Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Usunięcie oczu u żywych larw danio pręgowanego w celu zbadania zależnego od unerwienia wzrostu i rozwoju układu wzrokowego

4.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63509

⸱

11 lutego 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Reed College, 2Committee on Development, Regeneration, and Stem Cell Biology, University of Chicago, 3Department of Cell and Developmental Biology, University College London

W tym artykule

Podsumowanie

Artykuł wyjaśnia, jak chirurgicznie usunąć oczy z żywych larw danio pręgowanego, co jest pierwszym krokiem w kierunku zbadania, jak wejście siatkówki wpływa na wzrost i rozwój tektum nerwu wzrokowego. Ponadto artykuł zawiera informacje na temat znieczulenia, fiksacji i preparacji larw, a następnie immunohistochemii i obrazowania konfokalnego.

Streszczenie

Danio pręgowany wykazuje niezwykłe zdolności do wzrostu i regeneracji przez całe życie. Na przykład wyspecjalizowane nisze komórek macierzystych powstałe podczas embriogenezy wspierają ciągły wzrost całego układu wzrokowego, zarówno w oku, jak i w mózgu. Skoordynowany wzrost między siatkówką a tektum nerwu wzrokowego zapewnia dokładne mapowanie siatkówki w miarę dodawania nowych neuronów w oczach i mózgu. Aby odpowiedzieć na pytanie, czy aksony siatkówki dostarczają kluczowych informacji dla regulacji zachowań tektalnych komórek macierzystych i progenitorowych, takich jak przeżycie, proliferacja i/lub różnicowanie, konieczne jest porównanie unerwionych i odnerwionych płatów tektalnych u tego samego zwierzęcia i między zwierzętami.

Chirurgiczne usunięcie jednego oka z żywych larw danio pręgowanego, a następnie obserwacja tektum optycznego osiąga ten cel. Załączony film pokazuje, jak znieczulać larwy, elektrolitycznie ostrzyć igły wolframowe i używać ich do usunięcia jednego oka. Następnie pokazano, jak wypreparować mózgi z utrwalonych larw danio pręgowanego. Wreszcie, film zawiera przegląd protokołu immunohistochemicznego i demonstrację sposobu montowania barwionych zarodków w agarozie o niskiej temperaturze topnienia do mikroskopii.

Wprowadzenie

Celem tej metody jest zbadanie, w jaki sposób dopływ bodźców z siatkówki wpływa na wzrost i rozwój wzgórza optycznego, czyli centrum przetwarzania bodźców wzrokowych w mózgu danio pręgowanego. Poprzez usunięcie jednego oka i następujące po tym porównanie obu stron wzgórza optycznego, możliwe jest zaobserwowanie i znormalizowanie zmian w obrębie tego ośrodka u jednego osobnika, co umożliwia porównania między wieloma okazami. Nowoczesne podejścia molekularne w połączeniu z tą techniką pozwolą na uzyskanie wiedzy na temat mechanizmów leżących u podstaw wzrostu i rozwoju układu wzrokowego, a także degeneracji i regeneracji aksonów.

Układy sensoryczne – wzrok, słuch i somatosensoryka – zbierają informacje z organów zewnętrznych i przekazują je do ośrodkowego układu nerwowego, tworząc w śródmózgowiu „mapy” świata zewnętrznego1,2. Wzrok jest dominującą modalnością sensoryczną u niemal wszystkich kręgowców, w tym u wielu ryb. Siatkówka, będąca tkanką nerwową w oku, zbiera informacje za pomocą obwodu neuronalnego składającego się głównie z fotoreceptorów, komórek dwubiegunowych oraz komórek zwojowych siatkówki (RGCs), które są neuronami projekcyjnymi siatkówki. Komórki RGCs posiadają długie aksony, które prowadzą przez wewnętrzną powierzchnię siatkówki do główki nerwu wzrokowego, gdzie łączą się w pęczki i biegną wspólnie przez mózg, kończąc ostatecznie w ośrodku przetwarzania wizualnego w grzbietowej części śródmózgowia. Struktura ta u ryb i innych kręgowców niebędących ssakami nazywana jest tekton wzrokowym i jest homologiczna do wzgórka górnego u ssaków3.

Tectum opticum jest obustronnie symetryczną, wielowarstwową strukturą w grzbietowej części śródmózgowia. U rybek zebra oraz większości innych ryb każdy płat tectum opticum otrzymuje bodźce wzrokowe wyłącznie z oka przeciwległego, tak że lewy nerw wzrokowy kończy się w prawym płacie tectum, a prawy nerw wzrokowy w lewym płacie tectum4 (Rycina 1). Podobnie jak jego ssaczy odpowiednik – wzgórze górne – tectum opticum integruje informacje wzrokowe z innymi bodźcami sensorycznymi, w tym ze słuchu i somatosensacji, kontrolując zmiany uwagi wzrokowej oraz ruchy gałek ocznych, takie jak sakady1,5,6. Jednak w przeciwieństwie do ssaczego wzgórza górnego, tectum opticum nieustannie generuje nowe neurony i glej z wyspecjalizowanej niszy komórek macierzystych znajdującej się w pobliżu przyśrodkowej i guzowej krawędzi płatów tectum, zwanej strefą proliferacji tectum7. Utrzymanie proliferujących progenitorów w tectum opticum i innych obszarach ośrodkowego układu nerwowego przyczynia się częściowo do niezwykłej zdolności regeneracyjnej udokumentowanej u rybek zebra8.

