Artykuł metodologiczny

Bioreaktor sterowany obrazowaniem do generowania bioinżynieryjnych tkanek dróg oddechowych

DOI:

10.3791/63544

⸱

6 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Stevens Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 3Department of Cell Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 4Department of Cardiothoracic Surgery, Stanford University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisuje bioreaktor z obsługą obrazowania, który pozwala na selektywne usuwanie endogennego nabłonka z tchawicy szczura i jednorodne rozmieszczenie komórek egzogennych na powierzchni światła, a następnie długoterminową hodowlę in vitro konstruktu komórka-tkanka.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powtarzające się uszkodzenia tkanki dróg oddechowych mogą upośledzać funkcję płuc i powodować przewlekłe choroby płuc, takie jak przewlekła obturacyjna choroba płuc. Postępy w medycynie regeneracyjnej i technologiach bioreaktorów oferują możliwości wytwarzania wyhodowanych w laboratorium funkcjonalnych tkanek i narządów, które można wykorzystać do badań przesiewowych leków, modelowania chorób i inżynierii zamienników tkanek. W tym miejscu opisano zminiaturyzowany bioreaktor w połączeniu z metodą obrazowania, która umożliwia wizualizację in situ wewnętrznego światła eksplantowanej tchawicy szczura podczas manipulacji tkankami in vitro i hodowli. Korzystając z tego bioreaktora, protokół demonstruje selektywne usuwanie endogennych składników komórkowych pod kontrolą obrazowania, przy jednoczesnym zachowaniu wewnętrznych cech biochemicznych i ultrastruktury macierzy tkankowej dróg oddechowych. Ponadto pokazano dostarczanie, równomierne rozprowadzanie, a następnie przedłużoną hodowlę komórek egzogennych w zdecelularnym świetle dróg oddechowych z monitorowaniem optycznym in situ. Wyniki podkreślają, że bioreaktor sterowany obrazowaniem może być potencjalnie wykorzystany do ułatwienia wytwarzania funkcjonalnych tkanek dróg oddechowych in vitro.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powierzchnia świetlna dróg oddechowych jest pokryta warstwą nabłonka, która składa się głównie z komórek macierzystych wielorzęskowych, maczugowych, kielichowych i bazalnych1,2. Warstwa nabłonkowa służy jako podstawowy mechanizm obronny płuc, działając jako bariera biofizyczna, która chroni leżącą pod spodem tkankę dróg oddechowych przed wdychaniem patogenów, cząstek stałych lub gazów chemicznych. Chroni tkankę dróg oddechowych poprzez wiele mechanizmów, w tym tworzenie ścisłych połączeń międzykomórkowych, klirens śluzowo-rzęskowy oraz wydzielanie przeciwbakteryjne i przeciwutleniające3,4. Wadliwy nabłonek dróg oddechowych jest związany z wyniszczającymi chorobami układu oddechowego, takimi jak przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP)5, pierwotna dyskineza rzęsek (PCD)6 i mukowiscydoza (CF)7.

Postępy w technologii lung-on-chip (LOC) stanowią okazję do badania rozwoju płuc u ludzi, modelowania różnych chorób płuc i opracowywania nowych materiałów terapeutycznych w ściśle regulowanych środowiskach in vitro. Na przykład, nabłonek dróg oddechowych i śródbłonek mogą być hodowane po przeciwnych stronach cienkiej, porowatej błony, aby naśladować gaz wymieniający tkankę płucną, co pozwala na wierne modelowanie chorób i testowanie leków8. Podobnie, modele chorób in vitro zostały stworzone do modelowania chorób dróg oddechowych in vitro, takich jak POChP9 i mukowiscydoza10. Jednak głównym wyzwaniem związanym z urządzeniami LOC jest rekapitulacja złożonej trójwymiarowej (3D) architektury tkanki płucnej i dynamicznych interakcji komórka-tkanka macierz in vitro11.

Ostatnio opracowano innowacyjne metodologie inżynierii tkankowej, które pozwalają na manipulację tkankami płuc ex vivo12. Korzystając z tych metodologii, ogołocone allogeniczne lub ksenogeniczne przeszczepy tkanek mogą być przygotowywane poprzez usuwanie komórek endogennych z tkanki płucnej za pomocą chemicznych, fizycznych i mechanicznych zabiegów13. Ponadto zachowana macierzy zewnątrzkomórkowa tkanki natywnej (ECM) w zdecelularyzowanych rusztowaniach płuc dostarcza fizjo-mimetycznych strukturalnych, biochemicznych i biomechanicznych wskazówek dla wszczepionych komórek do przyczepiania, proliferacji i różnicowania14,15.

