Kurtyna DNA, wysokoprzepustowa technika obrazowania pojedynczych cząsteczek, stanowi platformę do wizualizacji w czasie rzeczywistym różnych interakcji białko-DNA. Niniejszy protokół wykorzystuje technikę kurtyny DNA do zbadania biologicznej roli i mechanizmu molekularnego Abo1, ATPazy AAA + zawierającej bromodomenę Schizosaccharomyces pombe.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Rozszyfrowanie molekularnego mechanizmu składania histonów za pomocą techniki kurtyny DNA
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Chromatyna to struktura wyższego rzędu, która zawiera eukariotyczne DNA. Chromatyna ulega dynamicznym zmianom w zależności od fazy cyklu komórkowego i w odpowiedzi na bodźce środowiskowe. Zmiany te są niezbędne dla integralności genomu, regulacji epigenetycznej i reakcji metabolicznych DNA, takich jak replikacja, transkrypcja i naprawa. Składanie chromatyny ma kluczowe znaczenie dla dynamiki chromatyny i jest katalizowane przez białka opiekuńcze histonów. Pomimo szeroko zakrojonych badań, mechanizmy, za pomocą których białka opiekuńcze histonów umożliwiają składanie chromatyny, pozostają nieuchwytne. Co więcej, globalne cechy nukleosomów zorganizowanych przez opiekuńcze histony są słabo poznane. Aby rozwiązać te problemy, w niniejszej pracy opisano unikalną technikę obrazowania pojedynczych cząsteczek o nazwie kurtyna DNA, która ułatwia badanie molekularnych szczegółów składania nukleosomów przez opiekuńcze histony. Kurtyna DNA to technika hybrydowa, która łączy płynność lipidów, mikrofluidykę i mikroskopię fluorescencyjną z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM), aby zapewnić uniwersalną platformę do obrazowania w czasie rzeczywistym różnych interakcji białko-DNA. Za pomocą kurtyny DNA bada się funkcję opiekuńczą histonów Abo1, ATPazy AAA+ zawierającej bromodomenę Schizosaccharomyces pombe, a także ujawnia się mechanizm molekularny leżący u podstaw składania histonów Abo1. Kurtyna DNA zapewnia unikalne podejście do badania dynamiki chromatyny.
Wprowadzenie
eukariotyczne DNA jest upakowane w strukturę wyższego rzędu znaną jako chromatyna1,2. Nukleosom jest podstawową jednostką chromatyny, która składa się z około 147 pz DNA owiniętego wokół histonów rdzenia oktamerycznego3,4. Chromatyna odgrywa kluczową rolę w komórkach eukariotycznych; na przykład zwarta struktura chroni DNA przed czynnikami endogennymi i zagrożeniami egzogennymi5. Struktura chromatyny zmienia się dynamicznie w zależności od fazy cyklu komórkowego i bodźców środowiskowych, a zmiany te kontrolują dostęp białek podc....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie komory przepływowej
- Przygotuj oczyszczoną szkiełko z topionej krzemionki zawierające wzory nano-rowów zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem25.
- Wywierć dwa otwory o średnicy 1 mm w oczyszczonym szkiełku z topionej krzemionki (Rysunek 1A) za pomocą wiertła z powłoką diamentową (patrz tabela materiałów).
- Umieść 250 nm grubego aluminium (Al) na szkiełku za pomocą DC sputter32 (patrz Tabela Materiałów) z 10 mTorr argonu.
- Warstwę poli(metakrylanu metylu 950K) (PMMA) o grubości 3....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejsza praca opisuje procedurę przygotowania komory przepływowej do analizy zasłony DNA (DNA curtain assay) (Rycina 1A). Analiza zasłony DNA ułatwiła badanie procesu składania dimerów histonowych H3-H4 na DNA przez białko Abo1. Najpierw sprawdzono formowanie zasłony DNA poprzez barwienie cząsteczek DNA barwnikiem interkalującym YOYO-1. Zielone linie pojawiły się w równoległych szeregach, co wskazuje, że YOYO-1 zinterkalował do cząsteczek DNA, które zostały odpowiednio wyrównane i rozciągn.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Jako technika obrazowania pojedynczych cząsteczek, kurtyna DNA jest szeroko stosowana do badania reakcji metabolicznych DNA43. Kurtyna DNA to system hybrydowy, który łączy płynność lipidów, mikrofluidykę i TIRFM. W przeciwieństwie do innych technik jednocząsteczkowych, kurtyna DNA umożliwia wysokoprzepustową wizualizację interakcji białko-DNA w czasie rzeczywistym. Dlatego technika kurtyny DNA jest odpowiednia do badania mechanizmu stojącego za interakcjami molekularnymi, w tym asocjacją specyficz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy doceniają życzliwe wsparcie dla Abo1 i Cy5-H3-H4 przez profesora Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D. i Juwon Jang, Ph.D., w KAIST, Korea Południowa. Praca ta jest wspierana przez grant Narodowej Fundacji Badawczej (NRF-2020R1A2B5B01001792), wewnętrzny fundusz badawczy (1.210115.01) Narodowego Instytutu Nauki i Technologii w Ulsan oraz Instytut Nauk Podstawowych (IBS-R022-D1).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 ml strzykawka typu luer-lock | BecktonDickinson | 301321 | |
| 'x 3' szkło ślizgowe z topionej silki | G. Finkenbeiner | 1 cal x 3 cale prostokątne i grubości 10 | |
| mm strzykawka luer-lock 10 ml | BecktonDickinson | 302149 | |
| 18:1 (Δ 9-Cis) PC (DOPC) | Avanti | 850375 | Jest to składnik biotynylowanego zapasu lipidowego |
| 18:1 Biotinyl cap PE | Avanti | 870273 | Jest to składnik biotynylowanego lipidu |
| 18:1 PEG2000 PE | Avanti | 880130 | Jest to składnik biotynylowanej |
| strzykawki typu luer-lock 3 ml | BecktonDickinson | 302832 | |
| 6-drogowy zawór do wstrzykiwania próbek | IDEX | MX series II | |
| 950K PMMA | All-resist | 671.04 | |
| Aceton | SAMCHUN | A1759 | |
| Hydrat soli disodowej adenozyno5'-trifosforanu (ATP) | Sigma | A2383 | |
| Aluminium (Al) | TASCO, Korea Południowa | LT50AI414 | Średnica 4 cale, grubość 1/4 cala |
| Filtr odśrodkowy Amicon Ultra, MWCO 10 kDa | Millipore | Z648027 | |
| Ampicillin | Mbcell | MB-A4128 | Antybiotyki |
| AZ 300 MIF wywoływacz | Merck | 10454110521 | Służy do usuwania aluminium |
| Ostrze | DORCO | DN52 | 12 mm x 6 m |
| Trichlorek boru (BCl3) | UNIONGAS | Czystość: >99,99% | |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Katalaza | Sigma | C40-1g | Jest to składnik 100x kolby gloxy |
| Chlor (Cl2) | UNIONGAS | Czystość: >99.99% | |
| Przezroczysta taśma dwustronna | 3M 313770 | ||
| D-(+)-glukoza | Sigma | G7528 | |
| Napylacz DC | Sorona | SRM-120 | Służy do osadzania aluminium na szkiełku |
| Wiertło z powłoką diamentową | Eurotool | DIB-211.00 | Służy do wykonywania otworów w szkiełku krzemionkowym z fusced |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| Dove-prism | Korea Electro-Optics Co., Ltd. | 1906-106 | Wykonany na zamówienie pryzmat gołębia z topionej krzemionki z powłoką antyrefleksyjną |
| Wiertło | Dremel | Dremel 3000 | Służy do wykonywania otworów w szkiełku krzemionkowym |
| Elektronowa litografia fasoli | Nanobeam Ltd. | NB3 | |
| Kwas etyleno-diamino-tetraoctowy (EDTA) | Sigma | EDS-1KG | |