Poprzednie prace badające mózgi ryb ślepych lub jedookich wykazały, że wielkość wzgórza optycznego jest bezpośrednio proporcjonalna do ilości otrzymywanej innowacji siatkówkowej9,10,11. U dorosłych ryb jaskiniowych, których oczy degenerują się we wczesnej embriogenezie, wzgórze optyczne jest wyraźnie mniejsze niż u blisko spokrewnionych, widzących ryb powierzchniowych9. Degeneracji oczu u ryb jaskiniowych można zapobiec, zastępując endogenny soczewkę soczewką z ryby powierzchniowej podczas embriogenezy. Gdy te jedooke ryby jaskiniowe osiągają wiek dorosły, zinnerwowany płat wzgórza zawiera około 10% więcej komórek niż płat niezinnerwowany9. Podobnie u larw ryb killifish, które inkubowano z zastosowaniem preparatów chemicznych w celu wygenerowania oczu o różnych rozmiarach u tego samego osobnika, strona wzgórza z większą ilością innowacji była większa i zawierała więcej neuronów10. Dowody z eksperymentów polegających na zmiażdżeniu nerwu wzrokowego u dorosłych złotych rybek wskazują, że innowacja promuje proliferację, a proliferacja komórek wzgórza zmniejsza się po przerwaniu innowacji11.

Potwierdzając i rozszerzając te klasyczne badania, kilka niedawnych raportów dostarcza danych sugerujących, że proliferacja w odpowiedzi na unerwienie jest modulowana, przynajmniej częściowo, przez szlak BDNF-TrkB12,13. Wiele pytań dotyczących wzrostu i rozwoju wzgórza optycznego pozostaje otwartych, w tym kwestie takie jak: w jaki sposób rozwijający się system sensoryczny radzi sobie z urazami i degeneracją aksonów, jakie sygnały komórkowe i molekularne umożliwiają regulację wzrostu wzgórza optycznego przez dopływ sygnałów z siatkówki, kiedy mechanizmy te stają się aktywne oraz czy związana z unerwieniem proliferacja i różnicowanie umożliwiają siatkówce i tkance docelowej koordynację tempa wzrostu i zapewnienie dokładnego mapowania retinotopowego. Ponadto istnieją znacznie szersze pytania dotyczące rozwoju zależnego od aktywności, które można rozpoznać, badając system wzrokowy rybek zebrafish za pomocą metod chirurgicznych, takich jak ta opisana poniżej.

Aby zbadać komórkowe i molekularne mechanizmy, poprzez które aktywność neuronalna, w szczególności wynikająca z bodźców wzrokowych, wpływa na przeżycie i proliferację komórek, opisane podejście bezpośrednio porównuje unerwione i odnerwione płaty tekta (Rysunek 1) w obrębie pojedynczych larw zebrafish. Metoda ta pozwala na udokumentowanie degeneracji aksonów RGC w tekcie optycznym oraz potwierdzenie, że liczba komórek mitotycznych koreluje z unerwieniem.

Schemat usunięcia oka larwy zebrafish, widoki boczny i grzbietowy, unerwienie, badanie rozwojowe.
Rysunek 1: Szkice larw zebrafish przed i po jednostronnym usunięciu oka. (A) Rysunek larwy w 5 dpf widzianej pod mikroskopem stereologicznym. Każda larwa jest zatopiona w agarozie o niskiej temperaturze topnienia i zorientowana bokiem, przed użyciem igły wolframowej z ostrym, zakrzywionym końcem do wybrania oka skierowanego ku górze (w tym przykładzie oka lewego). (B) Rysunek widoku grzbietowego larwy w 9 dpf po zabiegu przedstawionym w punkcie A. Przedstawiono jedynie trzy silnie uproszczone aksony RGC z prawego oka, które ulegają defasykulacji i łączą się z neuronami w lewym płacie tekta. Skróty: dpf = dni po zapłodnieniu; dps = dni po operacji; RGC = komórki zwojowe siatkówki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Metody opisane w tym artykule zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i aprobatą Komitetów ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytucjonalnych Reed College i University College London. Szczegółowe informacje na temat szczepów danio pręgowanego użytych w tym badaniu można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Przygotuj materiały i narzędzia

  1. Twórz rozwiązania.
    1. Przygotuj pożywkę dla zarodków (E314) rozcieńczając 60-krotny bulion (300 mM NaCl, 10,2 mM KCl, 20 mMCaCl 2-dihydrat i 20 mM MgCl 2-heksahydrat w wodzie dejonizowanej, autoklawowany i przechowywany w temperaturze pokojowej). Dodaj 160 ml 60x E3 do 10 l wody dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
    2. Zrób 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia (LMP) w E3. Rozpuść 1 g agarozy LMP w 100 ml E3, gotując w kuchence mikrofalowej przez 1-2 minuty na dużej mocy. Zawiesić stopioną agarozę w probówkach do mikrofuzy o pojemności 1,7 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C. Zagotować w łaźni wodnej i przechowywać w bloku grzewczym o temperaturze 40 °C, gdy będzie gotowa do użycia.
    3. Przygotuj roztwór izotoniczny Marc's Modified Ringers (MMR15), rozcieńczając 10x roztwór podstawowy (1 M NaCl, 20 mM KCl, 10 mM MgSO4, 20 mM CaCl 2-dihydrate, 50 mM HEPES, pH dostosowane do 7,5 z 10 M NaOH, a następnie autoklawowane i przechowywane w temperaturze pokojowej). Dodaj 10 ml 10x MMR do 90 ml wody dejonizowanej.
  2. Płytki Sylgard należy zalać zgodnie z zaleceniami producenta, pozwalając im zastygnąć i wyschnąć przez kilka dni16.
  3. Elektrolitycznie ostrzyć igły wolframowe (protokół zmodyfikowany z 17).
    1. Najpierw przygotuj 10% (w/v) roztwór KOH, dodając 200 ml dejonizowanej wody do szklanego słoika z szerokim otworem i zakręcaną pokrywką. Powoli wymieszaj 20 g granulek KOH.
      UWAGA: Ten roztwór jest wysoce egzotermiczny. Nosić rękawice i okulary ochronne, a następnie wymieszać roztwór w kapturze.
    2. Wytnij drut wolframowy o długości 2-3 cm i włóż go do uchwytu igły.
    3. Podłącz przewody katody i anody do zasilania. Przymocuj zacisk krokodylkowy na końcu przewodu katodowego do częściowo wyprostowanego spinacza do papieru i włóż spinacz do papieru do roztworu KOH, mocując go z boku słoika.
    4. Następnie przymocuj zacisk krokodylkowy drutu anodowego do szyjki uchwytu igły. Włącz zasilanie (do ~20 V) i zanurz drut wolframowy w roztworze KOH, wyciągając drut z roztworu pod kątem, aby elektrolitycznie naostrzyć drut w cienką końcówkę.
      UWAGA: Bąbelki będą wydobywać się ze spinacza do papieru w miarę postępu reakcji.
    5. Sprawdź końcówkę igły pod mikroskopem preparacyjnym, aby upewnić się, że jest wystarczająco ostra.
    6. Przepłukać igłę wodą dejonizowaną, aby usunąć wszelkie pozostałości KOH. Zrób kilka igieł z wyprzedzeniem i trzymaj je do czasu operacji larwalnych i sekcji.
  4. Wykonaj szkiełka komorowe do obrazowania okazów danio pręgowanego za pomocą pionowego mikroskopu konfokalnego.
    1. Zaopatrz się w szkiełka mikroskopowe i dwuskładnikową żywicę epoksydową (patrz tabela materiałów). Wymieszaj żywicę epoksydową zgodnie z instrukcją na opakowaniu i pomaluj grube pierścienie lub prostokąty na szkiełkach podstawowych. Pozostaw szkiełka do utwardzenia i wyschnięcia w okapie przez co najmniej 24 godziny przed użyciem.