Tutaj opisano system bioreaktora sterowany obrazowaniem, stworzony przez połączenie technologii LOC i inżynierii tkankowej, aby umożliwić manipulację tkankami in vitro i hodowlę eksplantowanych tkanek tchawicy szczura. Korzystając z tego bioreaktora tkankowego dróg oddechowych, protokół wykazuje selektywne usuwanie endogennych komórek nabłonka bez zakłócania leżących pod spodnabłonkiem składników komórkowych i biochemicznych tkanki dróg oddechowych. Następnie pokazujemy jednorodną dystrybucję i natychmiastowe odkładanie się nowo wysianych komórek egzogennych, takich jak mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), na ogołoconym świetle dróg oddechowych poprzez wkroplenie obciążonego komórkami roztworu żelu collagen I. Ponadto, dzięki zastosowaniu urządzenia do obrazowania mikrooptycznego zintegrowanego z bioreaktorem, odbywa się również wizualizacja światła tchawicy podczas usuwania nabłonka i dostarczania komórek endogennych. Ponadto wykazano, że tchawica i nowo wszczepione komórki mogą być hodowane w bioreaktorze bez zauważalnej śmierci komórki i degradacji tkanek przez 4 dni. Przewidujemy, że platforma bioreaktora z obsługą obrazowania, technika usuwania nabłonka oparta na cienkiej warstwie oraz metoda dostarczania komórek zastosowana w tym badaniu mogą być przydatne do generowania tkanek dróg oddechowych do modelowania chorób in vitro i badań przesiewowych leków.

Bioreaktor zawiera prostokątną komorę podłączoną do programowalnej pompy strzykawkowej, pompy perfuzyjnej i respiratora do hodowli izolowanej tchawicy szczura. Bioreaktor posiada wloty i wyloty podłączone do tchawicy lub komory hodowli tkankowej, które oddzielnie dostarczają odczynniki (np. pożywki hodowlane) do wewnętrznych i zewnętrznych przestrzeni tchawicy (Rysunek 1). Specjalnie zbudowany system obrazowania może być wykorzystany do wizualizacji wnętrza tchawicy szczura hodowanej in vitro na poziomie komórkowym (Rysunek 2). Endogenny nabłonek tchawicy jest usuwany poprzez wkroplenie roztworu decelularyzacyjnego na bazie detergentu, a następnie wspomagane wibracjami płukanie dróg oddechowych (Ryc. 3). Roztwór hydrożelu, taki jak kolagen typu I, jest używany jako nośnik do równomiernego i natychmiastowego wysiewu komórek egzogennych przez ogołocone światło tchawicy (Rysunek 4). Wszystkie materiały użyte do budowy bioreaktora i przeprowadzenia eksperymentów znajdują się w Tabeli Materiałów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższy protokół dotyczący tkanek zwierzęcych został zatwierdzony przez wytyczne i przepisy Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) w Stevens Institute of Technology i jest zgodny z wytycznymi National Institutes of Health (NIH) dotyczącymi wykorzystania zwierząt doświadczalnych.

