyj szkiełko nakrywkowe za pomocą końcówki pipety, aby utworzyć komorę mikroprzepływową (Rysunek 1A).
  5. Umieść zmontowaną komórkę przepływową między dwoma szkiełkami mikroskopowymi i przypnij je.
  6. Piecz komórkę przepływową w piekarniku próżniowym o temperaturze 120 °C przez 45 minut.
  7. Podłącz złącze płynu (Nanoport) do analiz opartych na chipach (patrz Tabela materiałów) do każdego otwartego otworu za pomocą gorącego pistoletu do klejenia i połącz dwie linie rurki Luer lock.
  8. Podłączyć strzykawkę typu Luer lock zawierającą 3 ml wody dejonizowanej i umyć komorę.
  9. Przemyć komorę 3 ml buforu lipidowego (20 mM Tris-HCl, pH 8,0 i 100 mM NaCl) za pomocą złącza kropla.
    UWAGA: Połączenie typu drop-by-drop łączy wszystkie strzykawki z komorą przepływową, aby uniknąć wstrzykiwania pęcherzyków powietrza do komory.
  10. Wstrzyknąć 1 ml 0,04x biotynylowanego lipidu w buforze lipidowym do komory w dwóch strzałach z 5-minutową inkubacją na zastrzyk.
    UWAGA: Przygotowanie 1x biotynylowanego zapasu lipidowego jest opisane w wcześniej opublikowanym raporcie34.
  11. Przemyć komorę 3 ml buforu lipidowego i inkubować przez 20 minut, aby dwuwarstwa lipidowa dojrzała na powierzchni szkiełka.
  12. Dodać 1 ml buforu BSA (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl2 i 0,2 mg/ml BSA) i inkubować przez 5 minut w celu pasywacji powierzchni szkiełka.
    UWAGA: Ten krok może zmniejszyć niespecyficzne wiązanie białek z powierzchnią szkiełka.
  13. Wstrzyknąć 0,025 mg/ml streptawidyny do 1 ml buforu BSA za pomocą dwóch zastrzyków i 10 minut inkubacji na zastrzyk.
  14. Wypłukać pozostałą streptawidynę 3 ml buforu BSA.
  15. Wstrzyknąć ~ 300 pM (30 μL) biotynylowanego DNA faga lambda w 1 ml buforu BSA do komory z dwoma strzałami i 10 minutami inkubacji na zastrzyk.
    UWAGA: Przygotowanie biotynylowanego DNA lambda opisano we wcześniej opublikowanym raporcie34.

2. Podłączanie komory przepływowej do systemu mikroprzepływowego i ładowanie jej do mikroskopu

  1. Przygotuj bufor obrazowania Abo1 (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 2 mM MgCl2, 1,6% glukozy i 0,1x gloksy, patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Gloxy to system oczyszczania tlenu, który zmniejsza fotowybielanie barwników fluorescencyjnych. Przygotowanie 100x bulionu gloksy z oksydazą glukozową i katalazą jest opisane w Reference35.
  2. Podłączyć strzykawkę zawierającą 10 ml buforu do obrazowania do pompy strzykawkowej i usunąć pęcherzyki ze wszystkich przewodów w układzie mikroprzepływowym.
  3. Połącz przygotowaną komorę przepływową z systemem mikroprzepływowym za pomocą połączenia typu kropla-kropla, aby uniknąć wstrzykiwania pęcherzyków do komory przepływowej (Rysunek 1B).
  4. Zmontuj komorę przepływową i uchwyty komory przepływowej, a następnie zamontuj zespół na specjalnie zbudowanym mikroskopie TIRF (Rysunek 1C).
    UWAGA: Gdy komórka przepływowa zostanie umieszczona pod mikroskopem, ostrożnie ustaw wysokość soczewki obiektywu. Komora przepływowa nie może dotykać soczewki obiektywu. Może to spowodować uszkodzenie obiektywu.
  5. Upuść pasujący indeks oleju na środek komory przepływowej i umieść wykonany na zamówienie pryzmat gołębi (patrz Tabela materiałów) na kropli oleju.

