Method Article

Oparty na fluorescencji test potencjału błonowego do wysokoprzepustowego badania funkcjonalnego dwóch endogennych kanałów jonowych w dwóch nabłonkowych liniach komórkowych

DOI:

10.3791/63528

⸱

June 22nd, 2022

 ,  ,  , 
1Molecular Medicine, Hospital for Sick Children, 2Cell Biology, Hospital for Sick Children, 3Department of Physiology, University of Toronto, 4Department of Paediatrics, University of Toronto, 5Department of Biochemistry, University of Toronto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę badania elektrogenicznych białek błonowych poprzez pomiar zmian potencjału błonowego. Test ten stanowi platformę do funkcjonalnego odczytu wielu kanałów jonowych ulegających endogenicznej ekspresji w liniach komórkowych nabłonka.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania oparte na fluorescencji są odpowiednie do wysokoprzepustowych testów komórek w hodowli. Są one powszechnie stosowane w kampaniach odkrywania leków ukierunkowanych na nadekspresję białek rekombinowanych kanałów jonowych w komórkach, takich jak komórki HEK-293. Coraz większy nacisk kładzie się jednak na wykorzystanie linii komórkowych istotnych dla tkanek do badania efektów interwencji na małych cząsteczkach. Poniższy protokół opisuje adaptację testu potencjału błonowego opartego na fluorescencji do badania kanałów jonowych endogenicznie eksprymowanych w liniach komórkowych nabłonka. Test potencjału błonowego szczegółowo opisuje wysokoprzepustowy test aktywności kanałów chlorkowych transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy (CFTR) w dwóch powszechnie badanych liniach komórek nabłonkowych, Caco-2 i Calu-3. Ponadto w artykule opisano nowatorskie zastosowanie tego systemu do pomiaru aktywności nabłonkowego kanału sodowego (ENaC) w formacie wysokoprzepustowym w tych samych liniach komórkowych nabłonka. Razem, te testy oparte na fluorescencji stanowią solidną i elastyczną platformę do badania modulatorów małocząsteczkowych, ukierunkowanych na dwa kanały nabłonkowe w odpowiednim kontekście komórkowym.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oparte na fluorescencji, wysokoprzepustowe testy aktywności białek kanału rekombinowanego okazały się bardzo skuteczne w identyfikacji modulatorów małocząsteczkowych, które mają potencjał, aby stać się przyszłymi terapiami1,2,3,4. Jedną z powszechnych metod badania przesiewowego bibliotek małych cząsteczek pod kątem modulatorów kanałów jonowych jest pomiar zmian potencjału błonowego. Zazwyczaj te badania przesiewowe są przeprowadzane przy użyciu kanałów rekombinowanych wyrażonych heterologicznie w liniach komórkowych, takich jak komórki HEK-2935,6,7.

Istnieje jednak potrzeba walidacji "trafień" w odpowiednich typach komórek. Sugerujemy, że pożądane jest wtórne badanie przesiewowe w odpowiednich liniach komórkowych, które endogennie wyrażają interesujące nas kanały. Takie wtórne badanie przesiewowe pozwoli zidentyfikować te modulatory, które z największym prawdopodobieństwem okażą się skuteczne w końcowych testach walidacyjnych, które opierają się na mniej dostępnych pierwotnych tkankach ludzkich.

Istnieje również potrzeba systemów testowych, które mają elastyczność w raportowaniu aktywności wielu celów kanałów jonowych w tym samym typie tkanki. Na przykład istnieje merytoryczna opublikowana literatura, która wspiera koncepcję, że CFTR i ENaC funkcjonalnie współdziałają8,9,10. Chociaż wiadomo, że kilka dobrze przebadanych linii komórek nabłonkowych wykazuje ekspresję zarówno CFTR, jak i ENaC, do tej pory nie opisano warunków testowych do badania obu w sposób wysokoprzepustowy.