2. Pobieranie i hodowla zarodków

  1. Dorosłe samce i samice ryb o pożądanych genotypach należy połączyć w pary w boksach hodowlanych późnym popołudniem/wczesnym wieczorem. Następnego ranka, po tarle, zbierz nowo zapłodnione jaja za pomocą sitka siatkowego i przenieś je do E3 na 100-milimetrowych szalkach Petriego.
  2. Inkubować zarodki w temperaturze ~27,5 °C w cyklu 14 godzin światła/10 godzin ciemności do dnia zabiegu. Zmieniaj E3 codziennie lub w razie potrzeby.
  3. Karmić larwy za pomocą zakraplacza pełnego zebranych wrotków raz dziennie, zaczynając od 5 dni po zapłodnieniu (dpf) lub jeden dzień po zabiegu. Po tym, jak larwy będą miały kilka godzin na zjedzenie, zmień E3, aby usunąć wszelkie pozostałe wrotki i produkty przemiany materii.
    UWAGA: Nie należy karmić larw w dniu zabiegu.

3. Przygotuj larwy do operacji

  1. W dniu zabiegu za pomocą szklanej pipety Pasteura o szerokim otworze przenieś 10-15 larw na szalkę Petriego o średnicy 35 mm wypełnioną świeżym E3.
  2. Znieczulij larwy, dodając 3-5 kropli 0,4% w/v roztworu trikainy (0,4 g trikainy rozpuszczonej w 210 mM Tris, pH 9; końcowy roztwór dostosowany do pH 7,4, jeśli to konieczne18) do naczynia, aby uzyskać końcowe stężenie ~0,0015% w/v Trikaina. Zwróć uwagę na brak reakcji na dotyk, aby ustalić, czy larwy są odpowiednio znieczulone. Jeśli po ~3 minutach nadal reagują na dotyk, dodaj jeszcze 2-3 krople 0,4% w/v roztworu Trikainy i ponownie oceń.
    UWAGA: Na tym etapie rozwoju możliwe jest monitorowanie przepływu krwi i tętna oprócz ruchliwości pod mikroskopem preparacyjnym
    3. .
  3. Unieruchomić znieczulone larwy danio pręgowanego, zanurzając je w 1% agarozie LMP rozpuszczonej w E3.
    1. Najpierw umieść pokrywkę szalki Petriego o średnicy 35 mm skierowaną do góry pod mikroskopem preparacyjnym. Następnie weź jedną larwę do szklanej pipety Pasteura o wąskim otworze, zawierającej tylko niewielką ilość E3.
    2. Następnie odessać ~200 μL stopionej, ciepłej (~40 °C) 1% agarozy LMP do pipety z larwą. Na koniec wypryskaj larwę i agarozę na odwróconą pokrywę szalki Petriego.
    3. Użyj igły wolframowej, aby szybko, ale delikatnie manewrować larwą tak, aby była boczna, z jednym okiem skierowanym do góry. Poczekaj, aż agaroza stężeje (~5 min).
      UWAGA: Jeśli agaroza stwardnieje, gdy larwa nie jest boczna, uwolnij ją od agarozy (jak opisano w kroku 5) i włóż ją z powrotem do naczynia z E3 i trikainą.

4. Usuwanie oczu

  1. Gdy agaroza jest już ustawiona, a larwa jest umieszczona bocznie, użyj końcówki bardzo cienkiej, elektrolitycznie zaostrzonej igły wolframowej, aby przekłuć skórę wokół oka, podążając za krawędzią oczodołu.
  2. Następnie wsuń krawędź igły (nie końcówkę) pod oko od skroniowo-brzusznej strony oka. Użyj kontrolowanego nacisku, aby uwolnić oko z oczodołu.
  3. Użyj bardzo cienkich kleszczy chirurgicznych, aby usunąć oko, ściskając nerw wzrokowy i popychając oko z przyśrodkowego na boczny. Alternatywnie, po prostu naciskaj oko grzbietowo i przednią stroną igły, ostatecznie przecinając nerw wzrokowy i uwalniając oko.
    UWAGA: Jeśli podczas operacji przypadkowo zostaną dźgnięte tkanki inne niż oko, należy szybko i humanitarnie zabić larwę poprzez szybkie ścięcie.

