Artykuł metodologiczny

Elastyczne organiczne urządzenia elektroniczne do terapii pulsacyjnym polem elektrycznym glejaka

5.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63527

⸱

9 sierpnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre CMP, Bioelectronics Department, Mines Saint-Etienne, 2Panaxium SAS, 3Institut Universitaire de France, 4Institut des Neurosciences de la Timone (UMR7289), CNRS, Aix-Marseille Université, 5Centre Européen de Recherche en Imagerie Médicale, Aix-Marseille Université

W tym artykule

Podsumowanie

Ta praca opisuje rozwój elastycznych elektrod międzypalcowych do implementacji w modelach 3D guzów mózgu, a mianowicie w hodowli in vitro, modelu in ovo i modelu mysim in vivo. Proponowana metoda może być wykorzystana do oceny wpływu pulsacyjnych pól elektrycznych na nowotwory na różnych poziomach złożoności.

Streszczenie

Glejak wielopostaciowy jest trudny do zwalczenia za pomocą standardowych terapii onkologicznych ze względu na jego wysoki stopień inwazyjności. Terapie bioelektryczne oparte na pulsacyjnym polu elektrycznym (PEF) są obiecujące dla poprawy skuteczności leczenia. Opierają się jednak na sztywnych elektrodach, które powodują ostre i przewlekłe uszkodzenia, zwłaszcza w tkankach miękkich, takich jak mózg. W tej pracy wykorzystano elastyczną elektronikę do dostarczania PEF do guzów, a odpowiedź biologiczną oceniono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Międzypalcowe złote elektrody na cienkim, przezroczystym podłożu parylenu-C zostały pokryte przewodzącym polimerem PEDOT:PSS, w wyniku czego uzyskano elastyczne i biokompatybilne urządzenie. Wpływ PEF na nowotwory i ich mikrośrodowisko badano przy użyciu różnych modeli biologicznych. Najpierw monowarstwy komórek glejaka hodowano na elektrodach w celu zbadania zjawisk in vitro. Na etapie pośrednim opracowano model in ovo, w którym zmodyfikowane sferoidy guza zostały wszczepione w błonę embrionalną przepiórki. Ze względu na brak układu odpornościowego doprowadziło to do silnie unaczynionych guzów. Na tym wczesnym etapie rozwoju zarodki nie mają układu odpornościowego, a nowotwory nie są rozpoznawane jako ciała obce. Dzięki temu mogą szybko się rozwijać, rozwijając własne naczynia z istniejącego układu naczyniowego zarodka, który stanowi cenny model 3D raka. Na koniec oceniono dostarczanie PEF przez elastyczne elektrody w kompletnym organizmie z funkcjonalnym układem odpornościowym, przy użyciu syngenicznego modelu myszy z przeszczepem ortoidalnym (wewnątrzczaszkowym). Sferoidy guza zostały wszczepione do mózgu transgenicznych myszy wielofluorescencyjnych przed wszczepieniem elastycznych elektrod organicznych. Szczelne okno czaszki umożliwiło wielofotonowe obrazowanie guza i jego mikrośrodowiska podczas leczenia PEF przez okres kilku tygodni.

Wprowadzenie

Glejak wielopostaciowy (GBM) jest wysoce inwazyjnym nowotworem i dlatego trudno go wyeliminować za pomocą standardowych metod leczenia, takich jak resekcja, radioterapia i chemioterapia. Pomimo leczenia multimodalnego, rokowanie pozostaje bardzo złe, a u większości pacjentów postęp choroby następuje w ciągu 1 roku od rozpoznania1,2. Niedawny rozwój terapii bioelektrycznych wykazał ogromny potencjał w zakresie ulepszania istniejących terapii. Terapie te wykorzystują dostarczanie pulsacyjnych pól elektrycznych (PEF), zwykle podczas jednej sesji leczenia, w celu zakłócenia integralności błony komórkowej i mikrośrodowiska guzów. To przerwanie błony komórkowej, znane również jako elektroporacja, może być odwracalne lub nieodwracalne w zależności od natężenia pola elektrycznego i liczby impulsów. Nieodwracalna elektroporacja (IRE) jest stosowana jako nietermiczna technika ablacji tkanek, w której impulsy elektryczne powodują śmiertelne uszkodzenie błon komórkowych, prowadząc do śmierci komórki3. Odwracalna elektroporacja jest stosowana w elektrochemioterapii (ECT), uznanej technice, która polega na dostarczaniu PEF w połączeniu z lekami chemioterapeutycznymi w celu zwiększenia wychwytu leku w komórkach nowotworowych4. Co więcej, ostatnie badania wykazały, że elektroporacja wapniowa jest alternatywą dla elektrowstrząsów o wysokiej skuteczności w leczeniu raka, która jest również niedroga i wywołuje mniej skutków ubocznych5. Pomimo tych obiecujących osiągnięć, PEF są zazwyczaj stosowane przy użyciu sztywnych, metalowych elektrod, o których wiadomo, że powodują uszkodzenia tkanek miękkich6. Mózg jest szczególnie wrażliwy na takie inwazyjne urządzenia, w których mechaniczne niedopasowanie wywołuje stan zapalny i bliznowacenie astrogleju7.

W tym kontekście, prezentowany jest elastyczny system dostarczania PEF w połączeniu z modelami 3D guzów glejaka, od mikrofabrykacji do modelu mysiego. Elektrody konforemne są wytwarzane w standardowych cienkowarstwowych procesach mikrowytwarzania, w tym przy użyciu miękkich i biokompatybilnych materiałów, takich jak parylen-C, złoto i PEDOT:PSS8,9. Konstrukcja elektrody międzypalcowej służy do pokrycia dużej powierzchni przy zachowaniu odpowiedniej przezroczystości dla obrazowania między palcami elektrody10. W przypadku modelu nowotworu, sferoidy 3D komórek glejaka wykazujących ekspresję genetycznie kodowanego reportera fluorescencyjnego są wytwarzane przy użyciu odmiany metody 96-dołkowej płytki z płynną nakładką11. Sferoidy są wszczepiane w błonę kosmówkowo-omoczniową zarodka przepiórki, w wyniku czego powstaje model in ovo, który jest szeroko stosowany do badania angiogenezy lub toksykologii leków12,13. Guzy mogą być przeszczepiane i unaczyniane przez układ naczyniowy zarodka przy braku układu odpornościowego na tym etapie rozwoju embrionalnego12. Elastyczne elektrody są następnie umieszczane na unaczynionym guzie w celu zbadania wpływu dostarczania PEF na sferoidę i jej unaczynienie. Na koniec bada się te efekty na całym żywym organizmie, w tym mikrośrodowisku guza i układzie odpornościowym, poprzez wszczepienie zmodyfikowanych sferoid do miąższu mózgu mysich modeli14. Elastyczne elektrody umieszcza się na górze miejsca wprowadzenia, a kraniotomię uszczelnia się szklanym okienkiem, co umożliwia wielokrotne obrazowanie dwufotonowe przez kilka tygodni.

Te metody będą przydatne dla osób zainteresowanych różnymi dziedzinami, począwszy od inżynierii mikroelektronicznej, a skończywszy na zastosowaniach onkologicznych. Protokół mikroprodukcji może być stosowany i dostosowywany do każdego zastosowania wymagającego cienkowarstwowych elektrod metalowych pokrytych PEDOT:PSS. Co więcej, modele biologiczne opracowane do oceny przeciwnowotworowych terapii elektrycznych będą miały ogólne znaczenie dla badania różnicowania odpowiedzi komórkowej, naczyniowej i immunologicznej na wszczepione materiały.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z francuskim ustawodawstwem i zgodnie z dyrektywą Rady Wspólnoty Europejskiej z dnia 24 listopada 1986 roku (86/609/EWG) w sprawie opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Badania na zwierzętach zostały autoryzowane przez Direction Départementale des Services Vétérinaires des Bouches-du-Rhône i zatwierdzone przez komisję etyczną Prowansji Côte D'Azur (Apafis # 22689-2019100414103054).

