Artykuł metodologiczny

Dokomorowe podawanie i pobieranie próbek leków do badania farmakokinetyki i farmakodynamiki

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63540

⸱

31 marca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry & Pharmacology, School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, The University of Melbourne, 2Department of Microbiology, Biomedicine Discovery Institute, Monash University, 3UNC Eshelman School of Pharmacy, University of North Carolina, Chapel Hill

W tym artykule

Podsumowanie

Dostarczanie leków bezpośrednio do ośrodkowego układu nerwowego jest jednym ze sposobów na obejście bariery krew-mózg. Niniejszy protokół demonstruje wstrzyknięcie domózgowo-komorowe w celu późniejszego pobrania płynu mózgowo-rdzeniowego i narządów ciała. Ułatwia to badanie farmakokinetyki i farmakodynamiki leków na modelach zwierzęcych w celu opracowania nowych metod leczenia.

Streszczenie

Chociaż bariera krew-mózg (BBB) chroni mózg przed obcymi jednostkami, zapobiega również przenikaniu niektórych leków do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w celu złagodzenia chorób lub infekcji. Leki podaje się bezpośrednio do OUN u zwierząt i ludzi w celu obejścia bariery krew-mózg. Niniejszy protokół opisuje unikalny sposób leczenia infekcji mózgu poprzez dokomorowe podawanie antybiotyków, tj. polimyksyn, antybiotyków ostatniego rzutu w leczeniu wielolekoopornych bakterii Gram-ujemnych. Opracowano prosty protokół chirurgii stereotaktycznej w celu wszczepienia kaniuli prowadzącej sięgającej do komory bocznej u szczurów. Po 24-godzinnym okresie rekonwalescencji szczurom można świadomie i wielokrotnie wstrzykiwać je przez kaniulę dopasowaną do przewodnika. Zastrzyki mogą być podawane ręcznie w bolusie lub we wlewie za pomocą pompy do mikroiniekcji, aby uzyskać powolne i kontrolowane natężenie przepływu. Wstrzyknięcie dokomorowe zostało pomyślnie potwierdzone barwnikiem Evans Blue. Płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) może zostać opróżniony, a mózg i inne narządy mogą zostać pobrane. Podejście to jest wysoce podatne na badania obejmujące dostarczanie leku do OUN, a następnie ocenę aktywności farmakokinetycznej i farmakodynamicznej.

Wprowadzenie

Bariera krew-mózg (BBB) jest kluczowym mechanizmem ochronnym dla ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Selektywnie przepuszczalna, anatomiczna bariera oddziela krążącą krew i jej substancje rozpuszczone od pozakomórkowego płynu mózgu, zapobiegając w ten sposób przedostawaniu się większości cząsteczek do mózgu1,2,3,4, w zależności od ich wielkości, lipofilowości5 oraz dostępności aktywnego mechanizmu transportu2.

Ta bariera ochronna jest korzystna dla skutecznej regulacji skomplikowanej homeostazy mózgu i zdrowia OUN4,6. Utrudnia to jednak również dostarczanie leków do leczenia infekcji mózgu lub innych chorób OUN4,7. Oprócz zakłócania bariery krew-mózg za pomocą różnych metod8,9, podstawowym podejściem do obejścia bariery krew-mózg jest dostarczenie leku bezpośrednio do mózgu poprzez uwolnienie go do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF)4. Mimo że jest to stosunkowo inwazyjna praktyka, jest z powodzeniem stosowana do dostarczania ukierunkowanych terapii pacjentom i zwierzętom laboratoryjnym. U ludzi leki mogą być dostarczane do układu dokomorowego lub płynu mózgowo-rdzeniowego, a następnie pobierane próbki za pomocą zbiornika Ommaya, zbiornika znajdującego się pod skórą głowy, podłączonego do cewnika wprowadzonego do komory bocznej10,11. Podobne techniki zostały opracowane na zwierzętach laboratoryjnych, takich jak gryzonie, aby osiągnąć równoważne cele. Myszom wszczepiono mikropompy osmotyczne12,13,14,15 i rats16,17 do ciągłego dostarczania leku do układu komorowego lub miąższu mózgu. Dodatkowo, bezpośrednie wstrzyknięcia domózgowo-komorowe przeprowadzono u znieczulonych myszy przy użyciu jednorazowej igły18,19 i przytomnych szczurów za pomocą chirurgicznie wszczepionej kaniuli20,21,22,23. Dostarczanie leków do OUN było nieocenioną metodą zwiększania zrozumienia w różnych dziedzinach20,24,25,26,27,28.

Infekcje OUNS to jedna z takich dziedzin, która pilnie potrzebuje nowych terapii i lepszego zrozumienia istniejących terapii przeciwinfekcyjnych. Szczególnie niepokojące są zakażenia OUN wywołane przez wielolekooporne bakterie Gram-ujemne7. Polimyksyny są antybiotykami ostatniego rzutu, coraz częściej stosowanymi w leczeniu zakażeń wywołanych przez te 'superbakterie'29. Gdy polimyksyny są podawane dożylnie zgodnie z aktualnymi wytycznymi dotyczącymi dawkowania30, ich przenikanie do OUN jest bardzo niskie, podczas gdy wyższe dawki zwiększają ryzyko nefrotoksyczności. Dlatego dożylna terapia polimyksynami jest mało przydatna w leczeniu infekcji OUN7. Ustalenie bezpiecznego i skutecznego schematu dawkowania polimyksyn dostarczanych do OUN jest pilną, niezaspokojoną potrzebą medyczną31,32,33. W związku z tym ustanowiono niniejszy protokół, który został opisany z naciskiem na wstrzykiwanie antybiotyków bezpośrednio do płynu mózgowo-rdzeniowego szczurów. Może być jednak stosowany do podawania dowolnego leku, który nie jest neurotoksyczny i w którym stężenia terapeutyczne mogą być podawane w małych objętościach (np. do 10 μl u szczurów). Opisane techniki można również modyfikować tak, aby celować w różne regiony mózgu i wykonywać wiele zastrzyków.

