Amplifikacja Escherichia coli w chipie mikroprzepływowym Continuous-Flow-PCR i jego wykrywanie za pomocą systemu elektroforezy kapilarnej

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak zbudować system łańcucha polimerazy o ciągłym przepływie oparty na mikroprzepływowym chipie i jak zbudować system elektroforezy kapilarnej w laboratorium. Przedstawiono w nim prostą metodę analizy kwasów nukleinowych w laboratorium.

Streszczenie

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to tradycyjna metoda stosowana do amplifikacji docelowego genu, który odegrał ważną rolę w diagnostyce biomolekularnej. Jednak tradycyjny PCR jest bardzo czasochłonny ze względu na wydajność zmienności w niskiej temperaturze. W niniejszej pracy zaproponowano system PCR Z CIĄGŁYM PRZEPŁYWEM (CF-PCR) oparty na chipie mikroprzepływowym. Czas amplifikacji można znacznie skrócić, wprowadzając roztwór PCR do mikrokanalika umieszczonego na grzejnikach ustawionych na różne temperatury. Ponadto, ponieważ elektroforeza kapilarna (CE) jest idealnym sposobem różnicowania dodatnich i fałszywie dodatnich produktów PCR, zbudowano system CE, aby osiągnąć skuteczną separację fragmentów DNA. W artykule opisano proces amplifikacji Escherichia coli (E. coli) przez zbudowany we własnym zakresie system CF-PCR oraz detekcję produktów PCR przez CE. Wyniki pokazują, że docelowy gen E. coli został pomyślnie amplifikowany w ciągu 10 minut, co wskazuje, że te dwa systemy mogą być wykorzystywane do szybkiej amplifikacji i wykrywania kwasów nukleinowych.

Wprowadzenie

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to technika biologii molekularnej używana do amplifikacji określonych fragmentów DNA, a tym samym do amplifikacji śladowych ilości DNA setki milionów razy. Jest szeroko stosowany w diagnostyce klinicznej, badaniach medycznych, bezpieczeństwie żywności, identyfikacji sądowej i innych dziedzinach. Proces PCR składa się głównie z trzech etapów: denaturacji w temperaturze 90-95 °C, wyżarzania w temperaturze 50-60 °C i przedłużania w temperaturze 72-77 °C. Cykle termiczne są ważną częścią procesu PCR; jednak tradycyjny termocykler PCR jest nie tylko nieporęczny, ale także niewydajny, wymaga około 40 minut na wykonanie 25 cykli. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, zbudowano system PCR O CIĄGŁYM PRZEPŁYWIE (CF-PCR), oparty na chipie mikroprzepływowym. CF-PCR może znacznie zaoszczędzić czas, wprowadzając roztwór PCR do mikrokanalików umieszczonych na grzejnikach w różnych temperaturach^1,2,3,4,5.

Ponieważ elektroforeza kapilarna (CE) ma wiele zalet, takich jak wysoka rozdzielczość, duża szybkość i doskonała odtwarzalność^6,7^,8,9,10,11, stał się popularnym narzędziem w laboratorium do analizy kwasów nukleinowych i białek. Jednak większość laboratoriów, zwłaszcza laboratoriów w krajach rozwijających się, nie może sobie pozwolić na tę technologię ze względu na wysoką cenę instrumentu CE. W tym artykule przedstawiliśmy protokoły wytwarzania chipa mikroprzepływowego CF-PCR i budowania wszechstronnego systemu CE w laboratorium. Demonstrujemy również proces amplifikacji E. coli przez ten system CF-PCR oraz wykrywanie produktów PCR przez system CE. Postępując zgodnie z procedurami opisanymi w tym protokole, użytkownicy powinni być w stanie wytworzyć chipy mikroprzepływowe, przygotować roztwory PCR, zbudować system CF-PCR do amplifikacji kwasów nukleinowych i skonfigurować prosty system CE, nawet przy ograniczonych zasobach, do separacji fragmentów DNA.