5. Opieka pooperacyjna aż do zakończenia eksperymentu

  1. Po udanym usunięciu oka przykryj agarozę roztworem MMR.
  2. Uwolnij każdą larwę z agarozy, delikatnie muskając igłą wolframową głowę, a następnie ciało, jednocześnie stabilizując pokrywę szalki Petriego za pomocą kleszczy.
  3. Przenieść jednookie larwy na szalkę Petriego o średnicy 35 mm, która zawiera MMR uzupełniony koktajlem penicyliny/streptomycyny w stosunku 1:100. Inkubować zarodki w temperaturze ~27,5 °C w cyklu 14 godzin światła/10 godzin ciemności.
    UWAGA: Ten izotoniczny roztwór MMR uzupełniony antybiotykami początkowo wspomaga gojenie się larw i przeżycie. Każde naczynie może pomieścić do 15 rekonwalescentów.
  4. Następnego dnia zwróć larwy do E3. Począwszy od popołudnia po zabiegu, raz dziennie należy karmić larwy (~6 dpf i starsze) za pomocą zakraplacza pełnego zebranych wrotków. Po tym, jak larwy będą miały kilka godzin na zjedzenie, zmień E3, aby usunąć wszelkie pozostałe wrotki i produkty przemiany materii.

6. Naprawianie larw

  1. Gdy larwy osiągną pożądany etap rozwoju do analizy, znieczul je śmiertelną dawką tricainy (~0,4% końcowego stężenia), aż ich serca przestaną bić.
  2. Odpipetować do 30 larw w probówce o pojemności 1,5 ml. Usuń nadmiar E3, a następnie dodaj 0,5-1 ml roztworu utrwalającego (4% paraformaldehydu (PFA) i 4% sacharozy w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS)) w celu utrwalenia tkanki. Inkubować larwy przez noc w temperaturze 4 °C.
  3. Następnego dnia przemyj larwy PBS, usuwając utrwalacz i spłukując larwy 3-4 razy PBS. Larwy należy przechowywać w temperaturze 4 °C do 7 dni przed rozbieraniem.

7. Sekcja larw w celu odsłonięcia mózgów (na podstawie 15)

  1. Zawiesić utrwalone larwy w kropelkach PBS na płytce Sylgarda pod mikroskopem preparacyjnym. Zabezpiecz je bocznie, umieszczając dwie szpilki wolframowe (zazwyczaj stare igły wolframowe, które mają mniej niż 2 cm) przez strunę grzbietową, przy czym jedna szpilka znajduje się tuż za pigmentowanym obszarem obejmującym obszar aorty-gonady-śródnercza (AGM), a druga w linii z końcem przedłużenia żółtka.
    UWAGA: Umieść szpilki wolframowe w jak najmniejszej liczbie prób, ponieważ tkanka będzie stawać się bardziej krucha z każdym nakłuciem.
  2. Użyj bardzo ostrej igły wolframowej i ostrych jak igła kleszczy, aby odsłonić mózg, usuwając w tej kolejności oko (oczy), ucho, szczękę, przewód pokarmowy i grzbietową skórę czaszki.
    1. Najpierw usuń oko przy użyciu techniki podobnej do chirurgicznego usunięcia oka w kroku 4. Następnie odepnij larwę i odwróć ją na przeciwną stronę, aby drugie oko było dostępne i powtórz. Alternatywnie, wbij igłę przez szczękę na drugą stronę i wyjmij oko bez odpinania.
      UWAGA: Oczy mogą zostać pobrane w tym momencie, jeśli pożądana jest analiza tej tkanki (podobnie jak w przypadku 19).
    2. Następnie użyj igły wolframowej, aby podrapać od skroniowej do brzusznej strony ucha. W tym samym działaniu/ruchu przyłóż igłę do tyłu szczęki i delikatnie pociągnij do przodu, aż ucho i szczęka zostaną usunięte.
    3. Użyj kleszczy, aby wyciągnąć narządy brzuszne i pozostałe żółtko.
    4. Na koniec wykonaj płytkie nacięcie w grzbietowej skórze czaszki w pobliżu połączenia między tyłomózgowiem a rdzeniem kręgowym. Podnieś skórę kleszczami i pociągnij ją do przodu i wokół kresomózgowia. Jeśli okaże się to zbyt trudne, zacznij od początkowego nacięcia w tyłomózgowiu i pociągnij skórę najpierw na boki, a następnie brzusznie i do przodu, uważając, aby nie zarysować bocznych krawędzi tectum.
      UWAGA: Ponieważ śródmózgowie jest przedmiotem badań, tyłomózgowie może zostać przecięte; Jednak głębokie nacięcie może skutkować dekapitacją.
    5. Usuń pozostałą tkankę za pomocą kleszczy. Odpiąć larwę i przenieść do PBS w probówce do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Pozostaw ogon przyczepiony do mózgu, aby uzyskać lepszą widoczność podczas wykonywania protokołów pełnego montowania.

8. Odwodnienie i magazynowanie mózgu

  1. Usuń PBS z mózgu i dodaj 1 ml PBS zawierającego 0,1% TritonX-100 (PBST). Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Usuń PBST i zastąp go roztworem metanolu w stosunku 50:50. Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Umyj mózgi 100% metanolem (MeOH) dwa razy po 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Przechowuj mózgi w 100% MeOH w temperaturze -20 °C przez co najmniej 16 godzin przed wykonaniem immunohistochemii lub innych procedur całościowych.
    UWAGA: Mózgi mogą być przechowywane w MeOH przez okres do 2 lat w temperaturze -20 °C.

