Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analizy białkomoczu, naciekania leukocytów przez nerki i odkładania się białek przez nerki u myszy MRL/lpr podatnych na toczeń

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63506

⸱

8 czerwca 2022

 , 
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje metodę śledzenia postępu tocznia u myszy. Przedstawiono dwie dodatkowe procedury w celu scharakteryzowania toczniowego zapalenia nerek w oparciu o naciek komórek i odkładanie się białek w nerkach.

Streszczenie

Toczeń rumieniowaty układowy (SLE) jest chorobą autoimmunologiczną, na którą nie ma lekarstwa i charakteryzuje się uporczywym stanem zapalnym w wielu narządach, w tym w nerkach. W takich okolicznościach nerka traci zdolność do oczyszczania krwi z odpadów i regulowania stężenia soli i płynów, co ostatecznie prowadzi do niewydolności nerek. Kobiety, zwłaszcza w wieku rozrodczym, diagnozowane są dziewięciokrotnie częściej niż mężczyźni. Choroby nerek są główną przyczyną śmiertelności pacjentów z TRU. Obecny protokół opisuje szybką i prostą metodę pomiaru poziomu wydalanego białka w pobranym moczu, śledząc postęp tocznia w czasie. Ponadto przedstawiono podejście do izolacji komórek jednojądrzastych nerki w oparciu o dobór wielkości i gęstości w celu zbadania naciekania leukocytów przez nerki. Ponadto opracowano metodę immunohistochemiczną w celu scharakteryzowania odkładania się białek w kłębuszkach nerkowych i nacieku leukocytów w przestrzeni cewkowo-śródmiąższowej. Razem metody te mogą pomóc w badaniu postępu przewlekłego stanu zapalnego związanego z nerkami myszy MRL / lpr podatnych na toczeń.

Wprowadzenie

Podstawową funkcją nerki jest eliminacja substancji toksycznych z moczem, przy jednoczesnym utrzymaniu homeostazy wody i soli1. Funkcja ta jest zagrożona u pacjentów z toczniem rumieniowatym układowym (SLE), prowadzącym do tzw. toczniowego zapalenia nerek (LN). LN jest konsekwencją ataku układu odpornościowego na nerki, co prowadzi do uporczywego zapalenia nerek, a tym samym utraty zdolności do oczyszczania krwi z odpadów i regulowania stężenia soli i płynów. To ostatecznie doprowadzi do niewydolności nerek, która może być śmiertelna. Podczas procesu nerkowego krążące limfocyty B, limfocyty T i monocyty są rekrutowane do nerki, wydzielając chemokiny, cytokiny i autoprzeciwciała tworzące kompleksy odpornościowe. To ostatecznie prowadzi do uszkodzenia komórek śródbłonka, urazów błoniastych, zaniku kanalików nerkowych i zwłóknienia2.

MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr) myszy podatne na toczeń to klasyczny model mysi wykazujący objawy kliniczne podobne do tocznia, które przypominają ludzki SLE3. Model ten odegrał zasadniczą rolę w zrozumieniu jednej z głównych przyczyn śmiertelności u pacjentów z TRU, toczniowego zapalenia nerek (LN)4. Zarówno w ludzkim, jak i mysim TRU, LN charakteryzuje się stopniowym stanem zapalnym wywołanym przez nerkowe odkładanie się kompleksów immunologicznych, po którym następuje aktywacja dopełniacza, rekrutacja komórek zapalnych i utrata funkcji nerek5. Odkładanie kompleksu immunologicznego jest pierwszym krokiem do indukowania produkcji chemokin i cytokin przez wewnętrzne komórki nerkowe, co rozszerza odpowiedź zapalną poprzez rekrutację komórek odpornościowych6. Obecny protokół przedstawia kilka technik śledzenia postępu choroby nerek, które analizują naciek komórek i odkładanie się kompleksu immunologicznego.

