Oparty na fluorescencji test potencjału błonowego do wysokoprzepustowego badania funkcjonalnego dwóch endogennych kanałów jonowych w dwóch nabłonkowych liniach komórkowych

Oparte na fluorescencji, wysokoprzepustowe testy aktywności białek kanału rekombinowanego okazały się bardzo skuteczne w identyfikacji modulatorów małocząsteczkowych, które mają potencjał, aby stać się przyszłymi terapiami^1,2,3,4. Jedną z powszechnych metod badania przesiewowego bibliotek małych cząsteczek pod kątem modulatorów kanałów jonowych jest pomiar zmian potencjału błonowego. Zazwyczaj te badania przesiewowe są przeprowadzane przy użyciu kanałów rekombinowanych wyrażonych heterologicznie w liniach komórkowych, takich jak komórki HEK-293^5,6,7.

Istnieje jednak potrzeba walidacji "trafień" w odpowiednich typach komórek. Sugerujemy, że pożądane jest wtórne badanie przesiewowe w odpowiednich liniach komórkowych, które endogennie wyrażają interesujące nas kanały. Takie wtórne badanie przesiewowe pozwoli zidentyfikować te modulatory, które z największym prawdopodobieństwem okażą się skuteczne w końcowych testach walidacyjnych, które opierają się na mniej dostępnych pierwotnych tkankach ludzkich.

Istnieje również potrzeba systemów testowych, które mają elastyczność w raportowaniu aktywności wielu celów kanałów jonowych w tym samym typie tkanki. Na przykład istnieje merytoryczna opublikowana literatura, która wspiera koncepcję, że CFTR i ENaC funkcjonalnie współdziałają^8,9,10. Chociaż wiadomo, że kilka dobrze przebadanych linii komórek nabłonkowych wykazuje ekspresję zarówno CFTR, jak i ENaC, do tej pory nie opisano warunków testowych do badania obu w sposób wysokoprzepustowy.

Ten oparty na fluorescencji test potencjału błonowego jest wszechstronny, ponieważ wykorzystuje egzogenną sondę chemiczną do pomiaru funkcji CFTR i ENaC, omijając potrzebę genetycznie kodowanych sond¹¹. Jako dowód zasadności, dwie powszechnie stosowane linie komórkowe nabłonka są badane jako przykłady, aby podkreślić krytyczne kroki niezbędne do pomiaru aktywności kanałów zarówno CFTR, jak i ENaC.

1. Posiewanie i różnicowanie komórek

1. Hodowla komórek Calu-3 i Caco-2 w EMEM zawierających 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny (wstrzykiwacz/paciorkowiec) w kolbie T-75.
2. Gdy komórki osiągną 80-100% zbieżności, należy odessać pożywkę z kolby T-75.
3. Delikatnie umyj komórki 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
4. Dodać 2 ml wstępnie podgrzanej 0,25% trypsyny/0,1% EDTA do monowarstwy komórek i umieścić kolbę T-75 w temperaturze 37 °C na około 5 minut, aby umożliwić komórkom podniesienie się z powierzchni kolby hodowlanej i dysocjację do zawiesiny jednokomórkowej.
5. Po podniesieniu komórek z powierzchni kolby, zneutralizować reakcję za pomocą 8 ml pożywki hodowlanej (krok 1.1), co daje w sumie 10 ml zawiesiny komórek.
   UWAGA: Mechanicznie zdysocjować zlepiska komórek w zawiesinę jednokomórkową za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
6. Umieść komórki na płytce 96-dołkowej (~140 000-150 000 komórek/dołek) lub 384-dołkowej płytce (~45 000-50 000 komórek/dołek) przy 30-40% konfluencji.
   1. Aby pokryć jedną pełną 96-dołkową płytkę, dodaj 1,5 ml zawiesiny komórek do 18,5 ml pożywki hodowlanej w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Po wymieszaniu dodać 200 μl zawiesiny komórek do każdego dołka.
   2. Aby pokryć jedną pełną 384-dołkową płytkę, dodaj 1 ml zawiesiny komórek do 17 ml pożywki hodowlanej w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Po wymieszaniu dodać 50 μl zawiesiny komórek do każdego dołka.
      UWAGA: Upewnij się, że nie ma grudek komórek, a pojedyncze komórki są równomiernie rozmieszczone w każdym dołku.
7. Zmieniaj podłoże co 2 dni po poszyciu. Jeśli komórki nie osiągną zbiegu w tym samym czasie między różnymi studzienkami, wyrzuć płytkę i powtórz krok 1.5.
8. Po wysianiu poczekaj, aż komórki osiągną 100% zbieżność w ciągu 3-5 dni. Zmienić pożywkę na 24 godziny przed badaniami funkcjonalnymi.