Obecny protokół przedstawia prostą technikę chirurgiczną i iniekcyjną, która pozwala na efektywną farmakokinetykę i dystrybucję leków po ICV. Zabieg polega na wszczepieniu kaniuli prowadzącej. Ponieważ jest to mniej inwazyjna procedura niż wszczepienie pompy mikroosmotycznej12,13,14,15,16,17, jest to zaawansowana opcja odpowiednia do krótkoterminowego podawania leków do płynu mózgowo-rdzeniowego. Protokół ten jest uproszczony i może zapewnić bardzo wysokie wskaźniki przeżycia i stabilną masę ciała 24 godziny po operacji, co stanowi poprawę w porównaniu z istniejącymi metodami34. Po operacji przytomne szczury otrzymywały albo ręczne wstrzyknięcie ICV w bolusie, albo wolniejsze podawanie za pomocą mikropompy w celu obniżenia szczytowego stężenia w osoczu. Jednocześnie mogły swobodnie poruszać się w swojej klatce. Aby ustalić bezpieczne i skuteczne schematy dawkowania leków, próbki płynu mózgowo-rdzeniowego, mózgu, rdzenia kręgowego, nerek, osocza itp. wykorzystano następnie do zbadania farmakokinetyki i dystrybucji leku po podaniu domózgowo-komorowym (ICV). Dystrybucja leków może być również badana wizualnie, np. za pomocą immunohistochemii lub obrazowania metodą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-MSI). W razie potrzeby można wszczepić obustronną kaniulę, np. w celu wstrzykiwania leków, które w przeciwnym razie rozprowadziłyby się jednostronnie do obu półkul.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z australijskim kodeksem opieki i wykorzystywania zwierząt do celów naukowych. Eksperymenty zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersytetu w Melbourne (wniosek #1914890). Do eksperymentów wykorzystano 8-14 tygodniowe samce i samice szczurów Sprague-Dawley.

