Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Elektrofizjologiczne metody pomiaru poziomu fotopigmentu w fotoreceptorach Drosophila

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63514

⸱

2 czerwca 2022

 ,  , 
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół do elektrofizjologicznego charakterystyki bistabilnych fotopigmentów: (i) wykorzystanie przemieszczeń ładunku w cząsteczkach fotopigmentu po absorpcji fotonów i ich ogromnej ilości w fotoreceptorach, oraz (ii) wykorzystanie różnic w widmach absorpcyjnych rodopsyny i metarodopsyny. Protokoły te są przydatne do badań przesiewowych pod kątem mutacji wpływających na bistabilne systemy fotopigmentowe.

Streszczenie

Fotopigment rodopsyna (R) sprzężony z białkiem G Drosophila składa się z białka (opsyny) i chromoforu. Proces aktywacji rodopsyny jest inicjowany przez indukującą absorpcję fotonów izomeryzację chromoforu, promującą zmiany konformacyjne opsyny i powodującą drugi ciemny stabilny stan fotopigmentu (metarodopsyna, M). Badanie tego bistabilnego fotopigmentu za pomocą mutagenezy losowej wymaga prostych i solidnych metod badań przesiewowych zmutowanych much. W związku z tym opracowano kilka metod pomiaru obniżenia funkcjonalnych poziomów fotopigmentu. Jedna z takich metod wykorzystuje przemieszczenia ładunku w fotopigmentach po absorpcji fotonów oraz ogromne ilości cząsteczek fotopigmentu ulegających ekspresji w fotoreceptorach. Ten sygnał elektryczny, nazwany wczesnym potencjałem receptora (lub wczesnym prądem receptora), jest mierzony za pomocą różnych metod elektrofizjologicznych (np. elektroretinogramu i zapisów całej komórki) i jest liniowo proporcjonalny do funkcjonalnych poziomów fotopigmentu. Zaletami tej metody są wysoki stosunek sygnału do szumu, bezpośredni liniowy pomiar poziomu fotopigmentu oraz niezależność mechanizmów fototransdukcji od aktywacji rodopsyny lub metarodopsyny. Dodatkowa metoda elektrofizjologiczna, zwana przedłużonym depolaryzującym potencjałem wtórnym (PDA), wykorzystuje bistabilność fotopigmentu Drosophila oraz absorpcyjno-spektralne różnice stanów pigmentowych R i M much. PDA jest indukowany przez intensywne niebieskie światło, przekształcając nasycone ilości rodopsyny w metarodopsynę, co powoduje niepowodzenie zakończenia odpowiedzi na światło przez dłuższy czas w ciemności, ale może zostać zakończone przez konwersję metarodopsyny do rodopsyny przy użyciu intensywnego pomarańczowego światła. Ponieważ PDA jest silnym sygnałem, który wymaga masowej konwersji fotopigmentu, nawet niewielkie defekty w biogenezie fotopigmentu prowadzą do łatwego wykrycia nieprawidłowego PDA. Rzeczywiście, wadliwe mutanty PDA doprowadziły do zidentyfikowania nowych białek sygnałowych ważnych dla fototransdukcji.

Wprowadzenie

Aktywowana światłem rodopsyna (R), która jest receptorem sprzężonym z białkiem G (GPCR), składa się z 7 białek transbłonowych (opsyna) i chromoforu. U Drosophila melanogaster (muszka owocowa) absorpcja fotonów indukuje izomeryzację chromoforu 11-cis-3-OH-siatkówki do all-trans-3-OH-retinal1, promując konformacyjną zmianę rodopsyny na metarodopsynę (M, Rysunek 1A). W przeciwieństwie do rodopsyny kręgowców, dominująca frakcja chromoforu bezkręgowców nie dysocjuje od opsyny, co skutkuje fizjologicznie aktywnym, ciemnostabilnym stanem pigmentowym M. Z kolei dodatkowa absorpcja fotonów przez chromofor all-trans-3-OH-retinalowy indukuje izomeryzację chromoforu2,3, generując stan pigmentu R za pomocą chromoforu 11-cis-3-OH-retinal. Stan R to ciemny, stabilny i fizjologicznie nieaktywny fotopigment. Oprócz niezwykle szybkiej drogi regeneracji fotonów chromoforu4, podobnie jak w przypadku fotopigmentów kręgowców, u bezkręgowców istnieje alternatywna enzymatyczna powolna droga regeneracji chromoforów, w której niektóre etapy są wykonywane w komórkach siatkówki otaczających komórki fotoreceptorów5,6.