9. Immunohistochemia

UWAGA: Ustalone protokoły dla wielu użytecznych technik montażu całego danio pręgowanego można znaleźć na ZFIN20. Manuskrypt ten zawiera przykłady porównujące jednookie i dwuokie larwy, które zostały wybarwione immunologicznie przeciwciałami, które rozpoznają albo czerwone białko fluorescencyjne (RFP), które ulega ekspresji w aksonach nerwu wzrokowego w linii Tg[atoh7:RFP] (Rysunek 2), lub fosforylowany histon H3 (PH3), który podkreśla komórki mitotyczne (Rysunek 3). Standardowy protokół immunohistochemiczny dla całych zarodków i larw jest podsumowany poniżej.

  1. Najpierw należy ponownie nawodnić mózgi larw za pomocą stopniowanej serii płukania MeOH:PBST w temperaturze pokojowej, inkubując próbki w 50:50 MeOH:PBST przez 5 minut, a następnie w 30:70 MeOH:PBST przez 5 minut, a na koniec 3 przemycia PBST.
  2. Aby przeniknąć do mózgu, należy je inkubować w PBST uzupełnionym proteinazą K (PK) w końcowym stężeniu 20 μg/ml PK przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Przechowywać podwielokrotności 10 mg/ml PK w temperaturze -20 °C i rozmrozić je przed użyciem.
  3. Usunąć roztwór PK i zmyć pozostały enzym, przepłukując mózgi PBST 3 razy w ciągu 15 minut.
  4. Ponownie napraw permeabilizowane mózgi, inkubując je w 4% PFA przez 20 minut w temperaturze 25 °C (lub temperaturze pokojowej). Następnie usuń PFA i zmyj pozostały utrwalacz, przepłukując mózgi 3 razy w ciągu 15 minut PBST.
  5. Zastąp końcowe płukanie PBST świeżo przygotowanym buforem immunoblokującym (IB) (10% normalnej surowicy koziej i 1% DMSO w PBST) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.
  6. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe do buforu IB w odpowiednim stężeniu (np. 1:500 dla RFP i 1:300 dla przeciwciał PH3).
  7. Usuń bufor IB z mózgu i zastąp go pierwszorzędowym rozcieńczeniem przeciwciała. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej, delikatnie kołysząc. Upewnij się, że rurki bezpiecznie spoczywają na bokach.
  8. Następnego ranka usuń roztwór przeciwciała pierwotnego za pomocą mikropipety, spłucz kilka razy w PBST, a następnie umyj mózgi w PBST w temperaturze pokojowej przez 4 x 30 min.
    UWAGA: Rozcieńczenia przeciwciał pierwotnych mogą być ponownie użyte raz w ciągu ~7 dni, jeśli są przechowywane w temperaturze 4 °C.
  9. Przepłukać mózgi w buforze IB, rozcieńczając przeciwciała drugorzędowe w buforze IB w odpowiednim stężeniu (np. 1:500 dla anty-królika Alexa-fluor 568).
  10. Usunąć bufor IB i zastąpić go drugorzędowym rozcieńczeniem przeciwciał. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej, delikatnie kołysząc probówkami spoczywającymi na ich bokach.
  11. Następnego ranka usuń wtórny roztwór przeciwciała, spłucz PBST, a następnie umyj mózgi w PBST w temperaturze pokojowej przez 4 x 30 min.
  12. Barwienie przeciwstawne za pomocą 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) lub ToPro3 (1:5 000 w PBST w temperaturze 4 °C przez noc).
  13. Następnego ranka przenieś mózgi larwalne do PBS i przejdź do etapów montażu i obrazowania wymienionych poniżej.