3. Składanie histonów przez Abo1 za pomocą kurtyny DNA

  1. Zmieszać 5 nM Abo1 i 12,5 nM dimeru histonów H3-H4 znakowanego Cy5 (Cy5-H3-H4) (patrz tabela materiałów) w 150 μl buforu do obrazowania. Wszystkie białka zostały przygotowane zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem17.
  2. Inkubować mieszaninę na lodzie przez 15 min.
    UWAGA: Aby uniknąć fotowybielania Cy5, inkubację należy przeprowadzać w ciemności.
  3. Wstrzyknąć ~20 pM (2 μL) barwnika YOYO-1 do buforu obrazowania przez 100 μl pętli próbki w celu wybarwienia cząsteczek DNA lambda.
  4. Uruchom oprogramowanie do obrazowania (patrz Tabela materiałów) i włącz laser 488 nm, aby sprawdzić, czy kurtyny DNA są dobrze uformowane.
    UWAGA: Jeśli kurtyny DNA są dobrze uformowane, cząsteczki DNA, które są barwione YOYO-1, są pokazane jako wyrównane linie na barierze w obecności przepływu. Rozciągnięte linie odsuwają się i rozpraszają od bariery, gdy przepływ jest wyłączony.
  5. Wstrzyknij 2 ml buforu o wysokiej zawartości soli (200 mM NaCl i 40 mM MgCl2), aby wyeliminować barwnik YOYO-1 z DNA.
  6. Po usunięciu barwnika YOYO-1 wstrzyknąć wstępnie inkubowaną próbkę białka.
  7. Gdy białka dotrą do kurtyny DNA, wyłącz pompę strzykawkową, wyłącz zawór odcinający i inkubuj 15 minut w celu załadowania histonów przez Abo1.
  8. Wypłukać niezwiązane białka Abo1 i histonowe przez 5 minut.
  9. Włączyć zawór odcinający i wznowić wtrysk przepływowy.
  10. Włącz laser 637 nm i zobrazuj białka fluorescencyjne, gdy przepływ buforowy jest włączony.
  11. Tymczasowo wyłącz przepływ bufora, aby sprawdzić, czy białka histonowe są załadowane do DNA (Rysunek 2C).
  12. Zbierz obrazy kurtyn DNA za pomocą programu do akwizycji obrazu (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Kiedy przepływ buforu przejściowo ustaje, DNA wydostaje się z ulotnego pola całkowitego wewnętrznego odbicia, a znakowane fluorescencyjnie białka związane z DNA znikają.