1. Elastyczna mikrofabrykacja urządzeń (Rysunek 1)

  1. Czyszczenie szkiełek szkiełkowych
    1. Sonikować szkiełka w 2% roztworze mydła przez 15 minut. Spłucz je wodą.
    2. Sonikować ponownie w mieszaninie 80% czystego acetonu i 20% czystego izopropanolu przez 15 min.
      UWAGA: Te rozpuszczalniki są szkodliwe i łatwopalne. Nosić środki ochrony osobistej (PPE) i obchodzić się z nimi pod wyciągiem.
    3. Szkiełka spłukać izopropanolem i osuszyć pistoletem pneumatycznym.
      UWAGA: Upewnij się, że aceton nie wysycha na podłożach podczas całego procesu.
  2. Wzór złotej elektrody (Rysunek 1A)
    1. Umieść 3 μm warstwę parylenu-C (PaC) za pomocą systemu osadzania parylenu (Rysunek 1Aa).
      1. Umieścić oczyszczone szkiełka podstawowe w komorze osadzania. Spryskaj chłodziarkę mydłem, pozostaw do wyschnięcia i włóż do wyczuwalnika systemu osadzania. Ten antyadhezyjny materiał ułatwiający usuwanie PaC z agregatu chłodniczego po osadzaniu.
        UWAGA: PaC jest drażniący i stanowi zagrożenie dla zdrowia. Podczas obchodzenia się z nim noś rękawice.
      2. Zważ 6 g PaC w aluminiowej łódce i umieść ją w piecu. Opróżnić maszynę (P = 10 mTorr) i rozpocząć osadzanie z następującymi parametrami: TChiller = -100 °C,T Piec = 690 °C, TParownik = 175 °C iT Chamber = 135 °C.
      3. Po zakończeniu osadzania i osiągnięciu temperatury parownika poniżej 40 °C wyłącz agregat chłodniczy, parownik i piec. Odpowietrzyć maszynę i pobrać próbki.
    2. Aktywuj powierzchnię próbek za pomocą plazmy tlenowej przez 30 s (100 W, 50 sccm).
    3. Próbki poddane działaniu plazmy należy wirować ujemnym fotorezystem o wymiarach 1,000 x g przez 40 s. Umieścić próbki na gorącej płycie w temperaturze 110 °C na 2 minuty (Rysunek 1Ab).
      UWAGA: Roztwór fotorezystu jest łatwopalny i powoduje podrażnienie; nosić środki ochrony osobistej i obchodzić się z nimi pod wyciągiem.
    4. Umieść filtr i-line w linii badawczej szerokopasmowego nakładki kontaktowego UV i naświetl fotorezystor przez maskę z konstrukcją elektrody międzypalcowej (Rysunek 1Ac).
      UWAGA: Elektrody międzypalcowe o odstępie 50 lub 250 μm zostały zaprojektowane przy użyciu edytora układu, a fotomaski zostały zamówione w firmie produkującej fotomaski poliestrowe metodą fotoplotingu laserowego.
    5. Piecz powyższe próbki w temperaturze 110 °C na gorącej płycie przez 3 minuty i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej przez 5 minut. Zanurz próbki w wywoływaczu niezawierającym jonów metali na 3 minuty, aby usunąć nienaświetlony fotorezyst. Opłucz próbki wodą i osusz je pistoletem pneumatycznym (Rysunek 1AD).
      UWAGA: Rozwiązanie deweloperskie jest drażniące; nosić środki ochrony osobistej i obsługiwać pod wyciągiem.
    6. Aktywuj powierzchnię próbek za pomocą plazmy tlenowej przez 60 s (100 W, 50 sccm).
    7. Osadź warstwę adhezyjną chromu o długości 20 nm i warstwę złota o długości fali 300 nm za pomocą parownika termicznego w następujący sposób (Rysunek 1Ae).
    8. Odpowietrzyć parownik i przypiąć próbki (skierowane w dół) do górnej okrągłej płyty za pomocą metalowych. Napełnij dedykowane tygle odpowiednio chromem i złotem. Uszczelnij i opróżnij maszynę, aby osiągnąć ciśnienie poniżej 5·10-6 Torr. Rozpocząć obrót uchwytu na próbkę.
    9. Wybrać tygiel zawierający chrom i powoli zwiększać przepływający przez niego prąd, aż do osiągnięcia szybkości osadzania 0,2 Å·s-1. Otwórz migawkę i poczekaj, aż opuści się 20 nm chromu. Zamknij migawkę i powoli zmniejszaj prąd aż do 0 mA.
    10. Wybierz tygiel zawierający złoto i powoli zwiększaj przepływający przez niego prąd, aż do osiągnięcia szybkości osadzania 0,2 Å·s-1. Otwórz migawkę, aby odparować złoto, poczekaj, aż osadzi się 10 nm złota, a następnie zwiększ szybkość stapiania do 1,5 Å·s-1, aż do osadzenia się około 300 nm. Zamknij migawkę i powoli zmniejsz prąd do 0 mA.
    11. Pozostawić próbki do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez 15 minut po osadzeniu. Zatrzymaj obrót uchwytu próbki, odpowietrz maszynę i zbierz próbki.
    12. Zanurzyć próbki w zlewce z acetonem. Umieść zlewkę na płycie wstrząsającej ustawionej na 110 obr./min na 15 minut, aby zdjąć fotorezystor. Przepłukać próbki izopropanolem i wysuszyć je pistoletem pneumatycznym (Rysunek 1Af).
    13. Aktywuj powierzchnię próbek za pomocą plazmy tlenowej przez 30 s (100 W, 50 sccm).
    14. Nałożyć warstwę izolacyjną PaC o grubości 3 μm za pomocą systemu osadzania parylenu (patrz krok 1.2.1) (Rysunek 1Ag).
  3. Otwarcie konspektu (Rysunek 1B)
    1. Wiruj próbki dodatnim fotorezystem o wymiarach 600 x g przez 35 s. Umieść je na gorącej płycie w temperaturze 110 °C na 2 minuty (Rysunek 1Ba).
      UWAGA: Roztwór fotorezystu jest łatwopalny i powoduje podrażnienie; nosić środki ochrony osobistej i obsługiwać pod wyciągiem.
    2. Upewnij się, że w linii badawczej szerokopasmowego nakładka kontaktowego UV nie ma filtra i-line i naświetl fotorezystor przez maskę, która przedstawia kontur urządzenia z szerokopasmowym wyrównywaczem kontaktowym UV (Rysunek 1Bb).