1. Projekt i budowa bioreaktora tchawicy szczura sterowanego obrazowaniem

  1. Projektowanie i produkcja bioreaktora tchawicy szczura
    1. Utwórz model komory bioreaktora do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) z odpowiednimi projektami, takimi jak wloty, wyloty i komora do hodowli tkankowej, za pomocą oprogramowania generatora CAD. Do tego badania wykorzystaj geometrię i wymiary przedstawione w Rysunek 1A-C. Samouczek oprogramowania do generowania CAD można znaleźć w16,17.
    2. Eksportuj wygenerowany model CAD do oprogramowania sterującego komputerowego sterowania numerycznego (CNC) i wytnij tworzywo sztuczne z politetrafluoroetylenu (PTFE) za pomocą maszyny CNC, aby stworzyć komorę bioreaktora. Samouczek oprogramowania sterownika CNC można znaleźć w18.
      UWAGA: Oprócz PTFE do produkcji komory hodowlanej można użyć innych tworzyw sztucznych, takich jak polietylen o ultrawysokiej masie cząsteczkowej (UHMWPE) i polieteroimid.
    3. Wysterylizuj wszystkie elementy bioreaktora, takie jak adaptery Luer i, aby uniknąć zanieczyszczenia tkanek i komórek hodowanych w urządzeniu. Zmontuj wszystkie elementy bioreaktora w głównej komorze hodowli tkankowej w czystym środowisku (Rysunek 1A).
  2. Budowa urządzenia do obrazowania opartego na soczewce z indeksem gradientu (GRIN)
    1. Aby stworzyć urządzenie do obrazowania in situ, włóż soczewkę tubusu do tubusu obiektywu, który można układać jeden na drugim, i zabezpiecz go za pomocą pierścienia ustalającego. Zamontuj zespół tubusu obiektywu w naukowej kamerze CMOS za pomocą adaptera C-mount.
    2. Użyj oprogramowania, takiego jak Micro-Manager, do obsługi aparatu oraz robienia zdjęć i nagrywania filmów. Wyceluj w obiekt znajdujący się w dużej odległości (np. 10 m od aparatu) i dostosuj odległość między obiektywem tubusu a czujnikiem obrazowania aparatu, aż na ekranie komputera zostanie utworzony ostry obraz obiektu przez używane oprogramowanie do obrazowania.
    3. Zamontuj soczewkę filtra na dwukrawędziowym zwierciadle dichroicznym o superrozdzielczości i laser do urządzenia za pomocą elementów systemu klatki optycznej, w tym pręta montażowego, gwintowanej płyty klatki i kostki klatki.
    4. Podłącz soczewkę obiektywu (20x) do urządzenia. Zamontuj soczewkę GRIN (średnica = 500 μm) na dystalnym końcu tubusu obiektywu za pomocą translatora XY. Dostosuj odległość między soczewką GRIN a soczewką obiektywu, aby uzyskać ostre obrazy mikroskopowe (Rysunek 2A,B).

2. Izolacja tchawicy szczura

  1. Zdezynfekować obszar operacyjny i wysterylizować narzędzia chirurgiczne za pomocą autoklawu w temperaturze 121 °C przez 30 minut przed zabiegiem.
  2. Umieść szczura w komorze indukcyjnej i dostarczaj 2,5% izofluranu przez 15 minut za pomocą małego waporyzatora w celu znieczulenia zwierzęcia. Oceń głębokość znieczulenia za pomocą odruchu pedałowania. Aby to zrobić, mocno ściśnij palec u nogi i upewnij się, że zwierzę nie reaguje na uszczypnięcie palca.
  3. Po znieczuleniu należy usunąć izofluran z komory i podać 1 ml heparyny o stężeniu 1000 jednostek/ml przez boczną żyłę ogonową, aby zapobiec krzepnięciu krwi w naczyniach płucnych.
  4. Aby poddać zwierzę eutanazji, należy wystawić zwierzę na działanie 5% izofluranu przez dodatkowe 15-20 minut. Wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej i połóż je na desce operacyjnej w pozycji leżącej na plecach twarzą do góry.
  5. Przymocuj szczura do deski chirurgicznej, unieruchamiając nogi i ogon za pomocą taśmy klejącej. Następnie wysterylizuj okolice szyi i klatki piersiowej szczura za pomocą 70% alkoholu izopropylowego (IPA). Otwórz jamę brzuszną, wykonując 3-4 cm nacięcie nożyczkami w skórze.
    UWAGA: Uważaj, aby nie przeciąć głęboko skóry, kierując końcówki nożyczek do góry.
  6. Przeciąć żyłę główną dolną (IVC) za pomocą nożyczek i potwierdzić eutanazję przez wykrwawienie.
  7. Wykonaj tracheotomię, wykonując nacięcie nożyczkami w linii środkowej szyi i odsłaniając tchawicę. Wykonaj torakotomię w linii środkowej, wykonując nacięcie w ścianie klatki piersiowej i przecinając między żebrami, aby dotrzeć do końca tchawicy połączonego z płucem. Następnie za pomocą bicepsa i nożyczek przeciąć oba końce tchawicy i odizolować tchawicę.
  8. Po izolacji przepłukać tchawicę za pomocą 20 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS). Przenieś tchawicę do bioreaktora za pomocą wysterylizowanych bicepsa. Przymocuj dwa końce tchawicy do łącznika Luer za pomocą nici do szwów 4-0.
  9. Dostarczyć 5 ml pożywki hodowlanej do komory bioreaktora za pomocą programowalnej pompy strzykawkowej przez rurkę podłączoną do komory bioreaktora przy natężeniu przepływu 5 ml/min.
    UWAGA: Pożywka hodowlana składa się ze zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, rekombinowanej ludzkiej zasady FGF (0,1 ng/ml), płodowej surowicy bydlęcej (FBS, 10%) i antybiotyku przeciwgrzybiczego (1%).
  10. Szczelnie zamknij pokrywę bioreaktora za pomocą akrylowej plastikowej pokrywy i. Zamknij połączenia przewodów komory bioreaktora za pomocą męskich/żeńskich wtyczek Luer, aby zapobiec przepływowi pożywki hodowlanej w przewodach.