4. Analiza danych

  1. Przekształć obrazy wykonane przez program do akwizycji obrazów do formatu TIFF jako sekwencje obrazów.
    UWAGA: Wszystkie dane zostały przeanalizowane przy użyciu Image J (NIH) zgodnie z opisem w Reference20.
  2. Wybierz pojedynczą cząsteczkę DNA z sekwencji obrazu i narysuj kymograf.
    UWAGA: Kymograf może pokazać zmianę intensywności fluorescencji każdego białka histonowego związanego z pojedynczą cząsteczką DNA w funkcji czasu.
  3. Utwórz profil intensywności fluorescencji z kimografu i dopasuj go do wielu funkcji Gaussa.
  4. Zbierz środkowe współrzędne pików z profilu intensywności fluorescencji. Na tym etapie można uzyskać minimalną intensywność fluorescencji histonów.
  5. Podzielić wszystkie szczytowe intensywności zebrane z profili przez minimalną intensywność. Na tym etapie szacuje się liczbę dimerów H3-H4 związanych z DNA.
  6. Wykonaj kroki 4.2-4.5 dla innych cząsteczek DNA.
  7. Utwórz histogram dla rozkładu powiązań dimerów H3-H4 o rozmiarze przedziału 1 kbp. Liczba analizowanych cząsteczek wynosi co najmniej 300.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejsza praca opisuje procedurę przygotowania komory przepływowej do analizy zasłony DNA (DNA curtain assay) (Rycina 1A). Analiza zasłony DNA ułatwiła badanie procesu składania dimerów histonowych H3-H4 na DNA przez białko Abo1. Najpierw sprawdzono formowanie zasłony DNA poprzez barwienie cząsteczek DNA barwnikiem interkalującym YOYO-1. Zielone linie pojawiły się w równoległych szeregach, co wskazuje, że YOYO-1 zinterkalował do cząsteczek DNA, które zostały odpowiednio wyrównane i rozciągn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jako technika obrazowania pojedynczych cząsteczek, kurtyna DNA jest szeroko stosowana do badania reakcji metabolicznych DNA43. Kurtyna DNA to system hybrydowy, który łączy płynność lipidów, mikrofluidykę i TIRFM. W przeciwieństwie do innych technik jednocząsteczkowych, kurtyna DNA umożliwia wysokoprzepustową wizualizację interakcji białko-DNA w czasie rzeczywistym. Dlatego technika kurtyny DNA jest odpowiednia do badania mechanizmu stojącego za interakcjami molekularnymi, w tym asocjacją specyficz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy doceniają życzliwe wsparcie dla Abo1 i Cy5-H3-H4 przez profesora Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D. i Juwon Jang, Ph.D., w KAIST, Korea Południowa. Praca ta jest wspierana przez grant Narodowej Fundacji Badawczej (NRF-2020R1A2B5B01001792), wewnętrzny fundusz badawczy (1.210115.01) Narodowego Instytutu Nauki i Technologii w Ulsan oraz Instytut Nauk Podstawowych (IBS-R022-D1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 ml strzykawka typu luer-lockBecktonDickinson301321
'x 3' szkło ślizgowe z topionej silkiG. Finkenbeiner1 cal x 3 cale prostokątne i grubości 10
mm strzykawka luer-lock 10 mlBecktonDickinson302149
18:1 (Δ 9-Cis) PC (DOPC)Avanti850375Jest to składnik biotynylowanego zapasu lipidowego
18:1 Biotinyl cap PEAvanti870273Jest to składnik biotynylowanego lipidu
18:1 PEG2000 PEAvanti880130Jest to składnik biotynylowanej
strzykawki typu luer-lock 3 mlBecktonDickinson302832
6-drogowy zawór do wstrzykiwania próbekIDEXMX series II
950K PMMAAll-resist671.04
AcetonSAMCHUNA1759
Hydrat soli disodowej adenozyno5'-trifosforanu (ATP)SigmaA2383
Aluminium (Al)TASCO, Korea PołudniowaLT50AI414Średnica 4 cale, grubość 1/4 cala
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra, MWCO 10 kDaMilliporeZ648027
AmpicillinMbcellMB-A4128Antybiotyki
AZ 300 MIF wywoływaczMerck10454110521Służy do usuwania aluminium
OstrzeDORCODN5212 mm x 6 m
Trichlorek boru (BCl3)UNIONGASCzystość: >99,99%
