Tutaj opisujemy nową, szybką technikę modelowania uszkodzenia otwartego rdzenia kręgowego u szczurów, która eliminuje laminektomię. Hemisekcję boczną wykonuje się podczas oglądania przez mikroskop. Technika ta jest wszechstronna i może być również stosowana w odcinku szyjnym, piersiowym i lędźwiowym rdzenia kręgowego innych zwierząt.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Minimalnie inwazyjna, szybka technika hemisekcji bocznej rdzenia kręgowego do modelowania otwartych urazów rdzenia kręgowego u szczurów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Techniki otwartego uszkodzenia rdzenia kręgowego modelujące urazy podobne do ran szarpanych są czasochłonne i inwazyjne, ponieważ obejmują laminektomię. Ta nowa technika eliminuje laminektomię poprzez usunięcie dwóch wyrostków kolczystych i podniesienie, a następnie przechylenie ogonowego łuku kręgowego. Pole operacyjne otwiera się bez konieczności laminektomii. Następnie wykonuje się hemisekcję boczną z bezpośrednią kontrolą widoczną pod mikroskopem. Uraz jest zminimalizowany, wymaga jedynie niewielkiej rany kostnej.
Ta technika ma kilka zalet: jest szybsza, a zatem stanowi mniejsze obciążenie dla zwierzęcia, a rana kostna jest mniejsza. Ponieważ laminektomia jest eliminowana, istnieje mniejsze prawdopodobieństwo niepożądanego uszkodzenia rdzenia kręgowego i nie ma odłamków kości, które mogą powodować problemy (odłamki kości osadzone w rdzeniu kręgowym mogą powodować obrzęk i wtórne uszkodzenia). Kanał kręgowy pozostaje nienaruszony. Głównym ograniczeniem jest to, że hemisekcję można wykonać tylko w przestrzeniach międzykręgowych.
Wyniki pokazują, że ta technika może być wykonana znacznie szybciej niż tradycyjne podejście chirurgiczne, przy użyciu laminektomii (11 min vs. 35 min). Technika ta może być przydatna dla naukowców pracujących z modelami zwierzęcymi otwartego urazu rdzenia kręgowego, ponieważ jest szeroko adaptowalna i nie wymaga żadnego dodatkowego specjalistycznego oprzyrządowania.
Wprowadzenie
Urazy rdzenia kręgowego (SCI) są niestety powszechne u ludzi. SCI mogą być skomplikowane na różne sposoby, na przykład przez infekcje, i klinicznie ważne jest zbadanie tych urazów1. Ponieważ nie ma jednego, definitywnego lekarstwa na SCI, modele zwierzęce są nadal potrzebne, aby pogłębić wiedzę badaczy i rozwinąć możliwe metody leczenia2,3. Chociaż najczęściej modelowane są urazy zamknięte (kompresja i stłuczenia), klinicznie ważne jest zrozumienie ran szarpanych, które można modelować tylko w urazach otwartych4. Modele ran otwartych z wykorzystaniem transsekcji lub hemisekcji mogą być stosowane do wykazania bardziej precyzyjnej lokalizacji rany w porównaniu z modelami obrażeń zamkniętych, ze względu na charakter urazu (stłuczenie vs. cięcie chirurgiczne). Eksperymenty z otwartymi ranami mogą rzucić światło na bardziej specyficzne uszkodzenia neuronów w kontrolowany, wiarygodny i powtarzalny sposób5. Całkowite lub częściowe przecięcie rdzenia kręgowego jest szeroko stosowaną techniką otwartą raną i można ją szczegółowo obejrzeć w artykule Browna i Martineza6.
Podczas badania otwartego uszkodzenia rdzenia kręgowego u szczurów, kilka zwierząt przedstawiło problemy, które wynikły z operacji: odłamki kości po laminektomii zagnieździły się w rdzeniu kręgowym i spowodowały obrzęk; większa rana kostna potrzebowała dużo czasu, aby się zagoić; operacja trwała zbyt długo. Opracowano alternatywną technikę chirurgiczną w celu wyeliminowania tych problemów. Celem było opracowanie szybszej techniki, która jest łagodniejsza dla zwierzęcia. Ta nowo opracowana technika jest znacznie szybsza niż tradycyjne techniki SCI. Podejście chirurgiczne jest minimalnie inwazyjne, co skutkuje mniejszą raną kostną przy jednoczesnym wyeliminowaniu problemów wynikających z laminektomii.