Mocz zbierany co tydzień pozwala na wykrycie i wizualizację przebiegu białkomoczu w czasie przed, w trakcie i po wystąpieniu tocznia. Białkomocz jako biomarker może determinować biologiczną progresję LN. Inne zalety tej techniki to to, że jest nieinwazyjna, opłacalna i łatwa do wdrożenia7. Kiedy nerki pracują idealnie, poziom białkomoczu jest stale niski; jednak u myszy MRL/lpr, po 8-9 tygodniu życia, obserwuje się stopniowy wzrost poziomu białkomoczu, który ostatecznie jest wystarczająco wysoki, aby spowodować niewydolność nerek8. W handlu dostępnych jest wiele pasków odczynników i odczynników kolorymetrycznych do monitorowania problemu. Jednak test Bradforda jest tani i bardzo dokładny w określaniu początku białkomoczu i przebiegu toczniowego zapalenia nerek. Ten test jest szybki, a na odczynnik nie ma wpływu obecność rozpuszczalników,, środków redukujących i czynników chelatujących metale, które mogą znajdować się w próbce9,10,11.

Jednym z ważnych aspektów do rozważenia jest infiltracja komórek w nerce. Nacieki te sprzyjają patogenezie, wyzwalając wydzielanie rozpuszczalnych czynników, takich jak cytokiny, w celu pogorszenia stanu zapalnego12. Aby lepiej zrozumieć, jakie populacje komórek są obecne w naciekach, przydatną metodą jest wyizolowanie leukocytów13. Tutaj jako przykład podaje się wykrycie naciekania limfocytów B przez nerki. Procedura rozpoczyna się od procesu trawienia z dezoksyrybonukleazą (DNazą) i kolagenazą, po którym następuje separacja gradientu gęstości, która usuwa zanieczyszczenia, czerwone krwinki i gęste granulocyty. Powodem izolacji limfocytów B (CD19+) i komórek plazmatycznych (CD138+) jest to, że nerki tocznia mogą koncentrować te komórki14. Sugeruje się, że obecność limfocytów B w małych agregatach w nerkach może wskazywać na ekspansję klonalną, a w konsekwencji na produkcję immunoglobulin (Ig). Wiadomo, że komórki plazmatyczne są również obecne w tych agregatach15. Po wyizolowaniu leukocytów można zastosować sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) do analizy komórek będących przedmiotem zainteresowania po barwieniu różnymi przeciwciałami sprzężonymi z fluorescencją.

Immunofluorescencja to jedna z metod wykrywania immunohistochemicznego (IHC), która pozwala na fluorescencyjną wizualizację białek w próbkach tkanki nerkowej o grubości 4 μm. Inne metody wykrywania IHC zależą od charakteru analitów, składu chemicznego wiązania i innych czynników16. Immunofluorescencja to metoda szybkiej identyfikacji, która poddaje antygen działaniu jego odpowiednika przeciwciała znakowanego określonym fluorochromem (lub barwnikiem fluorescencyjnym). Po wzbudzeniu wytwarza światło, które może wykryć mikroskop fluorescencyjny. Technika ta może być wykorzystana do obserwacji osadzania się dopełniacza C3 i IgG2a17. Nadmierna aktywacja kaskady dopełniacza może być związana z niekontrolowaną odpowiedzią immunologiczną i utratą funkcji18. Immunologiczne odkładanie autoprzeciwciał przeciwko dwuniciowemu DNA (anty-dsDNA) w nerkach jest poważnym problemem19, gdzie osoby z izotypem IgG2a zostały powiązane z LN20. W szczególności przeciwciała anty-dsDNA wykazują większą patogenność i powinowactwo do materiałów jądrowych, tworząc kompleksy immunologiczne21. Gdy IgG2a jest obecny, kaskada dopełniacza, w tym C3, jest aktywowana w celu usunięcia kompleksów immunologicznych22. Markery C3 i IgG2a można oznaczać ilościowo pojedynczo lub nakładać na siebie w celu ustalenia ich korelacji.