2. Przygotowanie roztworu buforowego do testu funkcjonalnego CFTR

1. Przygotować roztwór buforowy wolny od sodu i chlorków z odczynnikami wymienionymi w tabeli 1.
2. Dodać odczynniki do podwójnie destylowanego H₂O (ddH₂O) do hodowli tkankowej. Pozwól odczynnikom się rozpuścić (w zamkniętym pojemniku, aby uniknąć parowania), mieszając przez noc w temperaturze pokojowej.
3. Gdy roztwór się ustabilizuje, zmierz pH. Jeśli pH roztworu przekracza 7,4, dodawać kroplami 1 M roztwór N-metylo-D-glukaminy (NMDG), aby dostosować pH do 7.4.
   UWAGA: Nie należy regulować pH roztworu za pomocą HCl, ponieważ roztwór musi pozostać wolny od chlorków.
4. Pozostaw roztwór do wymieszania przez kolejne 30 minut i zmierz osmolarność roztworu.
   1. Zmniejszyć osmolarność roztworu buforowego do fizjologicznego zakresu 300 ± 5 mOsm/kg.
5. Przefiltrować i przechowywać roztwór buforowy w sterylnych butelkach.
   UWAGA: Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy. Jeśli jest przechowywany dłużej niż 6 miesięcy, przed użyciem sprawdź pH i osmolarność w temperaturze pokojowej.