Wszystkie techniki otwartego leczenia ran polegają na otwarciu dura7. W kilku ostatnich badaniach przeanalizowano różne, nowo opracowane techniki, mające na celu ulepszenie poprzednich metod8,9. Mimo że nie można wykluczyć otwarcia opony twardej przy użyciu tej nowej techniki, powoduje ona mniejszą ranę na oponie twardej, oferując jednocześnie niezawodne, kontrolowane uszkodzenie rdzenia kręgowego. Konsultując się z literaturą na temat technik urazów rdzenia kręgowego, wielu autorów starało się zminimalizować czas operacji, wprowadzając drobne zmiany do oryginalnej techniki10. Laminektomia jest zawsze częścią tych zabiegów chirurgicznych, chociaż jest czasochłonna i wymaga wykonania większej rany kostnej6. Ta technika chirurgiczna może być odpowiednia dla badaczy wykorzystujących modele uszkodzeń rdzenia kręgowego z otwartymi ranami, w szczególności pełną transsekcję lub hemisekcję boczną wykonywaną w przestrzeniach międzykręgowych (Ryc. 1).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z dyrektywą UE (2010/63/EU) i zostały zatwierdzone przez komisję etyki ds. zwierząt Węgierskiego Krajowego Urzędu Bezpieczeństwa Łańcucha Żywnościowego (PEI/001/2894-11/2014). Podczas badania przestrzegano wszystkich obowiązujących instytucjonalnych i rządowych przepisów dotyczących etycznego wykorzystania zwierząt.
1. Przygotowanie przed operacją
- Przed przystąpieniem do procedury wysterylizować wszystkie używane instrumenty (patrz Tabela materiałów) oraz zdezynfekować powierzchnie, na których będzie wykonywana praca.
- Profilaktycznie podać pojedynczą dawkę antybiotyku podskórnie.
UWAGA: Szczegóły dotyczące dawkowania antybiotyku znajdują się w Tabeli materiałów. - Pozostawić zwierzęta w sali operacyjnej na 1 h w celu aklimatyzacji i zmniejszenia poziomu stresu przed operacją.
- Zanestezjować szczura poprzez domięśniowy zastrzyk z kombinacji ketaminy i ksylazyny (ketamina 80 mg/kg masy ciała (bw) i ksylazyna 8 mg/kg bw).
UWAGA: Oprócz znieczulenia, kombinacja ketaminy i ksylazyny zapewnia wystarczającą analgezję dla tej procedury. Schemat analgezji może być modyfikowany zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi wykorzystania zwierząt. - Podczas procedury utrzymywać szczura w cieple, korzystając z podgrzewanego stołu lub lampy podczerwieni, a także utrzymywać wilgotność oczu przez cały czas trwania znieczulenia, stosując maść oftalmiczną (nakładać ponownie w razie potrzeby).
- Utrwalić zwierzę na stole operacyjnym, używając taśmy chirurgicznej na przednich i tylnych łapach oraz ogonie, a w zależności od miejsca urazu, również na szyi. W razie potrzeby umieścić szczura w aparacie stereotaktycznym, aby ustabilizować go podczas operacji.
- Używając sterylnej nici chirurgicznej, założyć pętlę wokół górnych siekaczy szczura i przymocować ją do krawędzi stołu operacyjnego.
- Odciągnąć język na bok w celu udrożnienia dróg oddechowych.
- Wygolić sierść na grzbiecie, co najmniej 2 cm w każdym kierunku od miejsca, w którym zostanie wykonane nacięcie.
- Zdezynfekować skórę w obszarze operacyjnym co najmniej trzy razy, używając roztworu powidonu z jodem i sterylnej gazy. Szczególną uwagę należy zwrócić na namoczenie sierści wokół tego obszaru. Zabezpieczyć pole operacyjne sterylnym obłożeniem.
- Przed wykonaniem pierwszego nacięcia ocenić skuteczność znieczulenia poprzez uciskanie palców u stóp i ogona zwierzęcia. Monitorować skuteczność znieczulenia przez całą procedurę.