Warto zauważyć, że pomiar kreatyniny w surowicy jest kolejną niezawodną techniką, która może być używana razem z mikroskopijnym krwiomoczem i biopsjami nerek do diagnozowania LN23. Jednak obecność białkomoczu jest silnym wskaźnikiem uszkodzenia kłębuszków nerkowych. W tym sensie, monitorowanie poziomu białkomoczu podczas tocznia może wykryć początek choroby i uzupełnić inne metody diagnozowania tocznia. Ponadto kompleksy immunologiczne zdeponowane w kłębuszkach nerkowych mogą indukować reakcję zapalną, aktywować układ dopełniacza i rekrutować więcej komórek zapalnych. Kolejnym godnym uwagi punktem tego protokołu jest infiltracja limfocytów B w nerce. To, wraz z naciekanymi limfocytami T, wzmacnia miejscowe odpowiedzi immunologiczne, które wywołują uszkodzenie narządów. Co ważne, klasyfikacja LN opiera się nie tylko na zmianach morfologicznych kłębuszków nerkowych obserwowanych w mikroskopii, ale także na złogach immunologicznych obserwowanych za pomocą immunofluorescencji. Dlatego w tym protokole oferowane są dokładne i opłacalne metody analizy czynności nerek w warunkach laboratoryjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Obecny protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Virginia Tech. Ponieważ toczeń występuje częściej u samic, użyto tylko samic myszy MRL / lpr. Pobieranie próbek rozpoczęto w wieku 4 tygodni, a zakończono w 15 tygodniu. Myszy pozyskano ze źródeł komercyjnych (patrz tabela materiałów) i były hodowane i utrzymywane w określonym środowisku wolnym od patogenów, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.

1. Test na białkomocz

  1. Zbierz mocz, wykonując poniższe czynności.
    1. Wysterylizuj kaptur, rozpylając 70% etanolu. Umieść sterylny plastikowy arkusz na powierzchni. Przygotuj końcówki, probówki o pojemności 1,5 ml i pipetę, aby zebrać około 20 μl płynu.
      UWAGA: Końcówki i rurki muszą być sterylne i bez żadnej obróbki wstępnej.
    2. Weź klatkę i spryskaj 70% etanolem przed włożeniem jej do maski.
    3. Przytrzymaj mysz jedną ręką, a drugą ręką delikatnie masuj obszar brzuszny od góry do dołu.
    4. Użyj probówki lub pipety o pojemności 1,5 ml, aby bezpośrednio zebrać mocz lub, jeśli próbka spadnie, zbierz ją z plastikowego arkusza. Do każdej próbki używaj świeżych rękawiczek, arkuszy i końcówek.
      UWAGA: Jeśli to nie zadziała, użyj sterylnej zlewki, aby odizolować mysz, a następnie zbierz mocz ze zlewki po oddaniu moczu przez mysz.
    5. Włóż mysz z powrotem do klatki. Wyjmij kolejną mysz i powtórz kroki 1.1.3-1.1.4.
      UWAGA: Zawsze czyść plastikowy arkusz i zlewkę 70% etanolem po pobraniu próbki dla każdej myszy. Do uzyskania istotności statystycznej potrzeba co najmniej pięciu myszy na grupę. Próbki moczu można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia przez okres do 12 miesięcy.
  2. Określ ilościowo białka metodą Bradforda24.
    1. Pozwól, aby próbki moczu, wzorzec albuminy i odczynnik Bradford osiągnęły temperaturę pokojową (RT), trzymając je poza zamrażarką przez 10-20 minut.
      UWAGA: Odczynnik Bradford i wzorzec albuminy znajdują się w dostępnym na rynku zestawie (patrz Tabela materiałów). Początkowe stężenie wzorca albuminy wynosi 2 mg/ml. Seryjne rozcieńczenia (1:2 sześć razy) należy wykonać wodą.
    2. Dodać odczynnik Bradforda do 96-dołkowej płytki (200 μl/basenik), nierozcieńczonej.
    3. Odpipetować 5 μl nierozcieńczonej próbki moczu na studzienkę i kilkakrotnie użyć końcówki do pipetowania w górę i w dół, aby prawidłowo wymieszać.
    4. Dodać wzorce (400, 200, 100, 50, 25, 12,5 mg/dl) w dwóch egzemplarzach. Pozostaw kilka studzienek jako puste miejsca.
      UWAGA: Dodawanie próbek i wzorców musi odbywać się szybko.
    5. Odstaw na 5-10 minut przy RT.
    6. Odczytać płytkę przy długości fali 595 nm w czytniku płytek zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów).