3. Usuwanie nabłonka tchawicy pod kontrolą obrazowania

  1. Aby uwidocznić światło tchawicy w jasnym polu lub fluorescencyjnym, umieść bioreaktor na stoliku obrazowania (Rysunek 3A).
  2. Przygotować roztwór estru sukcynimidylowego karboksyfluoresceiny (CFSE) (stężenie: 100 μM) w zestawie do znakowania komórek CFSE, rozcieńczając roztwór CFSE 1x PBS.
    UWAGA: Stężenie oryginalnego roztworu CFSE wynosi 10 mM (w dimetylosulfotlenku (DMSO)).
  3. Wlać 500 μl roztworu CFSE przez tchawicę za pomocą pompy strzykawkowej przez rurkę podłączoną do kaniuli tchawicy z szybkością przepływu 5 ml/min. Zatrzymać pompę, gdy roztwór CFSE wypełni tchawicę. Odczekać 10 minut, a następnie przemyć światło tchawicy przez infuzję 10 ml 1x PBS za pomocą pompy strzykawkowej w celu usunięcia pozostałości niewbudowanego odczynnika CFSE.
  4. Włóż dystalną końcówkę obrazowania soczewki GRIN do tchawicy za pomocą złącza Luer przymocowanego do jednego końca tchawicy. Następnie delikatnie przesuń soczewkę GRIN wewnątrz tchawicy, aż powierzchnia tchawicy zostanie zogniskowana i rób zdjęcia i nagrywaj filmy w jasnym polu lub fluorescencji przy 20-krotnym powiększeniu.
  5. Aby przechwytywać obrazy w jasnym polu w oprogramowaniu Micro-Manager, wykonaj poniższe czynności.
    1. Wprowadź białe światło przez kostkę klatki, aby oświetlić światło tchawicy. Kliknij ikonę Na żywo, aby wyświetlić powierzchnię świetlną tchawicy w czasie rzeczywistym. Użyj opcji Imaging Setting (Ustawienia obrazowania) > Exposure (ms), aby zmienić czas ekspozycji na żądaną wartość. W tym badaniu zastosowany czas ekspozycji mieścił się w zakresie od 10 ms do 50 ms.
    2. Aby dostosować kontrast i jasność obrazów, użyj okna Histogram i skalowanie intensywności, aby przesunąć czarno-białe strzałki w punkcie końcowym interaktywnego ekranu histogramu. Alternatywnie użyj opcji Auto Stretch, która pozwala oprogramowaniu automatycznie dostosować jasność i kontrast do optymalnych poziomów.
    3. Kliknij ikonę przyciągania, aby zamrozić obraz. Następnie użyj opcji Ustawienia > Eksportuj obrazy jako przemieszczone, aby zapisać obrazy w żądanym formacie. Alternatywnie użyj opcji Ustawienia > ImageJ, aby bezpośrednio wyeksportować obraz do oprogramowania ImageJ i zapisać go.
  6. Aby uzyskać zdjęcia i filmy w trybie fluorescencyjnym, należy oświetlić światło tchawicy światłem laserowym specyficznym dla CFSE (CFSE: długość fali wzbudzenia: 488 nm, długość fali emisji: 515 nm) przez sześcian klatki. Wykonaj kroki 3.5.2-3.5.3, aby uzyskać obrazy. Po zrobieniu zdjęć i nagraniu filmów delikatnie wyjmij soczewkę GRIN z tchawicy.
  7. Wykonaj deepitelializację zgodnie z poniższym opisem.
    1. Przygotować 2% roztwór decelularyzacyjny dodecylosiarczanu sodu (SDS) w wodzie destylowanej (DI). Wkroplić 50 μl SDS przez tchawicę z natężeniem przepływu 6,3 ml/min, używając pompy strzykawkowej przez kaniulę tchawicy w celu wytworzenia cienkiej warstwy roztworu detergentu na świetle tchawicy.
    2. Zamknij połączenia przewodów bioreaktora za pomocą męskich/żeńskich zatyczek Luer i przenieś bioreaktor do inkubatora. Pozostawić kartę charakterystyki do przebywania w tchawicy przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Wkroplić kolejne 50 μl roztworu SDS przez tchawicę i inkubować przez 10 minut.
    3. Usunąć zlizowany nabłonek i SDS poprzez przepłukanie tchawicy 500 μl 1x PBS za pomocą pompy strzykawkowej przy natężeniu przepływu 10 ml / min przez 3x. Umieść bioreaktor na wytrząsarce i mechanicznie wibruj bioreaktor z częstotliwością 20 Hz i amplitudą przemieszczenia około 0,3 mm, aby fizycznie przyspieszyć oderwanie komórek nabłonka poddanych SDS od światła tchawicy.
      UWAGA: W tym badaniu shaker został zbudowany na zamówienie poprzez zmontowanie głośnika subwoofera, płyty subwoofera amplifier i akcelerometr. Przebieg sinusoidalny był generowany przez komputer i wprowadzany do wytrząsarki za pośrednictwem wzmacniacza, podczas gdy odpowiedź wytrząsarki była monitorowana przez akcelerometr (Rysunek 3B). Ponadto konwencjonalne wytrząsarki, takie jak wytrząsarki elektromagnetyczne i bezwładnościowe, mogą być używane do wspomagania odłączania komórek. Aby to zrobić, ustaw częstotliwość i przyspieszenie wytrząsarki odpowiednio na 20 Hz i 0,5 g (co odpowiada amplitudzie przemieszczenia 0,3 mm).
    4. Wlej 500 μl 1x PBS dwukrotnie przez światło tchawicy, aby usunąć resztki SDS i resztki komórek, podczas gdy tchawica jest mechanicznie wibrowana. Po procedurze usuwania nabłonka oceń klirens warstwy nabłonkowej, mierząc intensywność CFSE za pomocą urządzenia do obrazowania soczewek GRIN, jak w kroku 3.6 (Rysunek 3C).