Drosophila ma ogromne zalety jako organizm modelowy do badania fotoreceptorów bezkręgowców. W szczególności dostępność preparatu i możliwość zastosowania genetyki molekularnej sprawiły, że Drosophila stała się potężnym systemem modelowym7. W związku z tym ustanowiono kilka eksperymentalnych metod in vivo i ex vivo do badania fototransdukcji w ogóle, a w szczególności poziomów fotopigmentu. Najprostsza metoda in-vivo wykorzystuje stosunkowo dużą pozakomórkowo zarejestrowaną odpowiedź napięciową na światło oka Drosophila. W związku z tym stymulacja światłem wywołuje elektryczną odpowiedź napięciową w całym oku, którą można zmierzyć za pomocą zapisu elektroretinogramu zewnątrzkomórkowego (ERG), który jest ~ 3 rzędy wielkości większy niż odpowiedź ERG na światło oczu kręgowców8,9. Odpowiedź Drosophila ERG jest solidna i łatwa do uzyskania, co czyni ją wygodną metodą identyfikacji nieprawidłowości w odpowiedzi na światło spowodowane mutacjami. Reakcja ERG na światło wynika głównie z fotoreceptorów, komórek barwnikowych (glejowych) i wtórnych neuronów blaszki (patrz Ryc. 1B). Głównymi składnikami ERG są (i) zewnątrzkomórkowa odpowiedź napięciowa fotoreceptorów, (ii) stany przejściowe "włączone" i "wyłączone" na początku i na końcu bodźca świetlnego, które powstają z neuronów blaszki (Rysunek 2A, wstawka, ON, OFF), (iii) powolna odpowiedź komórek glejowych (Rysunek 2A, wstawka, strzałki) oraz (iv) krótka i przejściowa odpowiedź, wynikająca z przemieszczenia ładunku podczas aktywacji fotopigmentu, która poprzedza ON transient10 (Rysunek 2C [wstawka], D, E). Ta krótka odpowiedź składa się z dwóch faz (M1 i M2, Rysunek 2C [wstawka]) i może być wywołana tylko przez niezwykle silną stymulację światłem, która aktywuje jednocześnie miliony cząsteczek fotopigmentu. Nie obserwuje się go ani pod niebieską stymulacją (Rysunek 2D, niebieski ślad), ani u mutantów o wysoce obniżonym poziomie fotopigmentu (Rysunek 2E, czerwony ślad), ale jego amplituda jest nieznacznie zwiększona w mutancie, który znosi aktywność PLC (Rysunek 2E, pomarańczowy ślad). Faza M1 jest typowym ERP muchy powstającym w wyniku aktywacji M w fotoreceptorach. Faza M1, która ma dodatnią polaryzację (wewnątrzkomórkowo), uwalnia neuroprzekaźnik w normalny sposób w synapsie odwracającej znaki i aktywuje neurony blaszki, które reagują na depolaryzację fotoreceptorów, generując synaptycznie amplifikowaną fazę M2. Tak więc zarówno faza M1, jak i M2 odzwierciedlają aktywację M10,11.

Depolaryzacja fotoreceptora generuje stan przejściowy "on" dodatni dla rogówki, wynikający z synapsy odwracającej znak między aksonem fotoreceptora a neuronami monopolarnymi blaszki10,11 (Rysunek 1B). Powolny wzrost i zanik ERG wynika z depolaryzacji komórek pigmentowych (Rysunek 2A, wstawka, strzałki) głównie z powodu wypływu K+ z komórek fotoreceptorowych12 przez kanały przejściowego potencjału receptora (TRP) i TRP podobne (TRPL)13,14,15. Te powolne komponenty kinetyczne w dużej mierze maskują i zniekształcają przebieg odpowiedzi fotoreceptora w porównaniu z wewnątrzkomórkowymi lub całokomórkowymi zapisami odpowiedzi fotoreceptora na światło9,10. Dodatkowo, przy bardzo silnym oświetleniu, można zaobserwować dodatkową reakcję przejściową, która poprzedza i częściowo łączy się z fazą przejściową "włączoną" (Rysunek 2C [wstawka],D,E). Sygnał ten pochodzi bezpośrednio z masywnej aktywacji fotopigmentu10.

Kilka protokołów reżimu świetlnego wykorzystujących neutralną gęstość (ND) i filtry kolorów, a także silne błyski rozświetlające, zostały opracowane w celu ogólnego zbadania oka, a kaskady fototransdukcji w szczególności. Protokoły te zostały również wykorzystane do zbadania właściwości fotopigmentu.

Protokół intensity-response mierzy szczytową amplitudę napięcia ERG całego oka na rosnące natężenie światła (Rysunek 2A,B). Protokół ten pomaga w wykrywaniu zmian we wrażliwości komórek fotoreceptorów na światło9.

Protokół przedłużonego depolaryzacji potencjału (PDA) wykorzystuje różnice w widmach absorpcji rodopsyny i metarodopsyny, co pozwala u Drosophila na masową konwersję fotopigmentu R do fizjologicznie aktywnego i ciemnego stabilnego pośredniego stanu M2. W odpowiedzi napięciowej ERG podawany jest stosunkowo krótki impuls nasyconego światła, a wynikowa odpowiedź napięciowa jest rejestrowana. W tym stanie pułap (potencjał odwrócenia) jest osiągany przez sygnał depolaryzacji, ponieważ aktywacja ułamka procenta ogromnej ilości cząsteczek rodopsyny (~1 x 108) jest wystarczająca, aby osiągnąć sufit. Obecność składników fototransdukcji w dużych ilościach zapewnia, że pułap ten zostanie osiągnięty nawet u mutantów ze znacznym spadkiem stężenia lub subtelnym nieprawidłowym funkcjonowaniem komponentów fototransdukcji. Sytuacja ta wyklucza izolację tych mutantów. Pak i in. wprowadzili PDA screening7 poszukując wiarygodnego i odkrywczego testu do izolacji wizualnych mutantów. U Drosophila odpowiedź PDA jest wywoływana przez genetyczne usunięcie czerwonego pigmentu przesiewowego, który umożliwia konwersję fotopigmentu, oraz zastosowanie niebieskiego światła, które jest preferencyjnie absorbowane przez rodopsynę (Rysunek 3A), a zatem powoduje dużą konwersję netto R do stanu fotopigmentu M. Zakończenie fototransdukcji jest zakłócone na poziomie fotopigmentu przez dużą konwersję netto R do M, co z kolei skutkuje trwałym wzbudzeniem długo po wyłączeniu światła (Rysunek 2C, Rysunek 4A [góra]). W okresie PDA fotoreceptory są mniej wrażliwe na kolejne światła testowe i są częściowo odczulone (dezaktywowane). PDA wykrywa nawet drobne defekty w biogenezie rodopsyny i testuje maksymalną zdolność komórki fotoreceptorowej do utrzymania pobudzenia przez dłuższy czas. Ponieważ jest ściśle zależny od obecności wysokich stężeń rodopsyny, łatwo ocenia niedostateczne uzupełnianie składników fototransdukcji. Co ciekawe, ekran PDA przyniósł wiele nowych i bardzo ważnych mutantów wizualnych (recenzowane w Pak et al.7). Tak więc mutanty PDA wyizolowane przez Pak et al.7 są nadal niezwykle przydatne do analizy układu wzrokowego Drosophila.

PDA jest indukowane u Drosophila przez nasycenie niebieskiego światła, co skutkuje ciągłą depolaryzacją długo po przesunięciu światła (Rysunek 4A [góra]). Po nasyceniu niebieskiego światła indukującego PDA, fotoreceptory obwodowe (R1-6) pozostają stale aktywne w ciemności ze swoją maksymalną wydajnością, osiągając nasycenie. Dodatkowe nasycone niebieskie światła podczas PDA nie wywołują żadnej dodatkowej odpowiedzi w komórkach R1-6 przez wiele sekund, ale indukują odpowiedź w komórkach R7-8, która jest nakładana na PDA. Nałożone na siebie odpowiedzi są wyjaśnione przez różne widma absorpcyjne fotopigmentów wyrażonych w tych komórkach (R7-8)16. PDA może być stłumiony przez fotokonwersję M z powrotem do R z nasycającym pomarańczowym światłem (Rysunek 4A [góra]). Zdolność PDA do doprowadzenia komórek fotoreceptorów do ich maksymalnej zdolności aktywnej, czego nie można osiągnąć za pomocą intensywnego białego światła, wyjaśnia, dlaczego jest to główne narzędzie do badań przesiewowych w kierunku wizualnych mutantów Drosophila. Dzieje się tak dlatego, że pozwala na wykrycie nawet drobnych defektów w białkach biorących udział w biogenezie prawidłowych poziomów fotopigmentu17,18. Wyizolowano dwie grupy mutantów z wadami PDA: mutanty ani mutanty inaktywacyjne, ani popotencjałowe (nina) oraz mutanty inaktywowane, ale nie popotencjałowe (ina). Fenotypem tego pierwszego jest brak PDA i związana z tym inaktywacja wynikająca z dużego obniżenia poziomu fotopigmentu (Rysunek 4A [środek]). Fenotyp tego ostatniego wykazuje inaktywację, ale nie ma ciemnej depolaryzacji po niebieskim świetle z powodu wciąż nieznanego mechanizmu w mutancie z normalnym poziomem rodopsyny, ale pozbawionym białek oddziałujących z kanałami TRP (Figura 4A [na dole]).

PDA wynika z różnicy w ilości fotopigmentu w stosunku do aresztyny (ARR2), która wiąże i kończy aktywność M19,20,21 (Rysunek 1A). W fotoreceptorach Drosophila ilość fotopigmentu jest około pięciokrotnie większa niż ilość ARR219. Tak więc poziomy ARR2 są niewystarczające do dezaktywacji wszystkich cząsteczek M generowanych przez dużą fotokonwersję netto R do M, pozostawiając nadmiar M stale aktywny w ciemności17,19,20,22,23. Mechanizm ten wyjaśnia eliminację odpowiedzi PDA przez mutacje lub deprywację karotenoidów24,25, powodując obniżenie poziomu fotopigmentu, ale nie wpływa na poziom aresztyny. Co więcej, wyjaśnienie to uwzględnia również fenotypy zmutowanego allelu mutanta ARR2 (arr23) mutant allelu21, w którym PDA można osiągnąć przy ~10-krotnym ściemnianiu niebieskiego światła19,20,21 (Rysunek 4B,C). PDA nie jest unikalną cechą fotoreceptorów much i pojawia się u każdego badanego gatunku, który ma ciemne stabilne M o widmie absorpcyjnym innym niż w stanie R, co pozwala na wystarczającą fotokonwersję fotopigmentu ze stanu R do stanu M. Dokładnie zbadanym gatunkiem, u którego odkryto fenomenologię PDA, jest fotoreceptor pąkli (Balanus), w którym widmo absorpcyjne stanu R jest na większej długości fali niż stan M2 (Ryc. 3B). W związku z tym, w przeciwieństwie do sytuacji w muchy, w pąkli pomarańczowo-czerwone światło indukuje PDA, podczas gdy niebieskie światło tłumi PDA2.

Protokół wczesnego potencjału receptorowego (ERP) wykorzystuje przemieszczenie ładunku występujące podczas aktywacji R lub M. Pigment wizualny jest integralną częścią błony powierzchniowej przedziału sygnalizacyjnego zarówno błon kręgowców, jak i bezkręgowców3. W związku z tym procesowi aktywacji, w którym cząsteczki fotopigmentu przechodzą z jednego stanu pośredniego w drugi, towarzyszy przemieszczenie ładunku4,26. Ponieważ cząsteczki fotopigmentu są elektrycznie wyrównane równolegle z pojemnością błony4, szybka zsynchronizowana zmiana konformacyjna generuje szybką zmianę polaryzacji błony powierzchniowej, która u much zachodzi w przedziale sygnalizacyjnym złożonym ze stosu ~ 30 000-50 000 mikrokosmków zwanych rabdomere. Ta polaryzacja następnie rozładowuje się pasywnie przez pojemność błony ciała komórki, aż błona komórkowa zostanie równomiernie spolaryzowana. ERP to zewnątrzkomórkowy zapis przemieszczenia ładunku. Wewnątrzkomórkowy zapis ERP manifestuje zewnątrzkomórkowy ERP zintegrowany przez stałą czasową błony komórkowej4,27,28. Prąd aktywowany przez wizualne przemieszczenie ładunku pigmentu można również zmierzyć w nagraniach cęgów napięcia całego ogniwa29,30 (Rysunek 5A-D), z główną zaletą (we wczesnych zapisach prądu receptora (ERC)) minimalizacją wpływu pojemności membrany na kinetykę sygnału.

Sekcja protokołu opisuje, jak wykonywać pomiary ERG z Drosophila eye9 oraz pomiary ERC na podstawie zapisów całokomórkowych z izolowanej ommatidii Drosophila31,32. Opisujemy również konkretne protokoły, które są używane do badania fototransdukcji w ogóle, a fotopigmentów w szczególności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Pomiar zależności między intensywnością reakcji, przedłużonym depolaryzacyjnym potencjałem (PDA) i wczesnym potencjałem receptorowym (ERP) za pomocą elektroretinogramu

  1. Odpowiednie warunki chowu dla preparatu D. melanogaster
    1. Muchy hodowlane D. melanogaster w butelkach zawierających standardową żółtą kukurydzę zawierającą pokarm w inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 24 °C i w 12-godzinnym cyklu ciemnym/jasnym
    2. Butelki z muchami należy przechowywać w ciemności co najmniej 24 godziny przed eksperymentem.
  2. Konfiguracja ogólna
    1. Przygotuj pipety rejestrujące, pociągając za kapilary ze szkła borokrzemianowego o wymiarach 1 mm x 0,58 mm (OD x ID) wypełnione włóknami (Rysunek 6L, O). Rezystancja pipet powinna wynosić 5-10 MΩ; Można użyć dowolnego odpowiedniego ściągacza.
    2. Pokryj dwa srebrne przewody AgCl2, wkładając srebrny drut 0,25 mm do roztworu 3 M KCl podłączonego do niestandardowego zasilacza 5 V.
    3. Włóż każdy powlekany srebrny drut do uchwytów elektrod (Rysunek 6N).
    4. Napełnij szklaną kapilarnę przefiltrowanym roztworem Ringera (patrz Tabela 1) za pomocą strzykawki z wydłużoną końcówką (Rysunek 6M).
    5. Włóż drut elektrodowy do szklanej kapilary. Upewnij się, że roztwór w kapilarze styka się ze srebrnym drutem.
    6. Włóż uchwyty elektrod (Rysunek 7P, N) do dwóch mikromanipulatorów elektrod (Rysunek 7G).
  3. Procedura przygotowania muchy do nagrań elektrycznych
    UWAGA: Aby utrzymać muchę w warunkach przystosowanych do ciemności, podczas wykonywania poniższych czynności używaj tylko słabego oświetlenia światłem czerwonym.
    1. Znieczulić muchy w butelce gazem CO2 za pomocą systemu do podkładów (Rysunek 6A, B) i wlać je do pojemnika do podkładu.
    2. Wybierz jedną muchę i ostrożnie trzymaj ją za skrzydło za pomocą ostrej pęsety. Przykryj resztę much szalką Petriego.
    3. Umieść muchę na uchwycie muchy we właściwej orientacji - leżąc na boku, tyłem do dłoni (Rysunek 6P).
    4. Włącz zasilanie lutownicy. Ustaw prąd na ~2,25 A. Prąd ten powinien podgrzać żarnik platynowo-irydowy o średnicy 0,25 mm do ~55-56 °C (patrz plik uzupełniający).
    5. Umieść kroplę wosku o niskiej temperaturze topnienia (~55-56 °C) na lutownicy (Rysunek 6F).
    6. Za pomocą pęsety podnieś muchę ze skrzydeł i przymocuj jej skrzydła do uchwytu na muchy (Rysunek 6I) za pomocą lutownicy.
    7. Za pomocą lutownicy połącz tył muchy z powierzchnią stojaka za pomocą wosku (Rysunek 6P).
    8. Opuść końcówkę lutownicy na punkt łączenia nóg i rozpuść wosk, aby pokryć wszystkie nogi razem (Rysunek 6P).
    9. Umieść małą kroplę wosku między głową a plecami w okolicy szyi (Rysunek 6P).
      UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność, aby uniknąć przegrzania głowicy muchy. Upewnij się, że mucha jest prawidłowo zamocowana i nie jest w stanie się poruszać podczas eksperymentu; Drobne ruchy mogą powodować powstawanie artefaktów w nagraniach. Upewnij się, że otwory tchawicy (wloty oddechowe) w klatce piersiowej i jamie brzusznej nie są pokryte woskiem.
    10. Umieść uchwyt na muchy (Rysunek 7Q) w ciemnej klatce Faradaya na bloku magnetycznym (Rysunek 7I) i upewnij się, że mucha znajduje się ~5 mm od końca światłowodu (Rysunek 7L).
    11. Umieść elektrodę rejestrującą (Rysunek 7P) nad okiem muchy, a elektrodę uziemiającą (Rysunek 7N) nad górną częścią pleców muchy za pomocą mikromanipulatorów.
    12. Włóż elektrodę uziemiającą do tylnej części muchy za pomocą mikromanipulatorów.
    13. Włożyć elektrodę rejestrującą w zewnętrzny brzeg oka muchy, najlepiej za pomocą mikromanipulatorów.
      UWAGA: Po włożeniu elektrody do oka zaobserwuje się małe wgłębienie; Pociągnij elektrodę do góry, nie wyjmując jej z oka, aż wgłębienie zniknie. Elektrody można również zanurzać w małych kropelkach galaretki elektrodowej nakładanej na tułów i oko.
  4. Protokół intensywność-odpowiedź
    1. Umieść pomarańczowy filtr (filtr krawędziowy 590) przed wysokociśnieniową lampą ksenonową. Należy użyć dużego (sześć rzędów wielkości) tłumiącego filtra o neutralnej gęstości (ND).
    2. Odczekaj 60 s w ciemności i daj 5-sekundowy impuls świetlny.
    3. Wymień filtr ND na filtr ND o mniejszym tłumieniu w krokach co jeden rząd wielkości.
    4. Odczekaj 60 s w ciemności i daj drugi 5-sekundowy impuls świetlny
      5. .
    5. Powtórz kroki 1.4.1.-1.4.4, stopniowo zwiększając natężenie światła przy użyciu mniej tłumiących filtrów ND (ostatni impuls powinien być generowany bez żadnego filtra ND). Upewnij się, że używasz serii filtrów ND we właściwym kierunku, zaczynając od dużego tłumienia i osiągając niskie tłumienie.
  5. Protokół PDA (ten protokół może być wykonywany tylko na muchach białookich)
    1. Daj 5-sekundowy impuls świetlny o maksymalnym natężeniu za pomocą pomarańczowego filtra (filtr krawędziowy 590, aby przekształcić maksymalny fotopigment w stan R).
    2. Wymień pomarańczowy filtr na szerokopasmowy niebieski filtr (BP450/40 nm) i daj trzy 5-sekundowe impulsy świetlne o maksymalnej intensywności.
      UWAGA: Możliwe jest również podanie długiego, ciągłego impulsu światła niebieskiego o maksymalnej intensywności, aż do osiągnięcia napięcia w stanie ustalonym.
    3. Odczekaj 60 s w ciemności, wymień niebieski filtr na poprzedni pomarańczowy filtr i daj dwa 5-sekundowe impulsy świetlne w odstępach 60 s.
  6. Protokół ERP/M-potencjał do pomiaru widma fotorównowagi M (ten protokół może być wykonywany tylko na muchach białooki10,25)
    1. Daj ciągły niebieski impuls świetlny (pasmowoprzepustowy (BP) 450/40 nm) aż do osiągnięcia odpowiedzi napięciowej w stanie ustalonym, która przekształca maksymalną ilość fotopigmentu ze stanu R do stanu M komórek R1-6.
    2. Daj krótki (<3 ms) intensywny błysk światła o długości fali między 350-700 nm (znane widmo absorpcyjne fotopigmentu komórek R1-6) przy użyciu wąskich (~20 nm) filtrów pasmowoprzepustowych i zmierz szczytową amplitudę fazy M1 odpowiedzi potencjału M (która odzwierciedla absorpcję metarodopsyny przy tej określonej długości fali w fotorównowadze10,25).
      UWAGA: Do synchronicznej aktywacji dużej puli cząsteczek fotopigmentu wymagany jest krótki, intensywny błysk światła, aby zawartość fotonów została upakowana w krótkim czasie. Potencjał M składa się z dwóch składników: M1 (ujemna faza rogówki), która odzwierciedla przemieszczenie ładunku metarodopsyny w fotoreceptorze, oraz M2 (dodatnia faza rogówki11,33), który odzwierciedla wzmocnioną odpowiedź M1 fotoreceptorów w blaszce9,10,11. Każdy z tych elementów można zidentyfikować i zmierzyć. Jednak lepiej jest mierzyć potencjał M1, ponieważ jest to bezpośrednia liniowa manifestacja poziomów M. Jeśli używany jest M2, upewnij się, że jego amplituda mieści się w zakresie liniowym, używając łagodnej deprywacji karotenoidów24,25.
    3. Ponownie daj ciągły niebieski impuls świetlny (BP450/40 nm), po którym następuje krótki (<1 ms) intensywny błysk światła o innej długości fali.
    4. Powtarzaj ten protokół, aż całe widmo absorpcyjne M w stanie równowagi foto zostanie pokryte.

2. Protokół ERC do pomiaru spektrum działania stanów R i M komórek R1-6 przy użyciu zapisów cęgowych napięcia całego ogniwa

UWAGA: Szczegółowy protokół korzystania z nagrań cęgowych całego ogniwa można znaleźć w Katz et al.34. Potencjał M wykorzystuje ERG do pomiaru aktywacji stanu M tylko dlatego, że wkład stanu R jest tłumiony przez pojemność membrany. W przeciwieństwie do tego, ERC mierzy aktywację zarówno stanów R (dodatni ERC), jak i M (ujemny ERC), ponieważ zapisy napięcia cęgowego usuwają efekt pojemności membrany (patrz wprowadzenie).

  1. Przekształć fotopigment do żądanego stanu (R lub M). W przypadku konwersji R na M, najpierw dostosuj muchy za pomocą krótkiego (<1 ms) adaptacyjnego niebieskiego (BP450/40 nm) błysku. W przypadku konwersji M na R daj krótki adaptacyjny pomarańczowy błysk (filtr krawędziowy OG590).
  2. Daj krótki błysk świetlny (<1 ms) o długości fali od 350 do 700 nm i zmierz maksymalną ujemną lub dodatnią amplitudę odpowiedzi ERBN, która odzwierciedla absorpcję M/R przy tej określonej długości fali.
    UWAGA: Do synchronicznej aktywacji dużej puli cząsteczek fotopigmentu wymagany jest krótki, intensywny błysk światła, aby upakować zawartość fotonów w krótkim czasie. Maksymalna konwersja fotopigmentu z R do M przez niebieski błysk może osiągnąć ~ 80% całkowitych cząsteczek fotopigmentu ze względu na nakładanie się widma absorpcji R i M (Rysunek 3A). Dlatego przy długościach fal poniżej ~550 nm ERC ma dwa składniki: fazę ujemną, która odzwierciedla odpowiedź metarodopsyny, oraz fazę dodatnią, która odzwierciedla odpowiedź pozostałej rodopsyny. ERC zależy liniowo od natężenia światła (Rysunek 5D). W związku z tym, aby wyprowadzić czułość spektralną stanów R i M, każda faza ERC musi być znormalizowana na różnych długościach fal dla równej energii29.
  3. Powtórz kroki 2.1.-2.2., używając błysków o różnych długościach fal.
  4. Wykreśl znormalizowane dodatnie i ujemne ERC w funkcji długości fali.
    UWAGA: Silny błysk światła indukuje ogromny prąd przez kanały wrażliwe na światło, prowadząc do stresu metabolicznego w fotoreceptorze, co z kolei powoduje otwarcie kanału niezależnego od światła. Na ten konstytutywny prąd nakłada się ERBN.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rycina 2 obrazuje niezawodność i łatwość stosowania techniki ERG. Jest ona niezawodna, ponieważ pomiary są rejestrowane u praktycznie nienaruszonej muchy za pomocą prostej metody pozakomórkowych pomiarów napięcia, która wymaga jedynie podstawowego zestawu elektrofizjologicznego. Niezawodność ta przejawia się w uzyskiwaniu zapisów odpowiedzi na światło o stosunkowo dużych amplitudach (w zakresie miliwoltów), nawet gdy mutacje silnie redukują lub zniekształcają tę odpowiedź. Dzięki temu nawet ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Główną zaletą stosowania preparatu fotoreceptorów Drosophila jest jego dostępność, łatwość i dokładność stymulacji światłem, a przede wszystkim możliwość zastosowania mocy genetyki molekularnej7. Szeroko zakrojone badania genetyczne ustaliły, że Drosophila jest niezwykle użytecznym systemem modelowym do genetycznej analizy złożonych procesów biologicznych7. Stosunkowo prosta struktura genomu Drosophila (składającego się tylko z czterech chromosomó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez granty z Izraelskiej Fundacji Naukowej (ISF) oraz Amerykańsko-Izraelskiej Dwunarodowej Fundacji Naukowej (BSF). Dziękujemy Panu Anatolijowi Szapochnikowowi za konstrukcję podgrzewacza z żarnika woskowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 1 ml z wydłużoną końcówkąRysunek 6M
1 szorstka pęsetaDumont #5, Standard0,1 mm x 0,06 mm, długość 110 mm, Inox (Rysunek 6H)
2 soczewki kondensatora
Przetwornik A/DUrządzenie molekularneDigidata 1200Możliwa zamiana: dowolne dane cyfrowe z urządzeń molekularnych (np. 1440A) -Rysunek 7C
WzmacniaczPrawie idealna elektronikaMożliwa wymiana: instrumenty Warner - IE251A lub IE-210 (w zestawie ze sceną główną) - Rysunek 7D
Stół antywibracyjnyNewportVW-3036-OPT-01Rysunek 7H
KapilaryHarvard AparatKapilary ze szkła borokrzemianowego1 mm x 0,58 mm (Rysunek 6O)
OprogramowanieurządzeniaClampex
CO2
Źródło zimnego światłaSchottKL1500 LCDRysunek 6C
Delikatne wycieraczkiKimtech Kimwipes(Rysunek 6K)
UchwytNadaje się do kapilarnej średnicy zewnętrznej 1 mm (Rysunek 6N, Rysunek 7N i Rysunek 7P)
Klatka FaradayaDomowa robotaElektromagnetyczna osłona przeciwhałasowa i kurtyna przednia (Rysunek 7K)
Filtr (kolor)SchottOG590, filtr krawędziowyRysunek 7S
Filtr (kolor)SchottBP450/40 nmRysunek 7S
Filtr (kolor)Blazers550 nmRysunek 7S Filtr
(kolor) dla źródła zimnego światłaSchottRG630Rysunek 6C
Filtr (ciepło)SchottKG3Rysunek 7S Filtry
(neutralne filtr gęstości)Chroma6,5,4,3,2,1,0,5,0,3Rysunek 7S
System lamp błyskowychHoneywellRysunek 7U
System podkładów muchowych z wtryskiwaczemInject + maticRysunek 6A-B
Zasilacz lampyPTILPS-220Rysunek 7W
Detektor światłaFototranzystor domowej roboty(rysunek 7O)
ŚwiatłowódŚrednica 3 mm, długość 1,3 m (Rysunek 7L,M)
ŹródłoWysokociśnieniowa, wolna od ozonu lampa ksenonowa o mocy 75 W (działająca na 50 W), możliwa wymiana: Badania Cairn - OptoLED (Rysunek 7R)
Wosk topliwy w niskiej temperaturzeDomowej robotySkłada się z mieszaniny wosku pszczelego (Tm≈ 62 &stopnie; C) i parafina w stosunku ~3:1, aby osiągnąć temperaturę topnienia ~55– 56 &stopni; C (Rysunek 6J)
Stojak magnetyczny na muchyDomowej robotyRysunek 6I i Rysunek 7Q
przedwzmacniacza mikroelektrodowego ze stopniem czołowymPrawie doskonała elektronikaTester impedancji (rysunek 7G)
Mikromanipulator (mechaniczny zgrubny)Tritech Research, NarishigeM-2
Mikromanipulator (mechaniczny drobny)Leitz MicrosystemsLeitz Mikromanipulator mechanicznyRysunek 7F
pCLAMPOprogramowaniemolekularnego
szalka60 mm
Generator impulsówAMPIMaster 8Rysunek 7A
Krem Redux do elektrokardiografiiParker LaboratoriesRedux Elektrolit Crè me
Sterownik migawkiUniblitz, Vincent AssociatesVCM-D1 Jednokanałowy Uni-stabilnyRysunek 7V
System żaluzjiUniblitz, Vincent AssociatesLS2 2 mm Niestabilne żaluzjeRysunek 7V
Srebrny drutWarner Instruments0.25– Średnica 1 mm, musi być chlorowana
Lutownica złożona z włóknaśrednicy 0,25 mm (Rysunek 6F)
Mikroskop stereoskopowy z zoomemNikonSMZ-2BRysunek 6D
Mikroskop stereoskopowyWildWild M5Z ustawieniami powiększenia 6, 12, 25 i 50 (Rysunek 7E)
Filtry strzykawkoweMillex22 i mikro; m Filtr PVDF
Pionowy ściągacz do pipetSutter / NarishigeModel P-97 / PP-830Użyj ściągacza pionowego lub poziomego, w zależności od preferencji (Rysunek 6L)
Podgrzewacz filamentu woskowegoDomowej robotyZobacz rysunek S1 (Rysunek 6E-G)
System ksenonowej lampy błyskowejDr. Rapp OptoElectronicJML-C2Rysunek 7X
molekularnego elektrody światła System urządzenia Petriego platynowo-irydowego o

Bibliografia

  1. Vogt, K., Kirschfeld, K. Chemical identity of the chromophores of fly visual pigment. Naturwissenschaften. 77, 211-213 (1984).
  2. Hillman, P., Hochstein, S., Minke, B. Transduction in invertebrate photoreceptors: role of pigment bistability. Physiological Reviews. 63 (2), 668(1983).
  3. Hamdorf, K. Handbook of Sensory Physiology. Comparative Physiology and Evolution of Vision in Invertebrates. Autrum, H. 7, Springer-Verlag. 145-224 (1979).
  4. Gagné, S., Roebroek, J. G., Stavenga, D. G. Enigma of early receptor potential in fly eyes. Vision Research. 29 (12), 1663-1670 (1989).
  5. Pak, W. L., Shino, S., Leung, H. T. PDA (prolonged depolarizing afterpotential)-defective mutants: the story of nina's and ina's--pinta and santa maria, too. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 216-237 (2012).
  6. Wang, X., Wang, T., Jiao, Y., von, L. J., Montell, C. Requirement for an enzymatic visual cycle in Drosophila. Current Biology. 20 (2), 93-102 (2010).
  7. Pak, W. L. Drosophila in vision research. The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).
  8. Pak, W. L. Neurogenetics, Genetic Approaches to the Nervous System. Breakfield, X. , Elsevier, North-Holland. 67-99 (1979).
  9. Minke, B. Light-induced reduction in excitation efficiency in the trp mutant of Drosophila. The Journal of General Physiology. 79, 361-385 (1982).
  10. Minke, B., Kirschfeld, K. Fast electrical potentials arising from activation of metarhodopsin in the fly. The Journal of General Physiology. 75 (4), 381-402 (1980).
  11. Stephenson, R. S., Pak, W. L. Heterogenic components of a fast electrical potential in Drosophila compound eye and their relation to visual pigment photoconversion. The Journal of General Physiology. 75 (4), 353-379 (1980).
  12. Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (15), 5748-5755 (2000).
  13. Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
  14. Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
  15. Phillips, A. M., Bull, A., Kelly, L. E. Identification of a Drosophila gene encoding a calmodulin-binding protein with homology to the trp phototransduction gene. Neuron. 8, 631-642 (1992).
  16. Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induced response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. Journal of Comparative Physiology. 98, 345-355 (1975).
  17. Selinger, Z., Doza, Y. N., Minke, B. Mechanisms and genetics of photoreceptors desensitization in Drosophila flies. Biochimica et Biophysica Acta. 1179, 283-299 (1993).
  18. Minke, B. The history of the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) and its role in genetic dissection of Drosophila phototransduction. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 106-117 (2012).
  19. Satoh, A. K., et al. Arrestin translocation is stoichiometric to rhodopsin isomerization and accelerated by phototransduction in Drosophila photoreceptors. Neuron. 67 (6), 997-1008 (2010).
  20. Byk, T., Bar Yaacov, M., Doza, Y. N., Minke, B., Selinger, Z. Regulatory arrestin cycle secures the fidelity and maintenance of the fly photoreceptor cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1907-1911 (1993).
  21. Dolph, P. J., et al. Arrestin function in inactivation of G protein-coupled receptor rhodopsin in vivo. Science. 260, 1910-1916 (1993).
  22. Belusic, G., Pirih, P., Stavenga, D. G. Photoreceptor responses of fruitflies with normal and reduced arrestin content studied by simultaneous measurements of visual pigment fluorescence and ERG. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 196 (1), 23-35 (2010).
  23. Stavenga, D. G., Hardie, R. C. Metarhodopsin control by arrestin, light-filtering screening pigments, and visual pigment turnover in invertebrate microvillar photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 197 (3), 227-241 (2011).
  24. Stark, W. S., Zitzmann, W. G. Isolation of adaptation mechanisms and photopigment spectra by vitamin A deprivation. Journal of Comparative Physiology. 105, 15-27 (1976).
  25. Minke, B., Kirschfeld, K. The contribution of a sensitizing pigment to the photosensitivity spectra of fly rhodopsin and metarhodopsin. The Journal of General Physiology. 73, 517-540 (1979).
  26. Cone, R. A., Cobbs, W. H. Rhodopsin cycle in the living eye of the rat. Nature. 221 (5183), 820-822 (1969).
  27. Murakami, M., Pak, W. L. Intracellularly recorded early receptor potential of the vertebrate photoreceptors. Vision Research. 10 (10), 965-975 (1970).
  28. Hodgkin, A. L., Obryan, P. M. Internal recording of the early receptor potential in turtle cones. The Journal of Physiology. 267 (3), 737-766 (1977).
  29. Yasin, B., et al. Ectopic expression of mouse melanopsin in Drosophila photoreceptors reveals fast response kinetics and persistent dark excitation. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3624-3636 (2017).
  30. Hardie, R. C. Photolysis of caged Ca 2+ facilitates and inactivates but does not directly excite light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 15, 889-902 (1995).
  31. Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing Papers of a Biological Character. Royal Society (Great Britain). 245, 203-210 (1991).
  32. Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium-dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
  33. Pak, W. L., Lidington, K. J. Fast electrical potential from a long-lived, long-wavelength photoproduct of fly visual pigment. The Journal of General Physiology. 63 (6), 740-756 (1974).
  34. Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R. C., Minke, B. Electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627(2017).
  35. Selinger, Z., Minke, B. Inositol lipid cascade of vision studied in mutant flies. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 53, 333-341 (1988).
  36. Minke, B., Kirschfeld, K. Microspectrophotometric evidence for two photoconvertible states of visual pigments in the barnacle lateral eye. The Journal of General Physiology. 71, 37-45 (1978).
  37. Ranganathan, R., Harris, W. A., Zuker, C. S. The molecular genetics of invertebrate phototransduction. Trends in Neurosciences. 14, 486-493 (1991).
  38. Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. The Journal of Physiology. 524, 179-194 (2000).
  39. Dimitracos, S. A., Tsacopoulos, M. The recovery from a transient inhibition of the oxidative metabolism of the photoreceptors of the drone (Apis mellifera). Journal of Experimental Biology. 119, 165-181 (1985).
  40. Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca 2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wczesny potencja receptorowyprzed u ony depolaryzuj cy potencja p nyrejestracja elektroretinogramurejestracja whole cellmutanty fototransdukcjirodopsynametarodopsynaprzesiew genetyczny
Elektrofizjologiczne metody pomiaru poziomu fotopigmentu w fotoreceptorach Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.