3. Test funkcjonalny CFTR

1. Rozpuścić barwnik potencjału błonowego w roztworze buforowym bez sodu i chlorków (0,5 mg barwnika/1 ml roztworu buforowego) i ogrzać go do temperatury 37 °C.
   UWAGA: Unikaj wystawiania proszku barwnika o potencjale membranowym na działanie światła.
2. Usunąć pożywkę hodowlaną z monowarstw komórek Calu-3 lub Caco-2 i dodać roztwór zawierający barwnik do każdej studzienki (195 μl na studzienkę dla płytki 96-dołkowej, 95 μl na studzienkę dla płytki 384-dołkowej).
   UWAGA: Można dodać do 112 μl na dołek z płytek 384-dołkowych.
3. Pozwól komórkom załadować barwnik przez 35 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
4. Przenieś ogniwa załadowane roztworem barwnika do czytnika płytek fluorescencyjnych. Pomiary fluorescencji należy wykonać od spodu płytki, przy wzbudzeniu = 530 ± 5 nm, emisji = 560 ± 5 nm
5. Rozpocznij od wykonywania ciągłych odczytów linii podstawowej przez 5 minut w odstępach 30 sekund.
6. Dodać 5 μl roztworu forskoliny lub DMSO o niskim stężeniu do każdego dołka, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM forskoliny (1x). Wykonuj odczyt stymulacji przez 20 minut z pomiarami w odstępach 15 sekund.
   1. Dla formatu płytki 96-dołkowej należy przygotować roztwór forskoliny o niskim stężeniu (40 μM (rozcieńczenie 1:25)) forskoliny, rozcieńczając 2 μl 1 mM roztworu podstawowego forskoliny (1000x) lub DMSO w 48 μl bezsodowego, bezchlorkowego roztworu buforowego.
      UWAGA: Po forskolinie o niskim stężeniu 40 μM następuje drugie rozcieńczenie (rozcieńczenie 1:40) w następnym kroku, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM forskoliny.
   2. Dla formy płytki 384-dołkowej należy przygotować roztwór o niskim stężeniu (20 μM forskoliny (rozcieńczenie 1:50)) przez rozcieńczenie 1 μl 1 mM (1000x) roztworu podstawowego forskoliny lub DMSO w 49 μl bezsodowego, bezchlorkowego roztworu buforowego.
      UWAGA: Po forskolinie o niskim stężeniu 20 μM następuje drugie rozcieńczenie (rozcieńczenie 1:20) w następnym kroku, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM forskoliny.
7. Dodać 5 μl roztworu CFTRInh172 o niskim stężeniu, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM CFTRInh172. Wykonaj odczyt inhibicji przez 15 minut z pomiarami w odstępach 30 s.
   1. W przypadku formy płytki 96-dołkowej należy przygotować roztwór CFTRInh172 o niskim stężeniu (400 μM CFTRInh172 (rozcieńczenie 1:25)) przez rozcieńczenie 2 μl 10 mM CFTRInh172 (1 000x) roztworu podstawowego w 48 μl roztworu buforowego bez sodu i chlorków.
      UWAGA: Po niskim stężeniu 400 μM CFTRInh172 następuje drugie rozcieńczenie (rozcieńczenie 1:40) w następnym etapie, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM CFTRInh172.
   2. Dla formy płytki 384-dołkowej należy przygotować roztwór CFTRInh172 o niskim stężeniu (200 μM CFTRInh172 (rozcieńczenie 1:50)) przez rozcieńczenie 1 μl 10 mM CFTRInh172 (1000x) roztworu podstawowego w 49 μl bezsodowego, wolnego od chlorków roztworu buforowego.
      UWAGA: Po niskim stężeniu 200 μM CFTRInh172 następuje drugie rozcieńczenie (rozcieńczenie 1:20) w następnym etapie, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM CFTRInh172.
8. Określ ilościowo pomiary intensywności fluorescencji każdego dołka i wyeksportuj wartości jako arkusz kalkulacyjny w formacie kolumnowym zawierającym poszczególne dołki. Aby obliczyć zmiany wywołane forskoliną, podziel pomiary RFU (względne jednostki fluorescencji) z każdej studzienki płytki 96- lub 384-dołkowej przez ostatni pomiar intensywności fluorescencji odczytu linii podstawowej i wykreśl je.
   1. Alternatywnie, określ ilościowo odpowiedź hamowania za pośrednictwem CFTRInh172, aby lepiej potwierdzić specyficzność funkcji CFTR ¹², ponieważ ostre leczenie forskoliną może powodować depolaryzację błony poprzez aktywność innych kanałów chlorkowych, takich jak SLC26A9¹².
9. Zmierz odpowiedzi pikowe jako maksymalny pomiar intensywności fluorescencji od linii wyjściowej podczas stymulacji forskoliny. Użyj tego pomiaru lub obszaru pod krzywą, aby określić ilościowo odpowiedź CFTR.

4. Przygotowanie roztworu buforowego do testu funkcjonalnego ENaC

1. Przygotować wysokosodowy, wolny od chlorków roztwór buforowy z odczynnikami wymienionymi w tabeli 2.
2. Gdy roztwór się ustabilizuje, zmierz pH. Jeśli pH roztworu jest poniżej 7,4, dodawać kroplami 1 N roztwór NaOH, aby dostosować pH do 7.4.
   UWAGA: Nie należy regulować pH roztworu za pomocą HCl, ponieważ roztwór musi pozostać wolny od chlorków.
3. Zmniejszyć osmolarność roztworu buforowego do fizjologicznego zakresu 300 ± 5 mOsm/kg.
4. Przefiltrować i przechowywać roztwór buforowy w sterylnych butelkach w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.
   UWAGA: Jeśli przechowywanie jest dłuższe niż 6 miesięcy, przed użyciem sprawdź pH i osmolarność w temperaturze pokojowej.

5. Test funkcjonalny ENaC

1. Rozpuścić barwnik potencjału błonowego w wysokosodowym, bezchlorkowym roztworze buforowym (0,5 mg barwnika/1 ml roztworu buforowego) i ogrzać go do temperatury 37 °C.
   UWAGA: Unikaj wystawiania proszku barwnika o potencjale membranowym na działanie światła.
2. Usunąć pożywkę hodowlaną z monowarstw komórek Calu-3 lub Caco-2 i dodać roztwór zawierający barwnik do każdej studzienki (195 μl na studzienkę dla płytek 96-dołkowych, 95 μl na studzienkę dla płytek 384-dołkowych).
   UWAGA: Unikaj wystawiania roztworu barwnika na działanie światła.
3. Pozwól komórkom załadować barwnik przez 35 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
4. Przenieś ogniwa załadowane roztworem barwnika do czytnika płytek fluorescencyjnych. Odczyt pomiarów fluorescencji od spodu płytki, przy wzbudzeniu = 530 ± 5 nm, emisji = 560 ± 5 nm.
5. Rozpocznij od wykonywania ciągłych odczytów linii podstawowej przez 5 minut w odstępach 30 sekund.
6. Aby zahamować funkcję ENaC, należy dodać 5 μl roztworu amilorydu o niskim stężeniu lub roztworu DMSO o niskim stężeniu rozpuszczonego w roztworze buforowym o wysokiej zawartości sodu i roztworze buforowym o zerowej zawartości chlorków, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM amilorydu.
   1. Dla formy płytki 96-dołkowej należy przygotować roztwór amilorydu o niskim stężeniu (400 μM amilorydu (rozcieńczenie 1:25)) przez rozcieńczenie 2 μl 10 mM roztworu podstawowego amilorydu (1000x) w 48 μl wysokosodowego, bezchlorkowego roztworu buforowego.
      UWAGA: Po amilorydzie o niskim stężeniu 400 μM następuje drugie rozcieńczenie (rozcieńczenie 1:40) w następnym etapie, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM amilorydu.
   2. Dla formy płytki 384-dołkowej należy przygotować roztwór amilorydu o niskim stężeniu (200 μM amilorydu (rozcieńczenie 1:50)) przez dodanie 1 μl 10 mM roztworu podstawowego amilorydu (1000x) w 49 μl wysokosodowego, bezchlorkowego roztworu buforowego.
      UWAGA: Po niskim stężeniu 200 μM amilorydu następuje drugie rozcieńczenie (rozcieńczenie 1:20) w następnym etapie, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM amilorydu.
7. Wykonaj odczyt inhibicji przez 60 minut z pomiarami w odstępach 45 s.
8. Powtórz krok 3.7 w celu analizy danych.
9. Zmierz odpowiedź amilorydową jako procentowe zahamowanie od linii podstawowej do punktu plateau, około 15-20 minut po dodaniu amilorydu. Użyj tej różnicy, aby określić ilościowo odpowiedź ENaC.

Aby zmierzyć aktywność kanału CFTR, dobrze zróżnicowane, przylegające do siebie komórki są inkubowane w roztworze zewnątrzkomórkowym o zerowej zawartości chlorków, zawierającym barwnik wrażliwy na potencjał błony. Funkcja CFTR jest konsekwentnie wykrywana jako depolaryzacja błony po stymulacji forskoliny. Wypływ chlorków jest wykrywany jako gwałtowny wzrost fluorescencji w porównaniu z kontrolą pojazdu. Sygnał fluorescencyjny jest podtrzymywany do momentu dodania inhibitora CFTR (CFTRInh172), co prowadzi do szybkiego spadku intensywności fluorescencji, jak widać w komórkach Caco-2 (Figura 1A) i jest odtwarzalna zarówno w komórkach Caco-2, jak i Calu-3 (Figura 1B). Ocena aktywności CFTR jako różnica w maksymalnej zmianie fluorescencji po forskolinie lub DMSO (nośniku). Poszczególne punkty mieściły się w zakresie ± 3 odchyleń standardowych od średniej stymulacji forskoliny (czarne punkty) lub kontroli DMSO (szare punkty), co odpowiadało współczynnikowi Z' wynoszącemu 0,586. Ten doskonały wynik wskazał na odtwarzalność tego testu (Rysunek 1C). W przypadku niewielkiego odchylenia w linii podstawowej, wpływ dryftu można zminimalizować poprzez ekstrapolację linii podstawowej na całym śladzie po aktywacji aż do punktu dodania inhibitora. Odpowiedź można określić ilościowo jako obszar pod krzywą, przy czym dolna granica jest zdefiniowana przez ekstrapolowaną linię.