Protokół

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, odczynników i sprzętu użytego w tym protokole.

1. Produkcja chipa mikroprzepływowego CF-PCR

1. Podgrzej wafel silikonowy w temperaturze 200 °C przez 25 minut, aby usunąć wilgoć.
2. Dozować 1 ml fotorezystu SU-8-2075 na cal płytki. Wirować na płytce krzemowej za pomocą powlekarki wirowej z prędkością 500 obr./min przez 5-10 s z przyspieszeniem 100 obr./min, a następnie z prędkością 2 000 obr./min przez 30 s z przyspieszeniem 500 obr./min/s.
3. Miękki wafel silikonowy pieczemy w temperaturze 65 °C przez 3 minuty, a następnie w temperaturze 95 °C przez 15 minut.
4. Ustaw 150 - 215 mJ/cm² jako energię ekspozycji dla maszyny fotolitograficznej i wygraweruj zaprojektowany wzór na fotorezyście za pomocą maski fotolitograficznej. Umieść wafel silikonowy i maskę gotowe do ekspozycji.
5. Po naświetleniu piecz wafel krzemowy w temperaturze 65 °C przez 2 minuty, a następnie w temperaturze 95 °C przez 7 minut.
6. Zanurz płytkę krzemową w roztworze wywoływacza, aby usunąć nadmiar fotorezystu i wyjmij go, gdy widoczne są mikrokanały (Rysunek 1). Użyj izopropanolu, aby spłukać pozostały roztwór wywoływacza.
7. Wymieszać prepolimer polidimetylosiloksanu (PDMS) i utwardzacz w stosunku 10:1. Wlać zmieszany roztwór PDMS do formy repliki i zestalić go w temperaturze 80 °C przez 60 minut.
8. Po aktywacji przymocuj chip mikroprzepływowy PDMS do szkiełka za pomocą myjki plazmowej i zestal je w temperaturze 80 °C przez 30 minut tak szybko, jak to możliwe (Rysunek 2).
   UWAGA: Wymiary zewnętrzne chipa to 80,0 mm × 30,0 mm × 0,4 mm. W chipie mikroprzepływowym znajduje się 40 kanałów serpentynowych (100 μm × 1,46 mm × 100 μm, szerokość × długość × głębokość).

2. Przygotowanie roztworu do PCR

1. Całkowicie rozmrozić odczynniki przed konfiguracją. Użyj mieszalnika wirowego i wirówki, aby upewnić się, że odczynniki są dobrze wymieszane.
2. Przygotuj probówkę wirówkową, dodając następujące składniki w następującej kolejności: 33,75 μl wody, 1,0 μl matrycy DNA, 0,5 μl startera, 5,0 μl buforu, 4,0 μl mieszaniny dNTP, 1,5 μl Tween 20, 3,5 μL PVP i na koniec 0,25 μl polimerazy DNA.
   UWAGA: W tym przypadku użytą matrycą DNA jest E. coli. Startery dla E. coli i składniki roztworu PCR są wymienione odpowiednio w Tabeli 1 i Tabeli 2.
3. Wymieszaj roztwór, wirując.

3. Budowa systemu CF-PCR

1. Przygotuj dwie grzałki ceramiczne o dodatnim współczynniku temperaturowym (PTC), dwa przekaźniki półprzewodnikowe, dwa regulatory temperatury PID, dwa czujniki temperatury i przewód zasilający.
   UWAGA: Rozmiar grzałek ceramicznych PTC zależy od wielkości chipa mikroprzepływowego; długość powinna być większa niż długość chipa - długość-szerokość-wysokość zastosowanych tutaj grzałek ceramicznych PTC wynosi 10 cm x 2 cm x 0,4 cm.
2. Podłącz grzałkę do przekaźnika półprzewodnikowego.
3. Podłącz przekaźnik półprzewodnikowy do regulatora temperatury PID.
4. Przymocuj sondę czujnika temperatury do dolnej części dwóch grzałek i podłącz zacisk do regulatora temperatury PID.
5. Podłącz szeregowo dwa przekaźniki półprzewodnikowe i podłącz przewód zasilający.
6. Wydrukuj w 3D szczelinę dla dwóch grzejników i utrzymuj grzejniki w tej samej płaszczyźnie (patrz plik uzupełniający 1 dla plików STL wymaganych do drukowania 3D).
   UWAGA: Pozostaw 12-milimetrową szczelinę powietrzną między dwoma grzejnikami.
7. Umieść chip mikroprzepływowy na dwóch grzejnikach.
8. Przygotuj pompę strzykawkową i strzykawkę, zamocuj strzykawkę na pompie strzykawkowej, połącz silikonową rurkę (średnica wewnętrzna 0,8 mm [ID]) ze strzykawką i podłącz stalową igłę (0,7 mm ID) do górnej części rurki silikonowej (Rysunek 3).
9. Włóż stalową igłę do wlotu chipa mikroprzepływowego.
10. Umieść końcówkę pipety na wylocie chipa, aby zebrać produkty PCR.

4. Budowa systemu CE

1. Użyj zasilacza wysokonapięciowego, aby wytworzyć pole elektryczne pola pulsacyjnego; zwróć uwagę na elektrody dodatnie i ujemne.
2. Użyj lampy rtęciowej jako źródła światła i przefiltruj długość fali wzbudzenia z lampy rtęciowej przez filtr.
3. Umieść kapilar na stoliku mikroskopu.
4. Zbierz emisję fluorescencji za pomocą obiektywu, a następnie wykryj ją za pomocą fotopowielacza R928 (PMT). Obserwuj mikroskop i kapilarę. Włącz światło w ciemnym pomieszczeniu; Światło wzbudzenia jest zbierane przez obiektyw.
5. Użyj samodzielnie opracowanego oprogramowania LABVIEW, aby sterować zasilaniem i zakończyć akwizycję danych (opisaną w krokach 6.3-6.6). Patrz https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi.
   UWAGA: Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone w ciemnym pomieszczeniu, a schemat systemu CE jest pokazany w Rysunek 4.

5. Uruchom rozwiązanie PCR

1. Ustawić temperaturę grzałek systemu CF-PCR na 65 °C i 95 °C.
2. Umieść chip mikroprzepływowy na dwóch blokach grzewczych.
3. Włożyć końcówkę silikonowej probówki do probówki wirówkowej zawierającej 50 μl roztworu do PCR (od kroku 2.3). Pociągnąć za tłok strzykawki, aby powoli pobrać roztwór. Zamocować strzykawkę na pompie strzykawkowej. Włóż stalową igłę do wlotu chipa mikroprzepływowego.
4. Ustaw natężenie przepływu pompy na 10 μl/min i naciśnij przycisk start, aby wepchnąć roztwór do mikrokanału na wlocie mikrochipa.
5. Zbierz produkty PCR na wylocie chipa mikroprzepływowego.
   UWAGA: Przepłucz kanał ultraczystą wodą przed i po PCR, aby usunąć zanieczyszczenia.

6. Wykrywanie produktów PCR przez ten system CE zbudowany we własnym

zakresie

1. Przygotuj kapilarnę o długości całkowitej 8 cm i długości efektywnej 6 cm.
2. Przygotować bufor separacyjny, mieszając 100 μl 1% hydroksyetylocelulozy (HEC, w/v), 2 μl 100x SYBR Green I i 98 μl ultraczystej wody, aby otrzymać 0,5% HEC (w/v) zawierającego 1x SYBR Green I.
3. Napełnić kapilarę przygotowanym buforem separacyjnym za pomocą pompy próżniowej.
4. Wprowadź napięcie wtrysku (800 V) i czas wtrysku (2,0 s) w interfejsie oprogramowania, kliknij przycisk start i poczekaj, aż produkty PCR zostaną elektrodynamicznie wprowadzone do kapilary przy napięciu 100 V/cm (2,0 s).
   UWAGA: Na tym etapie produkty PCR umieszcza się na elektrodzie ujemnej, a bufor umieszcza się na elektrodzie dodatniej.
5. Wprowadź napięcie stałe (800 V) do interfejsu oprogramowania, kliknij przycisk start i uruchom elektroforezę przy natężeniu pola elektrycznego 100 V/cm.
   UWAGA: Na tym etapie zarówno elektrody dodatnie, jak i ujemne są umieszczane z buforem.
6. Kliknij przycisk stop po oddzieleniu wszystkich fragmentów DNA w kapilarze.
7. Przepłukuj kapilarę wysterylizowaną wodą przez 1 minutę po każdym uruchomieniu.

Wyniki

Rysunek 5 przedstawia elektroferogram produktów PCR i markerów DNA. Ślad (Rysunek 5A) to wynik CE produktu amplifikowanego CF-PCR, ślad (Rysunek 5B) to wynik CE produktu wzmocnionego przez cykle termiczne, a ślad (Rysunek 5C) to wynik CE drabiny DNA 100 pz. Najpierw amplifikowaliśmy docelowy gen E. coli w systemie CF-PCR; roztwór PCR trwał ~10 minut, 30 s od wlotu do wylotu chipa. Wielkość docelowego amplikonu E. coli

Dyskusja

Zarówno PCR, jak i CE to dwie popularne biotechnologie w analizie kwasów nukleinowych. W artykule opisano amplifikację E. coli i wykrywanie produktów PCR przy użyciu systemów CF-PCR i CE, oba zbudowane we własnym zakresie. Docelowy gen E. coli został pomyślnie amplifikowany w ciągu 10 minut ze względu na wysokie szybkości wymiany ciepła. Fragmenty DNA mniejsze niż 1500 pz oddzielono w ciągu 8 minut (ryc. 5). Ogromną zaletą tych dwóch technik jest to, że mogą one znacznie za...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
100 pz drabinka DNA	Takara Bio Inc.	3422A
10x Szybki bufor I	Takara Bio Inc.	RR070A
10x TBE	Pekin Solarbio Nauka & Technologia Co., Sp. z o.o.	T1051
	Alfa Aesar, USA	L15459
mieszanina dNTP (2,5 μ M)	Takara Bio Inc.	RR070A
EC-F	Sangon Biotech, Szanghaj, Chiny
EC-R	Sangon Biotech, Szanghaj, Chiny
HEC, 1300K	Sigma-Aldrich, USA	9004-62-0
izopropanol	Aladdin, Szanghaj, Chiny	67-63-0
	mikroskop Olympus, Japonia	BX51
fotolitografia& nbsp;	SUSS MicroTec, Niemcy	MJB4
	Hamamatsu Photonics, Japonia	R928
fotorezystor	MicroChem, USA	SU-8 2075
Regulatory temperatury PID	Szanghaj, Chiny	XH-W2023
	Harrick Plasma	PDC-32G-2
poliwinylopirolidon (PVP)	Aladyn, Szanghaj, Chiny
	Aparatura Harvarda	PHD2000
rurki silikonowe	BIO-RAD,USA
przekaźniki półprzewodnikowe	KZLTD, Chiny	KS1-25LA
Polimeraza DNA SpeedSTAR HS 	Takara Bio Inc.	RR070A stalowa
igła	zhongxinqiheng, Suzhou, Chiny
SYBR ZIELONY	Solarbio, Pekin, Chiny	Czujniki temperatury SY1020
	EasyShining Technology, Chengdu, Chiny	TCM-M207
(E. coli)	Takara Bio Inc.	AK601
Tween 20	Aladdin, Szanghaj, Chiny	T104863
zasilacz napięciowy	Medina, Nowy Jork, Stany Zjednoczone	Trek Model 610E