Ten oparty na fluorescencji test potencjału błonowego jest wszechstronny, ponieważ wykorzystuje egzogenną sondę chemiczną do pomiaru funkcji CFTR i ENaC, omijając potrzebę genetycznie kodowanych sond11. Jako dowód zasadności, dwie powszechnie stosowane linie komórkowe nabłonka są badane jako przykłady, aby podkreślić krytyczne kroki niezbędne do pomiaru aktywności kanałów zarówno CFTR, jak i ENaC.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Posiewanie i różnicowanie komórek

  1. Hodowla komórek Calu-3 i Caco-2 w EMEM zawierających 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny (wstrzykiwacz/paciorkowiec) w kolbie T-75.
  2. Gdy komórki osiągną 80-100% zbieżności, należy odessać pożywkę z kolby T-75.
  3. Delikatnie umyj komórki 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  4. Dodać 2 ml wstępnie podgrzanej 0,25% trypsyny/0,1% EDTA do monowarstwy komórek i umieścić kolbę T-75 w temperaturze 37 °C na około 5 minut, aby umożliwić komórkom podniesienie się z powierzchni kolby hodowlanej i dysocjację do zawiesiny jednokomórkowej.
  5. Po podniesieniu komórek z powierzchni kolby, zneutralizować reakcję za pomocą 8 ml pożywki hodowlanej (krok 1.1), co daje w sumie 10 ml zawiesiny komórek.
    UWAGA: Mechanicznie zdysocjować zlepiska komórek w zawiesinę jednokomórkową za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
  6. Umieść komórki na płytce 96-dołkowej (~140 000-150 000 komórek/dołek) lub 384-dołkowej płytce (~45 000-50 000 komórek/dołek) przy 30-40% konfluencji.
    1. Aby pokryć jedną pełną 96-dołkową płytkę, dodaj 1,5 ml zawiesiny komórek do 18,5 ml pożywki hodowlanej w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Po wymieszaniu dodać 200 μl zawiesiny komórek do każdego dołka.
    2. Aby pokryć jedną pełną 384-dołkową płytkę, dodaj 1 ml zawiesiny komórek do 17 ml pożywki hodowlanej w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Po wymieszaniu dodać 50 μl zawiesiny komórek do każdego dołka.
      UWAGA: Upewnij się, że nie ma grudek komórek, a pojedyncze komórki są równomiernie rozmieszczone w każdym dołku.
  7. Zmieniaj podłoże co 2 dni po poszyciu. Jeśli komórki nie osiągną zbiegu w tym samym czasie między różnymi studzienkami, wyrzuć płytkę i powtórz krok 1.5.
  8. Po wysianiu poczekaj, aż komórki osiągną 100% zbieżność w ciągu 3-5 dni. Zmienić pożywkę na 24 godziny przed badaniami funkcjonalnymi.

2. Przygotowanie roztworu buforowego do testu funkcjonalnego CFTR

  1. Przygotować roztwór buforowy wolny od sodu i chlorków z odczynnikami wymienionymi w tabeli 1.
  2. Dodać odczynniki do podwójnie destylowanego H2O (ddH2O) do hodowli tkankowej. Pozwól odczynnikom się rozpuścić (w zamkniętym pojemniku, aby uniknąć parowania), mieszając przez noc w temperaturze pokojowej.
  3. Gdy roztwór się ustabilizuje, zmierz pH. Jeśli pH roztworu przekracza 7,4, dodawać kroplami 1 M roztwór N-metylo-D-glukaminy (NMDG), aby dostosować pH do 7.4.
    UWAGA: Nie należy regulować pH roztworu za pomocą HCl, ponieważ roztwór musi pozostać wolny od chlorków.
  4. Pozostaw roztwór do wymieszania przez kolejne 30 minut i zmierz osmolarność roztworu.
    1. Zmniejszyć osmolarność roztworu buforowego do fizjologicznego zakresu 300 ± 5 mOsm/kg.
  5. Przefiltrować i przechowywać roztwór buforowy w sterylnych butelkach.
    UWAGA: Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy. Jeśli jest przechowywany dłużej niż 6 miesięcy, przed użyciem sprawdź pH i osmolarność w temperaturze pokojowej.