10. Montaż i obrazowanie

  1. Zamocuj szkiełko z komorą w pokrywie szalki Petriego o średnicy 100 mm za pomocą smaru próżniowego.
  2. Przenieś wybarwione immunologicznie i przetworzone larwy na płytkę studzienkową lub szkiełko wgłębieniowe, aby obejrzeć je pod mikroskopem preparacyjnym.
  3. Zamontuj larwy na szkiełku komorowym w kolumnach z 1% agarozy LMP.
    1. Za pomocą szklanej pipety Pasteura umieść jedną larwę na szkiełku z komorą, osadzając jak najmniej PBS. Tą samą pipetą przykryj larwę stopioną 1% agarozą LMP (~40 °C).
    2. igłą wolframową lub kleszczami wciągnij agarozę w kolumnę, a następnie ustaw larwę tak symetrycznie, jak to możliwe, z widoczną powierzchnią grzbietową.
    3. Powtórz tę procedurę dla pozostałych larw.
    4. Gdy agaroza się zżeluje, przykryj ją kilkoma kroplami PBS, a następnie umieść na stoliku mikroskopu konfokalnego.
  4. Wyrównaj soczewkę obiektywu z próbką, ustaw ostrość mikroskopu za pomocą światła przechodzącego i oświetl próbkę odpowiednimi laserami.
    UWAGA: W tym przykładzie długości fal 405 nm i 568 nm zostały użyte odpowiednio do wzbudzenia DAPI i RFP.
  5. Dostosuj wzmocnienie, przesunięcie i moc lasera, przesuwając suwaki na odpowiedni poziom w stosunku do sygnału i używanego detektora. Sprawdź histogramy dla każdego kanału i kliknij przycisk Wskaźnik stanu nasycenia nad obrazem, aby ocenić poziom ekspozycji, upewniając się, że żaden z pikseli nie jest nasycony, a stosunek sygnału do szumu jest wysoki. Przykład optymalnych parametrów obrazowania konfokalnego dla rozdzielczości komórkowej i subkomórkowej u danio pręgowanego można znaleźć w 21.
  6. Ustaw górne i dolne granice stosu płaszczyzn z za pomocą kółka przewijania myszy, aby znaleźć górną i dolną część próbki. Kliknij górny i dolny limit pobierania obrazu, a następnie uruchom przechwytywanie stosu z, klikając przycisk Uruchom teraz.
    UWAGA: W zależności od tego, jak symetrycznie zamontowany jest mózg, całkowita głębokość z dla mózgu larwy danio pręgowanego o wartości 9 dpf wyniesie ~150-200 μm.
  7. Przetwarzaj i koloruj obrazy z myślą o ułatwieniach dostępu dla daltonistów (np. użyj niebieskiego i pomarańczowego lub karmazynowego i zielonego dla obrazów dwukolorowych). Ustaw tabele odnośników w oprogramowaniu używanym do przechwytywania obrazów lub w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów, takim jak Photoshop firmy Adobe.
  8. W programie Photoshop kolorowe mikrofotografie w formacie RAW są zapisywane w formacie TIFF (8 bit Tagged Image File Format) poprzez (i) konwersję trybu obrazu na RGB i (ii) dostęp do opcji Krzywe w obszarze Obraz | Dostosowania menu, a następnie (iii) przesunięcie odpowiednich kolorowych strumieni świetlnych do poziomów 0 lub 255, aby uzyskać żądany kolor. Na przykład, aby uzyskać zielony sygnał, wybierz kanał czerwony i przesuń jego wyjście na 0; następnie wybierz kanał niebieski i przesuń jego wyjście również na 0. Podobnie, aby uzyskać sygnał magenta, wybierz kanał zielony i przesuń jego wyjście na 0; Pozostaw kanały czerwony i niebieski bez zmian.
    UWAGA: Podobne kroki można wykonać w darmowym programie Gnu Image Manipulation Program (GIMP).
  9. Ręcznie określ ilościowo liczbę komórek wyświetlających określony znacznik za pomocą wtyczki licznika komórek w ImageJ22, dostępnej w obszarze Analizuj w menu Wtyczki. Przykłady użycia ImageJ do zliczania komórek można znaleźć w wielu samouczkach, w tym 23.
  10. Generowanie graficznych reprezentacji danych w oprogramowaniu statystycznym, takim jak RStudio (patrz dane uzupełniające dla . Rmd).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby potwierdzić, czy usunięcie oka było całkowite, oraz ocenić zmiany w obrębie wzgórza optycznego, przeprowadzono zabiegi chirurgiczne u szczepu Tg[atoh7:RFP], w którym wszystkie komórki zwojowe siatkówki (RGC) są znakowane białkiem RFP skierowanym do błony, a tym samym znakowane są wszystkie aksony wychodzące z siatkówki i tworzące nerw wzrokowy24. Choć wykorzystanie tego szczepu nie jest absolutnie konieczne, umożliwia ono bezpośrednią obserwację i wizualizację zakończeń nerwu wzrokowe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Techniki opisane w niniejszej pracy ilustrują jedno z wielu podejść do badania rozwoju układu wzrokowego kręgowców u danio pręgowanego. Inni badacze opublikowali metody preparowania siatkówki embrionalnej i przeprowadzania analiz ekspresji genów19 lub wizualizacji aktywności neuronalnej w tektum wzrokowym30. W artykule przedstawiono podejście do zbadania, w jaki sposób zróżnicowane wejście siatkówki może wpływać na zachowanie komórek w tektum optycznym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Finansowanie tej pracy było głównie wspierane przez fundusze start-upowe z Reed College do KLC, fundusze Helen Stafford Research Fellowship dla OLH oraz stypendium Reed College Science Research Fellowship dla YK. Projekt ten rozpoczął się w laboratorium Steve'a Wilsona jako współpraca z działem HR, który był wspierany przez stypendium Wellcome Trust (2009-2014). Dziękujemy Máté Vardze, Steve'owi Wilsonowi i innym członkom laboratorium Wilsona za wstępne dyskusje na temat tego projektu, a szczególnie dziękujemy Florencii Cavodeassi i Kate Edwards, które jako pierwsze nauczyły KLC, jak montować zarodki w agarozie i przeprowadzać sekcje mózgu danio pręgowanego. Dziękujemy również Grecie Glover i Jayowi Ewingowi za pomoc w montażu naszego wolframowego urządzenia do ostrzenia igieł.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sprzęt i materiały:
Pudełka hodowlaneAquaneeringZHCT100
Smar wysokopróżniowy Dow CorningSigma lub równoważny dostawcaZ273554
Kolby Erlenmeyera (125 ml)Do wytwarzania zmodyfikowanych Pierścieni Marca (MMR) z antybiotykami do inkubacji pooperacyjnej.
Cienkie kleszcze - Dumont #5Fine Science Tools (FST)11252-20
Szklane pipety PasteuraDWK Lifescience63A53 i 63A53WTDo pipetowania zarodków i larw.