    3. Zanurz próbki w wywoływaczu niezawierającym jonów metali na 4 minuty, aby usunąć odsłonięty fotorezyst. Przepłukać próbki wodą i osuszyć je pistoletem pneumatycznym (Rysunek 1Bc).
    4. Wytrawić kontur przez dwie warstwy PaC za pomocą reaktywnego wytrawiacza jonowego (160 W, 22 min, O2: 50 sccm, CF4: 10 sccm) (Rysunek 1Bd).
    5. Usunąć pozostały fotorezystor acetonem, spłukać izopropanolem i wysuszyć próbki pistoletem pneumatycznym.
  4. PEDOT: Powłoka PSS (Rysunek 1C)
    1. Wiruj 2% roztwór mydła o sile 70 x g przez 35 s (Rysunek 1Ca).
    2. Zdeponuj warstwę protektorową PaC o grubości 3 μm za pomocą systemu osadzania parylenu (patrz krok 1.2.1) (Rysunek 1Cb).
    3. Fotorezystor z dodatnim powłoką wirową o wymiarach 600 x g przez 35 s. Umieść próbki na płycie grzejnej w temperaturze 110 °C na 2 minuty (Rysunek 1Cc).
    4. Upewnij się, że w linii badawczej szerokopasmowego nakładki kontaktowego UV nie ma filtra i-line i naświetl fotorezystor przez maskę, która przedstawia aktywną powierzchnię elektrod (Rysunek 1Cd).
    5. Zanurz próbki w wywoływaczu niezawierającym jonów metali na 4 minuty, aby usunąć odsłonięty fotorezyst. Przepłukać próbki wodą i osuszyć je pistoletem pneumatycznym (Rysunek 1Ce).
    6. Wytrawić PaC reaktywnym wytrawiaczem jonowym, aby otworzyć powierzchnię czynną elektrod (160 W, 24 min, O2: 50 sccm, CF4: 10 sccm). Sprawdź pod mikroskopem, czy na powierzchni czynnej nie ma pozostałości PaC (Rysunek 1Cf).
    7. Usunąć pozostały fotorezystor acetonem, spłukać izopropanolem i wysuszyć próbki pistoletem pneumatycznym.
    8. Aktywuj powierzchnię próbek za pomocą plazmy tlenowej przez 90 s (100 W, 50 sccm).
    9. Zmieszać komercyjną dyspersję chemicznie spolimeryzowanego PEDOT:PSS z 5% obj. glikolu etylenowego (EG) i 0,1% obj. kwasu dodecylobenzenosulfonowego (DBSA). Sonikacja przez 15 minut. Dodać 1% wag. (3-glicydyloksypropylo)trimetylosiloksanu (GOPS) i sonikować przez 5 min. Przefiltruj roztwór przez filtr 1,2 μm.
      UWAGA: EG działa drażniąco i stanowi zagrożenie dla zdrowia. DBSA jest substancją drażniącą i. GOPS jest. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i obchodzić się z tymi chemikaliami pod wyciągiem.
      UWAGA: Całkowita objętość zależy od liczby próbek. Dla 10 standardowych szkiełek należy przygotować co najmniej 20 ml, co odpowiada następującym ilościom: 18,78 ml PEDOT:PSS, 1 ml EG, 20 μl DBSA i 200 μl GOPS.
    10. Wirować cztery warstwy roztworu PEDOT:PSS w temperaturze 150 x g przez 35 s. Po nałożeniu każdej warstwy piecz próbki w temperaturze 110 °C przez 60 s na gorącej płycie i schładzaj je do temperatury pokojowej przez 5 minut przed odwirowaniem następnej warstwy (Rysunek 1Cg).
    11. Usuń warstwę protektorową PaC, zanurzając próbki w wodzie ( Rysunek 1 kanał).
    12. Piec próbki w temperaturze 140 °C przez 1 godzinę.
    13. Zanurz próbki w wodzie dejonizowanej na 30 minut, aby usunąć pozostałe mydło i związki o niskiej masie cząsteczkowej z folii PEDOT:PSS i odłączyć próbki od szklanego podłoża (Rysunek 1Ci).
  5. Połączenia i pakowanie (Rysunek 1D)
    1. Umieść cienką warstwę farby akrylowej na folii poliimidowej, która jest pokryta miedzią (Rysunek 1Da). Użyj aerozolu, aby uzyskać jednorodną warstwę farby (Rysunek 1Db).
    2. Wzoruj farbę akrylową za pomocą lasera (75 kHz, 7 W, 1 przejście lasera, 400 mm·s-1), aby uzyskać dwie prostokątne podkładki kontaktowe (5 mm x 15 mm; odstęp 1,5 mm) (Rysunek 1Dc).
    3. Wytrawiaj miedź na mokro nasyconym 30% (w/v) chlorkiem żelaza (FeCl3) w wodzie przez 15 minut w temperaturze 40 °C (Rysunek 1Dd).
      UWAGA: FeCl3 jest drażniący i; Trzymaj go w rękawiczkach pod wyciągiem.
    4. Usuń farbę akrylową acetonem, lekko pocierając ją szmatką (Rysunek 1De).
    5. Wytnij wzorzystą folię poliimidową na prostokątne kształty (15 mm x 30 mm) za pomocą lasera (15 kHz, 10 W, 30 przejść lasera, 130 mm·s-1) (Rysunek 1Df).
    6. Dozowanie pasty srebrnej za pomocą trzyosiowej maszyny dozującej pod ciśnieniem trzech prętów za pomocą igły o średnicy 330 μm (5 m·min-1) (Rysunek 1Dg).
      UWAGA: Pasta ze srebra działa drażniąco; obręcz w rękawiczkach.
    7. Wyrównaj i przymocuj sondę PaC do folii poliimidowej pod mikroskopem lornetkowym za pomocą pęsety (Rysunek 1Dh).
      UWAGA: Znaczniki wyrównania można oznaczyć wzorem w kroku 1.5.2, aby ułatwić ustawienie sondy na podkładkach kontaktowych.
    8. Piec w temperaturze 140 °C przez 2 godziny w piekarniku.
    9. Umieść poliamidową taśmę ochronną o grubości 1 cm2 na podkładkach kontaktowych (Rysunek 1Di).
    10. Zanurz interfejs, w którym sonda PaC i folia poliimidowa są połączone w PDMS ( Rysunek 1Dj).
    11. Piecz przez 2 godziny w temperaturze 50 °C.
    12. Usuń taśmę ochronną, aby otworzyć podkładki stykowe (Rysunek 1Dk).
      UWAGA: Mikroprodukcja urządzeń in vitro jest podobna, ale kroki 1.2.1, 1.3 i 1.5 muszą zostać pominięte.