4. Przygotowanie tkanki tchawicy do dalszych analiz

  1. Aby potwierdzić usunięcie nabłonka, należy wykonać dalsze analizy tkanek, takie jak barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E), trichrome, pentachrom i barwienie immunologiczne. W tym celu należy wyjąć tchawicę z bioreaktora i umieścić ją w 30 ml 4% obojętnego buforowanego roztworu paraformaldehydu w 1x PBS (pH = 7,4) w temperaturze 4 °C przez noc.
  2. Odwodnić i osadź utrwaloną tkankę tchawicy, wykonując poniższe czynności.
    1. Po utrwaleniu przemyć tkankę tchawicy 10 ml 1x PBS, przenieść tchawicę do 30 ml 70% alkoholu i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc. Pokrój tchawicę na małe cylindryczne odcinki (~5 mm) za pomocą ostrego ostrza i włóż skrawki tkanki do kaset do zatapiania tkanek (długość x szerokość x wysokość: 4 cm x 2,5 cm x 0,5 cm). Trzymaj dwie sekcje tchawicy w każdej kasecie.
    2. Odwodnić skrawki w szeregu roztworów alkoholu izopropylowego (IPA) - 85%, 90%, 95%, 100% - przez 1 godzinę w 30 ml każdego roztworu. Usuń poprzednie rozwiązanie przed dodaniem następnego rozwiązania.
    3. Po zakończeniu zanurz kasety w 30 ml środka czyszczącego (np. ksylenu) na 2 godziny, aby całkowicie wyprzeć roztwór IPA z skrawków tkanki. Wykonaj tę czynność w dygestoria z odpowiednią wentylacją.
    4. Zanurz kasety w parafinie na 2 godziny, a następnie zanurz je w parafinie w temperaturze 4 °C na noc. Następnie pokrój tkanki zatopione w parafinie na cienkie odcinki (5-8 μm) za pomocą urządzenia mikrotomowego do H&E, trichromu, pentachromu i barwienia immunologicznego.
  3. Aby przygotować tkanki do analizy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), należy umieścić tchawicę w 30 ml 2,5% roztworu aldehydu glutarowego w 1x PBS (pH = 7,4) w temperaturze 4 °C przez noc. Następnie odwodnić utrwaloną tkankę tchawicy do SEM, wykonując poniższe czynności.
    1. Po utrwaleniu przepłukać tkankę tchawicy 10 ml 1x PBS. Przeciąć tkankę tchawicy wzdłużnie na małe półcylindryczne odcinki (długość: ~5 mm) za pomocą nożyczek i włożyć skrawki tkanki do kaset.
    2. Odwodnić skrawki w serii roztworów IPA - 35%, 50%, 70%, 85%, 95% i 100% - przez 10 minut w 30 ml każdego roztworu. Usuń poprzednie rozwiązanie przed dodaniem następnego rozwiązania.
    3. Przeprowadzić metodę suszenia opartą na heksametylodylazanie (HMDS), zanurzając tkanki w następujących roztworach: 100% IPA: HMDS (2:1; v/v) przez 10 min, następnie 100% IPA: HMDS (1:2; v/v) przez 10 min, a na końcu 100% HMDS przez noc.
      UWAGA: HMDS jest toksyczny. Pracować pod wyciągiem podczas wszystkich etapów suszenia.
    4. Wyjmij chusteczki z roztworu HMDS i pozostaw je do wyschnięcia pod wyciągiem przez 1 godzinę. Zamontuj sekcję na aluminiowych klockach za pomocą węglowej dwustronnej taśmy przewodzącej lub srebrnej pasty przewodzącej do obrazowania SEM.