1. Stereotaksja w kaniulacji komory bocznej

  1. Podczas operacji należy używać autoklawizowanych bawełnianych końcówek i obłożeni chirurgicznych.
  2. Skonfiguruj następujące elementy dla operacji.
    1. Skonfiguruj ramę stereotaktyczną, system dostarczania znieczulenia, leki, chemikalia i materiały pomocnicze (patrz Tabela materiałów). Wyczyść ramę stereotaktyczną, światłowodowe źródło światła, wiertarkę ręczną itp., Wyczyść 80% etanolem.
    2. Namocz kaniulę prowadzącą 22 G i powiązaną z nią atrapę kaniuli (patrz tabela materiałów) w 80% etanolu w celu sterylizacji.
      UWAGA: Producent wstępnie przyciął prowadnicę 22 G i atrapę kaniuli do długości ~4 mm poniżej cokołu.
    3. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne (patrz tabela materiałów) za pomocą sterylizatora kulek termicznych przez 20 sekund, a następnie spryskaj 80% etanolem. Umieść wysterylizowane narzędzia na sterylnym serwecie.
    4. Przygotuj pudełko do odzyskiwania (pudełko dla szczurów wyłożone podkładką), w którym połowa pudełka zostanie umieszczona na poduszce grzewczej.
  3. Wykonaj operację.
    1. Wkręć oczyszczoną etanolem kaniulę prowadzącą 22 G w uchwyt kaniuli na ramie stereotaktycznej.
    2. Umieścić szczura w komorze indukcyjnej (300 mm x 200 mm, patrz Tabela Materiałów) i wywołać znieczulenie 5% izofluranem w stężeniu 1 l/min tlenu.
    3. Gdy szczur jest głęboko znieczulony (bez odruchu pedałowania), przenieś szczura do ramy stereotaktycznej i zmniejsz izofluran do 2%-3% w 1 l / min tlenu w celu utrzymania przez stożek nosowy. Zaczep zęby o pręt gryzowy i ostrożnie przeciągnij stożek nosowy nad nosem - delikatnie pociągnij szczura do tyłu, aby sprawdzić, czy jest bezpieczny.
    4. Nałóż ochronny lubrykant do oczu na oba oczy, aby uniknąć wysuszenia.
    5. Wstrzyknąć karprofen (5 mg/kg), buprenorfinę (0,05 mg/kg) w roztworze soli fizjologicznej i 3 ml soli fizjologicznej podskórnie (s.c.) w celu złagodzenia bólu i wstrząśnienia po operacji.
    6. Ściśnij palce u stóp, aby sprawdzić, czy pedał jest odruchowywany. Po nieobecności przymocuj czaszkę szczura w ramce. Umieść jedną wkładkę uszną w przewodzie słuchowym i dokręć. Powtórz po drugiej stronie.
    7. Przesuń nauszniki na boki, aby upewnić się, że liczby podane na nausznikach są równe po obu stronach. Głowa nie powinna się poruszać podczas naciskania na czaszkę.
    8. Ogol czubek głowy maszynką do strzyżenia. Wytrzyj włosy chusteczką i solą fizjologiczną. W razie potrzeby ponownie nałóż lubrykant do oczu na oba oczy, aby uniknąć wysuszenia.
    9. Przetrzyj skórę głowy 4% chlorheksydyną i alkoholowym roztworem preparatu do skóry, używając sterylnych wacików do każdego kroku (patrz tabela materiałów). Zacznij od środka czaszki i poruszaj się w kółko na zewnątrz, aż cała powierzchnia zostanie oczyszczona.
    10. Wstrzyknąć ~150 μl ropiwakainy (1%) s.c. (patrz Tabela materiałów) wzdłuż zamierzonego miejsca nacięcia.
    11. Użyj ostrza skalpela, aby wykonać nacięcie 10-15 mm wzdłuż linii środkowej głowy, od między oczami do podstawy czaszki.
    12. Użyj bawełnianych końcówek i skalpela, aby zeskrobać tkankę łączną i odsłonić czaszkę.
    13. Zanurz sterylną bawełnianą końcówkę w 3% roztworze nadtlenku wodoru i nałóż ją na powierzchnię czaszki. Poczekaj 5 sekund, aż substancja chemiczna zareaguje ze skórą, a następnie oczyść obszar suchą bawełnianą końcówką.
    14. Zastosuj 3% nadtlenek wodoru po raz drugi. Dzięki temu linie szwów czaszki będą wyraźniejsze. Odczekaj 10 sekund, aż substancja chemiczna zareaguje ze skórą, a następnie oczyść obszar suchą bawełnianą końcówką. Umyć solą fizjologiczną i osuszyć czystą bawełnianą końcówką.
    15. Ostrożnie nałóż niewielką ilość żelu Super etch na bawełnianą końcówkę, a następnie nałóż go na powierzchnię czaszki. Tworzy to bardziej porowatą powierzchnię, do której przylega cement dentystyczny.
    16. Nałóż dużą ilość soli fizjologicznej na czaszkę, aby zmyć super wytrawiacz i wysuszyć go czystą bawełnianą końcówką.
    17. Zidentyfikuj bregmę i oznacz ją za pomocą pisaka.
    18. Wywierć wgłębienie na kotwiącą w miejscu, które nie będzie utrudniać umieszczenia kaniuli prowadzącej.
      UWAGA: Jeśli prawa boczna komora jest kaniulowana, wywierć na lewej półkuli i z tyłu w stosunku do komory.
    19. Trzymaj wiertło pod kątem ~75°-80° do czaszki i powoli wywierć wgłębienie o głębokości około połowy grubości czaszki. Użyj soli fizjologicznej na bawełnianej końcówce, aby zetrzeć kurz kostny.
    20. Ostrożnie włóż, przytrzymując ją mocno we wgłębieniu kleszczami i wkręcając ją w czaszkę śrubokrętem, unikając złamania czaszki. Po każdym pełnym obrocie sprawdź, czy śruba jest dobrze osadzona.