2. Izolacja komórek nerkowych

  1. Poddaj mysz eutanazji za pomocą CO2 (szybkość przepływu: 30% -70% objętości / min, aby uzyskać utratę przytomności lub śmierć) w komorze, a następnie zwichnąć szyjkę macicy. Kontynuuj sekcję, aby zebrać obie nerki. Umieść półtorej nerki w lodowatym podłożu C10. Umieść drugą połowę nerki w OCT (krok 3.1.1).
    UWAGA: C10 jest wytwarzany z RPMI 1640 uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą, 1 mM pirogronianu sodu, 1% 100x nieistotnych aminokwasów MEM, 10 mM HEPES, 55 μM 2-merkaptoetanolu i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny (patrz Tabela materiałów).
  2. Pokroić nerki na wielkość ziarna (1-2 mm3 kawałki) i wytrawić w 5 ml buforu wytrawiającego zawierającego 1 mg/ml kolagenazy i 0,2 mg/ml DNazy I (patrz tabela materiałów) w pożywce RPMI 1640 zawierającej 10 mmol/l HEPES przez 1 godzinę z ciągłym delikatnym wstrząsaniem w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Dodaj 1 ml buforu wytrawiającego do sterylnej probówki o pojemności 2 ml i użyj sterylnych nożyczek, aby posiekać nerkę.
  3. Dodaj 10 ml 1x lodowatego PBS zawierającego 10 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubuj przez 10 minut na lodzie. Następnie dwukrotnie wymieszaj zawiesinę.
  4. Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko 100 μM i przemyć 10 ml HBSS-full.
    UWAGA: HBSS-full zawiera 5 mM EDTA, 0,1% BSA i 10 mM HEPES.
  5. Wirować przy 350 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Przygotować 30%, 37% i 70% roztwór izotonicznego perkolu (SIP).
    UWAGA: Wymieszaj 1 część objętości 10x PBS i 9 części objętości Percollu, aby przygotować SIP (patrz Tabela Materiałów); użyj HBSS-full do rozcieńczenia SIP do 30%, 37% i 70% SIP.
  7. Zawieś komórki w 5 ml 30% SIP i załaduj 37% 5 ml (na górze) i 70% na 5 ml (na dole), tworząc gradient SIP, powoli za pomocą pipety do pasty.
  8. Wirować z Up9 w dół0 (lub hamulcem 0) przy 1000 x g przez 30 min przy RT.
  9. Zbierz leukocyty z granicy faz 37%-70% i zawieś je ponownie w 5 ml C10.
  10. Wirować przy 350 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  11. Zawiesić osad komórkowy w 3 ml buforu FACS. Komórki są gotowe do barwienia metodą FACS.
    UWAGA: Bufor FACS zawiera 1x PBS i 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA).
  12. Wirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant (SN), pozostawiając około 50 μl.
    UWAGA: Aby usunąć supernatant, ostrożnie wylać lub odpipetować roztwór od ciała stałego lub użyć półautomatycznego odkurzacza do zasysania supernatantu.
  13. Dodać 50 μl bloku FcR (patrz Tabela Materiałów) na probówkę (wstępnie rozcieńczoną 1/50 w 1x PBS); wymieszać i inkubować na lodzie w ciemności przez 10 minut.
  14. Dodaj 2 ml buforu FACS do przemycia.
  15. Wirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić SN, pozostawiając około 50 μl.
  16. Dodać 20 μl odpowiedniego barwnika fluorescencyjnego (rozcieńczyć 1/100 1x PBS, patrz Tabela Materiałów) i odstawić na 15-30 minut na lód.
  17. Dodać 50 μL mieszanki przeciwciał15 na probówkę: CD138-BV711 (1/200 w 1x PBS) i CD45-AF700 (1/200 w 1x PBS) (patrz tabela materiałów).
  18. Inkubować na lodzie w ciemności przez 15-30 minut i dodać 3 ml buforu FACS.
  19. Wirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odkurzyć SN, pozostawiając około 50 μL. Zawiesić w 200 μL 1x PBS. Jest to teraz gotowe do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

3. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Wykonaj pobieranie próbek.
    1. Zanurzyć połówkę nerki w małym plastikowym kriofordzie ze związkiem o optymalnej temperaturze skrawania (OCT) (patrz Tabela materiałów).
    2. Dodaj suchy lód do pudełka z pianką polistyrenową (patrz Tabela materiałów) i ostrożnie umieść krioformę na suchym lodzie. Upewnij się, że krioformy są umieszczone płasko.
      UWAGA: Potrzeba 3-4 minut, aby związek OCT zestalił się i zmienił kolor na biały.
    3. Wyjmij kriomold i zawiń go w folię aluminiową. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
      UWAGA: Można go przechowywać w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 rok.
  2. Wykonać cięcie i utrwalenie próbki.
    1. Pociąć próbki na odcinki o wielkości 4 μm, odczekać co najmniej 2-3 godziny do wyschnięcia, a następnie utrwalić zimnym acetonem (w temperaturze 4 °C) przez 10 minut
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas używania acetonu, który wymaga specjalistycznego kaptura chemicznego.
    2. Po zamocowaniu szkiełek należy wysuszyć na powietrzu przez 0,5-1 h i przechowywać je przez krótki czas w temperaturze -20 °C lub przez długi czas w temperaturze -80 °C.
  3. Zabarwić próbki.
    1. Ponownie zamocuj szkiełka w zimnym acetonie na 5-10 minut.
    2. Pozwól sekcjom rozgrzać się do RT. Użyj pisaka PAP (patrz Tabela materiałów) wokół sekcji i pozostaw do wyschnięcia.
      UWAGA: Można również użyć emalii do paznokci. Ten krok zapobiega unoszeniu się rozcieńczenia przeciwciał na całym szkiełku.
    3. Umieść szkiełka w 1x soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS) w słoiku Coplin (patrz Tabela Materiałów) na 20 minut, umieść słoik na shakerze i delikatnie wstrząśnij.
    4. Odlej 1x TBS i napełnij słoik 1x TBS, 5% BSA i 0,1% Tween 20. Inkubować przez 20 minut na shakerze, delikatnie wstrząsnąć.
    5. Wyjmij szkiełka i wytrzyj spód szkiełek do sucha. W razie potrzeby wstrząśnij szkiełkami do sucha. Dodać 100 μl sprzężonych przeciwciał25 C3-FITC (1/100) i IgG2a-PE (1/100) do sekcji (patrz tabela materiałów). Inkubować w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze przez 1 godzinę.
    6. Umyj sekcję 3 razy w 1x TBS, 5% BSA i 0,1% Tween 20 przez 10 minut na wytrząsarce.
    7. Wstrząśnij do sucha szkiełka i zamontuj sekcję za pomocą odczynnika zapobiegającego blaknięciu (patrz tabela materiałów), a następnie szkiełka nakrywkowego.
    8. Przechowywać szkiełka w temperaturze 4 °C do momentu wyświetlenia pod mikroskopem (np. mikroskopem konfokalnym lub mikroskopem systemu obrazowania). Określ ilościowo obrazy za pomocą oprogramowania i odejmij sygnały tła, porównując intensywność fluorescencji między regionami.
    9. W przypadku analizy obrazu za pomocą oprogramowania ImageJ (patrz tabela materiałów), obrysuj żądany obszar.
    10. Ustaw standardowe parametry, klikając Analizuj, a następnie Ustaw pomiary i Zmierz obszar, aby uzyskać wyniki.
    11. Przenieś dane uzyskane z okien miar do arkusza kalkulacyjnego.
      UWAGA: Jako tło można wybrać mały obszar z obrazu; Nie powinien mieć żadnej fluorescencji.
    12. Po zakończeniu kliknij Analizuj, aby zmierzyć region i ponownie przenieść dane do poprzedniego arkusza kalkulacyjnego.
    13. Powtórz kroki 3.3.11-3.3.12 dla kilku regionów.
    14. Oblicz średnią fluorescencję jako skorygowaną fluorescencję komórek (CCF) = Gęstość zintegrowana - (Wybrany obszar komórki x Średnia fluorescencja tła).
    15. Obliczaj dla każdego regionu i analizuj dane za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów i statystyk (patrz tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Protokół wykorzystuje kilka metod do oceny toczniowego zapalenia nerek u myszy MRL/lpr. Po pierwsze, opisano procedurę badania wzrostu poziomu białkomoczu wynikającego z dysfunkcji nerek w czasie. Jak pokazano na Ryc. 1, samice myszy w grupie kontrolnej otrzymywały drogą doustną 200 µL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (1x PBS), natomiast grupa badawcza otrzymywała probiotyk Lactobacillus reuteri w stężeniu 109 cfu/mL, dwa razy w tygodniu. Podawanie preparatów ro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