5. Jednorodny rozkład komórek egzogennych na ogołoconym świetle tchawicy

  1. Przygotuj tchawicę szczura bez nabłonka, korzystając z protokołu opisanego w kroku 3. Zamrożone mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) rozmrażać przez 30 s w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    UWAGA: W tym badaniu wykorzystaliśmy mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) jako komórkę modelową, aby pokazać rozmieszczenie komórek egzogennych na pozbawionej nabłonka tchawicy. Idealnie, pierwotne komórki nabłonka dróg oddechowych, komórki podstawne lub indukowane ludzkie komórki pluripotencjalne (iPSC) mogą być wykorzystywane do celów regeneracji nabłonka.
  2. Policz komórki za pomocą hemocytometru i przygotuj roztwór komórek o stężeniu 5 x 106 komórek/ml. Znakować komórki fluorescencyjnie, inkubując je w 2 ml roztworu CFSE (stężenie: 100 μM) w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Przepłukać komórki 5 ml 1x PBS przez 3x i ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce hodowlanej w końcowym stężeniu 3 x 10 7 komórek/ml.
  3. Przygotuj hydrożelowy roztwór żelu wstępnego jako nośnik do dostarczania komórek. W tym badaniu należy użyć kolagenu I jako nośnika dla komórek MSCs i postępować zgodnie z instrukcjami producenta, aby przygotować żel wstępny. Na przykład, aby uzyskać wstępny żel kolagenowy 3,6 mg / ml, wymieszaj jedną część schłodzonego roztworu neutralizującego z dziewięcioma częściami kolagenu z ogona szczura w sterylnej probówce o pojemności 1,5 ml. Następnie delikatnie pipetować mieszaninę w górę i w dół, aby uzyskać odpowiednie wymieszanie.
    UWAGA: Zamiast kolagenu I można stosować inne biokompatybilne hydrożele w zależności od badania i potrzeb użytkownika.
  4. Po przygotowaniu roztworu hydrożelu szybko dodaj komórki do roztworu o pożądanym stężeniu (np. 5 x 106 komórek/ml). Aby uzyskać jednolitą mieszaninę komórkowo-hydrożelową, należy wymieszać komórki i roztwór żelu, delikatnie pipetując za pomocą mikropipety.
  5. Podłącz jeden koniec tchawicy w bioreaktorze do programowalnej pompy strzykawkowej za pomocą złącza Luer. Dostarczyć 5 ml świeżej pożywki hodowlanej w temperaturze 37 °C do komory bioreaktora w celu pokrycia zewnętrznej powierzchni tchawicy za pomocą pompy strzykawkowej przy natężeniu przepływu 5 ml/min.
  6. Podać 10 μl bolusa mieszaniny komórka i hydrożel do pozbawionej nabłonka tchawicy w bioreaktorze za pomocą pompy strzykawkowej o natężeniu przepływu 5 ml / min w celu wytworzenia warstwy komórkowo-hydrożelowej na świetle tchawicy (Rysunek 4).
  7. Po wstrzyknięciu komórek umieścić bioreaktor w sterylnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu żelowania. W przypadku kolagenu I żelowanie następuje w ciągu 30 minut.
  8. Aby zobrazować rozmieszczenie wszczepionych komórek, wysterylizuj soczewkę GRIN, przecierając ją 70% IPA lub etanolem i umieść bioreaktor na stoliku do obrazowania. W razie potrzeby rób zdjęcia i nagrywaj filmy zarówno w trybie jasnego pola, jak i fluorescencyjnym.
  9. Po 30 minutach wysiewu komórek wlać 1 ml pożywki hodowlanej do światła tchawicy za pomocą pompy strzykawkowej z natężeniem przepływu 1 ml/min.
  10. Hodować tchawicę zasianą komórkami w bioreaktorze w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez żądany czas. W przypadku hodowli długoterminowej należy co 24 godziny odświeżać pożywkę hodowlaną w świetle tchawicy i komorze bioreaktora. Podczas hodowli komórkowej należy utrzymywać pożywkę wewnątrz światła statycznego i zmieniać ją co 24 godziny, podczas gdy pożywka na zewnątrz tchawicy jest stale perfuzjowana przez jednokierunkowy przepływ z prędkością 5 ml/min.
  11. Po hodowli komórek przez określony czas (np. 1 i 4 dni w tym badaniu) należy usunąć tchawicę z bioreaktora. Za pomocą nożyczek przeciąć tchawicę wzdłużnie na dwie półcylindryczne sekcje (tj. górną i dolną część) w 1. i 4. dniu hodowli in vitro, aby odsłonić wewnętrzne powierzchnie w celu monitorowania wzrostu komórek i obliczania gęstości komórek. Użyj konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego, aby uwidocznić komórki na wewnętrznych powierzchniach.
  12. Aby uzyskać obrazy za pomocą oprogramowania Micro-Manager, wykonaj kroki 3.5 i 3.6. Użyj filtra izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), aby uwidocznić komórki znakowane CFSE w trybie fluorescencji. Przeanalizuj obrazy wykonane przez mikroskop fluorescencyjny i oblicz gęstość komórek w górnej i dolnej części za pomocą oprogramowania ImageJ. Aby obliczyć liczbę komórek i gęstość komórek, wykonaj poniższe czynności.