    21. Upewnij się, że czaszka jest płaska. Korzystając z ruchomych ramion ramy, ustaw kaniulę prowadzącą tak, aby dotykała czaszki w bregmie. Wyzeruj DV (grzbietowo-brzuszne) reprezentujące współrzędne płaszczyzny Z, naciskając przycisk na monitorze sterującym ramką.
    22. Podnieś kaniulę prowadzącą (22 G i 4 mm długości) za pomocą ruchomych ramion ramy i przesuń ją do pozycji lambda. Opuść go tak, aby dotykał powierzchni czaszki i ponownie zwróć uwagę na wyświetlacz DV.
      UWAGA: Różnica między DV przy bregmie a DV przy lambdzie powinna być mniejsza niż 0,2 mm. W razie potrzeby odpowiednio wyreguluj stożek nosowy, tj. w razie potrzeby przesuń głowę szczura w górę lub w dół i powtórz pomiary.
    23. Przesuń kaniulę prowadzącą z powrotem, aby dotknąć bregma i ponownie wyzeruj wszystkie trzy współrzędne: DV, AP (przednio-tylne) i ML (przyśrodkowo-boczne), naciskając przyciski na monitorze.
    24. Przesuń kaniulę prowadzącą do wcześniej ustalonych współrzędnych.
      UWAGA: Do kaniulacji prawej komory bocznej u dorosłego szczura o wadze 300-350 g użyto następujących współrzędnych: -0,7 mm AP, -1,4 mm ML i -4,00 mm DV (taka sama długość jak kaniula prowadząca).
    25. Zaznacz końcową pozycję kaniuli, kolorując koniec kaniuli za pomocą markera, a następnie opuszczając ją w dół na powierzchnię czaszki, aby dotknąć i zaznaczyć pozycję.
    26. Wywierć otwór o średnicy 2.3 mm na kaniulę prowadzącą 22 G, trzymając wałek wiertła w prostej pozycji pionowej, tj. pod kątem 90° do czaszki. Uważaj, aby powoli i stopniowo przesuwać się w głąb czaszki, tj. unikaj wiercenia w tkance mózgowej.
      UWAGA: W razie potrzeby opuść kaniulę do otworu za pomocą mobilnego ramienia stereotaktycznego, aby sprawdzić, czy kaniulę można pomyślnie umieścić, czy też wymagane jest dalsze wiercenie.
    27. Gdy kaniula zostanie opuszczona do mózgu, podnieś ją z powrotem do góry, ostrożnie nałóż super klej na spód plastikowego cokołu kaniuli i opuść kaniulę z powrotem do otworu za pomocą ruchomego ramienia ramy stereotaktycznej.
    28. Pozostaw na miejscu, aby klej stwardniał.
    29. Czekając, wymieszaj rozpuszczalnik dentystyczny i proszek (patrz Tabela materiałów) w łódce do ważenia. Wsyp proszek cementu dentystycznego do naczynia wagowego, użyj strzykawki o pojemności 1 ml, aby dodać ~300 μl rozpuszczalnika i mieszaj za pomocą tej samej strzykawki, aż zgęstnieje i uzyska użyteczną konsystencję. W razie potrzeby dodaj więcej proszku, aby zwiększyć lepkość lub więcej rozpuszczalnika, aby zmniejszyć lepkość.
    30. Zwolnij kaniulę z uchwytu kaniuli za pomocą dedykowanej i ostrożnie unieś ramię.
      UWAGA: Kaniulę należy przykleić do czaszki pod kątem 90°.
    31. Nałóż świeży cement dentystyczny na odsłoniętą czaszkę, wciągając go do jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml i nakładając wokół kaniuli. Unikaj cementu dentystycznego na skórze lub otworu kaniuli. Pozostaw na kilka sekund, w zależności od konsystencji.
    32. Gdy cement dentystyczny stanie się grubszy, użyj szpatułki, aby nałożyć więcej cementu dentystycznego i uformuj końcowe mocowanie głowicy całkowicie zakrywające.
      UWAGA: Uważaj, aby nie zakryć zbyt dużej części kaniuli, aby atrapa kaniuli mogła być nadal przykręcona. Usuń nadmiar cementu dentystycznego ze skóry.
    33. Włóż sterylną kaniulę atrapy, gdy cement dentystyczny jest suchy i twardy.
    34. Wyłącz izofluran, zwolnij nauszniki, wyjmij szczura z ramy i umieść go w komorze regeneracyjnej.
    35. Gdy zwierzę dojdzie do siebie ~15-30 min, umieść je w czystym pudełku.
      UWAGA: Po operacji szczury muszą być trzymane w jednym pomieszczeniu. Rozważ zastąpienie standardowych blatów klatki rusztowej, w której pojemnik na żywność opuszcza się do klatki, dedykowanymi wysoko podniesionymi blatami klatki kratowej, aby zminimalizować ryzyko zakłóceń w mocowaniu głowicy. Alternatywnie, należy odciąć wszelkie części klatki, które znajdują się znacznie niżej niż wysokość chowu zwierzęcia.
    36. Wypełnij listę kontrolną monitorowania i monitoruj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi monitorowania określonymi w protokole.
      UWAGA: Rozważ umieszczenie granulek żywności na podłodze, aby ułatwić dostęp. Jeśli nie zakłóci to eksperymentu, można zapewnić dodatkową ulgę w bólu w słodkim jedzeniu, aby zastąpić dodatkowe zastrzyki pooperacyjne s.c., np. Buprenorfina zmieszana z pastą czekoladową ze słodkich orzechów35,36,37. W tym przypadku niektóre z tych samych słodyczy zostały dostarczone jako nagroda przed i po operacji, aby uniknąć neofobii żywieniowej podczas oferowania ulgi w bólu. Pasta z orzechów może być dostarczona na taśmie przymocowanej do ściany klatki.
    37. Zaopatrz się w więcej atrap kaniul niż kaniul prowadzących lub kaniul iniekcyjnych, ponieważ mogą one zgubić się wśród ściółki klatki dla zwierząt, jeśli przypadkowo odpadną. W takim przypadku należy wymienić kaniulę na nową, sterylną atrapę kaniuli.