2. Generacja stabilnej linii komórkowej glejaka GCaMP6f

  1. Produkcja lentiwirusa
    1. W kolbie o powierzchni 75 cm² wyhodować linię komórkową pochodzącą z HEK 293T zoptymalizowaną pod kątem produkcji lentiwirusa w 10 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, zawierającej 4,5 g·L-1 glukozy, L-glutaminy, pirogronianu sodu i wodorowęglanu sodu i uzupełnionej 10% wolną od tetracyklin płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 jednostkami penicyliny i 100 μg·mL-1 streptomycyny przez co najmniej 3 dni do 80% Confluence.
    2. Usunąć podłoże z kolby. Delikatnie przepłucz komórki 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    3. Dodać 1 ml 0,25% roztworu trypsyny/EDTA i inkubować kolbę przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Roztwór trypsyny/EDTA stanowi zagrożenie dla zdrowia; nosić środki ochrony osobistej i obsługiwać pod wyciągiem.
    4. Dodać 8 ml pożywki hodowlanej. Delikatnie przepłukać zawiesinę komórek.
    5. Policz komórki i płytkę 4 x 106 komórek na szalce Petriego w 8 ml pożywki hodowlanej.
    6. Następnego dnia rozcieńczyć 25 μg plazmidu zawierającego gen GCaMP6f i marker selekcyjny nadający oporność na puromycynę w całkowitej objętości 600 μl wody. Dodać go do probówki z odczynnikiem do transfekcji. Wirować przez 10 s przy 3,000 obr./min i inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić produkcję nanocząstek.
    7. Dodawać zawartość probówki kroplami do hodowli limfocytów T HEK 293 i delikatnie rozdrabniać ręcznie. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 4 godziny.
    8. Zastąp pożywkę zawierającą kompleksy nanocząstek świeżymi pożywkami i zwróć komórki w temperaturze 37 °C.
    9. Trzy dni później zebrać supernatant i odwirować przy 500 x g przez 10 minut, aby usunąć resztki komórkowe. Zebrać fazę ciekłą zawierającą cząsteczki wirusa.
      UWAGA: Wytwarzanie wirusa w supernatancie można potwierdzić za pomocą ilościowego testu miana lentiwirusa i można je przechowywać w temperaturze -80 °C przez co najmniej 2 lata.
  2. Transdukcja komórek glejaka
    1. W kolbie o powierzchni 75 cm² hodować komórki glejaka w 10 ml DMEM zawierającego 1 g·L-1 glukozy, L-glutaminy, pirogronianu sodu i wodorowęglanu sodu i uzupełnione 10% FBS bez tetracyklin, 100 jednostek·mL-1 penicyliny i 100 μg·mL-1 streptomycyny przez co najmniej 4 dni.
    2. Odrzucić pożywkę i dodać supernatant otrzymany w kroku 2.1.9 do komórek docelowych.
    3. Dodaj 5 μg·mL-1 bromku heksadimetryny do pożywki, aby poprawić transdukcję. Inkubować przez 6 godzin w temperaturze 37 °C. Zastąpić pożywkę 10 ml świeżej pożywki.
      UWAGA: Bromek heksadimetryny jest drażniący. Obchodź się z nim w rękawiczkach.
  3. Wytwarzanie stabilnej linii komórkowej
    1. Dwa do trzech dni po transdukcji dodaj 10 ml DMEM zawierającego 1 g·L-1 glukozy, L-glutaminę, pirogronian sodu i wodorowęglan sodu, 10% FBS, 100 jednostek·mL-1 penicyliny, 100 μg·mL-1 streptomycyny i uzupełnij puromycyną, aby zabić nietransdukowane komórki. Hoduj komórki w tym pożywce przez co najmniej 3 dni.
      UWAGA: Puromycyna jest substancją drażniącą; Trzymaj go w rękawiczkach.
      UWAGA: Wrażliwość komórek na puromycynę musi być przetestowana przed transdukcją poprzez hodowlę komórek w zalecanej pożywce zawierającej różne stężenia puromycyny. Dzień później sprawdź komórki pod mikroskopem. Wybierz odpowiednie stężenie, przy którym większość komórek jest martwa, ale niewiele jest nadal żywych, aby upewnić się, że antybiotyk nie jest zbyt toksyczny i może zabić również transfekowane komórki.
    2. Usuń pożywkę i przepłucz komórki 10 ml PBS.
    3. Dodać 1 ml 0,25% roztworu trypsyny/EDTA i inkubować kolbę przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Dodać 8 ml pożywki hodowlanej. Delikatnie przepłukać zawiesinę komórek.
    5. Zbierz 100 μl zawiesiny komórek i zmierz stężenie komórek za pomocą licznika komórek. Odessać 50 μl zawiesiny komórek w ręcznym automatycznym liczniku komórek z czujnikiem 60 μm.
    6. Wysiewaj 1 komórkę/studzienkę na 96-dołkowej płytce. Na przykład, dla stężenia 1 x 103 komórek na ml, dodaj 1 / (1 x 103), tj. 0,001 ml zawiesiny komórek na studzienkę. Wysiew każdy dołek, aby zwiększyć szanse na sukces. W komplecie z pożywką hodowlaną, aby osiągnąć całkowitą objętość 200 μl na studzienkę.
    7. Dzień później znajdź każdą studzienkę zawierającą jedną komórkę i sprawdź jej fluorescencję (λexc = 490 nm i λem = 530 nm). Zaznacz studzienki zawierające tylko jedną transfekowaną komórkę. Kontynuuj wzrost przez kilka dni, aż studzienka prawie się zlewa.
    8. Wyrzucić pożywkę i przepłukać komórki 200 μl PBS. Dodać 100 μl 0,25% roztworu trypsyny/EDTA i inkubować 96-dołkową płytkę przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
    9. Dodać 100 μl pożywki i delikatnie przepłukać zawiesinę komórkową. Przenieść zawiesinę komórkową na szalkę Petriego. Dodaj 5 ml pożywki i pozwól komórkom rosnąć przez kilka dni, aż szalka Petriego prawie się zlewa.
    10. Wyrzucić pożywkę i przepłukać komórki 5 ml PBS. Dodać 1 ml 0,25% roztworu trypsyny/EDTA i inkubować szalkę Petriego przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
    11. Dodać 6 ml pożywki i delikatnie przepłukać zawiesinę komórkową. Przenieść zawiesinę komórek do kolby T25. Kontynuuj wzrost przez kilka dni, aż kolba prawie się zrośnie.
    12. Wyrzucić pożywkę i przepłukać komórki 5 ml PBS. Dodać 1 ml 0,25% roztworu trypsyny/EDTA i inkubować kolbę T25 przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 7 ml DMEM zawierającego 1 g·L-1 glukozy, L-glutaminy, pirogronianu sodu i wodorowęglanu sodu i uzupełnić 10% FBS, 100 jednostek·mL-1 penicyliny i 100 μg·mL-1 streptomycyny. Delikatnie przepłukać zawiesinę komórek.
    13. Podzielić zawiesinę komórek na cztery kolby T25 (po 2 ml na kolbę) i dodać 5 ml pożywki do każdej kolby. Pozwól komórkom rosnąć przez kilka dni, aż kolby prawie się zlewą.
    14. Powtórzyć krok 2.3.12 dla trzech kolb i zachować ostatnią kolbę dla kroku 3.1.3. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 150 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 900 μl. Delikatnie wymieszać komórki, aby utrzymać jednorodną zawiesinę komórek.
    15. Przenieść zawiesinę komórkową do kriogenicznych fiolek do przechowywania. Dodać 100 μl dimetylosulfotlenku. Umieścić kriowiale w temperaturze -80 °C na noc. Przenieś zamrożone komórki do ciekłego azotu w celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów.
      UWAGA: Skuteczność transfekcji można ocenić, dodając 5 μM soli wapniowej jonomycyny do pożywki i sprawdzając indukowany wzrost fluorescencji pod mikroskopem fluorescencyjnym (λexc = 490 nm i λem = 530 nm).