    1. Otwórz obraz w oprogramowaniu ImageJ i przekonwertuj obraz na obraz binarny (16-bitowy) za pomocą opcji Typ > obrazu > 16-bitowy. Ustaw skalę obrazu za pomocą paska skali za pomocą opcji Analizuj > Ustaw skalę.
    2. Dostosuj próg obrazu, aby wyróżnić struktury komórek do zliczenia. Użyj opcji Obraz > Dostosuj > próg. Użyj opcji Analizuj > Analizuj cząstki, aby policzyć liczbę komórek. Oblicz gęstość komórek, dzieląc liczbę komórek przez powierzchnię obrazu.
  13. Aby ocenić żywotność po wysiewie komórek, użyj zestawu do pomiaru żywotności komórek. W tym badaniu inkubować tkankę tchawicy i komórki w bioreaktorze w temperaturze 37 °C przez 6 godzin i barwić komórki 4 mM kalceiny-AM i 2 mM homodimeru etydyny-1 w 1 ml 1x PBS w temperaturze pokojowej przez 15 min.
  14. Po przepłukaniu 1x PBS uwidocznić komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Policz żywe i martwe komórki, wykonując czynności opisane w kroku 5.12. Oblicz żywotność komórek jako procent żywych komórek (barwionych kalceiną-AM) na wszystkie komórki (zarówno żywe, jak i martwe).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda obrazowania in situ oparta na soczewkach GRIN pozwala na wizualizację wewnętrznego światła tchawicy in situ (Rysunek 5A). Za pomocą tej metody obrazowania można uzyskać zarówno obrazy w jasnym polu, jak i fluorescencyjne tchawic natywnych i pozbawionych nabłonka (Rysunek 5B, C). Nie zaobserwowano sygnału fluorescencyjnego z natywnej tchawicy przed znakowaniem CFSE (Rysunek 5Bii). Jednakże, gdy nabłonek tchawicy został oz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ramach tej pracy stworzyliśmy bioreaktor sterowany obrazowaniem, który może umożliwić (i) monitorowanie światła tchawicy in situ po usunięciu komórek i dostarczeniu komórek egzogennych oraz (ii) długoterminową hodowlę in vitro tkanki tchawicy zasianej w komórkach. Korzystając z tego specjalnie zbudowanego bioreaktora, wykazaliśmy (i) selektywne usuwanie endogennych komórek nabłonka ze światła tchawicy za pomocą detergentu i płukania dróg oddechowych wspomaganego wibracjami oraz (ii) równomierne rozmie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania były częściowo wspierane przez American Thoracic Society Foundation Research Program, New Jersey Health Foundation i National Science Foundation (CAREER Award 2143620) dla J.K.; oraz National Institutes of Health (P41 EB027062) dla G.V.N.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 i razy; PBSGibco, Thermo Fisher Scientific10-010-031
Złącze 3-portoweWorld Precision Instruments14048-20
Złącze 4-portoweWorld Precision Instruments14047-10
AkcelerometrSTMicroelectronicsIIS3DWBTR
Achromatyczny dubletThorlabsAC254-150-A-ML
Aluminium kkońcówka szpilkiTED PELLA16111
Antybiotykowo-przeciwgrzybiczaThermo Fisher Scientific15240062
Pręt montażowyThorlabsER1
z kulistymMcMaster-Carr91255A274
Kostka koszykowaThorlabsC4W
Dwustronna taśma przewodząca węglowaTED PELLA16073
Zestaw do etykietowania CFSEAbcamab113853
Citrisolv (środek czyszczący)Decon1061
Adapter C-mountThorlabsSM1A9
Collagen IAdvanced BioMatrix5153
Przewodząca płynna farba srebrnaTED PELLA16034
Lustro dichroiczneSemrockDI03-R488Odbite długości fal lasera:  473,0 +- 2 nm 488,0 +3/-2 nm
Zmodyfikowany Dulbecco' Dulbecco' s mediumGibco, Thermo Fisher Scientific11965118
Żeńska przejściówka grodziowa typu luer do króćca wężaCole-ParmerEW-45501-30
luer do rurkiCole-ParmerEW-45508-03
Złącze luer żeńskie na męskieCole-ParmerZY-45508-80
Płodowa surowica bydlęcaGibco, Thermo Fisher Scientific10082147
Soczewka filtrującaChroma Technology CorpET535/50m
Mikroskop fluorescencyjnyNikonEclipse E1000 - D
Fusion 360Autodesk
Nakrętka sześciokątnaMcMaster-Carr91813A160
Heksametyldisilazan (HMDS)Fisher ScientifcAC120585000
Światłowód obrazującySELFOC, NSG grupaSoczewka
LaserOpto EngineMDL-D-488-150mW
Tubusy obiektywuThorlabsSM1L40
LIVE/DEAD Zestaw żywotności/cytotoksyczności (Invitrogen)Thermo Fisher ScientificL3224
MACH 3 Oprogramowanie sterujące CNCNewfangled Solutions
Soczewka obiektywowaOlympusUCPLFLN20X
Pompa perystaltycznaCole ParmerL/S standardowy cyfrowy system
Rekombinowany ludzki FGF-basicPeproTech100-18B
Pierścień ustalającyThorlabsSM1RR
Naukowa kamera CMOSPCO PandaPCO Panda 4.2
Dodecylosiarczan soduVWR97064-472
Solidworks ( 2019)Dassault Systè mes
Tubus obiektywu do układaniaw stosy ThorlabsSM1L10
Wzmacniacz płytowy subwooferaDayton AudioSPA250DSP
Głośnik niskotonowyDayton AudioRSS21OHO-4Średnica membrany: 21 cm
Pompa strzykawkowaWorld Precision InstrumentsAL-4000
Gwintowana płyta klatkowaThorlabsCP33
Gwintowany adapter luerCole-ParmerEW-45513-81
Soczewka tubusuThorlabsAC254-150-A-ML
Tygon RurkaCole-Parmer13-200-110
XY TranslatorThorlabsCXY1
Żeńska przesuwnica GRINpomp