2. Zastrzyki ICV

  1. Przygotować lek i nośnik, np. 30 mg/ml polimyksyny B (patrz tabela materiałów) w 0,9% sterylnym roztworze soli fizjologicznej. Utrzymuj objętość wstrzyknięcia w zakresie 5-10 μl u dorosłych szczurów o masie ciała w zakresie 300-400 g.
  2. Po minimum 24 godzinach od zabiegu należy zważyć szczura i przetransportować go do sali zabiegowej.
  3. Obliczyć objętość wstrzyknięcia, biorąc pod uwagę masę ciała szczura.
  4. Zdejmij pokrywę klatki i odkręć atrapę kaniuli.
    UWAGA: Szczury zwykle siedzą nieruchomo, gdy delikatnie trzymają je w klatce i nie potrzebują ograniczeń. Ściereczka kuchenna może być używana na ciekawskiego lub nerwowego szczura lub łaskotanie kości policzkowych.
  5. W przypadku wstrzyknięcia bolusa należy przymocować rurkę PE-50 (patrz tabela materiałów) o długości co najmniej 40 cm do gazoszczelnej mikrostrzykawki o pojemności 10 μl, naciągając jeden koniec rurki na stałą lub wyjmowaną igłę na strzykawce i zapewniając szczelne uszczelnienie. Podłącz dopasowaną kaniulę wtryskiwacza na drugim końcu rurki.
    1. Pobrać wymaganą ilość przez kaniulę. Włóż kaniulę do prowadnicy do momentu dopasowania i wstrzyknij. Po wstrzyknięciu całego płynu należy przytrzymać tłok strzykawki na miejscu przez co najmniej dodatkową minutę, aby uniknąć przepływu wstecznego.
  6. W celu zmniejszenia szybkości podawania należy wstrzykiwać leki za pomocą pompy do mikroiniekcji (patrz Tabela materiałów).
    1. Najpierw użyj przefiltrowanej wody i jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml z igłą pobierającą 23 G, aby całkowicie napełnić rurkę PE-50. Następnie wyjąć jednorazową strzykawkę z igły do pobierania i zastąpić ją mikrostrzykawką.
    2. Cofnij 1-3 μl, aby utworzyć mały, ale widoczny pęcherzyk powietrza. Następnie należy sporządzić wymaganą ilość leków. Opcjonalnie należy oznaczyć pęcherzyk powietrza markerem, aby poprawić widoczność przepływu leku. Zablokować strzykawkę na pompie.
      UWAGA: Należy upewnić się, że ustawienia dla używanego leku i sprzętu są prawidłowe, tj. należy ustawić prędkość podawania i średnicę wewnętrzną używanej strzykawki zgodnie z instrukcją obsługi.
  7. Po wstrzyknięciu całej cieczy zatrzymaj pompę, jeśli nie zatrzyma się automatycznie. Pozostawić włożoną igłę na co najmniej dodatkową minutę, aby uniknąć przepływu wstecznego.
  8. Powoli wyjmij kaniulę iniektora i przykręć kaniulę prowadzącą.
  9. Wyczyść sprzęt, wciągając i wyrzucając etanol i wodę demineralizowaną po trzy razy.