2. Operacja
- Wykonaj nacięcie skóry za pomocą ostrza skalpela 20. Aby otworzyć pole operacyjne, wykonaj nacięcie o długości 2-2,5 cm wzdłuż kręgosłupa, przecinając wszystkie warstwy skóry. Umieść nacięcie równolegle do kolumny kręgosłupa, przyjmując kręg L1 jako punkt środkowy, tak aby nacięcie rozciągało się na ok. 1 cm w kierunku kranio- i kaudalnym wzdłuż kolumny kręgosłupa.
- Zmobilizuj brzegi rany, przecinając tkankę łączną otaczającą mięśnie.
- Wykonaj dwa równoległe nacięcia wzdłuż kręgosłupa, penetrując okostną. Wykonaj nacięcia bezpośrednio przy wyrostkach kolczystych po obu stronach, obejmując odległość między kręgami Th13 a L1.
- Rozdziel mięśnie przytwierdzone do kręgów za pomocą raspatorium, aż wszystkie więzadła kręgosłupa staną się widoczne. Umieść rozwierak.
- Usuń wyrostki kolczyste 13th kręgu piersiowego i 1st kręgu lędźwiowego za pomocą kleszczyków kostnych stomatologicznych, aby uwidocznić cały obszar operacyjny. Od tego momentu kontroluj procedurę, obserwując powiększony obraz mikroskopowy (powiększenie 4x-16x).
- W razie potrzeby używaj sterylnej gazy do opanowania krwawienia w trakcie całej procedury.
- Ostrożnie unieś pozostałą część wyrostków kolczystych L1, wynosząc łuk kręgu L1. Przetnij ligamentum flavum, aby uzyskać dostęp do rdzenia kręgowego. Unieś dalej kaudalne wyrostki kolczyste, umożliwiając dostęp do twardówki rdzenia kręgowego, którą również należy przeciąć. Przechyl kaudalne wyrostki kolczyste w kierunku kranialnym, aby uwidocznić oponę miękką.
- Przez oponę miękką zlokalizuj żyłę tylną środkową, która wyznacza linię środkową kręgosłupa.
- Wykorzystując żyłę jako wyznacznik kierunku, wykonaj nacięcie skalpelem mikrosurgicalnym, oszczędzając żyłę. Wykonaj nacięcie pod żyłą, w płaszczyźnie poprzecznej przez średnicę przednio-tylną rdzenia kręgowego. Przetnij połowę rdzenia kręgowego, przesuwając ostrze bocznie od linii środkowej.
UWAGA: Nacięcie jest jednostronne, po prawej stronie, na wysokości 4th segmentu lędźwiowego. - Staraj się wykonać nacięcie tak, aby uniknąć przecięcia przedniej tętnicy rdzeniowej. Upewnij się, że podczas przecinania rdzenia kręgowego nie wywierasz nadmiernego nacisku na trzon kręgu, aby oszczędzić przednią tętnicę rdzeniową po stronie brzusznej rdzenia kręgowego.
Rysunek 1: Schemat przedstawiający etapy nowej otwartej techniki SCI u szczurów. (A) Odsłonięte kręgi. (B) Usunięte wyrostki kolczyste (Th13 i L1). (C) Podniesiony i przechylony łuk kręgowy kręgu L1. (D) Hemisekcja wykonana po prawej stronie, z oddzielnie pokazanym, powiększonym obrazem hemisekcji rdzenia kręgowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
- Podczas zamykania rany nie należy bezpośrednio zszywać opony twardej. Należy ściśle zaszyć (nici rozmiaru 4-0) mięśnie wzdłuż wyrostków kolczystych, w ten sposób pośrednio zamykając niewielką ranę w oponie twardej.
- Warstwę tkanki łącznej grzbietu należy zamknąć za pomocą szwów.
- Na koniec należy zaszyć skórę wokół miejsca ncięcia.
3. Opieka pooperacyjna i monitorowanie stanu pacjenta
- Pozwól zwierzętom obudzić się w klatkach. Utrzymuj zwierzęta w cieple, stosując lampę grzewczą jako uzupełnienie klimatyzowanego pomieszczenia. Nie zostawiaj szczurów bez nadzoru po przebudzeniu z narkozy i nie umieszczaj ich w jednej klatce z innymi szczurami.