LN jest główną przyczyną śmiertelności u pacjentów z TRU, a czynniki nasilające chorobę pozostają niejasne. Zastosowanie tego protokołu polega na scharakteryzowaniu funkcji nerek przy użyciu wielu metod, w tym pomiaru białkomoczu, analizy FACS izolowanych leukocytów nerkowych oraz barwienia immunofluorescencyjnego zamrożonych skrawków nerki.

Jedną z ważnych kwestii, które należy wziąć pod uwagę podczas zbierania moczu, jest to, że należy być konsekwentnym w kwestii pory dnia i miejsca zbierani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Głównemu Ośrodku Cytometrii Przepływowej, Laboratorium Histopatologii, Centrum Obrazowania Fralin w Instytucie Politechnicznym Wirginii oraz Uniwersytetowi Stanowemu za wsparcie techniczne. Praca ta jest wspierana przez różne granty NIH i wewnętrzne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10x sól fizjologiczna buforowana trójpierścieniowo (TBS)Thermo Fisher ScientificJ60764. K2
2-merkaptoetanolThermo Fisher Scientific21985-023
Anti-Human/Mouse C3CedarlaneCL7632F
Anti-Mouse CD138 BV711Biolegend142519
Anti-Mouse CD45 AF700Biolegend103127
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA9418-100G
Kolagenaza DSigma-Aldrich11088882001
Mikroskop konfokalny LSM 880ZeissLSM 880
Słoik z koplinyFisher Scientific50-212-281
CryomoldFisher ScientificNC9511236
Gradient gęstości średniGE Healthcare17-1440-02Percoll
DEPC-Woda uzdatnionaThermo Fisher ScientificAM9906
DNase ISigma-AldrichD4527
dsDNA-ECInvivoGentlrl-ecdna
Kwas etylenodiaminotetraoctowyFisher ScientificS311-500EDTA
EVOS M5000Thermo Fisher ScientificAMF5000
FACS Fusion Cell sorterBD BiosciencesFACS Fusion
Płodowa surowica bydlęca - premium, inaktywowana termicznieR& Systemy DS11150H
96-dołkowe płyty polistyrenowe FisherbrandFisher Scientific12-565-501
Pryzmat graficznyGraphPadN/A
Hank' s Zrównoważony roztwór soliThermo Fisher Scientific14175-079
HEPESThermo Fisher Scientific15630-080
Oprogramowanie ImageJNational Institutes of HealthN/A
Lactobacillus reuteri Kandler i wsp.ATCC23272
MEM Aminokwasy endogenneThermo Fisher Scientific11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr /J Myszy (MRL/lpr)Jackson Lab485
Szkliwo paznokciN/AN/ADowolny konwencjonalny sklep
Związek O.C.TTisse-Tek4583
PAP długopisSigma-AldrichZ377821
Jednorazowe formy do zatapiania Peel-A-WayPolysciencesR-30
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher Scientific15140-122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific70011069
Pierce 20x TBS BuforThermo Fisher Scientific28358
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Zestaw testowyThermo Fisher Scientific23236Albumina w standardzie w zestawie
ProLon Gold Anti-Blade MountantThermoFisherP36934
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32BD Biosciences553141blok FcR
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875-093
Pirogronian soduThermo Fisher Scientific11360-070
SpectraMax M5Urządzenia molekularneN/ASoftMax Pro 6.1
Oprogramowanie Sitka do komórek sterylnych 100 i mikro; MFisher Scientific22363549
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
Chlorowodorek wankomycynyGoldbioV-200-1
Zombie AquaBiolegend423102barwnik fluorescencyjny do analizy cytometrii przepływowej
System obrazowania mikroskopowego

Bibliografia

  1. Tsokos, G. C. Systemic Lupus Erythematosus. New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).
  2. Davidson, A., Aranow, C. Lupus nephritis: lessons from murine models. Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).
  3. Maldonado, M. A., et al. The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice. Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).
  4. Lech, M., Anders, H. J. The pathogenesis of lupus nephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1357-1366 (2013).
  5. Bagavant, H., Fu, S. M. Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus. Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).
  6. Li, Q. Z., et al. Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).
  7. Aragón, C. C., et al. Urinary biomarkers in lupus nephritis. Journal of Translational Autoimmunity. 3, 100042(2020).
  8. Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73(2017).
  9. Lu, T. -S., Yiao, S. -Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -L. Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification. North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).
  10. Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. How should proteinuria be detected and measured. Annals of Clinical Biochemistry. 46, Pt 3 205-217 (2009).
  11. Viswanathan, G., Upadhyay, A. Assessment of proteinuria. Advances in Chronic Kidney Disease. 18 (4), 243-248 (2011).
  12. Hsieh, C., et al. Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring. Arthritis Care & Research. 63 (6), 865-874 (2011).
  13. Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bariéty, J. Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis. Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).
  14. Chang, A., et al. In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis. Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).
  15. Schrezenmeier, E., Jayne, D., Dörner, T. Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives. Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741(2018).
  16. Fitzgibbons, P. L., et al. Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).
  17. Lewis, M. J., Botto, M. Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity. Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).
  18. Watanabe, H., et al. Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B. Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).
  19. Yin, Z., et al. IL-10 regulates murine lupus. Journal of Immunology. 169 (4), 2148-2155 (2002).
  20. Singh, R. R., et al. Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis. Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).
  21. van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).
  22. Zuniga, R., et al. Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles. Arthritis & Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).
  23. Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
  24. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
  25. Cabana-Puig, X., et al. Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota. Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).
  26. Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
  27. Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes. Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).
  28. Park, J. G. -, et al. Immune cell composition in normal human kidneys. Scientific Reports. 10 (1), 15678(2020).
  29. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  30. Okutucu, B., Dınçer, A., Habib, Ö, Zıhnıoglu, F. Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza białkomoczuinfiltracja leukocytów do nerekodkładanie białek w nerkachmyszy predysponowane do toczniatoczeń układowymonocyty i limfocyty nerkowebarwienie immunohistochemiczneizolacja w gradiencie Percollcytometria przepływowaodkładanie białek w kłębkach nerkowych
Analizy białkomoczu, naciekania leukocytów przez nerki i odkładania się białek przez nerki u myszy MRL/lpr podatnych na toczeń
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.