Aktywność ENaC może być również mierzona w zlewających się komórkach nabłonka dróg oddechowych i okrężnicy hodowanych na 96-dołkowych płytkach. W przeciwieństwie do testu aktywności kanału CFTR, komórki te są zanurzone w roztworze o wysokiej zawartości sodu, umożliwiającym wchłanianie sodu przez ENaC. Przy ostrym dodaniu amilorydu wychwyt sodu jest blokowany, a komórki doświadczają względnej hiperpolaryzacji błony. Jest to pokazane w komórkach Caco-2 zarówno przy niskich (10 μM) (Figura 2A), jak i wysokich stężeniach (50 μM) amilorydu (Figura 2A, B) oraz w komórkach Calu-3 o wysokim stężeniu amilorydu (50 μM) (Figura 2B). Test ENaC został rozszerzony do formatu płytki 384-dołkowej i wykazał dużą odtwarzalność w hamowaniu ENaC. Podobnie, poszczególne punkty mieściły się w zakresie ± 3 odchyleń standardowych od średniego hamowania amilorydów (czarne punkty) lub kontroli DMSO (szare punkty). Odpowiedź ENaC w komórkach Calu-3 wykazała współczynnik Z' wynoszący 0,629 przy ostrym leczeniu przy użyciu amilorydu (50 μM) (Figura 2C), co wskazuje, że parametry te wspierają wysokoprzepustowe badania przesiewowe.

Rysunek 1: Pomiar kanału CFTR jako zmian w depolaryzacji błony w komórkach Caco-2 i Calu-3. (A) Reprezentatywny ślad stymulacji CFTR za pomocą forskoliny (1 μM) i kontroli DMSO w komórkach Caco-2. (B) Wykres pudełkowy i wąsowy stymulacji forskoliny w komórkach Caco-2 i Calu-3 (**** P < 0,0001, n > 3 kontrprób biologicznych, n > 3 kontrprób technicznych). Kontrpróby biologiczne są niezależnymi pasażami linii komórkowej; Powtórzenia techniczne odnoszą się do niezależnych studzienek płytek wielodołkowych. Wykres pudełkowy przedstawia wartość mediany; granice reprezentują IQR, przy czym wąsy definiują wartości minimów i maksimów. (C) Wykres Blanda-Altmana odtwarzalnej odpowiedzi CFTR ze stymulacją forskoliny w porównaniu z kontrolą DMSO w komórkach Caco-2. Czarne punkty reprezentują maksymalne bezwzględne zmiany fluorescencji w odpowiedzi na stymulację forskoliny. Szare punkty reprezentują zmiany fluorescencji w odpowiedzi na kontrolę DMSO. Skróty: CFTR = Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator; DMSO = sultlenek dimetylu; IQR = rozstęp międzykwartylowy; Fsk = forskolina; ΔF/F0 = zmiana fluorescencji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Pomiary inhibicji ENaC poprzez hiperpolaryzację błony w komórkach Caco-2 i Calu-3. (A) Reprezentatywny ślad inhibicji ENaC za pomocą amilordu (10 μM) w stosunku do kontroli DMSO w komórkach Caco-2. (B) Wykres pudełkowy i wąsowy inhibicji amilorydów w komórkach Caco-2 i Calu-3 (**** P < 0,0001, n > 3 kontrprób biologicznych, n > 3 kontrprób technicznych). (C) Wykres Blanda-Altmana odtwarzalnej odpowiedzi ENaC z hamowaniem amilorydów w porównaniu z kontrolą DMSO w komórkach Calu-3. Czarne punkty reprezentują maksymalne bezwzględne zmiany fluorescencji w odpowiedzi na hamowanie amilorydów. Szare punkty reprezentują zmiany fluorescencji w odpowiedzi na kontrolę DMSO. Skróty: ENaC = nabłonkowy kanał sodowy; DMSO = sultlenek dimetylu; Amil. = amiloryd; ΔF/F0 = zmiana fluorescencji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Odczynniki i odpowiadające im stężenia do testu funkcjonalnego CFTR z zerowym sodem i chlorkiem. Skrót: CFTR = Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator).

Tabela 2: Odczynniki i odpowiadające im stężenia dla funkcjonalnego buforu testowego ENaC o wysokiej zawartości sodu, zero chlorków. Skrót: ENaC = Kanał sodowy nabłonkowy (Na).

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.