- Monitoruj częstotliwość oddechów co najmniej co 10 min, aż do pełnego wybudzenia. W razie potrzeby zastosuj delikatną stymulację (np. pocieranie głowy), aby wspomóc wybudzanie z anestezji.
- Gdy zwierzęta będą czujne i odpowiednio aktywne, bezpiecznie przetransportuj je z powrotem do zwierzęca.
- Utrzymuj szczury pod ścisłą obserwacją przez pierwsze 24 h po operacji. Po upływie pierwszych 24 h po operacji sprawdzaj stan zwierząt co najmniej dwa razy dziennie aż do zakończenia eksperymentu, monitorując je pod kątem objawów stresu.
- Raz dziennie dokładnie oceniaj zwierzęta pod kątem objawów stresu, stosując odpowiedni instytucjonalny protokół dobrostanu zwierząt, i zwracaj szczególną uwagę na oznaki infekcji i stanu zapalnego w obrębie ran.
UWAGA: Stres i infekcje wpływają na dobrostan zwierząt oraz wyniki eksperymentów. - Podawaj antybiotyki podskórnie każdego dnia aż do zakończenia eksperymentów. Trzymaj zwierzęta w sterylnych klatkach (jedno zwierzę na klatkę), zapewniając pożywienie i wodę ad libitum, tak jak przed zabiegiem. Po zakończeniu eksperymentów (lub w przypadku wystąpienia jakiejkolwiek poważnej niepożądanej reakcji w trakcie trwania eksperymentu) przeprowadź humanitarną eutanazję zwierząt, zgodnie z odpowiednim instytucjonalnym protokołem dobrostanu zwierząt.
UWAGA: W tym przypadku zwierzęta poddano eutanazji (w stanie głębokiego snu wywołanego kombinacją ketaminy i ksylazyny) poprzez najpierw przeprowadzenie perfuzji solą fizjologiczną (1/3 mL/g bw), a następnie perfuzji 4% paraformaldehydem (1 mL/g bw).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po hemisekcji u szczurów występuje paraliż kończyny tylnej po stronie ipsilateralnej (in vivo dowód na pomyślną hemisekcję). Dokładna ocena preparatu jest możliwa dopiero po usunięciu rdzenia kręgowego (patrz Rycina 2, gdzie widoczny jest usunięty rdzeń kręgowy od strony brzusznej i grzbietowej).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ta minimalnie inwazyjna technika uszkodzenia rdzenia kręgowego została opracowana podczas badania szczurów z uszkodzeniem rdzenia kręgowego, a zespół stanął w obliczu problemów wynikających z samej operacji (odłamki kości z laminektomii powodujące ucisk i uszkodzenie rdzenia kręgowego, operacja trwająca zbyt długo, powolne gojenie się dużej rany kostnej). Dzięki wyeliminowaniu laminektomii zabieg stał się znacznie szybszy (11 min vs. 35 min), struktura kanału kręgowego pozostała nienaruszona, rana kostna była znacznie mn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani powiązania osobiste, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym artykule.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Gergely'emu Ángyánowi za oryginalną grafikę. Praca badawcza została sfinansowana przez Uniwersytet Semmelweisa w Budapeszcie na Węgrzech. Badanie to było również wspierane przez Węgierski Program Operacyjny Rozwoju Zasobów Ludzkich (EFOP-3.6.2-16-2017-00006). Dodatkowe wsparcie otrzymano z Programu Doskonałości Tematycznej (2020-4.1.1.-TKP2020) Ministerstwa Innowacji i Technologii na Węgrzech, w ramach programu tematycznego Terapia Uniwersytetu Semmelweisa.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Augmentin (1,000 mg/200 mg proszek) | GlaxoSmithKline, Wielka Brytania | Jednorazowa dawka antybiotyków s.c. profilaktycznie (10 mg amoksycyliny i 2 mg kwasu klawulanowego; Augmentin 1,000 mg/200 mg proszek). Każdego dnia po zabiegu 10 mg amoksycyliny i 2 mg kwasu klawulanowego (Augmentin 1 000 mg/200 mg proszek) dziennie na zwierzę | |
| Betadine | EGIS, Węgry | Zdezynfekować skórę pola operacyjnego za pomocą roztworu jodu powidonu | |
