Analizy białkomoczu, naciekania leukocytów przez nerki i odkładania się białek przez nerki u myszy MRL/lpr podatnych na toczeń

Podstawową funkcją nerki jest eliminacja substancji toksycznych z moczem, przy jednoczesnym utrzymaniu homeostazy wody i soli¹. Funkcja ta jest zagrożona u pacjentów z toczniem rumieniowatym układowym (SLE), prowadzącym do tzw. toczniowego zapalenia nerek (LN). LN jest konsekwencją ataku układu odpornościowego na nerki, co prowadzi do uporczywego zapalenia nerek, a tym samym utraty zdolności do oczyszczania krwi z odpadów i regulowania stężenia soli i płynów. To ostatecznie doprowadzi do niewydolności nerek, która może być śmiertelna. Podczas procesu nerkowego krążące limfocyty B, limfocyty T i monocyty są rekrutowane do nerki, wydzielając chemokiny, cytokiny i autoprzeciwciała tworzące kompleksy odpornościowe. To ostatecznie prowadzi do uszkodzenia komórek śródbłonka, urazów błoniastych, zaniku kanalików nerkowych i zwłóknienia².

MRL/Mp-Fas^lpr (MRL/lpr) myszy podatne na toczeń to klasyczny model mysi wykazujący objawy kliniczne podobne do tocznia, które przypominają ludzki SLE³. Model ten odegrał zasadniczą rolę w zrozumieniu jednej z głównych przyczyn śmiertelności u pacjentów z TRU, toczniowego zapalenia nerek (LN)⁴. Zarówno w ludzkim, jak i mysim TRU, LN charakteryzuje się stopniowym stanem zapalnym wywołanym przez nerkowe odkładanie się kompleksów immunologicznych, po którym następuje aktywacja dopełniacza, rekrutacja komórek zapalnych i utrata funkcji nerek⁵. Odkładanie kompleksu immunologicznego jest pierwszym krokiem do indukowania produkcji chemokin i cytokin przez wewnętrzne komórki nerkowe, co rozszerza odpowiedź zapalną poprzez rekrutację komórek odpornościowych⁶. Obecny protokół przedstawia kilka technik śledzenia postępu choroby nerek, które analizują naciek komórek i odkładanie się kompleksu immunologicznego.

Mocz zbierany co tydzień pozwala na wykrycie i wizualizację przebiegu białkomoczu w czasie przed, w trakcie i po wystąpieniu tocznia. Białkomocz jako biomarker może determinować biologiczną progresję LN. Inne zalety tej techniki to to, że jest nieinwazyjna, opłacalna i łatwa do wdrożenia⁷. Kiedy nerki pracują idealnie, poziom białkomoczu jest stale niski; jednak u myszy MRL/lpr, po 8-9 tygodniu życia, obserwuje się stopniowy wzrost poziomu białkomoczu, który ostatecznie jest wystarczająco wysoki, aby spowodować niewydolność nerek⁸. W handlu dostępnych jest wiele pasków odczynników i odczynników kolorymetrycznych do monitorowania problemu. Jednak test Bradforda jest tani i bardzo dokładny w określaniu początku białkomoczu i przebiegu toczniowego zapalenia nerek. Ten test jest szybki, a na odczynnik nie ma wpływu obecność rozpuszczalników,, środków redukujących i czynników chelatujących metale, które mogą znajdować się w próbce9^,10,11.

Jednym z ważnych aspektów do rozważenia jest infiltracja komórek w nerce. Nacieki te sprzyjają patogenezie, wyzwalając wydzielanie rozpuszczalnych czynników, takich jak cytokiny, w celu pogorszenia stanu zapalnego¹². Aby lepiej zrozumieć, jakie populacje komórek są obecne w naciekach, przydatną metodą jest wyizolowanie leukocytów¹³. Tutaj jako przykład podaje się wykrycie naciekania limfocytów B przez nerki. Procedura rozpoczyna się od procesu trawienia z dezoksyrybonukleazą (DNazą) i kolagenazą, po którym następuje separacja gradientu gęstości, która usuwa zanieczyszczenia, czerwone krwinki i gęste granulocyty. Powodem izolacji limfocytów B (CD19⁺) i komórek plazmatycznych (CD138+) jest to, że nerki tocznia mogą koncentrować te komórki¹⁴. Sugeruje się, że obecność limfocytów B w małych agregatach w nerkach może wskazywać na ekspansję klonalną, a w konsekwencji na produkcję immunoglobulin (Ig). Wiadomo, że komórki plazmatyczne są również obecne w tych agregatach¹⁵. Po wyizolowaniu leukocytów można zastosować sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) do analizy komórek będących przedmiotem zainteresowania po barwieniu różnymi przeciwciałami sprzężonymi z fluorescencją.

Immunofluorescencja to jedna z metod wykrywania immunohistochemicznego (IHC), która pozwala na fluorescencyjną wizualizację białek w próbkach tkanki nerkowej o grubości 4 μm. Inne metody wykrywania IHC zależą od charakteru analitów, składu chemicznego wiązania i innych czynników¹⁶. Immunofluorescencja to metoda szybkiej identyfikacji, która poddaje antygen działaniu jego odpowiednika przeciwciała znakowanego określonym fluorochromem (lub barwnikiem fluorescencyjnym). Po wzbudzeniu wytwarza światło, które może wykryć mikroskop fluorescencyjny. Technika ta może być wykorzystana do obserwacji osadzania się dopełniacza C3 i IgG2a¹⁷. Nadmierna aktywacja kaskady dopełniacza może być związana z niekontrolowaną odpowiedzią immunologiczną i utratą funkcji¹⁸. Immunologiczne odkładanie autoprzeciwciał przeciwko dwuniciowemu DNA (anty-dsDNA) w nerkach jest poważnym problemem¹⁹, gdzie osoby z izotypem IgG2a zostały powiązane z LN²⁰. W szczególności przeciwciała anty-dsDNA wykazują większą patogenność i powinowactwo do materiałów jądrowych, tworząc kompleksy immunologiczne²¹. Gdy IgG2a jest obecny, kaskada dopełniacza, w tym C3, jest aktywowana w celu usunięcia kompleksów immunologicznych²². Markery C3 i IgG2a można oznaczać ilościowo pojedynczo lub nakładać na siebie w celu ustalenia ich korelacji.

Warto zauważyć, że pomiar kreatyniny w surowicy jest kolejną niezawodną techniką, która może być używana razem z mikroskopijnym krwiomoczem i biopsjami nerek do diagnozowania LN²³. Jednak obecność białkomoczu jest silnym wskaźnikiem uszkodzenia kłębuszków nerkowych. W tym sensie, monitorowanie poziomu białkomoczu podczas tocznia może wykryć początek choroby i uzupełnić inne metody diagnozowania tocznia. Ponadto kompleksy immunologiczne zdeponowane w kłębuszkach nerkowych mogą indukować reakcję zapalną, aktywować układ dopełniacza i rekrutować więcej komórek zapalnych. Kolejnym godnym uwagi punktem tego protokołu jest infiltracja limfocytów B w nerce. To, wraz z naciekanymi limfocytami T, wzmacnia miejscowe odpowiedzi immunologiczne, które wywołują uszkodzenie narządów. Co ważne, klasyfikacja LN opiera się nie tylko na zmianach morfologicznych kłębuszków nerkowych obserwowanych w mikroskopii, ale także na złogach immunologicznych obserwowanych za pomocą immunofluorescencji. Dlatego w tym protokole oferowane są dokładne i opłacalne metody analizy czynności nerek w warunkach laboratoryjnych.

Obecny protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Virginia Tech. Ponieważ toczeń występuje częściej u samic, użyto tylko samic myszy MRL / lpr. Pobieranie próbek rozpoczęto w wieku 4 tygodni, a zakończono w 15 tygodniu. Myszy pozyskano ze źródeł komercyjnych (patrz tabela materiałów) i były hodowane i utrzymywane w określonym środowisku wolnym od patogenów, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.

1. Test na białkomocz

1. Zbierz mocz, wykonując poniższe czynności.
   1. Wysterylizuj kaptur, rozpylając 70% etanolu. Umieść sterylny plastikowy arkusz na powierzchni. Przygotuj końcówki, probówki o pojemności 1,5 ml i pipetę, aby zebrać około 20 μl płynu.
      UWAGA: Końcówki i rurki muszą być sterylne i bez żadnej obróbki wstępnej.
   2. Weź klatkę i spryskaj 70% etanolem przed włożeniem jej do maski.
   3. Przytrzymaj mysz jedną ręką, a drugą ręką delikatnie masuj obszar brzuszny od góry do dołu.
   4. Użyj probówki lub pipety o pojemności 1,5 ml, aby bezpośrednio zebrać mocz lub, jeśli próbka spadnie, zbierz ją z plastikowego arkusza. Do każdej próbki używaj świeżych rękawiczek, arkuszy i końcówek.
      UWAGA: Jeśli to nie zadziała, użyj sterylnej zlewki, aby odizolować mysz, a następnie zbierz mocz ze zlewki po oddaniu moczu przez mysz.
   5. Włóż mysz z powrotem do klatki. Wyjmij kolejną mysz i powtórz kroki 1.1.3-1.1.4.
      UWAGA: Zawsze czyść plastikowy arkusz i zlewkę 70% etanolem po pobraniu próbki dla każdej myszy. Do uzyskania istotności statystycznej potrzeba co najmniej pięciu myszy na grupę. Próbki moczu można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia przez okres do 12 miesięcy.
2. Określ ilościowo białka metodą Bradforda²⁴.
   1. Pozwól, aby próbki moczu, wzorzec albuminy i odczynnik Bradford osiągnęły temperaturę pokojową (RT), trzymając je poza zamrażarką przez 10-20 minut.
      UWAGA: Odczynnik Bradford i wzorzec albuminy znajdują się w dostępnym na rynku zestawie (patrz Tabela materiałów). Początkowe stężenie wzorca albuminy wynosi 2 mg/ml. Seryjne rozcieńczenia (1:2 sześć razy) należy wykonać wodą.
   2. Dodać odczynnik Bradforda do 96-dołkowej płytki (200 μl/basenik), nierozcieńczonej.
   3. Odpipetować 5 μl nierozcieńczonej próbki moczu na studzienkę i kilkakrotnie użyć końcówki do pipetowania w górę i w dół, aby prawidłowo wymieszać.
   4. Dodać wzorce (400, 200, 100, 50, 25, 12,5 mg/dl) w dwóch egzemplarzach. Pozostaw kilka studzienek jako puste miejsca.
      UWAGA: Dodawanie próbek i wzorców musi odbywać się szybko.
   5. Odstaw na 5-10 minut przy RT.
   6. Odczytać płytkę przy długości fali 595 nm w czytniku płytek zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów).

2. Izolacja komórek nerkowych

1. Poddaj mysz eutanazji za pomocą CO₂ (szybkość przepływu: 30% -70% objętości / min, aby uzyskać utratę przytomności lub śmierć) w komorze, a następnie zwichnąć szyjkę macicy. Kontynuuj sekcję, aby zebrać obie nerki. Umieść półtorej nerki w lodowatym podłożu C10. Umieść drugą połowę nerki w OCT (krok 3.1.1).
   UWAGA: C10 jest wytwarzany z RPMI 1640 uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą, 1 mM pirogronianu sodu, 1% 100x nieistotnych aminokwasów MEM, 10 mM HEPES, 55 μM 2-merkaptoetanolu i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny (patrz Tabela materiałów).
2. Pokroić nerki na wielkość ziarna (1-2 mm³ kawałki) i wytrawić w 5 ml buforu wytrawiającego zawierającego 1 mg/ml kolagenazy i 0,2 mg/ml DNazy I (patrz tabela materiałów) w pożywce RPMI 1640 zawierającej 10 mmol/l HEPES przez 1 godzinę z ciągłym delikatnym wstrząsaniem w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Dodaj 1 ml buforu wytrawiającego do sterylnej probówki o pojemności 2 ml i użyj sterylnych nożyczek, aby posiekać nerkę.
3. Dodaj 10 ml 1x lodowatego PBS zawierającego 10 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubuj przez 10 minut na lodzie. Następnie dwukrotnie wymieszaj zawiesinę.
4. Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko 100 μM i przemyć 10 ml HBSS-full.
   UWAGA: HBSS-full zawiera 5 mM EDTA, 0,1% BSA i 10 mM HEPES.
5. Wirować przy 350 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
6. Przygotować 30%, 37% i 70% roztwór izotonicznego perkolu (SIP).
   UWAGA: Wymieszaj 1 część objętości 10x PBS i 9 części objętości Percollu, aby przygotować SIP (patrz Tabela Materiałów); użyj HBSS-full do rozcieńczenia SIP do 30%, 37% i 70% SIP.
7. Zawieś komórki w 5 ml 30% SIP i załaduj 37% 5 ml (na górze) i 70% na 5 ml (na dole), tworząc gradient SIP, powoli za pomocą pipety do pasty.
8. Wirować z Up9 w dół0 (lub hamulcem 0) przy 1000 x g przez 30 min przy RT.
9. Zbierz leukocyty z granicy faz 37%-70% i zawieś je ponownie w 5 ml C10.
10. Wirować przy 350 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
11. Zawiesić osad komórkowy w 3 ml buforu FACS. Komórki są gotowe do barwienia metodą FACS.
    UWAGA: Bufor FACS zawiera 1x PBS i 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA).
12. Wirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant (SN), pozostawiając około 50 μl.
    UWAGA: Aby usunąć supernatant, ostrożnie wylać lub odpipetować roztwór od ciała stałego lub użyć półautomatycznego odkurzacza do zasysania supernatantu.
13. Dodać 50 μl bloku FcR (patrz Tabela Materiałów) na probówkę (wstępnie rozcieńczoną 1/50 w 1x PBS); wymieszać i inkubować na lodzie w ciemności przez 10 minut.
14. Dodaj 2 ml buforu FACS do przemycia.
15. Wirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić SN, pozostawiając około 50 μl.
16. Dodać 20 μl odpowiedniego barwnika fluorescencyjnego (rozcieńczyć 1/100 1x PBS, patrz Tabela Materiałów) i odstawić na 15-30 minut na lód.
17. Dodać 50 μL mieszanki przeciwciał¹⁵ na probówkę: CD138-BV711 (1/200 w 1x PBS) i CD45-AF700 (1/200 w 1x PBS) (patrz tabela materiałów).
18. Inkubować na lodzie w ciemności przez 15-30 minut i dodać 3 ml buforu FACS.
19. Wirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odkurzyć SN, pozostawiając około 50 μL. Zawiesić w 200 μL 1x PBS. Jest to teraz gotowe do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

3. Barwienie immunofluorescencyjne

1. Wykonaj pobieranie próbek.
   1. Zanurzyć połówkę nerki w małym plastikowym kriofordzie ze związkiem o optymalnej temperaturze skrawania (OCT) (patrz Tabela materiałów).
   2. Dodaj suchy lód do pudełka z pianką polistyrenową (patrz Tabela materiałów) i ostrożnie umieść krioformę na suchym lodzie. Upewnij się, że krioformy są umieszczone płasko.
      UWAGA: Potrzeba 3-4 minut, aby związek OCT zestalił się i zmienił kolor na biały.
   3. Wyjmij kriomold i zawiń go w folię aluminiową. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
      UWAGA: Można go przechowywać w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 rok.
2. Wykonać cięcie i utrwalenie próbki.
   1. Pociąć próbki na odcinki o wielkości 4 μm, odczekać co najmniej 2-3 godziny do wyschnięcia, a następnie utrwalić zimnym acetonem (w temperaturze 4 °C) przez 10 minut
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas używania acetonu, który wymaga specjalistycznego kaptura chemicznego.
   2. Po zamocowaniu szkiełek należy wysuszyć na powietrzu przez 0,5-1 h i przechowywać je przez krótki czas w temperaturze -20 °C lub przez długi czas w temperaturze -80 °C.
3. Zabarwić próbki.
   1. Ponownie zamocuj szkiełka w zimnym acetonie na 5-10 minut.
   2. Pozwól sekcjom rozgrzać się do RT. Użyj pisaka PAP (patrz Tabela materiałów) wokół sekcji i pozostaw do wyschnięcia.
      UWAGA: Można również użyć emalii do paznokci. Ten krok zapobiega unoszeniu się rozcieńczenia przeciwciał na całym szkiełku.
   3. Umieść szkiełka w 1x soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS) w słoiku Coplin (patrz Tabela Materiałów) na 20 minut, umieść słoik na shakerze i delikatnie wstrząśnij.
   4. Odlej 1x TBS i napełnij słoik 1x TBS, 5% BSA i 0,1% Tween 20. Inkubować przez 20 minut na shakerze, delikatnie wstrząsnąć.
   5. Wyjmij szkiełka i wytrzyj spód szkiełek do sucha. W razie potrzeby wstrząśnij szkiełkami do sucha. Dodać 100 μl sprzężonych przeciwciał²⁵ C3-FITC (1/100) i IgG2a-PE (1/100) do sekcji (patrz tabela materiałów). Inkubować w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze przez 1 godzinę.
   6. Umyj sekcję 3 razy w 1x TBS, 5% BSA i 0,1% Tween 20 przez 10 minut na wytrząsarce.
   7. Wstrząśnij do sucha szkiełka i zamontuj sekcję za pomocą odczynnika zapobiegającego blaknięciu (patrz tabela materiałów), a następnie szkiełka nakrywkowego.
   8. Przechowywać szkiełka w temperaturze 4 °C do momentu wyświetlenia pod mikroskopem (np. mikroskopem konfokalnym lub mikroskopem systemu obrazowania). Określ ilościowo obrazy za pomocą oprogramowania i odejmij sygnały tła, porównując intensywność fluorescencji między regionami.
   9. W przypadku analizy obrazu za pomocą oprogramowania ImageJ (patrz tabela materiałów), obrysuj żądany obszar.
   10. Ustaw standardowe parametry, klikając Analizuj, a następnie Ustaw pomiary i Zmierz obszar, aby uzyskać wyniki.
   11. Przenieś dane uzyskane z okien miar do arkusza kalkulacyjnego.
       UWAGA: Jako tło można wybrać mały obszar z obrazu; Nie powinien mieć żadnej fluorescencji.
   12. Po zakończeniu kliknij Analizuj, aby zmierzyć region i ponownie przenieść dane do poprzedniego arkusza kalkulacyjnego.
   13. Powtórz kroki 3.3.11-3.3.12 dla kilku regionów.
   14. Oblicz średnią fluorescencję jako skorygowaną fluorescencję komórek (CCF) = Gęstość zintegrowana - (Wybrany obszar komórki x Średnia fluorescencja tła).
   15. Obliczaj dla każdego regionu i analizuj dane za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów i statystyk (patrz tabela materiałów).

Protokół wykorzystuje wiele metod do oceny myszy MRL/lpr pod kątem toczniowego zapalenia nerek. Po pierwsze, opisano procedurę mającą na celu zbadanie zwiększonego poziomu białkomoczu z powodu dysfunkcji nerek w czasie. Jak pokazano w Rycina 1, samice myszy były leczone doustnym zgłębnikiem 200 μL soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS) jako grupa kontrolna i probiotyczny Lactobacillus reuteri jako grupa leczona, w stężeniu 109 jtk/ml, dwa razy w tygodniu. Leczenie rozpoczęło się w wieku 3 tygodni, a zakończyło w wieku 15 tygodni. Grupa myszy leczona L. reuteri miała bardziej agresywną progresję białkomoczu niż grupa kontrolna.

Rysunek 1: Wykrywanie poziomu białka w moczu myszy MRL/lpr w czasie. n = 5 myszy w grupie. Statystyki zostały wykonane za pomocą prostego testu regresji liniowej. *P < 0,05, **P < 0,01. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2 pokazuje analizę FACS izolowanych leukocytów nerkowych. W tym eksperymencie myszy leczono wankomycyną (2 g / l) lub wankomycyną z E. coli dsDNA (80 μg). Wankomycynę podawano wraz z wodą do picia we wskazanym okresie czasu. Doustne pobranie bakteryjnego DNA podawano myszom leczonym wankomycyną raz w tygodniu przez cztery kolejne tygodnie w wieku 4, 5, 6 i 7 tygodni. Oczekiwano, że E. coli dsDNA wyzwala naciek nerkowy komórek plazmatycznych, prowadząc do upośledzenia funkcji nerek, ale nie stwierdzono istotnej różnicy.

Rysunek 2: Analiza komórek plazmatycznych w izolowanych leukocytach nerkowych. (A) Strategia bramkowania sekwencyjnego: całkowita liczba komórek, pojedyncze komórki, żywe komórki, komórki CD45+ i wreszcie komórki CD138+. (B) Odsetek komórek plazmatycznych po leczeniu van (wankomycyna) lub van + DNA (wankomycyna + E. coli dsDNA) przez 3 tygodnie (n ≥ 5 myszy na grupę). Nie zaobserwowano istotności statystycznej ("ns"). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3 pokazuje barwienie immunofluorescencyjne dopełniacza C3 i IgG2a na żeńskich odcinkach nerek MRL/lpr. W tym doświadczeniu porównano wpływ czynników środowiskowych na nerkowe odkładanie się C3 i IgG2a. Myszy domowe były hodowane w hodowli zwierząt przez kilka pokoleń i porównywano je z niedawno zakupionymi myszami od sprzedawcy. Analiza immunohistochemiczna nie wykazała żadnej różnicy między różnymi obiektami.

Rysunek 3: Wykrywanie dopełniacza C3 i IgG2a w odcinkach nerek za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. (A) Reprezentatywne zdjęcia skrawków nerki wybarwionych anty-C3-FITC (zielony) i anty-IgG2a-PE (czerwony). (B) Porównanie skorygowanej fluorescencji komórek (CCF) między dwiema grupami (n ≥ 5 myszy na grupę). Podziałka liniowa = 100 μM. Nie zaobserwowano istotności statystycznej ("ns"). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.