3. 3D modele

  1. Kultura sferoidalna
    1. Przygotować roztwór 1% (w/v) agarozy w wodzie dejonizowanej (DI).
      1. Dodaj 100 g proszku agarozy do 100 ml wody demineralizowanej i podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej, aż cały proszek się rozpuści. Regularnie mieszaj roztwór, aby uniknąć grudek. Roztwór należy sterylizować w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 120 °C.
    2. Po wyjęciu z autoklawu ostrożnie dodaj 75 μl roztworu agarozy na dołek do 96-dołkowej płytki. Umieść go z boku studni, aby utworzyć menisk, co spowoduje nieprzylegające okrągłe dno. Pozwól mu zestalić się przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Odłączyć komórki (krok 2.3.12) od kolby otrzymanej w kroku 2.3.14.
    4. Dodać 10 000 komórek na studzienkę komórek glejaka i uzupełnić, aby osiągnąć całkowitą objętość 150 μl na studzienkę z DMEM zawierającym 1 g·L-1 glukozy, L-glutaminy, pirogronianu sodu i wodorowęglanu sodu, a następnie uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 jednostkami ·mL-1 penicyliny i 100 μg·mL-1 streptomycyny.
    5. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C bez przesuwania płytki przez 3 dni. Następnie co 2 dni zastępuj połowę pożywki świeżymi za pomocą pipety wielokanałowej, aż do dalszych eksperymentów. Trzymaj końcówkę pipety w górnej części studzienki, aby uniknąć uszkodzenia agarozy lub samej sferoidy.
      UWAGA: Rozmiar sferoid zależy od liczby zasianych komórek i linii komórkowej, dlatego należy go dostosować w zależności od eksperymentów.
  2. Model in ovo
    1. Zapłodnione jaja przepiórki japońskiej (C. japonica) umieścić w inkubatorze (37 °C i 57% wilgotności) na tacach z automatycznym rotatorem, który obraca jaja co 2 godziny. Ten dzień jest uważany za Dzień Zarodka (ED) 0.
    2. Umyj plastikowe łódeczki wagowe, umieszczając je w 70% (w/v) etanolu. Wyjmij łódki wagowe i wysusz je pod wyciągiem.
      UWAGA: Od tego momentu eksperymenty nie są wykonywane w sterylnych warunkach. Wymagane są jednak czyste warunki, aby uniknąć rozwoju pleśni na zarodkach.
    3. Na ED3 delikatnie otwórz jajka za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami wstępnie umytymi 70% (w/v) etanolem. Wsypać zarodek do plastikowej łódki do ważenia, przykryć inną łódką do ważenia i umieścić w standardowym nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C na 3 dni.
    4. Na ED6 wykonaj małe nacięcie w błonie kosmówkowo-omoczniowej (CAM) za pomocą igły 23 G.
    5. Za pomocą pipety umieść 7-dniową sferoidę na nacięciu i umieść zarodek z powrotem w inkubatorze na 3 dni, do czasu dalszych eksperymentów.
      UWAGA: Barwnik fluorescencyjny można wstrzyknąć do oka zarodka w celu uwidocznienia naczyń krwionośnych.
    6. W dniu eksperymentu umieść elastyczną sondę na unaczynionym guzie za pomocą mikromanipulatora.
  3. Model in vivo
    UWAGA: Ta część protokołu jest zaadaptowana z tej opublikowanej wcześniej w reference14. Dorosłe wielokolorowe fluorescencyjne myszy AMU-Neuroinflam (B6. Zastosowano Cg-Tg(Thy1-CFP)23Jrs(Ly6a-EGFP)G5Dzk(Itgax-EYFP)1Mnz/FD); myszy te wykazują znakowanie subpopulacji neuronów Thy1 + przez transgeniczną ekspresję ECFP, znakowanie obwodowych komórek zapalnych LyzM + przez transgeniczną ekspresję EGFP i znakowanie podtypu mikrogleju wyrażającego EYFP pod kontrolą Cd11c +. Krótko mówiąc, zwierzęta są lekko uspokajane 1,5% izofluranem przez 2 minuty przed jakimkolwiek leczeniem lub wstrzyknięciem. Przed zabiegiem zwierzęta są znieczulane ketaminą (120 mg/kg; IP) i ksylazyna (12 mg/kg; Adres IP). Następnie 3% żel lidokainy nakłada się miejscowo, aby złagodzić ból uszu związany z utrwaleniem wsparcia stereotaktycznego. Następnie 0,25% roztwór bupiwakainy podaje się do miejsca operowanego w celu złagodzenia bólu spowodowanego kraniotomią. Gdy mysz została przygotowana do operacji, wykonano kraniotomię o średnicy 4 mm zgodnie z reference14. Za pomocą igły 26 G wykonano otwór w oponie twardej w środku kraniotomii i wstrzyknięto sferoidę guza za pomocą systemu iniekcyjnego opisanego w reference14. Dodatkowo, jak opisano tutaj, elastyczna elektroda została umieszczona na sferoidzie guza wyrażającej GCamp6 lub DsRed przed uszczelnieniem kraniotomii szklanym okienkiem.
    1. Umieść kroplę soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco tak, aby pokryła kraniotomię. Umieść elastyczną elektrodę na kropli DPBS i delikatnie umieść tylną część sondy z podkładkami kontaktowymi na grzbiecie myszy (Rysunek 4B).
      UWAGA: Używaj sterylnych rękawiczek i techniki "tylko końcówka". Zmień rękawice, jeśli dojdzie do kontaktu z niesterylną powierzchnią. Zapewnij wsparcie termiczne podczas tej procedury.
    2. Dotknij kropli DPBS małym kawałkiem papieru, aby wchłonąć DPBS, aż sonda będzie mogła położyć się płasko na oponie twardej i podążać za krzywizną mózgu. Upewnij się, że niewielka warstwa DPBS pozostaje pod elektrodami bez ucieczki z boku elektrody. Zapewnia to barierę przed rozlaniem się kleju podczas kolejnych kroków.
      UWAGA: Wysterylizuj cały sprzęt przed użyciem.
    3. Umieść małą kroplę kleju silikonowego na sondzie i przykryj ją okrągłą szklaną pokrywą o średnicy 5 mm. Dociśnij szklankę nakrywkową w dół, aż silikon zostanie równomiernie rozłożony, a odległość między szkłem nakrywkowym a sondą będzie minimalna. Dociśnij szklankę nakrywkową w dół na kolejne 30 sekund, aby silikon mógł stwardnieć.
    4. Aby zabezpieczyć szkło nakrywkowe, szybko nałóż superglue na jego boki i dociśnij go, aż klej utwardzi się na stałe.
    5. Za pomocą wykałaczki nałóż superglue na szyjkę sondy, uważając, aby superglue został wciągnięty pod szyję, aby zapewnić jej stabilne podparcie.
    6. Przykryj czaszkę cementem dentystycznym, aby zbudować przewlekłą czapkę. Zachowaj szczególną ostrożność, aby zakryć tylko krawędzie szkła nakrywkowego.
    7. Podnieś tylną część sondy i nałóż cement pod szyjkę sondy. Połóż sondę na cemencie przed utwardzeniem. Delikatnie dociśnij szyjkę sondy kleszczami, tak aby jej powierzchnia znajdowała się na tym samym poziomie co powierzchnia szkła nakrywkowego i nie przeszkadzała obiektywowi mikroskopu podczas eksperymentu.
    8. Przykryj górną część szyjki sondy nie więcej niż 1.5 mm warstwą cementu dentystycznego, aby uzyskać mocne trzymanie sondy. Zbuduj studnię cementową z grzbietem 1,5 mm w odległości 1-2 mm wokół szkła nakrywkowego, aby stworzyć miskę na płyn zanurzeniowy do obrazowania dwufotonowego (Rysunek 4C).
    9. Po utwardzeniu cementu należy zastosować pooperacyjne leki przeciwbólowe z buprenorfiną (0,05 mg/kg, 0,1 ml na 10 g masy ciała podskórnie) i utrzymywać zwierzę w ciepłej atmosferze aż do przebudzenia. Obejmuje to bliskość żarówki na podczerwień, a także owinięcie zwierzęcia w ręcznik papierowy.
      UWAGA: Umieść termometr na poziomie myszy, aby monitorować temperaturę.
    10. Scharakteryzować impedancję w zakresie 1-10 kHz za pomocą potencjostatu.
    11. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie po operacji przez co najmniej 10 dni. Natychmiast po operacji należy podać leki przeciwzapalne i kontynuować monitorowanie stanu zwierzęcia w celu zapewnienia odpowiedniej analgezji pooperacyjnej.

4. Dostarczanie i obrazowanie impulsowego pola elektrycznego (PEF)

  1. Umieść próbki pod mikroskopem fluorescencyjnym. W przypadku modeli 3D guzy można obserwować tylko od góry.
    UWAGA: W przypadku modelu in ovo eksperymenty przeprowadzono pod mikroskopem epifluorescencyjnym (ale jest to również możliwe przy użyciu mikroskopu dwufotonowego), natomiast eksperymenty na modelu in vivo przeprowadzono pod mikroskopem dwufotonowym (Rysunek 6).
  2. Podłącz generator impulsów do pól stykowych urządzeń za pomocą złączy pogo pin (in vitro) lub zacisków krokodylkowych (in ovo i in vivo) (Rysunek 4A). Ustaw żądane parametry (liczbę impulsów, napięcie, czas trwania impulsu, częstotliwość) i zastosuj PEF, uruchamiając generator (Rysunek 4A). Jednoczesny pomiar fluorescencji w celu obserwacji efektów PEF w czasie rzeczywistym.

Wyniki

Niniejszy protokół umożliwia zastosowanie metody w dwóch modelach glejakowładnoliściaka, w których zintegrowano elastyczny system dostarczania PEF. Po etapach mikrowytwarzania i pakowania, elastyczne elektrody są charakteryzowane w roztworze soli fizjologicznej za pomocą elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej (EIS) w celu oceny i walidacji ich wydajności. Elektrody powlekane PEDOT:PSS wykazują typowe obszary zdominowane przez pojemność i rezystancję, rozdzielone częstotliwością odcięcia, podczas gdy elektrody niepowlekane wykazują wyłącznie zachowanie pojemnościowe (Rysunek 2).

Wariacja metody z płytką 96-dołkową z nakładką ciekłą jest wykorzystywana do hodowli trójwymiarowych guzów stworzonych z transfektowanych komórek glejaka, które stabilnie ekspresjonują fluorescencyjny wewnątrzkomórkowy reporter wapnia. Wzrost sferoidów można obserwować za pomocą mikroskopu w świetle przechodzącym (Rysunek 3; ED 0). Uzyskanie sferycznych i gęstych sferoidów wymaga co najmniej 2 lub 3 dni, w zależności od linii komórkowej oraz liczby wysianych komórek.

W modelu in ovo sferoidy są przeszczepiane do błony pozarodowej zarodka przepiórki (Rysunek 3; ED 6). Sukces przeszczepu można ocenić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej kilka dni później, ponieważ żywe komórki posiadają wewnątrzkomórkowy wapń i są zatem fluorescencyjne (Rysunek 3; ED 9). Unaczynienie guza można obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym poprzez wstrzyknięcie barwnika fluorescencyjnego do naczyń krwionośnych (Rysunek 3; ED 9). Jednakże nie zawsze może być możliwe zwizualizowanie naczyń krwionośnych wewnątrz guza, ponieważ sferoid jest bardzo gęsty. Elastyczne elektrody grzebieniowe są umieszczane na powierzchni unaczynionego guza (Rysunek 3; ED 9) i podłączane do generatora impulsów. Sondę należy umieścić ostrożnie, aby uniknąć krwawienia zarodka; w przeciwnym razie barwnik fluorescencyjny może się rozprzestrzenić, co uniemożliwi wszelkie obserwacje obrazowe. Poprawność dostarczenia impulsu do środowiska biologicznego można zweryfikować poprzez pomiar prądu płynącego w obwodzie. Obrazowanie tych modeli in ovo pozwala na monitorowanie w czasie rzeczywistym wpływu PEF na wewnątrzkomórkowy wapń w trójwymiarowym guzie glejaka, a także na skurcz naczyń wywołany w unaczynieniu guza, eliminując wpływ innych typów komórek, w tym układu odpornościowego15.

Badanie wpływu PEF na glejak wielopostaciowy można przeprowadzić również w bardziej kompletnym i predykcyjnym modelu. Rzeczywiście, opisany powyżej model in vivo 14 polega na przeszczepieniu 3D guza glejaka do miąższu mózgu myszy (Rycina 4). Miejsce wstrzyknięcia guza zostaje zamknięte półkulistym koralikiem z sieciowanego żelu dekstranowego, aby odtworzyć fizjologiczne ograniczenia biofizyczne podczas wzrostu guza. Choć zostało to opisane w referencji14, warto ponownie podkreślić, że krytycznie ważne jest, aby koralik dekstranowy został precyzyjnie przyklejony superglue do opony twardej; w przeciwnym razie guz może wydostać się przez otwartą oponę i całkowicie pokryć mózg, co uniemożliwi obrazowanie. W przypadku każdego obrazowania przewlekłego, wrastanie tkanki, które zachodzi podczas gojenia się okna czaszkowego, stanowi poważną barierę, ponieważ nowa tkanka nie jest przezroczysta i sprawia, że obrazy stają się zamglone lub bezużyteczne. Dlatego po wstawieniu i przyklejeniu koralika, ściany boczne otwartego okna czaszkowego muszą zostać uszczelnione cienką warstwą superglue, starannie naniesioną wokół całej ściany otworu, nie dopuszczając do ześlizgnięcia się lub spłynięcia superglue na oponę twardą. Gdy elastyczna sonda zostanie umieszczona nad miejscem wstrzyknięcia guza, pod sondą nie mogą pozostać żadne pęcherzyki powietrza, i to z dwóch powodów. Po pierwsze, obrazowanie nie może być prowadzone w obecności pęcherzyków. Po drugie, pęcherzyki działają jako izolatory, zmieniając tym samym właściwości stymulacji elektrycznej. Po zastosowaniu opisanych powyżej środków ostrożności, otwór trepanacyjny zostaje zamknięty szklanym okienkiem przycementowanym do czaszki, aby umożliwić przewlekłe obrazowanie przez wiele tygodni. Ponieważ guz składa się z komórek wykazujących ekspresję GCaMP lub DsRed, wstrzyknięcie można potwierdzić za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Impedancja elektrochemiczna elektrod musi zostać zmierzona w celu walidacji ich wydajności po implantacji. W porównaniu z impedancją w roztworze soli fizjologicznej, in vivo oczekiwany jest wzrost impedancji przy częstotliwościach powyżej 100 Hz ze względu na obecność środowiska biologicznego (Rycina 5). Unaczyniony miąższ neuronalny oraz infiltracja guza mogą być obserwowane i charakteryzowane przez przezroczysty substrat przez wiele tygodni za pomocą mikroskopii dwufotonowej (Rycina 6). Wykorzystanie zwierząt transgenicznych wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych w komórkach zainteresowania (komórkach odpornościowych i neuronach) może, na przykład, pozwolić na wykazanie minimalnego procesu zapalnego wywołanego samą implantacją elektrody (Rycina 6A) lub wykazać obecność mikrogleju i monocytów 26 dni po implantacji elektrody stymulującej PEF umieszczonej nad rosnącym guzem GBM (Rycina 6B1). W tym ostatnim przypadku zarówno komórki pochodzące z monocytów obwodowych, jak i rezydentne w mózgu komórki mikrogleju zostały znalezione wokół i wewnątrz guza (Rycina 6B2). W dniu podania PEF, pady kontaktowe elastycznych elektrod mogą zostać podłączone do generatora impulsów bezpośrednio pod mikroskopem dwufotonowym. Ogólnie rzecz biorąc, model ten może być wykorzystany do badania efektu zabiegów bioelektrycznych w czasie, z użyciem różnych typów komórek zaangażowanych w rozwój guza mózgu, do głębokości około 500 µm.

Wzorowanie elektrod złotych, naświetlanie fotorezystu, uwalnianie elastycznego urządzenia; schemat procesu.
Rycina 1: Mikrowytwarzanie elastycznych elektrod. (A) Wzorowanie elektrod złotych i podłoże z Parylenu C. (B) Otwieranie obrysu. (C) Powlekanie PEDOT:PSS. (D) Połączenia i pakowanie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres spektroskopii impedancyjnej; częstotliwość w funkcji impedancji dla elektrod pokrytych PEDOT:PSS i złotych.
Rysunek 2: Elektrochemiczna spektroskopia impedancyjna elastycznych elektrod złotych oraz elektrod złotych pokrytych PEDOT:PSS w roztworze soli fizjologicznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat CAM jaja przepiórczego: inkubacja, hodowla bez skorupki, przeszczep guza, elektrody na guzie.
Rysunek 3The in ovo model glejaka wielopostaciowego. ED 0: Sferoid obserwowany za pomocą mikroskopu w polu jasnym. ED 3: Hodowla pozaskorupowa zarodka przepiórki 3 dni po otwarciu. ED 6: Guz wszczepiony w CAM obserwowany za pomocą mikroskopu w polu jasnym. ED 9: Elastyczne urządzenie umieszczone na unaczynionym guzie (guz w kolorze zielonym, naczynia krwionośne w kolorze czerwonym). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat ustawienia sondy neuronalnej w kraniotomii z generatorem impulsów, elastyczną sondą i eksperymentem stymulacyjnym.
Rysunek 4: Zastosowanie in vivo. (A) Schemat eksperymentów in vivo. (B) Umiejscowienie sondy przed nałożeniem szkiełka zakryjącego i żywicy akrylowej. (C) Zakończona implantacja sondy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres impedancji w funkcji częstotliwości; wszczepione złote elektrody w porównaniu z elektrodami w roztworze soli fizjologicznej, eksperymentalna analiza elektryczna.
Rycina 5: Spektroskopia impedancji elektrochemicznej elastycznych złotych elektrod w roztworze soli fizjologicznej w porównaniu z sondą wszczepioną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.

Obrazowanie mikroskopem fluorescencyjnym urządzenia mikrofluidycznego, pokazujące wzrost komórek w ciągu 26 dni.
Rysunek 6: Intrawitalne wielospektralne obrazowanie dwufotonowe przez elektrody. (A) Mozaika obrazów zdrowej powierzchni mózgu u kontrolnej wielobarwnej fluorescencyjnie myszy AMU-Neuroinflam 3 dni po implantacji elektrod. Kolor cyjan obrazuje arboryzację dendrytyczną neuronów piramidalnych warstwy 5, kolor zielony wskazuje zrekrutowane granulocyty i monocyty, a kolor żółty obrazuje aktywowane mikroglej i komórki dendrytyczne. Kolor różowy wskazuje dyfuzję podczerwieni spowodowaną akumulacją ciepła. (B1) Obraz analogiczny do A, ale 26 dni po implantacji sferoidu nowotworowego na głębokość 200 µm w korze, bezpośrednio po której nastąpiła implantacja elektrod. Zwróć uwagę na akumulację zielonych i żółtych komórek odpornościowych. (B2) Obraz analogiczny do B1, ale 100 µm poniżej powierzchni elektrod. Zwróć uwagę na obecność niebieskiej arboryzacji dendrytycznej neuronów na obrzeżach czerwonej masy guza, która jest nacieczona przez żółty mikroglej i komórki dendrytyczne. Ciemnoniebieski kolor obrazuje sygnał drugiej harmonicznej z kolagenu peritumorowego. (B3) Powiększenie obrazu B2 pokazujące obecność som neuronów pośredniczących (wskazane strzałkami) w sąsiedztwie guza. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Podejście opisane w tej pracy umożliwia modelom guzów mózgu ze zintegrowanym systemem dostarczania PEF badanie wpływu PEF na różne poziomy organizacji biologicznej. Protokół mikroprodukcji składa się ze standardowych procesów cienkowarstwowych, które zapewniają dużą swobodę w projektowaniu elektrod, które można dostosować do konkretnego zastosowania. Czasami dodatkowy etap wyżarzania termicznego może być przydatny pod koniec produkcji, aby zmniejszyć zginanie elektrod, które wystąpiło podczas produkcji.

Zastosowanie stabilnej linii komórkowej glejaka wykazującej ekspresję fluorescencyjnego wskaźnika wapnia pozwala uniknąć wszelkich powikłań związanych z dostarczaniem i zatrzymywaniem barwnika, szczególnie w guzach 3D, które są bardzo gęste16. Rzeczywiście, wysoki poziom ekspresji obserwuje się przez długi czas w porównaniu ze standardowymi chemicznymi fluorescencyjnymi wskaźnikami wapnia17. Protokół ten może być stosowany do różnych linii komórkowych, ponieważ jest powszechnie stosowany do obrazowania aktywności neuronalnej11. W tym przypadku wykorzystano ludzkie i mysie linie komórkowe (U87 i Gl261 do implantacji odpowiednio u myszy z niedoborem odporności lub immunokompetentnych). Rzeczywiście, ostatnie badania wykazały, że linia komórkowa U87 różni się od linii oryginalnych komórek, ponieważ wiele mutacji zostało nabytych przez lata hodowli komórkowej, wpływając na odtwarzalność eksperymentalną18. Metoda stosowana do przygotowania guzów 3D jest wysokoprzepustowa, powtarzalna i pozwala na generowanie sferoid o określonej wielkości w zależności od linii komórkowej, liczby komórek podczas wysiewu i czasu wzrostu19. Jednak te sferoidy są gęste, co stanowi wadę podczas obrazowania w rdzeniu guza.

Model in ovo jest przydatny jako pierwsze podejście do badania wpływu PEF na guzy 3D i ich unaczynienie, bez interakcji z innymi typami komórek obecnych w mózgu. Ten model jest niedrogi, szybki, wysokowydajny i stwarza mniej problemów etycznych niż modele zwierzęce. Ważne jest, aby zachować integralność zarodka przez cały czas trwania eksperymentu, ponieważ może to wpłynąć na jego przeżycie i jakość obrazowania. Należy zachować szczególną ostrożność podczas otwierania jaja przepiórczego, aby uniknąć uszkodzenia błony zarodkowej. Przeszczep i umieszczenie elastycznych elektrod muszą być również wykonane ostrożnie, aby uniknąć krwawienia, które mogłoby zabić zarodek. Wstrzyknięcie barwnika fluorescencyjnego do naczyń krwionośnych umożliwia jednoczesną wizualizację komórek nowotworowych i unaczynienie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Wstrzyknięcie do gałki ocznej należy wykonać ostrożnie, aby uniknąć przedostania się barwnika do płynu embrionalnego, co mogłoby spowodować fluorescencję resztkową w tle, która pogarsza jakość obrazowania. Model ten może być również stosowany do śledzenia wchłaniania leku, ponieważ umożliwia dostęp do układu krążenia. Eksperymenty są jednak ograniczone 12-dniowym czasem przeżycia zarodka, co pozwala na 7 dni obserwacji, czyli znacznie krócej niż w modelu in vivo 21.

Model guza mózgu in vivo może być monitorowany przez 4 do 5 tygodni, zanim zwierzęta osiągną etyczny eksperymentalny punkt końcowy określony przez nagłą utratę masy ciała o 20%. Jest dobrze tolerowany i pozostaje na swoim miejscu, jeśli końcówka łącząca elektrody nie jest zbyt długa. W przeciwnym razie zwierzęta mają tendencję do drapania złącza, które może ostatecznie zostać rozerwane, uniemożliwiając w ten sposób późniejsze połączenie ze stymulatorem. Ten 4-tygodniowy okres jest jednak cenny, aby objąć różne etapy rozwoju glejaka. Porównując gęstości komórek nowotworowych w tej samej objętości zainteresowania w różnych odstępach czasu, można zaobserwować ewolucję kinetyki wzrostu guza. W szczególności zaobserwowano zwiększony wzrost guza w momencie zmiany układu immunologicznego22. Podobne badanie w obecności elektrody stymulującej dostarczyłoby informacji na temat wpływu PEF na tempo proliferacji guza i wrażliwość guza na eliminację immunologiczną. W porównaniu z modelem in ovo , model in vivo może być postrzegany jako cenny model przedkliniczny do badania wpływu komórek odpornościowych na progresję guza i ich wkład w efekt terapeutyczny PEF. Protokół ten jest zaadaptowany z poprzedniego artykułu z dodaniem elastycznej elektrody do guza przed umieszczeniem okna czaszkowego14. Zarówno ostre, jak i przewlekłe leczenie bioelektryczne nowotworów można scharakteryzować poprzez bezpośrednie i późniejsze obserwacje za pomocą mikroskopii dwufotonowej, biorąc pod uwagę, że oczekuje się, że początkowa stymulacja wywoła śmierć komórki i wywoła trwałe rozregulowanie odpowiedzi immunologicznej.

Połączenia elastycznej sondy są łatwo dostępne pod mikroskopem dwufotonowym. Parametry stymulacji elektrycznej mogą być zatem dostosowywane w czasie rzeczywistym w oparciu o zaobserwowany wpływ na tkankę nerwową i/lub komórki docelowe, podobnie jak lekarz przeprowadzałby zabiegi interwencyjne, obserwując obrazy MRI lub CT swojego pacjenta. Ostatnią kwestią jest znaczenie starannego uszczelnienia elektrody na mózgu za pomocą kleju superglue i kleju silikonowego, aby zapobiec ponownemu wzrostowi tkanki.

Podsumowując, opisany tutaj protokół stanowi innowacyjny model do badania wpływu terapii PEF elastycznymi elektrodami z polimeru organicznego w modelach guza glejaka. Oba modele wykazują różne poziomy złożoności, dzięki czemu efekty komórkowe, naczyniowe lub immunologiczne można rozdzielić w celu lepszego zrozumienia mechanizmów działania. Konforemne, powierzchowne elektrody zmniejszają jatrogenne uszkodzenia, umożliwiając jednocześnie zakłócenie mikrośrodowiska guza, wywołując zwężenie naczyń krwionośnych lub rozregulowanie wewnątrzkomórkowego wapnia15.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Opisana tutaj praca była wspierana przez Francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR-18-CE19-0029). Autorzy gorąco dziękują S.M. Bardet za jej wkład w wygenerowanie stabilnej linii komórkowej GCaMP6f oraz D. O'Connor za pomoc w tworzeniu modelu in ovo.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilaneSigma440167GOPS
0,25% Trypsyna-EDTA (1X)Gibco25200-056
Kwas 4-dodecylobenzenosulfonowySigma44198DBSA
96-dołkowa płytkaFalcon353075
AcetonTechnic530
Żywica akrylowaFischer NC1455685
autoklaw agarozySigmaA9539
Tuttnauer3150 EL
AZ 10XTMikrochemikaliaFotorezystor dodatni
AZ 826 MIF DeweloperMerck10056124960Wywoływacz bez jonów metali do fotorezystu ujemnego
AZ DeweloperMerck10054224960Niezawierający jonów metali wywoływacz do dodatniego fotorezystu
AZ nLof 2070MikrochemikaliaFotorezystu ujemny
BuprenorfinaAksjacja
KarprofenWirówka rimadylowa
Sorvall Legend X1RThermo Scientific75004260
CMOS Prime 95BFotometria
Inkubator CO2 HERAcell 150iThermo scientific
płytka przetwornika cyfrowo-analogowegoNational InstrumentsUSB 6259
Dé co spray Pé bé o Cultura3167860937307farba akrylowa
Dextran Texas Red 70.000ThermofisherD1830
Pasta do klejenia matryc "Epinal"HitachiEN-4900GCPasta srebrna
DimetylosulfotlenekSigmaD2438
Automat dozującyTianhaoTH-2004C
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium + GlutaMAX™-IGibco10567-014
Dulbecco's Modified Eagle's MediumSigmaD6429
Inkubator jaj COUVAD'OR 160lafermedemanon.com
Glikol etylenowyCarl Roth6881.1
Zapłodnione jaja przepiórki japońskiejJapocaille
Płodowa surowica bydlęcaVWRS181BH
KolbaGreiner658170
Makroskop fluorescencyjnyLeica MZFLIII
Gl261DSMZACC 802
Złote granulki - średnica 3 mm x 6 mm thNeyco
Ręczny automatyczny licznik komórekMilliporePHCC00000
Piecgrzewczy i suszącyMemmertUF110
Bromek heksadimetryny Sequa-breneSigmaS2667
płyta grzejna Delta 6 HP 350Sü ss Microtec
System oświetlenia pE-4000CoolLed
Przestrajalny laser femtosekundowy na podczerwień (Maï-Taï)Spectra Physics (USA)
Jonomycyna sól wapniowaSigmaI3909
Taśma kaptonowa SCOTCH 92 33x193MPoliimidowa taśma ochronna
Laboratoryjny generator
Labcoter 2 System osadzania parylenu PDS 2010SCS
Lenti-X 293 Linia komórek TTakara Bio63218Linia komórkowa pochodząca z HEK 293T zoptymalizowana pod kątem produkcji lentiwirusa
Lenti-X GoStix PlusTakara Bio631280Ilościowy test miana lentiwirusa
Nakładka maski MJB4Sü ss Microtec
Micro-90 Skoncentrowany roztwór czyszczącyProdukty międzynarodoweM9050-12
Szkiełka mikroskopowe 76 x 52 x 1 mmMarienfeld1100420
Igły 30GBD Microlance 3304000
Potencjostat PalmSens4PalmSens
parylen-c : dichloro-p-cyklofanSCS300073
Zbiorniki do przetwarzania PCBMega ElectronicsPA104
PEDOT: PSS Clevios PH 1000Heraeus
penicylina / streptomycynaGibco15140-122
Szalka PetriegoFalcon351029
pGP-CMV-GCaMP6fAddgene40755plazmid
Bufor fosforanowy Roztwórsoli fizjologicznejThermofisherD8537
System obróbki plazmowej PE-100Wytrawianie
PlasmaLab 80 Reaktywny wytrawiacz jonowyOxford Instruments
Plastikowa maskaSelba
Plastikowa łódź wagowa 64 x 51 x 19 mmVWR10770-454
Polidimetylosiloksan: SYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowychDow chemicals
Folia poliimidowa miedziana 60 i mikro; m (Kapton)GoodfellowIM301522
Propan-2-olTechnic574
Protolaser SLPKF
puromycinGibcoA11103
Okrągłe szkło osłonowe o średnicy 5 mmFischer scientific50-949-439
Czujniki berła - 60 i mikro; mMilliporePHCC60050
Klej silikonowy Kwik-SilWorld Precision Instruments
powlekarka spinowaSü ss Microtec
Spin CoaterLaurellWS-650
Super klejOffice depot
bez tetracyklin; tal bydlęca surowicaTakara Bio631105
Parownik termiczny Auto 500Boc Edwards
Mikroskop dwufotonowyZeiss LSM 7MP
U87-MGATCCHTB-14Ludzkie komórki glejaka
Myjka ultradźwiękowaVWR
Vortex VTX-3000LLMSVTX100323410
Odczynnik Xfect do pojedynczych strzałówOdczynnik do transfekcjiTakara Bio 631447
naukowyimpulsówplazmowe1673921

Bibliografia

  1. Koshy, M., et al. Improved survival time trends for glioblastoma using the SEER 17 population-based registries. Journal of Neuro-Oncology. 107 (1), 207-212 (2012).
  2. Davis, M. E. Glioblastoma: Overview of disease and treatment. Clinical Journal of Oncology Nursing. 20, 5 Suppl 2-8 (2016).
  3. Edd, J. F., Horowitz, L., Davalos, R. V., Mir, L. M., Rubinsky, B. In vivo results of a new focal tissue ablation technique: irreversible electroporation. IEEE transactions on Bio-Medical Engineering. 53 (7), 1409-1415 (2006).
  4. Breton, M., Mir, L. M. Microsecond and nanosecond electric pulses in cancer treatments. Bioelectromagnetics. 33 (2), 106-123 (2012).
  5. Frandsen, S. K., et al. Direct therapeutic applications of calcium electroporation to effectively induce tumor necrosis. Cancer Research. 72 (6), 1336-1341 (2012).
  6. Lee, J. H., Kim, H., Kim, J. H., Lee, S. -H. Soft implantable microelectrodes for future medicine: prosthetics, neural signal recording and neuromodulation. Lab on a Chip. 16 (6), 959-976 (2016).
  7. Lee, H., Bellamkonda, R. V., Sun, W., Levenston, M. E. Biomechanical analysis of silicon microelectrode-induced strain in the brain. Journal of Neural Engineering. 2 (4), 81-89 (2005).
  8. Fattahi, P., Yang, G., Kim, G., Abidian, M. R. A review of organic and inorganic biomaterials for neural interfaces. Advanced Materials. 26 (12), 1846-1885 (2014).
  9. Lecomte, A., Degache, A., Descamps, E., Dahan, L., Bergaud, C. In vitro and in vivo biostability assessment of chronically-implanted Parylene C neural sensors. Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 1001-1008 (2017).
  10. Dijk, G., Ruigrok, H. J., O'Connor, R. P. PEDOT:PSS-coated stimulation electrodes attenuate irreversible electrochemical events and reduce cell electropermeabilization. Advanced Materials Interfaces. 8 (19), 2100214(2021).
  11. Chen, T. -W., et al. Ultra-sensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  12. Ribatti, D. Chapter 5 Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. International Review of Cell and Molecular Biology. 270, 181-224 (2008).
  13. Valdes, T. I., Kreutzer, D., Moussy, F. The chick chorioallantoic membrane as a novel in vivo model for the testing of biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. 62 (2), 273-282 (2002).
  14. Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e51108(2014).
  15. Lefevre, M. C. Integrating flexible electronics for pulsed electric field delivery in a vascularized 3D glioblastoma model. npj Flexible Electronics. 5, 19(2021).
  16. Perry, J. L., Ramachandran, N. K., Utama, B., Hyser, J. M. Use of genetically-encoded calcium indicators for live cell calcium imaging and localization in virus-infected cells. Methods. 90, 28-38 (2015).
  17. Blömer, U., et al. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. Journal of Virology. 71 (9), 6641-6649 (1997).
  18. Lenting, K., Verhaak, R., ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).
  19. Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).
  20. Tay, S. L. M., Heng, P. W. S., Chan, L. W. The CAM-LDPI method: a novel platform for the assessment of drug absorption. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 64 (4), 517-529 (2012).
  21. Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. Chorioallantoic Membrane Models of Various Avian Species: Differences and Applications. Biology. 10 (4), 301(2021).
  22. Ricard, C., et al. Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice. Scientific Reports. 6 (1), 26381(2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Elastyczna elektronika organicznaimpulsowe pola elektryczneterapia glejaka wielopostaciowegourządzenia bioelektroniczneelektrody PEDOT:PSSsferoidy nowotworoweimplantacja okna czaszkowegomikroskopia dwufotonowamodel błony chorioallantoicznejmikrośrodowisko nowotworu
Elastyczne organiczne urządzenia elektroniczne do terapii pulsacyjnym polem elektrycznym glejaka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.