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  2. Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Scientific Reports. 9 (1), 500(2019).
  3. Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases. Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).
  4. Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. Barrier function of airway tract epithelium. Tissue Barriers. 1 (4), 24997(2013).
  5. De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD. Mediators of Inflammation. 2018, 1309746(2018).
  6. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  7. Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74(2019).
  8. Shrestha, J., et al. Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).
  9. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  10. Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).
  11. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
  12. Gilpin, S. E., Wagner, D. E. Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration. European Respiratory Review. 27 (148), 180021(2018).
  13. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
  14. Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. Bioengineering lungs for transplantation. Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).
  15. Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use. Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).
  16. Planchard, D. Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , SDC Publications. (2022).
  17. Coward, C. A Beginner's Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , No Starch Press. (2019).
  18. Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).
  19. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  20. Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods. The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).
  21. Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
  22. Balestrini, J. L., et al. Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering. Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).
  23. Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).
  24. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
  25. Huang, S. X. L., et al. The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).
  26. Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).
  27. Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary. Applied Physics Letters. 107 (14), 144101(2015).
  28. O'Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).
  29. Sengyoku, H., et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).
  30. Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respiratory Research. 14 (1), 135(2013).
  31. O'Neill, J. D., et al. Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung. Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037(2017).
  32. Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985(2019).
  33. Chen, J., et al. Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus. Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).
  34. Dorrello, N. V., et al. Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering. Science Advances. 3 (8), 1700521(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Regeneracja tkanki dr g oddechowychobrazowanie in situdecelularyzacja tchawicymezenchymalne kom rki macierzystedostarczanie kom rek w hydro elumikroskopia fluorescencyjnamodelowanie chor bin ynieria tkankowa

Powiązane artykuły