3. Płyn mózgowo-rdzeniowy i pobieranie próbek tkanek

  1. Przetransportuj szczura do sali zabiegowej.
  2. Umieścić szczura w komorze indukcyjnej i wywołać znieczulenie 5% izofluranem w 2 l/min tlenu, aż do spowolnienia oddechu (~ 5 min).
  3. Przenieś szczura do ramy stereotaktycznej i utrzymuj ten sam poziom głębokiego znieczulenia przez stożek nosowy.
  4. Sprawdź, czy nie ma odruchu pedałowania. Po nieobecności przymocuj czaszkę do ramy za pomocą nauszników.
    UWAGA: Może to być prostsza ramka stereotaktyczna bez wyświetlacza, zaokrąglonych nauszników lub ruchomych ramion. Jest to procedura niewymagająca odzyskania należności; Jedyną niezbędną funkcją są dowolne nauszniki dla szczurów.
  5. Używając stożka nosowego, odchyl nos szczura w dół pod kątem około 45°, aby wystawić szyję w dobrej pozycji roboczej.
  6. Używając małych,, zakrzywionych nożyczek, poczuj czaszkę i przesuń się do tyłu do końca czaszki. W tej pozycji przetnij najbardziej zewnętrzną warstwę mięśni przez linię środkową szyi o długości około 2-3 cm. Ostrożnie przetnij wszystkie inne warstwy mięśni.
    1. Użyj małego zwijacza sprężynowego, aby przytrzymać ranę otwartą i zapewnić dobrą widoczność. Tnij, aż błona cisterna magna będzie widoczna. Użyj bawełnianej końcówki, aby delikatnie usunąć nadmiar skóry.
  7. Jeśli wystąpi krwawienie, użyj gazy, aby oczyścić i zatamować krwawienie.
  8. W razie potrzeby użyj małych pasków zwiniętej tkanki i umieść ją wokół cisterna magna, aby uniknąć zanieczyszczenia płynu mózgowo-rdzeniowego przez krew.
    UWAGA: Aby potwierdzić powodzenie wstrzyknięcia za pomocą barwnika, wstrzyknij 2-3 μl 1,1% barwnika Evans Blue (patrz Tabela materiałów) znieczulonemu szczurowi przed pobraniem płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą dopasowanej kaniuli i jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml.
  9. Aby przygotować narzędzie do ekstrakcji płynu mózgowo-rdzeniowego, napełnij strzykawkę ~500 μl przefiltrowanej wody, przymocuj igłę do pobierania 23 G i naciągnij rurkę na igłę. Podłącz wyciągniętą szklaną pipetę do drugiego końca rurki.
  10. Aby wyekstrahować płyn mózgowo-rdzeniowy, powoli włóż wyciągniętą pipetę do odsłoniętego cisterna magna.
    UWAGA: Płyn mózgowo-rdzeniowy będzie powoli i biernie przepływał do pipety i był aktywnie pobierany za pomocą strzykawki. Jeśli barwnik zostanie wstrzyknięty, płyn mózgowo-rdzeniowy będzie pokolorowany na niebiesko (Rysunek 1).
  11. Dodaj płyn mózgowo-rdzeniowy do oznaczonej tubki i natychmiast umieść go na suchym lodzie. Płyn mózgowo-rdzeniowy można następnie przechowywać w temperaturze -80 °C.
  12. Zbierz wszelkie inne tkanki będące przedmiotem zainteresowania do analizy. W przypadku osocza należy pobrać co najmniej 3 ml krwi sercowej.
    1. Połóż głęboko znieczulonego szczura na plecach i otwórz klatkę piersiową, aby odsłonić serce. Użyj hemostatu, aby zacisnąć klatkę piersiową i umieść ją na gardle zwierzęcia, aby poprawić widoczność. Użyj kleszczyków tkankowych z haczykami, aby przytrzymać prawą komorę i włóż jednorazową strzykawkę o pojemności 5 ml z igłą 18 G do lewej komory równolegle do przegrody. Powoli pobrać krew do strzykawki. Po zebraniu 3-5 ml krwi wyjmij igłę z serca.
  13. Wyjąć igłę ze strzykawki i umieścić ją w ostrym pojemniku. Przenieść krew do probówek poddanych heparyni i wirować w temperaturze 2,739 x g i 4 °C przez 15 minut, a następnie zebrać supernatant za pomocą pipety o pojemności 200 μl i zamrozić na suchym lodzie.
  14. Poddaj szczura eutanazji, usuwając serce nożyczkami. Wyłączyć dopływ izofluranu.
  15. Zbierz wszelkie inne interesujące Cię narządy jamy brzusznej, takie jak nerki lub śledziona. Zidentyfikuj narząd, przytrzymaj interesujący go narząd za pomocą kleszczy tkankowych z haczykami, podnieś go i odetnij wszelkie przyczepy. Umieść narząd w oznakowanej probówce i zatrzaskowo zamroź na suchym lodzie.
  16. Aby usunąć mózg, odetnij zwierzę parą ostrych, dużych nożyczek, przecinając podstawę czaszki. Zdejmij uchwyt na głowę ręcznie. Przeciąć pozostałą skórę pokrywającą czaszkę.
  17. Za pomocą nożyczek do rozwarstwiania przeciąć czaszkę na linii środkowej od podstawy do lambdy, tj. przeciąć kość nadpotyliczną na pół. Użyj hemostatu, aby chwycić połowę i odsunąć ją. Powtórz po drugiej stronie, aby całkowicie odsłonić móżdżek.
  18. Przystąp do cięcia wzdłuż szwu strzałkowego aż do kości czołowej. Użyj hemostatu, aby usunąć każdą z kości ciemieniowych. W razie potrzeby przetnij kość czołową dalej i usuń więcej kości, aby odsłonić opuszki węchowe.
  19. Przytrzymaj głowę do góry nogami i ostrożnie podważ mózg szpatułką, odrywając go od nerwów wzrokowych i trójdzielnych, przecinając je szpatułką. Zbierz mózg do probówki i zatrzaskowo zamroź na suchym lodzie.
  20. Komory mózgu zostaną zabarwione na niebiesko, jeśli barwnik zostanie wstrzyknięty. Użyj jednorazowego ostrza, aby przeciąć mózg w miejscu wstrzyknięcia (Rycina 2A,B) i ~1 cm z tyłu (Rysunek 2C), aby zbadać rozkład barwnika w komorach.
  21. Aby usunąć rdzeń kręgowy, odsłoń kręgosłup, przecinając skórę wzdłuż linii środkowej grzbietowej powierzchni szczura. Wyciąć kolumnę kręgowców, wykonując obustronne nacięcie wokół niej i przecinając ją poprzecznie na ogonowym końcu lędźwiowego rdzenia kręgowego.
  22. Przetnij blaszkę obustronnie wzdłuż kolumny za pomocą nożyczek, aż odsłoni się cały rdzeń kręgowy. Podnieś rdzeń kręgowy z jednego końca, np. końca rostralnego, i wyciągnij go, rozcinając nerwy rdzeniowe w kierunku ogonowym, aż wszystkie nerwy zostaną przecięte. Zbierz rdzeń kręgowy do rurki i zatrzaskowo zamroź na suchym lodzie.
    UWAGA: Zważ wszystkie probówki przed i po pobraniu narządów w celu analizy danych. Jeśli jest to konieczne i właściwe, układ komorowy można przemyć po pobraniu płynu mózgowo-rdzeniowego i przed pobraniem mózgu, aby usunąć resztki leków z przedziałów komorowych. Użyj strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej solą fizjologiczną dołączoną do rurki i kaniuli iniektora, a następnie włóż ją do kaniuli prowadzącej. Wstrzyknąć 2-3 ml soli fizjologicznej. Sól fizjologiczna powinna wydostać się z otworu w cisterna magna. Kaniule prowadzące, atrapy kaniul i można ponownie użyć, mocząc je w acetonie przez 24 godziny, a następnie zanurzając i czyszcząc detergentem medycznym i wodą. Po wyschnięciu resztki cementu dentystycznego można usunąć za pomocą cienkich kleszczy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiony protokół chirurgiczny jest bardzo udany, z wyszkolonymi chirurgami osiągającymi >99,8% wskaźnik przeżycia, a zwierzęta wykazują stabilną masę ciała po operacji w dniu 1, w porównaniu do ich wagi sprzed operacji w dniu 0 (średnia ± SD 315,8 g ± 42,1 g w dniu 0 i 314,1 g ± 43,0 g w dniu 1, Rysunek 3).