3. Test funkcjonalny CFTR

  1. Rozpuścić barwnik potencjału błonowego w roztworze buforowym bez sodu i chlorków (0,5 mg barwnika/1 ml roztworu buforowego) i ogrzać go do temperatury 37 °C.
    UWAGA: Unikaj wystawiania proszku barwnika o potencjale membranowym na działanie światła.
  2. Usunąć pożywkę hodowlaną z monowarstw komórek Calu-3 lub Caco-2 i dodać roztwór zawierający barwnik do każdej studzienki (195 μl na studzienkę dla płytki 96-dołkowej, 95 μl na studzienkę dla płytki 384-dołkowej).
    UWAGA: Można dodać do 112 μl na dołek z płytek 384-dołkowych.
  3. Pozwól komórkom załadować barwnik przez 35 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  4. Przenieś ogniwa załadowane roztworem barwnika do czytnika płytek fluorescencyjnych. Pomiary fluorescencji należy wykonać od spodu płytki, przy wzbudzeniu = 530 ± 5 nm, emisji = 560 ± 5 nm
  5. Rozpocznij od wykonywania ciągłych odczytów linii podstawowej przez 5 minut w odstępach 30 sekund.
  6. Dodać 5 μl roztworu forskoliny lub DMSO o niskim stężeniu do każdego dołka, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM forskoliny (1x). Wykonuj odczyt stymulacji przez 20 minut z pomiarami w odstępach 15 sekund.
    1. Dla formatu płytki 96-dołkowej należy przygotować roztwór forskoliny o niskim stężeniu (40 μM (rozcieńczenie 1:25)) forskoliny, rozcieńczając 2 μl 1 mM roztworu podstawowego forskoliny (1000x) lub DMSO w 48 μl bezsodowego, bezchlorkowego roztworu buforowego.
      UWAGA: Po forskolinie o niskim stężeniu 40 μM następuje drugie rozcieńczenie (rozcieńczenie 1:40) w następnym kroku, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM forskoliny.
    2. Dla formy płytki 384-dołkowej należy przygotować roztwór o niskim stężeniu (20 μM forskoliny (rozcieńczenie 1:50)) przez rozcieńczenie 1 μl 1 mM (1000x) roztworu podstawowego forskoliny lub DMSO w 49 μl bezsodowego, bezchlorkowego roztworu buforowego.
      UWAGA: Po forskolinie o niskim stężeniu 20 μM następuje drugie rozcieńczenie (rozcieńczenie 1:20) w następnym kroku, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM forskoliny.
  7. Dodać 5 μl roztworu CFTRInh172 o niskim stężeniu, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM CFTRInh172. Wykonaj odczyt inhibicji przez 15 minut z pomiarami w odstępach 30 s.
    1. W przypadku formy płytki 96-dołkowej należy przygotować roztwór CFTRInh172 o niskim stężeniu (400 μM CFTRInh172 (rozcieńczenie 1:25)) przez rozcieńczenie 2 μl 10 mM CFTRInh172 (1 000x) roztworu podstawowego w 48 μl roztworu buforowego bez sodu i chlorków.
      UWAGA: Po niskim stężeniu 400 μM CFTRInh172 następuje drugie rozcieńczenie (rozcieńczenie 1:40) w następnym etapie, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM CFTRInh172.
    2. Dla formy płytki 384-dołkowej należy przygotować roztwór CFTRInh172 o niskim stężeniu (200 μM CFTRInh172 (rozcieńczenie 1:50)) przez rozcieńczenie 1 μl 10 mM CFTRInh172 (1000x) roztworu podstawowego w 49 μl bezsodowego, wolnego od chlorków roztworu buforowego.
      UWAGA: Po niskim stężeniu 200 μM CFTRInh172 następuje drugie rozcieńczenie (rozcieńczenie 1:20) w następnym etapie, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM CFTRInh172.
  8. Określ ilościowo pomiary intensywności fluorescencji każdego dołka i wyeksportuj wartości jako arkusz kalkulacyjny w formacie kolumnowym zawierającym poszczególne dołki. Aby obliczyć zmiany wywołane forskoliną, podziel pomiary RFU (względne jednostki fluorescencji) z każdej studzienki płytki 96- lub 384-dołkowej przez ostatni pomiar intensywności fluorescencji odczytu linii podstawowej i wykreśl je.
    1. Alternatywnie, określ ilościowo odpowiedź hamowania za pośrednictwem CFTRInh172, aby lepiej potwierdzić specyficzność funkcji CFTR 12, ponieważ ostre leczenie forskoliną może powodować depolaryzację błony poprzez aktywność innych kanałów chlorkowych, takich jak SLC26A912.
  9. Zmierz odpowiedzi pikowe jako maksymalny pomiar intensywności fluorescencji od linii wyjściowej podczas stymulacji forskoliny. Użyj tego pomiaru lub obszaru pod krzywą, aby określić ilościowo odpowiedź CFTR.