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA7030
KatalazaSigmaC40-1gJest to składnik 100x kolby gloxy
Chlor (Cl2)UNIONGASCzystość: >99.99%
Przezroczysta taśma dwustronna3M 313770
D-(+)-glukozaSigmaG7528
Napylacz DCSoronaSRM-120Służy do osadzania aluminium na szkiełku
Wiertło z powłoką diamentowąEurotoolDIB-211.00Służy do wykonywania otworów w szkiełku krzemionkowym z fusced
DL-Dithiothreitol (DTT)SigmaD0632
Dove-prismKorea Electro-Optics Co., Ltd.1906-106Wykonany na zamówienie pryzmat gołębia z topionej krzemionki z powłoką antyrefleksyjną
WiertłoDremelDremel 3000Służy do wykonywania otworów w szkiełku krzemionkowym
Elektronowa litografia fasoliNanobeam Ltd.NB3
Kwas etyleno-diamino-tetraoctowy (EDTA)SigmaEDS-1KG
Złączki palcoweIDEXF-300Jest połączony z "PFA Tubing Natural" w celu utworzenia rurki typu luer-lock
Nakrętka męska bez kołnierzaIDEXP-235Jest połączony z "PFA Tubing Natural" w celu utworzenia rurki luer-lock
Liofilizator, HyperCOOLLabogeneHC3110Używany do liofilizacji płynnych białek
Oksydaza glukozowaSigmaG2133-50KUJest to składnik 100x zapasu gloxy
Chlorowodorek guanidynyAcros Organics364790025
strzykawkaHamilton Company80065Ta strzykawka służy do wstrzykiwania próbki
Hellmanex IIISigmaZ805939
HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pgCytiva28-9893-36Używany do FPLC (bez rozmiaru)
Mieszadło z gorącą płytąCorningPC-420D
Kwas solnySigmaH1759Używany do Tris-HCl
Olej dopasowany do indeksuZEISS444970-9000-000
Indukcyjnie sprzężone plazmowo-reaktywne trawienie jonoweTop Technology Ltd.FabStar
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Glentham Life SciencesGC6586-100gSłuży do indukcji aktywności β-galaktozydazy
Lambda DNANEBN0311
LB bulionBD difco244610Pożywka do wzrostu komórek E.coli
Luer adapter 10-32IDEXP-659To łączy luer-lock strzykawka i rurka
Sześciowodny chlorek magnezuFisher BioresoleBP214
Keton metylowo-izobutylowy (MIBK)KAYAKU ZAAWANSOWANE MATERIAŁYUżywany do opracowywania roztworu
Mikroskop (Eclipse Ti2)NikonEclipse Ti2Odwrócony mikroskop fluorescencyjny
Szkiełko nakrywkowe mikroskopuMARIENFELD10114222 x 50 mm (nr 1)
Szkiełko mikroskopoweDURAN GROUPDU.2355013Szkiełko szkiełkowe szlifowane 45°, gładkie 26 x 76 mm
NanoportIDEXN-333-01
Soczewka obiektywuNikonCFI Plan Apochromat VC 60XC WIRodzaj zanurzenia: woda, powiększenie: 60x, korekcja: 18, odległość robocza: 0,29 (0,31-0,28)
One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemicznie kompetentny E. coliThermo Fisher ScientificC6060-03Właściwa komórka do nadekspresji białek
Tlen (O2)NOBLEGAS, KoreaPołudniowa Czystość: >99,99%
rurki PFA naturalneIDEX1512LJest połączony z "złączkami palcowymi" w celu utworzenia rurki typu luer-lock
Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)Roche11359061001Inhibitor
proteazySephacryl S-200 Wysoka rozdzielczośćCytiva17-0584-01Używany do FPLC (wykluczenie rozmiaru)
Zawór odcinającyIDEXP-732
Octan soduSigma791741
Chlorek sodu (NaCl)SigmaS3014
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigmas5881
Rurki z membraną molekularną Spectra/Por, MWCO 6-8 kDaSpectrum laboratories132660
StreptawidynaThermo Fisher ScientificS888
Tetrafluorek siarki (SF4)NOBLEGAS, KoreaPołudniowa Czystość: >99.99%
Pompa strzykawkowaKD Scientific78-8210
Tetrafluorometan (CF4)NOBLEGAS, KoreaCzystość: > 99,99%
TritonX-100SigmaT9284
Baza TrizmaSigmaT1503Używana do Tris-HCl
TSKgel SP-5PWTOSOH14715Używana do FPLC (wymiana jonowa)
Montaż złączkiIDEXP-760Łączy rurki
MocznikSigmaU5378
Piec próżniowyJeio TechOV-11
YOYO-1Thermo Fisher ScientificY3601Ten barwnik interkalacyjny jest rozcieńczany w DMSO&
beta;-merkaptoetanolu (BME)SigmaM6250
1 Południowa