| Calypsol (50 mg/ml) | Richter Gedeon, Węgry | Znieczulenie: połączenie ketaminy 80 mg/kg i ksylazyny 8 mg/kg domięśniowo | |
| CP XYLAZIN 2% (20 mg/mL) | Produlab Pharma B.V., Holandia | Znieczulenie: połączenie ketaminy 80 mg/kg i ksylazyny 8 mg/kg domięśniowo | |
| Kleszczyki do kości dentystycznych | Dentech, Węgry | BS 0127 | Usuń wyrostki kolczyste kręgu piersiowego 13th i kręgu lędźwiowego 1st za pomocą kleszczyków do kości dentystycznych |
| Mikrosilnik chirurgiczny dentystyczny | W& H, Austria | MF-TECTORQUE Za | pomocą mikrosilnika chirurgicznego wykonuje się laminektomię w mikroskopie optycznym kręgów L1 |
| Zeiss, Niemcy | OPMI19-FC | Kontroluj procedurę, oglądając powiększony (16-krotne powiększenie) obraz mikroskopowy fizjologiczny | |
| roztwór soli fizjologicznej (0,9% NaCl) | Fresenius Kabi, Niemcy | Utrzymuj oczy szczura wilgotne przez cały czas znieczulenia za pomocą kropli roztworu soli fizjologicznej (w razie potrzeby nałóż ponownie) | |
| raspatorium | Dentech, Węgry | FK 1164 | Wypreparuj mięśnie przyczepione do kręgów za pomocą raspatorium, aż wszystkie więzadła rdzeniowe będą widoczne. |
| zwijacz | Dentech, Węgry | RT 1253 | |
| skalpel | Dentech, Węgry | Skalpel BB 173 | |
| Dentech, Węgry | BB 184 | ||
| ostrze skalpela 12 | B. Braun, Niemcy | 12 | |
| ostrzy skalpela 20 | B. Braun, Niemcy | 20 | |
| sterylna gaza cięta 10 x 10 cm | Sterilux, Hartmann, Niemcy | ||
| szwy (monofilamentowe, syntetyczne; wchłanialne i niewchłanialne), rozmiar: 4-0 | B. Braun, Niemcy | ||
| pęseta (13 cm) | Dentech, Węgry | BD 1555 | |
| (szczypce do tkanek delikatnych) | Dentech, Węgry | BD 1670 |
Bibliografia
- Failli, V., et al. Functional neurological recovery after spinal cord injury is impaired in patients with infections. Brain. 135, Pt 11 3238-3250 (2012).
- Guan, B., Chen, R., Zhong, M., Liu, N., Chen, Q. Protective effect of Oxymatrine against acute spinal cord injury in rats via modulating oxidative stress, inflammation and apoptosis. Metabolic Brain Disease. 35 (1), 149-157 (2020).
- Kjell, J., Olson, L. Rat models of spinal cord injury: from pathology to potential therapies. Disease Models & Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).
- Minakov, A. N., Chernov, A. S., Asutin, D. S., Konovalov, N. A., Telegin, G. B. Experimental models of spinal cord injury in laboratory rats. Acta Naturae. 10 (3), 4-10 (2018).
- Borbély, Z., et al. Effect of rat spinal cord injury (hemisection) on the ex vivo uptake and release of [3H]noradrenaline from a slice preparation. Brain Research Bulletin. 131, 150-155 (2017).
- Brown, A. R., Martinez, M. Thoracic spinal cord hemisection surgery and open-field locomotor assessment in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59738(2019).
- Taoka, Y., Okajima, K. Spinal cord injury in the rat. Progress in Neurobiology. 56 (3), 341-358 (1998).
- Hou, S., Saltos, T. M., Iredia, I. W., Tom, V. J. Surgical techniques influence local environment of injured spinal cord and cause various grafted cell survival and integration. Journal of Neuroscience Methods. 293, 144-150 (2018).
- Mattucci, S., et al. Development of a traumatic cervical dislocation spinal cord injury model with residual compression in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 322, 58-70 (2019).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), 01324(2019).
- Ashammakhi, N., et al. Regenerative therapies for spinal cord injury. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 25 (6), 471-491 (2019).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