Szkiełka podstawowe do mikroskopiiVWR lub ich odpowiednik48311-703Standardowe szkiełka mikroskopowe można zamawiać u wielu różnych dostawców laboratoryjnych.
Wyroby szklane, w tym butelki z podziałką i cylindry z podziałką Dowytwarzania i przechowywania roztworów.
2-częściowa żywica epoksydowaACE Hardware lub inny równoważny dostawca kleju Gorilla Glue lub równoważnastrzykawka 0,85 uncjihttps://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
probówka do mikrowirówek (1,7 ml)VWR lub równoważny dostawca22234-046
Niklowany uchwyt na szpilki (długość 17 cm)Fine Science Tools (FST)26018-17Do trzymania drutu wolframowego podczas ostrzenia i wykonywania operacji/sekcji.
Sitko do herbaty z siatki nylonowej lub odpowiednikAli Express lub odpowiednikDo zbierania ikry danio pręgowanego po tarle; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
SpinaczDo urządzenia do ostrzenia igieł wolframowych.
Szalki Petriego 100 mmFischer Dostawca naukowy lub równoważny50-190-0267
Szalki Petriego 35 mmFischer Dostawca naukowy lub równoważny08-757-100A Pompa
do pipetSP Bel-Art lub równoważnaF37898-0000
Wodorotlenek potasu (KOH)Sigma909122Do urządzenia do ostrzenia igieł wolframowych. Przygotuj 10% w/v roztwór KOH w okapie, dodając granulki do wody dejonizowanej.
Zasilacz (zmienne napięcie)Do urządzenia do ostrzenia igieł wolframowych. Sprawdzi się każdy zasilacz o zmiennym napięciu (nawet taki używany do elektroforezy żelowej).
Sylgard 184 Zestaw elastomerówDow Corning3097358
Drut wolframowy (średnica 0,125 mm)World Precision Instruments (WPI)TGW0515Ostrzyć w celu usunięcia oka i wypreparowania larw.
Blok grzewczy o zmiennej temperaturzeLab Depot lub równoważny dostawcaBSH1001 lub BSH1002Ustaw na 40-42 ° C wyprzedza eksperymenty.
Szklany słoik z szerokim otworem i pokrywką (np. Czysty słoik z dżemem lub salsą)Do urządzenia do ostrzenia igieł wolframowych.
Przewody z przewodamiDo urządzenia do ostrzenia igieł wolframowych.
< silne>mikroskopy: < / strong>
preparacyjnyKażdy typ będzie działał, ale preferowane jest regulowane światło przechodzące na lustrzanej podstawie.
Zalecany jest laserowy skaningowy mikroskopHigh NA, soczewka obiektywowa zanurzająca się w wodzie 20-25x.
Używane jest tutaj oprogramowanie do sterowania mikroskopem i przechwytywania obrazu (NIS-Elements firmy Nikon), ale każdy mikroskop konfokalny będzie działał.
Odczynniki do operacji i sekcji:
Dwuwodny chlorek wapniaSigmaC7902do zmodyfikowanych pierścieni Marca (MMR) i pożywki zarodkowej (E3).
HEPESSigmaH7006do zmodyfikowanych dzwonków Marca (MMR).
Agaroza o niskiej temperaturze topnieniaInvitrogen16520-050Zrobić 1% w pożywce zarodkowej (E3) lub zmodyfikowanych pierścieniach Marca (MMR).
Chlorek magnezu sześciowodnySigma1374248Do pożywki zarodkowej (E3).
Siarczan magnezuSigmaM7506do zmodyfikowanych dzwonków Marca (MMR).
Paraformaldehydowamikroskopia elektronowa Sciences19210Rozcieńczyć 8% (w/v) materiału z 2x skoncentrowanym PBS (rozcieńczonym z 10x PBS stock).
Penicylina/StreptomycynaSigmaP4333-20MLRozcieńczyć w stosunku 1:100 w zmodyfikowanych dzwonkach Marca.
Tabletki z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS)Diagnostyka BioSystemsDMR E404-01Przygotować 10x bulion w wodzie dejonizowanej, autoklawać i przechowywać w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć do 1x stężenia roboczego.
Chlorek potasuSigmaP3911do zmodyfikowanych pierścieni Marca (MMR) i pożywki dla zarodków (E3).
Chlorek soduSigmaS9888do zmodyfikowanych pierścieni Marca (MMR) i pożywki zarodkowej (E3).
Wodorotlenek soduSigmaS5881 Wykonaj10 M i użyj do dostosowania pH MMR do 7,4.
SacharozaSigmaS9378
Tricaine-SPentair100G #TRS1Przepis:
https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINEOdczynniki do immunohistochemii:
Alexafluor 568 oznaczone Przeciwciało drugorzędowe do wykrywania króliczej IgGInvitrogenA-11011Stosować w rozcieńczeniu 1:500 dla całego montażu immunohistochemia.
DAPI lub ToPro3Invitrogen1306 lub T3605Uzupełnić roztwory o stężeniu 1 mg/ml w DMSO; rozcieńczenie 1:5 000 do barwienia przeciwstawnego.
Dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaD8418Składnik buforu immunoblokowego.
Metanol (MeOH)Sigma34860Mieszanie MeOH z roztworami wodnymi, takimi jak PBST, jest egzotermiczne. Przygotuj roztwory MeOH/PBST co najmniej kilka godzin wcześniej lub schłodzić je na lodzie przed użyciem.
Normalna surowica koziaThermoFisher Scientific50-062ZSkładnik buforu immunoblokowego. Może być podawany w objętościach 1-10 ml i przechowywany w temperaturze -20 °C.
Przeciwciało pierwszorzędowe do wykrywania fosfohistonu H3Millipore06-570Stosować w rozcieńczeniu 1:300 do całkowitej immunohistochemii.
Pierwszorzędowe przeciwciało do wykrywania białka czerwonej fluorescencji (RFP; wykrywa pochodne dsRed)MBL InternationalPM005Stosować w rozcieńczeniu 1:500 do całkowitej immunohistochemii.
Proteinaza K (PK)SigmaP2308-10MGUzupełnić 10 mg/ml roztworów podstawowych w PBS i stosować w 10 &mikro; g/ml.
Triton X-100SigmaT8787Przydatny do przygotowania 20% (v/v) roztworu podstawowego w PBS.
Software do analizy danych
ImageJ (Fidżi)Darmowe oprogramowanie do analizy obrazu; https://imagej.net/software/fiji/
RStudioFreeware do analizy statystycznej i wizualizacji danych; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop lub GIMPDo komponowania figur często używa się zastrzeżonego oprogramowania do przetwarzania obrazów (Adobe Photoshop i Illustrator). Darmową alternatywą jest Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)
Zebrafish breins. W tym badaniu wykorzystano szczepy AB, TU, Tg[atoh7:RFP].Dostępne w  Międzynarodowe Centra Zasobów Zebra w USA (https://zebrafish.org/home/guide.php) lub w Europie (https://www.ezrc.kit.edu/). Specjalistyczne szczepy transgeniczne, które nie zostały jeszcze zdeponowane w żadnym z centrów zasobów, można zamówić w poszczególnych laboratoriach po publikacji.
do papieru zaciskowymi krokodylkowymi mikroskop konfokalny