Bibliografia

  1. Woodcock, C. L., Ghosh, R. P. Chromatin higher-order structure and dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (5), 000596(2010).
  2. Kim, K., Eom, J., Jung, I. Characterization of structural variations in the context of 3D chromatin structure. Molecules and Cells. 42 (7), 512-522 (2019).
  3. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  4. McGhee, J. D., Felsenfeld, G. Nucleosome structure. Annual Review of Biochemistry. 49, 1115-1156 (1980).
  5. Takata, H., et al. Chromatin compaction protects genomic DNA from radiation damage. PLOS One. 8 (10), 75622(2013).
  6. Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
  7. Peterson, C. L., Almouzni, G. Nucleosome dynamics as modular systems that integrate DNA damage and repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), 012658(2013).
  8. Torigoe, S. E., Urwin, D. L., Ishii, H., Smith, D. E., Kadonaga, J. T. Identification of a rapidly formed nonnucleosomal histone-DNA intermediate that is converted into chromatin by ACF. Molecules and Cells. 43 (4), 638-648 (2011).
  9. Gurard-Levin, Z. A., Quivy, J. P., Almouzni, G. Histone chaperones: assisting histone traffic and nucleosome dynamics. Annual Review of Biochemistry. 83, 487-517 (2014).
  10. Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
  11. Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
  12. Hammond, C. M., Stromme, C. B., Huang, H., Patel, D. J., Groth, A. Histone chaperone networks shaping chromatin function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (3), 141-158 (2017).
  13. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: an escort network regulating histone traffic. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
  14. Zou, J. X., Revenko, A. S., Li, L. B., Gemo, A. T., Chen, H. W. ANCCA, an estrogen-regulated AAA+ ATPase coactivator for ERalpha, is required for co-regulator occupancy and chromatin modification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18067-18072 (2007).
  15. Lombardi, L. M., Davis, M. D., Rine, J. Maintenance of nucleosomal balance in cis by conserved AAA-ATPase Yta7. Genetics. 199 (1), 105-116 (2015).
  16. Gal, C., et al. Abo1, a conserved bromodomain AAA-ATPase, maintains global nucleosome occupancy and organisation. EMBO Reports. 17 (1), 79-93 (2016).
  17. Cho, C., et al. Structural basis of nucleosome assembly by the Abo1 AAA+ ATPase histone chaperone. Nature Communications. 10 (1), 5764(2019).
  18. Morozumi, Y., et al. Atad2 is a generalist facilitator of chromatin dynamics in embryonic stem cells. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (4), 349-362 (2016).
  19. Zhang, M., Zhang, C., Du, W., Yang, X., Chen, Z. ATAD2 is overexpressed in gastric cancer and serves as an independent poor prognostic biomarker. Clinical and Translational Oncology. 18 (8), 776-781 (2016).
  20. Kang, Y., Cho, C., Lee, K. S., Song, J. J., Lee, J. Y. Single-molecule imaging reveals the mechanism underlying histone loading of schizosaccharomyces pombe AAA+ ATPase Abo1. Molecules and Cells. 44 (2), 79-87 (2021).
  21. Fried, M. G. Measurement of protein-DNA interaction parameters by electrophoresis mobility shift assay. Electrophoresis. 10 (5-6), 366-376 (1989).
  22. Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. Journal of Immunology. 115 (6), 1617-1624 (1975).
  23. Lu, H. P. Single-molecule study of protein-protein and protein-DNA interaction dynamics. Methods in Molecular Biology. 305, 385-414 (2005).
  24. Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24 (18), 10524-10531 (2008).
  25. Kang, Y., et al. High-throughput single-molecule imaging system using nanofabricated trenches and fluorescent DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1640-1648 (2020).
  26. Cheon, N. Y., Kim, H. S., Yeo, J. E., Scharer, O. D., Lee, J. Y. Single-molecule visualization reveals the damage search mechanism for the human NER protein XPC-RAD23B. Nucleic Acids Research. 47 (16), 8337-8347 (2019).
  27. Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecules and Cells. 54 (5), 832-843 (2014).
  28. Kang, H. J., et al. TonEBP recognizes R-loops and initiates m6A RNA methylation for R-loop resolution. Nucleic Acids Research. 49 (1), 269-284 (2021).
  29. Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
  30. Visnapuu, M. L., Greene, E. C. Single-molecule imaging of DNA curtains reveals intrinsic energy landscapes for nucleosome deposition. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (10), 1056-1062 (2009).
  31. Stigler, J., Camdere, G. O., Koshland, D. E., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals a collapsed conformational state for DNA-bound cohesin. Cell Reports. 15 (5), 988-998 (2016).
  32. Thornton, J. A. Sputter Coating- Its Principles and Potential. SAE Transactions. 82, 1787-1805 (1973).
  33. Grigorescu, A. E., Hagen, C. W. Resists for sub-20-nm electron beam lithography with a focus on HSQ: state of the art. Nanotechnology. 20 (29), 292001(2009).
  34. Meir, A., Kong, M., Xue, C., Greene, E. C. DNA curtains shed light on complex molecular systems during homologous recombination. Journal of Visualized Experiments. (160), e61320(2020).
  35. Cold Spring Harbor Protocols. Gloxy. Vol. 2. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
  36. Gracey, L. E., et al. An in vitro-identified high-affinity nucleosome-positioning signal is capable of transiently positioning a nucleosome in vivo. Epigenetics Chromatin. 3 (1), 13(2010).
  37. Subtil-Rodriguez, A., Reyes, J. C. BRG1 helps RNA polymerase II to overcome a nucleosomal barrier during elongation, in vivo. EMBO Reports. 11 (10), 751-757 (2010).
  38. Lancrey, A., et al. Nucleosome positioning on large tandem DNA repeats of the '601' sequence engineered in Saccharomyces cerevisiae. bioRxiv. , (2021).
  39. Perales, R., Zhang, L., Bentley, D. Histone occupancy in vivo at the 601 nucleosome binding element is determined by transcriptional history. Molecular and Cellular Biology. 31 (16), 3485-3496 (2011).
  40. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  41. Rossmann, K. Point spread-function, line spread-function, and modulation transfer function. Tools for the study of imaging systems. Radiology. 93 (2), 257-272 (1969).
  42. Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).
  43. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  44. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
  45. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  46. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  47. Teif, V. B., Rippe, K. Nucleosome mediated crosstalk between transcription factors at eukaryotic enhancers. Physical Biology. 8 (4), 044001(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dynamika chromatynyobrazowanie pojedynczych cz steczekchaperony histonowemonta nukleosom wkomora mikroprzep ywowamikroskopia ca kowitego wewn trznego odbiciahydroliza ATPoddzia ywanie bia ko DNA

Powiązane artykuły