| Złączki palcowe | IDEX | F-300 | Jest połączony z "PFA Tubing Natural" w celu utworzenia rurki typu luer-lock |
| Nakrętka męska bez kołnierza | IDEX | P-235 | Jest połączony z "PFA Tubing Natural" w celu utworzenia rurki luer-lock |
| Liofilizator, HyperCOOL | Labogene | HC3110 | Używany do liofilizacji płynnych białek |
| Oksydaza glukozowa | Sigma | G2133-50KU | Jest to składnik 100x zapasu gloxy |
| Chlorowodorek guanidyny | Acros Organics | 364790025 | |
| strzykawka | Hamilton Company | 80065 | Ta strzykawka służy do wstrzykiwania próbki |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | |
| HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg | Cytiva | 28-9893-36 | Używany do FPLC (bez rozmiaru) |
| Mieszadło z gorącą płytą | Corning | PC-420D | |
| Kwas solny | Sigma | H1759 | Używany do Tris-HCl |
| Olej dopasowany do indeksu | ZEISS | 444970-9000-000 | |
| Indukcyjnie sprzężone plazmowo-reaktywne trawienie jonowe | Top Technology Ltd. | FabStar | |
| Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) | Glentham Life Sciences | GC6586-100g | Służy do indukcji aktywności β-galaktozydazy |
| Lambda DNA | NEB | N0311 | |
| LB bulion | BD difco | 244610 | Pożywka do wzrostu komórek E.coli |
| Luer adapter 10-32 | IDEX | P-659 | To łączy luer-lock strzykawka i rurka |
| Sześciowodny chlorek magnezu | Fisher Bioresole | BP214 | |
| Keton metylowo-izobutylowy (MIBK) | KAYAKU ZAAWANSOWANE MATERIAŁY | Używany do opracowywania roztworu | |
| Mikroskop (Eclipse Ti2) | Nikon | Eclipse Ti2 | Odwrócony mikroskop fluorescencyjny |
| Szkiełko nakrywkowe mikroskopu | MARIENFELD | 101142 | 22 x 50 mm (nr 1) |
| Szkiełko mikroskopowe | DURAN GROUP | DU.2355013 | Szkiełko szkiełkowe szlifowane 45°, gładkie 26 x 76 mm |
| Nanoport | IDEX | N-333-01 | |
| Soczewka obiektywu | Nikon | CFI Plan Apochromat VC 60XC WI | Rodzaj zanurzenia: woda, powiększenie: 60x, korekcja: 18, odległość robocza: 0,29 (0,31-0,28) |
| One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemicznie kompetentny E. coli | Thermo Fisher Scientific | C6060-03 | Właściwa komórka do nadekspresji białek |
| Tlen (O2) | NOBLEGAS, Korea | Południowa Czystość: >99,99% | |
| rurki PFA naturalne | IDEX | 1512L | Jest połączony z "złączkami palcowymi" w celu utworzenia rurki typu luer-lock |
| Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) | Roche | 11359061001 | Inhibitor |
| proteazySephacryl S-200 Wysoka rozdzielczość | Cytiva | 17-0584-01 | Używany do FPLC (wykluczenie rozmiaru) |
| Zawór odcinający | IDEX | P-732 | |
| Octan sodu | Sigma | 791741 | |
| Chlorek sodu (NaCl) | Sigma | S3014 | |
| Wodorotlenek sodu (NaOH) | Sigma | s5881 | |
| Rurki z membraną molekularną Spectra/Por, MWCO 6-8 kDa | Spectrum laboratories | 132660 | |
| Streptawidyna | Thermo Fisher Scientific | S888 | |
| Tetrafluorek siarki (SF4) | NOBLEGAS, Korea | Południowa Czystość: >99.99% | |
| Pompa strzykawkowa | KD Scientific | 78-8210 | |
| Tetrafluorometan (CF4) | NOBLEGAS, Korea | Czystość: > 99,99% | |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Baza Trizma | Sigma | T1503 | Używana do Tris-HCl |
| TSKgel SP-5PW | TOSOH | 14715 | Używana do FPLC (wymiana jonowa) |
| Montaż złączki | IDEX | P-760 | Łączy rurki |
| Mocznik | Sigma | U5378 | |
| Piec próżniowy | Jeio Tech | OV-11 | |
| YOYO-1 | Thermo Fisher Scientific | Y3601 | Ten barwnik interkalacyjny jest rozcieńczany w DMSO& |
| beta;-merkaptoetanolu (BME) | Sigma | M6250 |
Bibliografia
- Woodcock, C. L., Ghosh, R. P. Chromatin higher-order structure and dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (5), 000596(2010).
- Kim, K., Eom, J., Jung, I. Characterization of structural variations in the context of 3D chromatin structure.<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