Przed pobraniem płynu mózgowo-rdzeniowego, wstrzyknięcie 1,1% barwnika Evans Blue do wszczepionej kaniuli może pomóc jako potwierdzenie, że zastrzyk zos...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Naukowcy i klinicyści stosują zastrzyki ICV, aby obejść mechanizm ochronny bariery krew-mózg i dostarczyć leki bezpośrednio do OUN 12,18,19,21,24. Niniejsza praca jest kompletnym protokołem ICV do skutecznego dostarczania leków do OUN i ekstrakcji płynu mózgowo-rdzeniowego do analizy farmakokinetycznej. Na początku eksperymentu, gdy protokół ten jest ustalany ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Biomedical Science Animal Facility na Uniwersytecie w Melbourne za zapewnienie i opiekę nad zwierzętami. Badania te były wspierane przez grant badawczy z Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych Narodowego Instytutu Zdrowia (R01 AI146241, GR i TV). JL jest głównym pracownikiem naukowym Australijskiej Narodowej Rady ds. Badań Medycznych (NHMRC). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych lub Narodowego Instytutu Zdrowia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetonTerumo, JaponiaSS+01T
Strzykawki 5 mlTerumo, JaponiaSS+05S
AcetonMerck, Niemcy67641
Prześcieradła ochronne na ławkiFał, USA2765-C
BetadineMundipharma, Holandia1015695
Buprenorfina; TemgesicClifford Hallam Healthcare, Australia1238366
CarprofenZoetis, Australia10001132
ChlorheksydynaTasman Chemicals, Australia890401
chusteczki Chux superwipes (lub ich odpowiedniki)Chux, Australianie dotyczyautoklawizowanych
maszynek do strzyżenian/adotyczy
Waciki bawełnianeLP Italiana, Włochy112191autoklawizowany
Cement dentystyczny w proszku (Vertex Self cure powder)Henry Schein, USAVX-SC500GVD5
Rozpuszczalnik do cementu dentystycznego (Vertex Self cure liquid)Henry Schein, USAVX-SC250MLLQ
Igły jednorazowe: 18 G, 26 G, 30 GTerumo, JaponiaNN+2525RL
Jednorazowe ostrza chirurgiczneWestlab, Australia663-255
Nożyczki do rozwarstwianiaF.S.T.14082-09
Atrapy kaniulBio Scientific, AustraliaC313DC/SPCprzycięte do 4,05 w celu dopasowania do kaniuli prowadzącej
Etanol 80%Merck, Australia10107
Niebieski barwnik EvanaSigmaE2129 - 50G
Lubrykant do oczuClifford Hallam Healthcare, Australia2070491
PisakSharpie, USAD-4236
Światłowodowe źródło światłanie dotyczy
Nie dotyczy Spłaszczona igła (18 G) lub podobna do nakładania superglueniedotyczy
Pipety szklane, ciągnioneHirschmann Laborgeraete, Niemcy9100175
Szklana strzykawka 10 μlHamilton, Stany Zjednoczone701 LT i 1701 LT
Kaniule prowadząceBio Scientific, AustraliaC313G/SPC22 G, nacięte 4 mm poniżej cokołu do kaniulacji komór bocznych u dorosłych szczurów Sprague Dawley
Haemostat
Sterylizator kulek ciepłaInotech, SzwajcariaIS-250
Poduszka grzewczanie
nie dotyczy Nadtlenek wodoru 3%Perrigo, Australia11383
Komora indukcyjna (pleksiglas 300 mm x 200 mm)n/an/
a Kaniula iniekcyjnaBio Scientific, AustraliaC313I/SPCprzycięty tak, aby pasował do kaniuli 4 mm + projekcji 0,5 mm
IzofluranClifford Hallam Healthcare, Australia2093803
Parownik izofluranu i odpowiedni system oczyszczanianie dotyczy
Średniej wielkości łodzie wagoweniedotyczy Nie dotyczy
Metalowa szpatułkaMet-App, Australian/a
Mikropompa strzykawkowaNew Era, USANE-300
MicrodrillRWD Life Science Co, Chiny87001
Polymyxin BBeta Pharma, Chiny86-40302
Probówki białkowe LoBind, 0,5 mlEppendorf, NiemcyZ666491
Ropiwakaina 1%; NaropinAstraZeneca, Wielka BrytaniaPS09634
Nożyczki, dużyFST14511-15
Nożyczki małeF.S.T.14079-10
Wkrętakniedotyczy
Mr. Specs, Australian/a
Rama stereotaktycznaRWD Life Science Co, Chinynie dotyczyNiezbędne elementy: nauszniki szczura, listwa zębata, stożek nosowy anestezjologiczny, ramię z odczytem cyfrowym (X, Y, Z) i uchwyt na kaniulę
Sól fizjologiczna sterylna 0,9%Baxter, Stany ZjednoczoneAHB1323
Super etch (37% kwas fosforowy) żelSDI Limited, Australia8100045
SuperglueUHU, Niemcynie dotyczy
Kleszczyki do tkanek z haczykamiF.S.T.11027-12
Przewody, PE-50Bio Scientific, AustraliaC313CT
nie dotyczy