4. Przygotowanie roztworu buforowego do testu funkcjonalnego ENaC

  1. Przygotować wysokosodowy, wolny od chlorków roztwór buforowy z odczynnikami wymienionymi w tabeli 2.
  2. Gdy roztwór się ustabilizuje, zmierz pH. Jeśli pH roztworu jest poniżej 7,4, dodawać kroplami 1 N roztwór NaOH, aby dostosować pH do 7.4.
    UWAGA: Nie należy regulować pH roztworu za pomocą HCl, ponieważ roztwór musi pozostać wolny od chlorków.
  3. Zmniejszyć osmolarność roztworu buforowego do fizjologicznego zakresu 300 ± 5 mOsm/kg.
  4. Przefiltrować i przechowywać roztwór buforowy w sterylnych butelkach w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.
    UWAGA: Jeśli przechowywanie jest dłuższe niż 6 miesięcy, przed użyciem sprawdź pH i osmolarność w temperaturze pokojowej.

5. Test funkcjonalny ENaC

  1. Rozpuścić barwnik potencjału błonowego w wysokosodowym, bezchlorkowym roztworze buforowym (0,5 mg barwnika/1 ml roztworu buforowego) i ogrzać go do temperatury 37 °C.
    UWAGA: Unikaj wystawiania proszku barwnika o potencjale membranowym na działanie światła.
  2. Usunąć pożywkę hodowlaną z monowarstw komórek Calu-3 lub Caco-2 i dodać roztwór zawierający barwnik do każdej studzienki (195 μl na studzienkę dla płytek 96-dołkowych, 95 μl na studzienkę dla płytek 384-dołkowych).
    UWAGA: Unikaj wystawiania roztworu barwnika na działanie światła.
  3. Pozwól komórkom załadować barwnik przez 35 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  4. Przenieś ogniwa załadowane roztworem barwnika do czytnika płytek fluorescencyjnych. Odczyt pomiarów fluorescencji od spodu płytki, przy wzbudzeniu = 530 ± 5 nm, emisji = 560 ± 5 nm.
  5. Rozpocznij od wykonywania ciągłych odczytów linii podstawowej przez 5 minut w odstępach 30 sekund.
  6. Aby zahamować funkcję ENaC, należy dodać 5 μl roztworu amilorydu o niskim stężeniu lub roztworu DMSO o niskim stężeniu rozpuszczonego w roztworze buforowym o wysokiej zawartości sodu i roztworze buforowym o zerowej zawartości chlorków, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM amilorydu.
    1. Dla formy płytki 96-dołkowej należy przygotować roztwór amilorydu o niskim stężeniu (400 μM amilorydu (rozcieńczenie 1:25)) przez rozcieńczenie 2 μl 10 mM roztworu podstawowego amilorydu (1000x) w 48 μl wysokosodowego, bezchlorkowego roztworu buforowego.
      UWAGA: Po amilorydzie o niskim stężeniu 400 μM następuje drugie rozcieńczenie (rozcieńczenie 1:40) w następnym etapie, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM amilorydu.
    2. Dla formy płytki 384-dołkowej należy przygotować roztwór amilorydu o niskim stężeniu (200 μM amilorydu (rozcieńczenie 1:50)) przez dodanie 1 μl 10 mM roztworu podstawowego amilorydu (1000x) w 49 μl wysokosodowego, bezchlorkowego roztworu buforowego.
      UWAGA: Po niskim stężeniu 200 μM amilorydu następuje drugie rozcieńczenie (rozcieńczenie 1:20) w następnym etapie, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM amilorydu.
  7. Wykonaj odczyt inhibicji przez 60 minut z pomiarami w odstępach 45 s.
  8. Powtórz krok 3.7 w celu analizy danych.
  9. Zmierz odpowiedź amilorydową jako procentowe zahamowanie od linii podstawowej do punktu plateau, około 15-20 minut po dodaniu amilorydu. Użyj tej różnicy, aby określić ilościowo odpowiedź ENaC.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zmierzyć aktywność kanału CFTR, dobrze zróżnicowane, przylegające do siebie komórki są inkubowane w roztworze zewnątrzkomórkowym o zerowej zawartości chlorków, zawierającym barwnik wrażliwy na potencjał błony. Funkcja CFTR jest konsekwentnie wykrywana jako depolaryzacja błony po stymulacji forskoliny. Wypływ chlorków jest wykrywany jako gwałtowny wzrost fluorescencji w porównaniu z kontrolą pojazdu. Sygnał fluorescencyjny jest podtrzymywany do momentu dodania inhibitora CFTR (CFTRInh172), co prowadzi do szybkiego spadku intensywności fluorescencji, jak widać w komórkach Caco-2 (Figura 1A) i jest odtwarzalna zarówno w komórkach Caco-2, jak i Calu-3 (Figura 1B). Ocena aktywności CFTR jako różnica w maksymalnej zmianie fluorescencji po forskolinie lub DMSO (nośniku). Poszczególne punkty mieściły się w zakresie ± 3 odchyleń standardowych od średniej stymulacji forskoliny (czarne punkty) lub kontroli DMSO (szare punkty), co odpowiadało współczynnikowi Z' wynoszącemu 0,586. Ten doskonały wynik wskazał na odtwarzalność tego testu (Rysunek 1C). W przypadku niewielkiego odchylenia w linii podstawowej, wpływ dryftu można zminimalizować poprzez ekstrapolację linii podstawowej na całym śladzie po aktywacji aż do punktu dodania inhibitora. Odpowiedź można określić ilościowo jako obszar pod krzywą, przy czym dolna granica jest zdefiniowana przez ekstrapolowaną linię.

Aktywność ENaC może być również mierzona w zlewających się komórkach nabłonka dróg oddechowych i okrężnicy hodowanych na 96-dołkowych płytkach. W przeciwieństwie do testu aktywności kanału CFTR, komórki te są zanurzone w roztworze o wysokiej zawartości sodu, umożliwiającym wchłanianie sodu przez ENaC. Przy ostrym dodaniu amilorydu wychwyt sodu jest blokowany, a komórki doświadczają względnej hiperpolaryzacji błony. Jest to pokazane w komórkach Caco-2 zarówno przy niskich (10 μM) (Figura 2A), jak i wysokich stężeniach (50 μM) amilorydu (Figura 2A, B) oraz w komórkach Calu-3 o wysokim stężeniu amilorydu (50 μM) (Figura 2B). Test ENaC został rozszerzony do formatu płytki 384-dołkowej i wykazał dużą odtwarzalność w hamowaniu ENaC. Podobnie, poszczególne punkty mieściły się w zakresie ± 3 odchyleń standardowych od średniego hamowania amilorydów (czarne punkty) lub kontroli DMSO (szare punkty). Odpowiedź ENaC w komórkach Calu-3 wykazała współczynnik Z' wynoszący 0,629 przy ostrym leczeniu przy użyciu amilorydu (50 μM) (Figura 2C), co wskazuje, że parametry te wspierają wysokoprzepustowe badania przesiewowe.

figure-results-1
Rysunek 1: Pomiar kanału CFTR jako zmian w depolaryzacji błony w komórkach Caco-2 i Calu-3. (A) Reprezentatywny ślad stymulacji CFTR za pomocą forskoliny (1 μM) i kontroli DMSO w komórkach Caco-2. (B) Wykres pudełkowy i wąsowy stymulacji forskoliny w komórkach Caco-2 i Calu-3 (**** P < 0,0001, n > 3 kontrprób biologicznych, n > 3 kontrprób technicznych). Kontrpróby biologiczne są niezależnymi pasażami linii komórkowej; Powtórzenia techniczne odnoszą się do niezależnych studzienek płytek wielodołkowych. Wykres pudełkowy przedstawia wartość mediany; granice reprezentują IQR, przy czym wąsy definiują wartości minimów i maksimów. (C) Wykres Blanda-Altmana odtwarzalnej odpowiedzi CFTR ze stymulacją forskoliny w porównaniu z kontrolą DMSO w komórkach Caco-2. Czarne punkty reprezentują maksymalne bezwzględne zmiany fluorescencji w odpowiedzi na stymulację forskoliny. Szare punkty reprezentują zmiany fluorescencji w odpowiedzi na kontrolę DMSO. Skróty: CFTR = Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator; DMSO = sultlenek dimetylu; IQR = rozstęp międzykwartylowy; Fsk = forskolina; ΔF/F0 = zmiana fluorescencji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Pomiary inhibicji ENaC poprzez hiperpolaryzację błony w komórkach Caco-2 i Calu-3. (A) Reprezentatywny ślad inhibicji ENaC za pomocą amilordu (10 μM) w stosunku do kontroli DMSO w komórkach Caco-2. (B) Wykres pudełkowy i wąsowy inhibicji amilorydów w komórkach Caco-2 i Calu-3 (**** P < 0,0001, n > 3 kontrprób biologicznych, n > 3 kontrprób technicznych). (C) Wykres Blanda-Altmana odtwarzalnej odpowiedzi ENaC z hamowaniem amilorydów w porównaniu z kontrolą DMSO w komórkach Calu-3. Czarne punkty reprezentują maksymalne bezwzględne zmiany fluorescencji w odpowiedzi na hamowanie amilorydów. Szare punkty reprezentują zmiany fluorescencji w odpowiedzi na kontrolę DMSO. Skróty: ENaC = nabłonkowy kanał sodowy; DMSO = sultlenek dimetylu; Amil. = amiloryd; ΔF/F0 = zmiana fluorescencji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

nazwakoncentracja
NMDG (N-metylo-D-glukamina)150 mM
Kwas glukonowy Lakton150 mM
Glukonian potasu3 mM
HEPESY10 mM

Tabela 1: Odczynniki i odpowiadające im stężenia do testu funkcjonalnego CFTR z zerowym sodem i chlorkiem. Skrót: CFTR = Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator).

nazwakoncentracja
Glukonian sodu150 mM
Glukonian potasu3 mM
HEPESY10 mM

Tabela 2: Odczynniki i odpowiadające im stężenia dla funkcjonalnego buforu testowego ENaC o wysokiej zawartości sodu, zero chlorków. Skrót: ENaC = Kanał sodowy nabłonkowy (Na).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisaliśmy oparte na fluorescencji metody pomiaru aktywności CFTR i ENaC w linii komórkowej nabłonkowego raka jelita grubego, Caco-2, oraz w linii komórkowej ludzkiego nabłonkowego raka płuc, Calu-3. Te testy potencjału błonowego w liniach komórkowych nabłonka mogą być wykorzystane do potwierdzenia skuteczności związków modulujących małe cząsteczki, wcześniej zidentyfikowanych w heterologicznych systemach ekspresji, przed ostateczną walidacją in vitro w pierwotnych kulturach nabłonkowych pochodzących od pacjenta.

Konieczne jest potwierdzenie, że powyższe pomiary są odpowiednio przypisane do kanału zainteresowania. Na przykład, pomiar przypisany do CFTR powinien wykazać zależność od ekspresji białka CFTR i elektrochemicznej siły napędowej chlorku, która jest modulowana przez forskolinę i inhibitor CFTRInh-172. Podobnie, zmiany potencjału błonowego spowodowane przez amiloryd 10 μM można przypisać ENaC, jeśli są one zależne od ekspresji białka ENaC i wewnętrznej siły napędowej sodu. Chociaż potwierdziliśmy te właściwości ENaC w komórkach MDCK po transfekcji wszystkimi trzema podjednostkami ENaC2, nie potwierdziliśmy jeszcze formalnie, że odpowiedź amilorydowa mierzona w komórkach Caco-2 i Calu-3 jest nadawana przez ENaC. Jest to szczególnie ważne, ponieważ amiloryd może modulować funkcję wymiennika sodowo-protonowego NHE3 oprócz ENaC13. Możliwe, że hiperpolaryzacja wywołana amilorydem zaobserwowana w tym teście może częściowo odzwierciedlać pośrednie skutki zakwaszenia wewnątrzkomórkowego na inne kanały. Aby potwierdzić, że hiperpolaryzacja wywołana amilorydem mierzona za pomocą tego barwnika wrażliwego na potencjał błonowy jest nadawana przez ENaC w powyższych liniach komórkowych i bardziej złożonych systemach komórkowych, takich jak tkanki pochodzące z iPSC, potwierdzamy, że ta aktywność jest tracona przez wybicie obligatoryjnej podjednostki ENaC (beta) w tych liniach.

Powodzenie tych testów wymaga zwrócenia uwagi na kilka czynników. Po pierwsze, kultury nabłonkowe muszą być zlewające się i dobrze zróżnicowane. W celu pomiaru funkcji CFTR i ENaC należy posiać około 145 000 komórek na studzienkę na płytkach 96-dołkowych lub 45 000 komórek na studzienkę na płytkach 384-dołkowych. Gdy komórki nabłonkowe osiągną zbieżność (w ciągu 3-4 dni od posiewu), odczekaj 2-5 dni różnicowania. Czas ten został określony wcześniej na podstawie maksymalnej ekspresji białka CFTR przez immunoblotting14. Podobnie określono optymalny czas dla funkcjonalnej ekspresji ENaC w obu liniach komórkowych, Calu-3 i Caco-2.

Niezlewające się monowarstwy lub przerost komórek prowadzi do niskiej odtwarzalności w kontrpróbach technicznych. W przypadkach, gdy komórki w poszczególnych studzienkach nie osiągną zbiegu w tym samym czasie, płytki te należy wyrzucić. Ponadto niestabilne odczyty wyjściowe lub brak odpowiedzi na stymulację mogą wskazywać na słabą jakość komórek, którą należy wykluczyć z analizy. Zmniejszona odpowiedź na aktywator CFTR, forskolinę, lub inhibitor ENaC, amiloryd, może potencjalnie odzwierciedlać użycie nadmiernie pasażowanych komórek15. Chociaż nie stanowi to problemu dla komórek Calu-3 i Caco-2, inne komórki lub tkanki mogą nie przylegać dobrze do płytek i mogą wymagać wstępnego powlekania studzienek. Na przykład w poprzednich badaniach hodowle cholangiocytów 2D przyłączono do płytek za pomocą powłoki kolagenowej16. Alternatywnie, przyleganie tkanek jelitowych 2D zostało zwiększone za pomocą Poly-L-Lizyny2.

Ponadto, testując modulację kanałów jonowych przez małe cząsteczki za pomocą testu opartego na fluorescencji, bardzo ważne jest, aby zająć się potencjalnymi artefaktami wynikającymi z właściwości fluorescencyjnych małych cząsteczek. Aby potwierdzić swoistość odpowiedzi funkcjonalnych, testy potencjału błonowego można dalej walidować przy użyciu konwencjonalnych metod elektrofizjologicznych, takich jak badania Ussing17.

Po potwierdzeniu, że odpowiedź wykryta przez barwniki wrażliwe na potencjał błonowy jest specyficznie nadawana przez kanał będący przedmiotem zainteresowania, testy te mają ogromny potencjał do walidacji obiecujących modulatorów nabłonkowych kanałów jonowych w ich odpowiednim kontekście komórkowym. Platforma ta może wypełnić lukę między wysokoprzepustowymi ekranami modulatorów w heterologicznych systemach ekspresji a czasochłonnymi pomiarami bioelektrycznymi w trudno dostępnych tkankach pierwotnych.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Christopherowi Fladdowi i SPARC BioCentre w Szpitalu dla Chorych Dzieci za pomoc w przeprowadzeniu testów potencjału błonowego mierzących CFTR i ENaC. Praca ta była wspierana przez program CFIT z funduszami zapewnionymi przez CF Canada i Sick Kids Foundation. Prace te zostały sfinansowane przez rząd Kanady za pośrednictwem Genome Canada i Ontario Genomics Institute (OGI-148). To badanie zostało sfinansowane przez rząd Ontario. S.X. był wspierany przez stypendium doktoranckie Kanadyjskiego Towarzystwa Gastroenterologii (CAG).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Spektrum amilorydówChemicznyTCI-A2599-5GRozpuszczony w DMSO i przechowywany w temperaturze -20 & stopni; C
CFTRInh-172CF Foundation Therapeutics Rozpuszczonyw DMSO i przechowywany w temperaturze -20 & deg; C
EMEM, 1xsŻubr320-005-CL
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Żubr080-450
Urządzenia molekularnedo barwienia potencjału błonowegoR8042Przechowywane w temperaturze 4 & stopni; C
ForskolinaSigma-AldrichF3917rozpuszczona w DMSO i przechowywana w temperaturze -20 & deg; C
Kwas glukonowy lakton lub (D-(+)-kwas glukonowy δ-lakton)Sigma-AldrichG4750Przechowywany w temperaturze pokojowej
HEPESBioshopHEP001.5Przechowywany w temperaturze pokojowej
Ludzka linia komórkowa gruczolakoraka oskrzeli (Calu-3)ATCCHTB-55
Ludzka linia komórkowa gruczolakoraka jelita grubego nabłonka (Caco-2)ATCCHTB-37
N-metylo-D-glukamina (NMDGSigma-AldrichM2004Przechowywany w temperaturze pokojowej
Roztwór penicyliny-streptomycynyŻubr450-200-EL
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)Żubr311-010-CL
Glukonian potasuSigma-AldrichP1847Przechowywany w temperaturze pokojowej
Glukonian soduSigma-AldrichG9005Przechowywany w temperaturze pokojowej
FLIPR

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ahmadi, S., et al. Phenotypic profiling of CFTR modulators in patient-derived respiratory epithelia. NPJ Genomic Medicine. 2, 12(2017).
  2. Xia, S., et al. High-throughput functional analysis of CFTR and other apically localized proteins in iPSC-derived human intestinal organoids. Cells. 10 (12), 3419(2021).
  3. Jiang, J. X., et al. A new platform for high-throughput therapy testing on iPSC-derived lung progenitor cells from cystic fibrosis patients. Stem Cell Reports. 16 (11), 2825-2837 (2021).
  4. Hu, J., et al. Human Embryonic Kidney 293 Cells: a vehicle for biopharmaceutical manufacturing, structural biology, and electrophysiology. Cells, Tissues, Organs. 205 (1), 1-8 (2018).
  5. Hadida, S., et al. Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (23), 9776-9795 (2014).
  6. Chen, M. X., et al. Validation and optimization of novel high-throughput assays for human epithelial sodium channels. Journal of Biomolecular Screening. 20 (2), 242-253 (2015).
  7. Maitra, R., Sivashanmugam, P., Warner, K. A rapid membrane potential assay to monitor CFTR function and inhibition. Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1132-1137 (2013).
  8. Mall, M. A. ENaC inhibition in cystic fibrosis: potential role in the new era of CFTR modulator therapies. European Respiratory Journal. 56 (6), 2000946(2020).
  9. Moore, P. J., Tarran, R. The epithelial sodium channel (ENaC) as a therapeutic target for cystic fibrosis lung disease. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 22 (8), 687-701 (2018).
  10. Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
  11. Merkert, S., et al. High-throughput screening for modulators of CFTR activity based on genetically engineered cystic fibrosis disease-specific iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1389-1403 (2019).
  12. Bertrand, C. A., et al. The CFTR trafficking mutation F508del inhibits the constitutive activity of SLC26A9. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (6), 912-925 (2017).
  13. Frelin, C., et al. Amiloride and its analogs as tools to inhibit Na+ transport via the Na+ channel the Na+/H+ antiport and the Na+/Ca2+ exchanger. Biochimie. 70 (9), 1285-1290 (1988).
  14. Di Paola, M., et al. SLC6A14 is a genetic modifier of cystic fibrosis that regulates Pseudomonas aeruginosa attachment to human bronchial epithelial cells. mBio. 8 (6), 02073(2017).
  15. Schiavi, S. C., et al. Biosynthetic and growth abnormalities are associated with high-level expression of CFTR in heterologous cells. American Journal of Physiology. 270, 341-351 (1996).
  16. Ogawa, M., et al. Generation of functional ciliated cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 12 (1), 6504(2021).
  17. Lu, C., Pribanic, S., Debonneville, A., Jiang, C., Rotin, D. The PY motif of ENaC, mutated in Liddle syndrome, regulates channel internalization, sorting and mobilization from subapical pool. Traffic. 8 (9), 1246-1264 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence AssayMembrane PotentialHigh Throughput ScreeningIon Channel FunctionEpithelial Cell LinesCFTR ActivityENaC ActivitySmall Molecule ModulatorsPlate Reader AssayForskolin Stimulation

Related Articles