Bibliografia

  1. Butler, A. B., Hodos, W. Optic tectum. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , John Wiley & Sons, Inc. 311-340 (2005).
  2. Cang, J., Feldheim, D. A. Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment. Annual Review of Neuroscience. 36 (1), 51-77 (2013).
  3. Basso, M. A., Bickford, M. E., Cang, J. Unraveling circuits of visual perception and cognition through the superior colliculus. Neuron. 109 (6), 918-937 (2021).
  4. Burrill, J. D., Easter, S. S. Development of the retinofugal projections in the embryonic and larval zebrafish (Brachydanio rerio). The Journal of Comparative Neurology. 346 (4), 583-600 (1994).
  5. Nona, S. Regeneration in the goldfish visual system. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/ (2021).
  6. Sauve, Y., Gaillard, F. Regeneration in the visual system of adult mammals. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/ (2021).
  7. Cerveny, K. L., Varga, M., Wilson, S. W. Continued growth and circuit building in the anamniote visual system. Developmental Neurobiology. 72 (3), 328-345 (2012).
  8. Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420(2019).
  9. Soares, D., Yamamoto, Y., Strickler, A. G., Jeffery, W. R. The lens has a specific influence on optic nerve and tectum development in the blind cavefish Astyanax. Developmental Neuroscience. 26 (5-6), 308-317 (2004).
  10. White, E. L. An experimental study of the relationship between the size of the eye and the size of the optic tectum in the brain of the developing teleost, Fundulus heteroclitus. Journal of Experimental Zoology. 108 (3), 439-469 (1948).
  11. Raymond, P., Easter, S., Burnham, J., Powers, M. Postembryonic growth of the optic tectum in goldfish. II. Modulation of cell proliferation by retinal fiber input. The Journal of Neuroscience. 3 (5), 1092-1099 (1983).
  12. Sato, Y., Yano, H., Shimizu, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Optic nerve input-dependent regulation of neural stem cell proliferation in the optic tectum of adult zebrafish. Developmental Neurobiology. 77 (4), 474-482 (2017).
  13. Hall, Z. J., Tropepe, V. Visual experience facilitates BDNF-dependent adaptive recruitment of new neurons in the postembryonic optic tectum. The Journal of Neuroscience. 38 (8), 2000-2014 (2018).
  14. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
  15. Cold Spring Harbor Protocols. Marc's modified Ringer's (MMR) (10X, pH 7.4). Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
  16. Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A. Anatomical dissection of zebrafish brain development. Brain Development. 1082, 197-214 (2014).
  17. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  18. ZFIN Tricaine recipe. , Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE (2018).
  19. Zhang, L., Leung, Y. F. Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e2028(2010).
  20. ZFIN protocols. , Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview (2021).
  21. Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging subcellular structures in the living zebrafish embryo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53456(2016).
  22. ImageJ with batteries included. Fiji. , Available from: https://figi.sc/ (2021).
  23. O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719(2016).
  24. Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. The Journal of Cell Biology. 171 (6), 991-999 (2005).
  25. Karlstrom, R. O., et al. Zebrafish mutations affecting retinotectal axon pathfinding. Development. 123 (1), 427-438 (1996).
  26. Harvey, B. M., Baxter, M., Granato, M. Optic nerve regeneration in larval zebrafish exhibits spontaneous capacity for retinotopic but not tectum specific axon targeting. PLOS ONE. 14 (6), 0218667(2019).
  27. Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise lamination of retinal axons generates multiple parallel input pathways in the tectum. Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
  28. Vargas, M. E., Barres, B. A. Why Is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 153-179 (2007).
  29. Hughes, A. N., Appel, B. Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination. Nature Neuroscience. 23 (9), 1055-1066 (2020).
  30. de Calbiac, H., Dabacan, A., Muresan, R., Kabashi, E., Ciura, S. Behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e58837(2021).
  31. Adams, S. L., Zhang, T., Rawson, D. M. The effect of external medium composition on membrane water permeability of zebrafish (Danio rerio) embryos. Theriogenology. 64 (7), 1591-1602 (2005).
  32. Fredj, N. B., et al. Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection. Journal of Neuroscience. 30 (32), 10939-10951 (2010).
  33. Alberio, L., et al. A light-gated potassium channel for sustained neuronal inhibition. Nature Methods. 15 (11), 969-976 (2018).
  34. Kay, J. N., Finger-Baier, K. C., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. Retinal ganglion cell genesis requires lakritz, a zebrafish atonal homolog. Neuron. 30 (3), 725-736 (2001).
  35. Gnuegge, L., Schmid, S., Neuhauss, S. C. F. Analysis of the activity-deprived zebrafish mutant macho reveals an essential requirement of neuronal activity for the development of a fine-grained visuotopic map. The Journal of Neuroscience. 21 (10), 3542-3548 (2001).
  36. Jeffery, W. R. Astyanax surface and cave fish morphs. EvoDevo. 11 (1), 14(2020).
  37. Sieger, D., Peri, F. Animal models for studying microglia: The first, the popular, and the new. Glia. 61 (1), 3-9 (2013).
  38. Svahn, A. J., et al. Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum. Developmental Neurobiology. 73 (1), 60-71 (2013).
  39. Herzog, C., et al. Rapid clearance of cellular debris by microglia limits secondary neuronal cell death after brain injury in vivo. Development. 146 (9), (2019).
  40. Chen, J., Poskanzer, K. E., Freeman, M. R., Monk, K. R. Live-imaging of astrocyte morphogenesis and function in zebrafish neural circuits. Nature Neuroscience. 23 (10), 1297-1306 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

tectum opticumaksony siatkówkirozwój neuronówsekcja mózguimmunohistochemiaobrazowanie żywych komórekdegeneracja wallerowskanisze komórek macierzystych
Usunięcie oczu u żywych larw danio pręgowanego w celu zbadania zależnego od unerwienia wzrostu i rozwoju układu wzrokowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.