Bibliografia

  1. Goldmann, E. E. Vitalfärbung am Zentralnervensystem. Beitrag zur Physio-Pathologie des Plexus chorioideus und der Hirnhäute. Königl. Akademie der Wissenschaften. , Berlin. (1913).
  2. Koziara, J. M., Lockman, P. R., Allen, D. D., Mumper, R. J. The blood-brain barrier and brain drug delivery. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9-10), 2712-2735 (2006).
  3. Davson, H. Review lecture. The blood-brain barrier. The Journal of Physiology. 255 (1), 1-28 (1976).
  4. Pandit, R., Chen, L., Götz, J. The blood-brain barrier: Physiology and strategies for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 165-166, 1-14 (2020).
  5. Oldendorf, W. H., Hyman, S., Braun, L., Oldendorf, S. Z. Blood-brain barrier: Penetration of morphine, codeine, heroin, and methadone after carotid injection. Science. 178 (4064), 984-986 (1972).
  6. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  7. Velkov, T., Dai, C., Ciccotosto, G. D., Cappai, R., Hoyer, D., Li, J. Polymyxins for CNS infections: Pharmacology and neurotoxicity. Pharmacology & Therapeutics. 181, 85-90 (2018).
  8. Martin, J. A., Maris, A. S., Ehtesham, M., Singer, R. J. Rat Model of blood-brain barrier disruption to allow targeted neurovascular therapeutics. Journal of Visualized Experiments. (69), e50019(2012).
  9. KrolI, R. A., Neuwelt, E. A., Neuwelt, E. A. Outwitting the blood-brain barrier for therapeutic purposes: Osmotic opening and other means. Neurosurgery. 42 (5), 1083-1099 (1998).
  10. Wei, B., Qian, C., Liu, Y., Lin, X., Wan, J., Wang, Y. Ommaya reservoir in the treatment of cryptococcal meningitis. Acta Neurologica Belgica. 117 (1), 283-287 (2017).
  11. Zubair, A., Jesus, O. D. Ommaya reservoir. StatPearls [Internet]. , StatPearls Publishing. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK559011/ (2021).
  12. DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. (75), e50326(2013).
  13. Ajoy, R., Chou, S. -Y. Studying the hypothalamic insulin signal to peripheral glucose intolerance with a continuous drug infusion system into the mouse brain. Journal of Visualized Experiments. (131), e56410(2018).
  14. Sajadi, A., Provost, C., Pham, B., Brouillette, J. Neurodegeneration in an animal model of chronic amyloid-beta oligomer infusion is counteracted by antibody treatment infused with osmotic pumps. Journal of Visualized Experiments. (114), e54215(2016).
  15. Rauschenberger, L., Knorr, S., Volkmann, J., Ip, C. W. Implantation of osmotic pumps and induction of stress to establish a symptomatic, pharmacological mouse model for DYT/PARK-ATP1A3 dystonia. Journal of Visualized Experiments. (163), e61635(2020).
  16. Cooper, J. D., Heppert, K. E., Davies, M. I., Lunte, S. M. Evaluation of an osmotic pump for microdialysis sampling in an awake and untethered rat. Journal of Neuroscience Methods. 160 (2), 269-275 (2007).
  17. Sharma, R. K., et al. Microglial cells impact gut microbiota and gut pathology in angiotensin II-induced hypertension. Circulation Research. 124 (5), 727-736 (2019).
  18. Kim, H. Y., Lee, D. K., Chung, B. -R., Kim, H. V., Kim, Y. Intracerebroventricular injection of amyloid-β peptides in normal mice to acutely induce alzheimer-like cognitive deficits. Journal of Visualized Experiments. (109), e53308(2016).
  19. Fukushima, A., Fujii, M., Ono, H. Intracerebroventricular treatment with resiniferatoxin and pain tests in mice. Journal of Visualized Experiments. (163), e57570(2020).
  20. Niaz, N., et al. Intracerebroventricular injection of histamine induces the hypothalamic-pituitary-gonadal axis activation in male rats. Brain Research. 1699, 150-157 (2018).
  21. Yokoi, H., Arima, H., Murase, T., Kondo, K., Iwasaki, Y. Intracerebroventricular injection of adrenomedullin inhibits vasopressin release in conscious rats. Neuroscience Letters. 216 (1), 65-70 (1996).
  22. Savci, V., Gürün, S., Ulus, I. H., Kiran, B. K. Intracerebroventricular injection of choline increases plasma oxytocin levels in conscious rats. Brain Research. 709 (1), 97-102 (1996).
  23. Sunter, D., Hewson, A. K., Dickson, S. L. Intracerebroventricular injection of apelin-13 reduces food intake in the rat. Neuroscience Letters. 353 (1), 1-4 (2003).
  24. Moreau, C., et al. Intraventricular dopamine infusion alleviates motor symptoms in a primate model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 139, 104846(2020).
  25. Calvo, P. M., de la Cruz, R. R., Pastor, A. M. A single intraventricular injection of VEGF leads to long-term neurotrophic effects in axotomized motoneurons. eNeuro. 7 (3), (2020).
  26. Choi, C. R., Ha, Y. S., Ahn, M. S., Lee, J. S., Song, J. U. Intraventricular or epidural injection of morphine for severe pain. Neurochirurgia. 32 (6), 180-183 (1989).
  27. Zhong, L., Shi, X. -Z., Su, L., Liu, Z. -F. Sequential intraventricular injection of tigecycline and polymyxin B in the treatment of intracranial Acinetobacter baumannii infection after trauma: A case report and review of the literature. Military Medical Research. 7 (1), 23(2020).
  28. Gross, P. M., Weaver, D. F. A new experimental model of epilepsy based on the intraventricular injection of endothelin. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 22, Suppl 8 282-287 (1993).
  29. Nang, S. C., Azad, M. A. K., Velkov, T., Zhou, Q. Rescuing the last-line polymyxins: Achievements and challenges. Pharmacological Reviews. 73 (2), 679-728 (2021).
  30. Tsuji, B. T., et al. International Consensus Guidelines for the Optimal Use of the Polymyxins: Endorsed by the American College of Clinical Pharmacy (ACCP), European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID), Infectious Diseases Society of America (IDSA), International Society for Anti-infective Pharmacology (ISAP), Society of Critical Care Medicine (SCCM), and Society of Infectious Diseases Pharmacists (SIDP). Pharmacotherapy. 39 (1), 10-39 (2019).
  31. Velkov, T., Roberts, K. D., Nation, R. L., Thompson, P. E., Li, J. Pharmacology of polymyxins: New insights into an "old" class of antibiotics. Future Microbiology. 8 (6), 711-724 (2013).
  32. Nation, R. L., et al. Dosing guidance for intravenous colistin in critically-ill patients. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 64 (5), 565-571 (2017).
  33. Nation, R. L., Velkov, T., Li, J. Colistin and polymyxin B: Peas in a pod, or chalk and cheese. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (1), 88-94 (2014).
  34. Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments. (59), e3528(2012).
  35. Molina-Cimadevila, M. J., Segura, S., Merino, C., Ruiz-Reig, N., Andrés, B., de Madaria, E. Oral self-administration of buprenorphine in the diet for analgesia in mice. Laboratory Animals. 48 (3), 216-224 (2014).
  36. Goldkuhl, R., Hau, J., Abelson, K. S. P. Effects of voluntarily-ingested Buprenorphine on plasma corticosterone levels, body weight, water intake, and behaviour in permanently catheterised rats. In Vivo. 24 (2), Athens, Greece. 131-135 (2010).
  37. Hestehave, S., Munro, G., Pedersen, T. B., Abelson, K. S. P. Antinociceptive effects of voluntarily ingested Buprenorphine in the hot-plate test in laboratory rats. Laboratory Animals. 51 (3), 264-272 (2017).
  38. Faesel, N., Schünemann, M., Koch, M., Fendt, M. Angiotensin II-induced drinking behavior as a method to verify cannula placement into the cerebral ventricles of mice: An evaluation of its accuracy. Physiology & Behavior. 232, 113339(2021).
  39. Elsevier. Neurotoxicity. Neurotoxicity | Elsevier Enhanced Reader. , (2021).
  40. Vuillemenot, B. R., Korte, S., Wright, T. L., Adams, E. L., Boyd, R. B., Butt, M. T. Safety evaluation of CNS administered biologics-study design, data interpretation, and translation to the clinic. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 152 (1), 3-9 (2016).
  41. Cerebrospinal fluid dynamics and intracranial pressure elevation in neurological diseases. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6456952/ (2021).
  42. Nau, R., Sörgel, F., Eiffert, H. Penetration of drugs through the blood-cerebrospinal fluid/blood-brain barrier for treatment of central nervous system infections. Clinical Microbiology Reviews. 23 (4), 858-883 (2010).
  43. Quagliarello, V. J., Ma, A., Stukenbrok, H., Palade, G. E. Ultrastructural localization of albumin transport across the cerebral microvasculature during experimental meningitis in the rat. The Journal of Experimental Medicine. 174 (3), 657-672 (1991).
  44. Reinhardt, V. Common husbandry-related variables in biomedical research with animals. Laboratory Animals. 38 (3), 213-235 (2004).
  45. Morton, L. D., Sanders, M., Reagan, W. J., Crabbs, T. A., McVean, M., Funk, K. A. Confounding factors in the interpretation of preclinical studies. International Journal of Toxicology. 38 (3), 228-234 (2019).
  46. Bailey, J. Does the stress of laboratory life and experimentation on animals adversely affect research data? A critical review. Alternatives to laboratory animals: ATLA. 46 (5), 291-305 (2018).
  47. Moberg, G. P., Mench, J. A. The Biology of Animal Stress: Basic Principles and Implications for Animal Welfare. , CABI. (2000).
  48. Russel, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique principles. , Methuen & Co LTD. (1959).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

bariera krew m zgo rodkowy uk ad nerwowybadanie farmakokinetycznechirurgia stereotaktycznakaniula prowadz capompa do mikrowstrzykiwaniapobieranie p ynu m zgowo rdzeniowegoleczenie infekcji m zgu
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły