Artykuł metodologiczny

Mikroskopia elektronowa zamrażalno-pękająca do analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

4.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63550

⸱

16 września 2022

 ,  ,  , 
1Faculty of Medicine, Institute of Cell Biology, University of Ljubljana

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół izolacji i zamrażania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z nowotworowych komórek urotelialnych. Technika zamrażania i pękania ujawniła średnicę i kształt pojazdów elektrycznych oraz – jako unikalną cechę – wewnętrzną organizację membran pojazdów elektrycznych. Mają one ogromne znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób pojazdy elektryczne oddziałują z błonami biorczymi.

Streszczenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) są strukturami o ograniczonej błonie, uwalnianymi z komórek do przestrzeni zewnątrzkomórkowej i są zaangażowane w komunikację międzykomórkową. EV składają się z trzech populacji pęcherzyków, a mianowicie mikropęcherzyków (MV), egzosomów i ciał apoptotycznych. Błona ograniczająca EV jest kluczowo zaangażowana w interakcje z komórkami biorcy, co może prowadzić do transferu biologicznie aktywnych cząsteczek do komórek biorcy, a w konsekwencji wpływać na ich zachowanie. Technika mikroskopii elektronowej zamrażania i pękania służy do badania wewnętrznej organizacji błon biologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji MV z hodowanych nowotworowych komórek urotelialnych oraz zamrażania-pękania MV w etapach szybkiego zamrażania, pękania, wytwarzania i czyszczenia replik oraz ich analizy za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Wyniki pokazują, że protokół izolacji daje jednorodną populację EV, która odpowiada kształtowi i rozmiarowi MV. Cząstki wewnątrzbłonowe znajdują się głównie w protoplazmatycznej powierzchni błony ograniczającej. W związku z tym zamrażanie-pękanie jest techniką z wyboru do scharakteryzowania średnicy, kształtu i rozmieszczenia białek błonowych MV. Przedstawiony protokół ma zastosowanie do innych populacji pojazdów elektrycznych.

Wprowadzenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to pęcherzyki o ograniczonej błonie, uwalniane z komórek do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Trzy główne populacje EV to egzosomy, mikropęcherzyki (MV) i ciała apoptotyczne, które różnią się pochodzeniem, rozmiarem i składem molekularnym1,2,3. Skład EV odzwierciedla profil molekularny komórki dawcy i jej stan fizjologiczny (tj. zdrowy lub chory)4,5. Daje to EV ogromny potencjał w diagnostyce, prognozowaniu i terapii chorób ludzkich, a także ma obiecujące zastosowania medyczne do wykorzystania w medycynie spersonalizowanej6,7,8.

EV są mediatorami komunikacji międzykomórkowej. Zawierają biologicznie aktywne białka, lipidy i RNA, które zakłócają procesy biologiczne w komórce biorcy i mogą zmieniać jej zachowanie9,10. Jednak skład błony ograniczającej EV ma kluczowe znaczenie dla interakcji z błoną komórkową biorcy.

Źródłem EV są płyny ustrojowe i kondycjonowane pożywki hodowlane. Aby odizolować populację EV, należy zastosować odpowiednią technikę izolacji. Na przykład odwirowanie przy 10 000 × g daje frakcję wzbogaconą w MV, podczas gdy siły odśrodkowe ≥100 000 × g dają frakcję wzbogaconą w egzosomy11,12. Wyizolowana frakcja EV musi zostać zwalidowana pod względem czystości, wielkości i kształtu. W tym celu Międzynarodowe Towarzystwo Pęcherzyków Zewnątrzkomórkowych 2018 zaleciło trzy klasy technik obrazowania o wysokiej rozdzielczości: mikroskopia elektronowa, mikroskopia sił atomowych i mikroskopia superrozdzielcza oparta na mikroskopii świetlnej13. Żadna z tych technik nie jest w stanie dostarczyć informacji na temat wnętrza membrany EV.

Mikroskopia elektronowa z zamrażaniem i pękaniem to technika rozbijania zamrożonych próbek w celu ujawnienia ich wewnętrznych struktur, szczególnie dając widok na wnętrze membrany. Etapy przygotowania próbki to: (1) szybkie zamrażanie, (2) szczelinowanie, (3) wykonanie repliki, oraz (4) czyszczenie repliki14. W kroku 1 próbka jest (opcjonalnie) utrwalana chemicznie, kriozabezpieczona glicerolem i zamrażana w ciekłym freonie. W kroku 2 zamrożona próbka jest pękana w jednostce zamrażania-pękania, która odsłania wnętrze dwuwarstwy membrany. W kroku 3 odsłonięte pęknięte powierzchnie są zacieniane platyną (Pt) i węglem (C) w celu wytworzenia replik. W kroku 4 materiał organiczny jest usuwany. Replika jest analizowana w transmisyjnym mikroskopie elektronowym (TEM). W celu dokładnej interpretacji mikrofotografii należy postępować zgodnie ze wskazówkami dotyczącymi ich prawidłowej orientacji14,15. Krótko mówiąc, kierunek cieni na mikrofotografii jest odniesieniem do orientacji mikrofotografii (tj. do określenia kierunku cieniowania Pt), a w konsekwencji do określenia wypukłych i wklęsłych kształtów (Rysunek 1). W wyniku rozszczepienia błony można zaobserwować dwa widoki wnętrza zwane pękniętymi powierzchniami dwuwarstwy błony: powierzchnię protoplazmatyczną (P) i egzoplazmatyczną (E). Powierzchnia P reprezentuje ulotkę błony przylegającą do protoplazmy komórki, podczas gdy powierzchnia E reprezentuje ulotkę błony przylegającą do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Integralne białka błonowe i ich asocjacje są postrzegane jako wystające cząstki wewnątrzbłonowe14,15.

Tutaj celem jest zastosowanie techniki zamrażania i pękania w celu scharakteryzowania MV pod względem rozmiaru, kształtu i struktury ich błony ograniczającej. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji i zamrażania MV pochodzących z ludzkich inwazyjnych komórek urotelialnych raka pęcherza moczowego.

Protokół

1. Hodowla nowotworowych komórek urotelialnych i izolacja EV

UWAGA: Przedstawiono protokół uzyskiwania EVs z ludzkiej inwazyjnej linii komórkowej urotelialnej raka pęcherza moczowego (T24). Jednak warunki hodowli muszą być zoptymalizowane, aby można było wykorzystać inne typy komórek.

  1. Umieść komórki T24 o gęstości 3 × 104 komórki/cm2 w trzech kolbach (powierzchnia wzrostu 75 cm2) i rozpocznij od hodowli komórek w inkubatorze CO2 przez 3 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 (Rysunek 2A).
    1. Użyj pożywki hodowlanej dla komórek T24 w mieszaninie 1:1 (v/v) A-DMEM i F12 uzupełnionej 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 4 mM Glutamax, 100 mg/ml streptomycyny i 100 U/ml penicyliny.
      UWAGA: Poniższa izolacja daje EV wzbogacone w MV. Przed rozpoczęciem izolacji należy sprawdzić komórki pod mikroskopem świetlnym, aby potwierdzić żywotność i konfluencję ( Rysunek 2B). Rozpocznij zbieranie EV z kondycjonowanej pożywki hodowlanej, gdy komórki T24 osiągną 70% zbieżności.
  2. Zebrać pożywkę hodowlaną z MV za pomocą pipety z kolb (T75) do stożkowych probówek wirówek (Rysunek 2C). Wirować przy 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C (rysunek 2D).
  3. Ostrożnie zebrać supernatant do nowej probówki wirówkowej za pomocą pipety (Rysunek 2E).
  4. Odwirować supernatant o stężeniu 2 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Ostrożnie zebrać supernatant za pomocą pipety do nowej probówki wirówkowej.
  6. Wirować przy 10 000 × g przez 40 minut w temperaturze 4 °C. Poszukać obecności białawego osadu na dnie probówki.
    UWAGA: W razie potrzeby wymień wirnik wirówki, aby osiągnąć wymaganą siłę g. Osad EV jest widoczny jako biały osad na dnie probówki wirówki (Rysunek 2F); zaznacz jego położenie, aby uniknąć utraty granulki podczas pipetowania (Rysunek 2G).
  7. Ostrożnie wyrzucić supernatant za pomocą pipety. Do osadu dodać 1,5 ml PBS i ponownie zawiesić osad zawierający MVs. Umieścić zawiesinę w nowej probówce wirówkowej.
  8. Wirować przy 10 000 × g przez 40 minut w temperaturze 4 °C i poszukać obecności białego osadu na dnie probówki.
    UWAGA: Granulka EV jest widoczna jako biała plama na dnie probówki wirówki; Zaznacz jego położenie, aby uniknąć utraty granulki podczas pipetowania.
  9. Ostrożnie wyrzucić supernatant za pomocą pipety. Delikatnie dodać utrwalacz, 2,5% aldehydu glutarowego do 0,1 M buforu kakodylanu sodu (pH 7,2). Pozostaw na 20 minut w temperaturze 4 °C (Rysunek 2H).
    UWAGA: Aldehyd glutarowy i kakodylan sodu są toksyczne. Pracuj pod wyciągiem, noś rękawice ochronne i odpowiednio je wyrzuć.
  10. Ostrożnie usuń utrwalacz za pomocą pipety. Dodać bufor płuczący (0,1 M bufor kakodylanu sodu) do osadu. Pozostawić na 10 minut w temperaturze 4 °C bez ponownego zawieszania granulatu.

2. Zamrażanie EV

UWAGA: Przed zamrożeniem, najpierw zabezpiecz próbki za pomocą glicerolu.

  1. Przygotować 0,1 M bufor kakodylanu sodu. Usunąć bufor płuczący i dodać 50 μl 30% glicerolu do 0,1 M buforu kakodylowego. Delikatnie ponownie zawiesić EV, aby roztwór był jednorodny. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Wyczyść miedziane nośniki za pomocą centralnego wgłębienia w kąpieli ultradźwiękowej z chloroformem przez 5 minut (Rysunek 3A). Wysuszyć je na powietrzu i oznaczyć kolorami, jeśli używasz wielu próbek (Rysunek 3B). Do czasu użycia należy przechowywać nosidełka w suchym, czystym miejscu (np. na papierze do soczewek na szalce Petriego). Nie dotykaj nosidełka gołymi rękami.
    1. Przygotuj pipety, roztwory, bibułę filtracyjną, pęsetę, mikroskop stereoskopowy, kolbę Dewara z freonem i ciekłym azotem (LN2), metalowy pręt i kriowialisty. Schłodzić za pomocą LN2.
      UWAGA: Nosić sprzęt ochronny i pracować odpowiednio podczas obchodzenia się z LN2 i schłodzonym freonem.
  3. Ponownie zawieś EV przed zamrożeniem. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Kroki 2.4-2.7 należy wykonać szybko.
  4. Praca pod mikroskopem stereoskopowym (Rysunek 3C). Przenieś 1,5-1,7 μl próbki do centralnego dołu miedzianego nośnika, aby uzyskać wypukłą kroplę sięgającą wyżej niż krawędź miedzianego nośnika, nie rozlewając próbki przez krawędź (Rysunek 3D). W przypadku nadmiernego rozlania należy użyć bibuły filtracyjnej do wysuszenia zewnętrznego pierścienia nośnika.
  5. Wymieszaj zestalony freon z metalowym prętem, aby go ponownie upłynnić (Rysunek 3E).
  6. Chwyć pęsetą zewnętrzny pierścień miedzianego nośnika i zanurz go w schłodzonym freonie, delikatnie potrząsając pęsetą przez 8 s (Rysunek 3F). Po 8 s szybko przenieś nośnik do innej kolby Dewara wypełnionej LN2.
  7. Natychmiast przystąpić do szczelinowania lub przechowywania próbek w LN2. W tym drugim przypadku należy oznaczyć kriowial i schłodzić fiolkę oraz końcówki pęsety, zanurzając je w LN2 (Rysunek 3G). W LN2 zebrać zamrożone miedziane nośniki do fiolki, zamknąć ją i przechowywać w pojemniku LN2 (Rysunek 3H) do momentu zamrożenia szczelinowania.

3. Szczelinowanie EV i tworzenie replik

UWAGA: Przygotuj urządzenie do szczelinowania zamrażalniczego zgodnie z instrukcją obsługi producenta. (Rysunek 4A). Wyczyść komorę urządzenia. Ustaw pistolety platynowe (Pt/C) i węglowe (C) odpowiednio pod kątem 45° i 90° (Rysunek 4B).

  1. Uruchom system odkurzania urządzenia. Po osiągnięciu ciśnienia 6,6 × 10−2 Pa (5 × 10−4 Torr) schłodzić komorę urządzenia do −150 °C.
  2. Przenieś miedziane nośniki z zamrożonymi próbkami do urządzenia do szczelinowania zamrażalniczego za pomocą suchej pęsety (Rysunek 4C). Użyj kriotransferu lub pracuj szybko, aby uniknąć rozmrożenia próbki i osadzania się kryształków lodu. Przymocuj nośniki do stołu na próbkę.
  3. Poczekaj, aż podciśnienie ponownie osiągnie 6,6 × 10−2 Pa (5 × 10−4 Torr), a następnie ustaw temperaturę noża na −100 °C (Rysunek 4D).
  4. Poczekaj, aż próżnia osiągnie 1,0 × 10−3 Pa (8 × 10−6 Torr).
  5. Obserwuj próbkę przez lornetkę i ostrożnie podejdź do noża (Rysunek 4E).
  6. Rozpocznij dzielenie próbki na sekcje, włączając zmotoryzowany ruch noża (Rysunek 4F) i ciąć, aż powierzchnia próbki stanie się gładka (Rysunek 4G).
  7. W celu szczelinowania należy wyłączyć zmotoryzowany ruch noża i kontynuować powolną ręczną kontrolę noża, powodując w ten sposób szczelinowanie próbki (Rysunek 4H). W celu ochrony pękniętej powierzchni przed tworzeniem się kryształków lodu i zanieczyszczeń aż do zacienienia, należy przesunąć nóż nad pękniętą próbką.
  8. Kontynuuj cieniowanie Pt pod kątem 45° (Rysunek 4I, J).
    1. Przygotować stoper i/lub włączyć monitor kwarcowy na urządzeniu do szczelinowania zamrażalniczego, co umożliwi nadzór nad grubością Pt na próbce. Zalecana grubość warstwy Pt mierzona na monitorze kwarcowym wynosi 2,5 nm, co odpowiada 4 s cieniowania przy danym wysokim napięciu i prądzie (tj. prędkość cieniowania Pt wynosi 0,63 nm/s).
    2. Przed rozpoczęciem cieniowania należy odsunąć nóż od próbki. Zastosuj wysokie napięcie na pistolecie Pt/C (1 600 V) i zwiększ prąd do 60 mA. Powinny pojawić się iskry Pt, które powinny zacząć zacieniać próbkę. W tym momencie rozpocznij odliczanie 4 s i/lub obserwuj i zlokalizuj pozycję Pt na monitorze kwarcowym.
      UWAGA: Zalecana grubość warstwy C to 2,5 nm, co odpowiada 10 s cieniowania przy danym wysokim napięciu i prądzie.
    3. Wyłącz prąd i wysokie napięcie, gdy uzyskana zostanie żądana grubość Pt.
  9. Kontynuuj cieniowanie C pod kątem 90° (tj. prędkość cieniowania C wynosi 0,25 nm/s).
    1. Zastosuj wysokie napięcie na pistolecie C (1900 V), zwiększ prąd do 90 mA, a powinny pojawić się iskry C i zacząć zacieniać próbkę; w tym momencie rozpocznij odliczanie 10 sekund. Wyłącz prąd i wysokie napięcie, gdy uzyskana zostanie żądana grubość C.

4. Czyszczenie replik i analiza replik

  1. Użyj miedzianych nośników ze stołu do próbek i przenieś je pęsetą do wody destylowanej o temperaturze pokojowej na porcelanowej 12-dołkowej płytce (Rysunek 4K). Repliki będą unosić się na powierzchni wody, podczas gdy nośniki toną (Rysunek 4L).
  2. Przenieś repliki za pomocą drucianej pętli z wody destylowanej do studzienki z podchlorynem sodu. Przykryj i pozostaw na noc w temperaturze pokojowej w dygestorium.
    UWAGA: Podchloryn sodu jest toksyczny. Pracuj pod wyciągiem, noś rękawice ochronne i odpowiednio je wyrzuć.
  3. Przenieś repliki do ddH2O i myj przez 30 min. Powtórz 3 razy.
  4. Przenieś repliki za pomocą drucianej pętli na siatkę miedzianą TEM (np. kwadratową lub o strukturze plastra miodu 100+). Suszyć siatki na powietrzu przez 2 godziny, a następnie przechowywać je w pojemniku do przechowywania siatki do czasu mikroskopii.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, kratki można przechowywać przez wiele miesięcy w ciemnych, suchych warunkach o temperaturze pokojowej.
  5. Użyj mikroskopu TEM, aby zobrazować repliki i uzyskać mikrofotografie.
    1. W tym celu należy włożyć siatkę TEM z repliką i uruchomić obrazowanie TEM zgodnie z instrukcją obsługi producenta. Praca przy napięciu 80 kV lub 100 kV.
  6. Zbadaj próbkę i uzyskaj mikrofotografie przy mniejszych i większych powiększeniach za pomocą kamery na TEM.
  7. Przeanalizuj mikrofotografie MV. Do pomiarów średnic SN należy użyć oprogramowania Fiji/ImageJ16. Średnica MV jest 4/π razy większa niż pomiar na mikrofotografiach według Hallett et al.17.

Wyniki

MV zostały wyizolowane z medium kondycjonowanego komórek raka urothelium T24 po wirowaniu różnicowym. Zgodnie z protokołem, frakcja EV została najpierw wykryta po wirowaniu przy 10,000 × g, kiedy była widoczna jako biały osad (Rysunek 2G).

Następnie pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) przetworzono zgodnie z powyższym protokołem i poddano badaniu za pomocą TEM. Cieniowanie Pt/C pozwoliło na otrzymanie (Rysunek 4L) stosunkowo dużych replik, które często rozpadały się na mniejsze fragmenty podczas etapu oczyszczania. Duże repliki oraz ich mniejsze fragmenty przeniesiono na siatkę TEM i porównano pod mikroskopem. Wyniki nie wykazały różnic w jakości powierzchni replik niezależnie od ich rozmiaru, w związku z czym wszystkie mogą być wykorzystane. Badania przy niskim powiększeniu wykazały obszary repliki o: i) jednorodnej powierzchni (tło), ii) wklęsłych i wypukłych profilach sferycznych (pęcherzyki) oraz iii) obszarach uszkodzonej powierzchni (artefakty; Rysunek 5A). Typowe artefakty widoczne były jako pęknięcia, fałdy i nieregularne, ciemniejsze cienie (tj. repliki osadów kryształków lodu na próbce). Ważne jest również odnotowanie, że nie zaobserwowano żadnych szczątków komórkowych ani organelli komórkowych, co potwierdza czystość próbki (Rysunek 5B).

Wyizolowane pęcherzyki gromadziły się zazwyczaj w skupiskach po trzy lub więcej, bądź były rozproszone pojedynczo (Rysunek 5B). Pęcherzyki miały kształt sferyczny, co wskazuje na dobrą konserwację ultrastruktury podczas izolacji, fiksacji i mrożenia (Rysunek 5C). Pęcherzyki spłaszczone i wydłużone (Rysunek 5C), które pojawiały się sporadycznie, były prawdopodobnie artefaktami przygotowania i nie zostały uwzględnione w późniejszych pomiarach średnicy pęcherzyków. Średnica widocznych profili wynosiła 238,5 nm (±8,0 nm, n = 190), co po uwzględnieniu współczynnika korekcji zaproponowanego przez Halletta i wsp.17 odpowiada średniej średnicy pęcherzyków wynoszącej 304 nm (±10 nm; Rysunek 5D). Wielkość ta koreluje z zakresem średnic MVs od 100 nm do 1000 nm i potwierdza skuteczność zastosowanego protokołu izolacji. Obrazy pęcherzyków wraz z wyznaczeniem ich średnicy jednoznacznie potwierdziły, że EVs w izolacie były wzbogacone w MVs.

Analiza replik ujawniła organizację powierzchni P (P-face) i powierzchni E (E-face) błon ograniczających MV. MV obserwowano jako wklęsłe i wypukłe okrągłe kształty (Rysunek 5C,E,F), co odzwierciedlało płaszczyznę przełomu. Kształty wypukłe reprezentują powierzchnie E (tj. przełamane warstwy egzoplazmatyczne błon; Rysunek 5E). Powierzchnie egzoplazmatyczne EV miały gładki, jednolity wygląd. Kształty wklęsłe odpowiadają powierzchniom P (Rysunek 5F). W powierzchniach P, w obrębie gładkich błon, zaobserwowano kilka wystających cząsteczek wewnątrzbłonowych (Rysunek 5C,F). Sugeruje to, że MV wyizolowane z rakowych komórek urotelialnych T24 zawierają jedynie niewielką ilość białek błonowych.

Schemat mroźnego trawienia: pęknięcie błony i cieniowanie wykazujące rozdzielenie warstw E-face i P-face.
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie wyznaczania błony po mroźnym trawieniu. (A) Mikropęcherzyki odpączkowują z błony plazmatycznej do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. (B) Mikropęcherzyk jest ograniczony warstwami P- oraz E- błony aż do momentu mroźnego trawienia, które rozdziela warstwy i odsłania ich widok wewnętrzny, nazywany powierzchniami pęknięcia. (C) Po cieniowaniu Pt/C widoczne są dwie powierzchnie pęknięcia: powierzchnia protoplazmatyczna (P-face) o kształcie wypukłym zwróconym w stronę cytoplazmy (protoplazmy) oraz powierzchnia egzoplazmatyczna (E-face) o kształcie wklęsłym zwróconym w stronę przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Rycina 1 została stworzona przy użyciu Biorender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Hodowla i analiza komórek; mikroskopia, pipetowanie, wirowanie; ustawienie eksperymentu laboratoryjnego.
Rysunek 2: Izolacja EV. (A) Komórki T24 hodowane w inkubatorze CO2 są badane za pomocą (B) mikroskopu świetlnego w celu potwierdzenia ich żywotności i konfluencji przed izolacją MV. (C) Pożywka hodowlana jest zbierana i (D) kolejno wirowana przy 300 × g oraz 2,000 × g, przy czym (E) za każdym razem pobierany jest nadosad. (F,G) Po wirowaniu przy 10,000 × g widoczna i zaznaczona jest biała plama wskazująca na osad. Nadosad jest usuwany, a następnie (H) do osadu ostrożnie dodaje się utrwalacz bez jego resuspensji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Przygotowanie i analiza nanocząstek; konfiguracja mikroskopii i technik kriogenicznych; etapy eksperymentu.
Rycina 3: Zamrażanie EV. (A) Wysuszone na powietrzu, czyste nośniki miedziane z centralnym wgłębieniem są (B) znakowane przed obróbką. Mikropęcherzyki są resuspendowane w glicerolu w celu uzyskania homogenicznej próbki i (C) naniesione do centralnego wgłębienia nośnika miedzianego pod stereomikroskopem. (D) Należy dodać taką objętość próbki, aby utworzyła ona wypukłą kroplę w centralnym wgłębieniu. (E) Bezpośrednio przed zamrażaniem należy wymieszać chłodzony LN2 freon za pomocą metalowego pręta, aby upłynnić freon. (F) Zamrozić próbkę poprzez zanurzenie jej w freonie, a następnie (G) przenieść ją do LN2. (H) Nośniki z zamrożoną próbką można zebrać do krioprobówek i przechowywać w naczyniu typu Dewar z LN2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Konfiguracja systemu napylania próżniowego do analizy materiałów, obejmująca mikrotom, przygotowanie próbek oraz działa Pt/C.
Rycina 4: Mrożenie z frakturowaniem i tworzenie repliki. (A) Jednostka do mrożenia z frakturowaniem. Wewnątrz komory jednostki (B) znajduje się działo elektronowe platyny (Pt) i węgla (C), nóż oraz stół do próbek. (C) Aby rozpocząć frakturowanie, nośniki z próbką są przenoszone na stół do próbek, (D) jednostka do mrożenia z frakturowaniem jest chłodzona i wytwarzana jest próżnia. (E) Sekcjonowanie odbywa się poprzez zmotoryzowany (F) ruch noża, jednak frakturowanie najlepiej przeprowadzać ręcznie. (G) Próbka przed sekcjonowaniem i (H) po frakturowaniu. (I) Bezpośrednio po frakturowaniu tworzona jest replika. (J) Podczas tego procesu na próbkę napylana jest platyna (Pt). Napylanie platyny jest widoczne jako jasne światło (iskry) w komorze. (K) Nośniki próbek są zbierane do porcelanowego naczynia wypełnionego wodą. (L) Replika (strzałka) pływająca w roztworze podchlorynu sodu podczas etapu czyszczenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy z mikroskopii elektronowej przedstawiające powierzchnie pęcherzyków; zawiera wykres średnicy pęcherzyków; analiza strukturalna.
Rycina 5: Mikrofotografie elektronowe MVs po mrożeniu z frakturowaniem i cieniowaniu Pt/C. (A) Przegląd osadu EV po mrożeniu z frakturowaniem i cieniowaniu (i) przy mniejszym powiększeniu. Jednorodna powierzchnia to tło (ii), jasne obszary to pęknięcia w replikach (iii), ciemniejsze obszary to fałdy replik (gwiazdka), a nieregularne, ciemniejsze cienie wynikają z obecności kryształków lodu (dwie gwiazdki). (B) Grupa okrągłych EV z powierzchniami wklęsłymi i wypukłymi. (C) Duże powiększenie EV. W frakturach wypukłych, które ukazują powierzchnię P (P-face) błon EV, widoczne są cząstki wewnątrzbłonowe (strzałki) oraz obszary gładkiej powierzchni (groty strzałek). Stwierdzono obecność pęcherzyków zewnątrzkomórkowych o kształcie wydłużonym (gwiazda) i spłaszczonej kuli (dwie gwiazdy). (D) Średnica izolowanych urothelial MVs wynosi 304 nm ± 10 nm zgodnie z pomiarami wielkości zaproponowanymi przez Halletta i wsp.17. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. (E,F) Powierzchnia E (E-face) i powierzchnia P (P-face) MVs. Legenda: strzałki = cząstki wewnątrzbłonowe w powierzchni P, strzałki w okręgach = kierunek cieniowania Pt/C. Paski skali: A = 10 µm, B-F = 400 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Charakterystyka MV lub jakiejkolwiek innej populacji izolowanych EV ma pierwszorzędne znaczenie przed rozpoczęciem dalszych analiz, takich jak badania "omiczne" lub badania funkcjonalne11,18. W tym przypadku EV z ludzkich inwazyjnych komórek urotelialnych T24 raka pęcherza moczowego wyizolowano przez wirowanie, a postępując zgodnie z dostarczonym protokołem analizy za pomocą mikroskopii elektronowej zamrażania i złamania, wykazaliśmy, że wyizolowana frakcja została wzbogacona w MVs11,13. Izolat MV był pozbawiony resztek komórkowych lub organelli, co potwierdza udany protokół izolacji i oczyszczania.

Połączenie chemicznego utrwalania i zamrażania, które są krytycznymi etapami protokołu, zachowało kulisty kształt EVs12. Należy jednak zachować środki ostrożności przy ocenie średnicy EV metodą szczelinowania zamrażalniczego17. Ponieważ pęknięcie przechodzi przez próbkę losowo, błony MV są dzielone na płaszczyzny równikowe i nierównikowe. Aby zapewnić rygorystyczną metodę analizy obrazów próbek pękniętych przez lód i zacienionych, Hallett i in. wykazali, że średnia średnica pęcherzyka jest 4/π razy większa niż rzeczywista średnica pęcherzyka na obrazie17. Biorąc to pod uwagę, obliczono, że pojazdy elektryczne z ogniw T24 mają średnicę 304 nm, co mieści się w teoretycznym zakresie rozkładu wielkości MV wynoszącym 100-1000 nm19.

Szczelinowanie zamrażające może uzupełniać barwienie ujemne, najszerzej stosowaną technikę TEM do wizualizacji EV. Poprzez barwienie ujemne próbka jest zwykle chemicznie utrwalana, suszona i dołączana do siatki TEM oraz kontrastowana z roztworem uranylu. Bez nośników wspierających pojazdy elektryczne mają tendencję do zapadania się, co nadaje im wygląd miseczki. Poprzez szczelinowanie zamrażalne pokazujemy, że MV są kulami, co odzwierciedla ich kształt w przestrzeniach pozakomórkowych i płynach ustrojowych12. Tym samym nasze wyniki są również zgodne z obserwacjami EV w krio-ultracienkich sekcjach20.

Kluczową zaletą techniki zamrażania i pękania jest jej zdolność do rozwiązywania wewnętrznej organizacji błony ograniczającej, co jest kluczowym czynnikiem w zrozumieniu, w jaki sposób pojazdy elektryczne są kierowane do błon biorczych i wchodzą z nimi w interakcję. Tutaj przeanalizowaliśmy błony MV, jednak szczelinowanie zamrażalnicze może ujawnić organizację błon każdej innej populacji EV. MV powstają w wyniku pączkowania błony plazmatycznej; w związku z tym oczekuje się, że białka błony plazmatycznej i klastry białek zostaną znalezione w błonie MV. Nasze wyniki potwierdziły, że MV z komórek T24 zawierały cząstki wewnątrzbłonowe, prezentujące integralne białka błonowe. Opierając się na rozkładzie cząstek między powierzchnią E i P, można oczekiwać, że cząstki obserwowane w MV są transbłonowymi białkami uroplakinami, które są specyficzne dla komórek urotelialnych 21,24. Zaobserwowane cząstki były nieliczne, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami donoszącymi o zmniejszeniu uroplakiny podczas kancerogenezy urotelialnej 21,22,23. Jednak w celu dalszego zbadania składu białkowego błon MV zaleca się zastosowanie techniki znakowania immunologicznego repliki zamrażania i złamania (FRIL). FRIL jest ulepszeniem przedstawionej techniki zamrażania i łamania i jest dedykowany do ujawnienia tożsamości białek w replikach poprzez rozpoznawanie przeciwciał 24,25. Podsumowując, technika zamrażania-pękania jest techniką mikroskopii elektronowej odpowiednią do charakterystyki błony ograniczającej EV, a także kształtu, wielkości i czystości izolowanych frakcji EV. Przedstawiony protokół może być również wykorzystany do oceny innych populacji izolowanych EV; w związku z tym technika zamrażania i szczelinowania zasługuje na włączenie do wytycznych Międzynarodowego Towarzystwa Pęcherzyków Zewnątrzkomórkowych dotyczących badań nad organizacją błon ograniczających EV.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez Słoweńską Agencję Badawczą (główny fundusz badawczy nr P3-0108 i projekt J7-2594) oraz program infrastrukturalny MRIC UL IP-0510. Prace te stanowią wkład w działania COST CA17116 Międzynarodowej Sieci na rzecz Przekładania Badań nad Pochodnymi Okołoporodowymi na Podejścia Terapeutyczne (SPRINT), wspieranej przez COST (Europejska Współpraca w Nauce i Technologii). Autorzy chcieliby podziękować Lindzie Štrus, Sanji Čabraji, Nadze Pavlicy Dubarič i Sabinie Železnik za pomoc techniczną w hodowli komórkowej i przygotowaniu próbek oraz Marko Vogrincowi, Ota Širca Rošowi i Nejcowi Debevecowi za pomoc techniczną w przygotowaniu filmu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
A-DMEMThermoFisher Scientific, USA12491015
Urządzenie do zamrażania i łamania BalzersBalzers AG, LiechtensteinBalzers BAF 200
Eppendorf, Niemcymodel 5810R
Inkubator CO2 HeraCell Heraues, Niemcy
Nośniki miedziBalzersBB 113 142-2100+ mesh
Siatki miedzianeSPI, Stany Zjednoczone2010C
Kolba hodowlana T75TPP, Szwajcariapowierzchnia uprawowa 75 cm2
F12 (HAM)Sigma-Aldrich, Niemcy21765029
FBSGibco, Life Technologies, USA10500064
Glazed Porcelain Plate 6 WellFischer Sientific, Stany Zjednoczone50-949-072
GlicerolKemika, Chorwacja711901stężenie końcowe 30 % (v/v)
Glutaradehyd Serva, Niemcy23114.01stężenie końcowe 2,5 % (v/v)
GlutaMAXGibco, Life Technologies35050-079stężenie końcowe 4 mM
PenicylinaGibco, Life Technologies15140163stężenie końcowe 100 U/ml
Mikroskop odwrócony z kontastem fazNikon, Japoniamodel Eclipse
RotorEppendorf, NiemcyA 4-44
Wirnik Eppendorf, NiemcyF-34-6-38
Pipety serologiczneTPP, Szwajcaria50 ml objętości
Roztwór podchlorynu sodu w wodzieCarlo Erba, Włochy481181
StereomikroskopLeica, Niemcy
StreptomycynaGibco, Life Technologies35050038stężenie końcowe 100 mg/ml
Transmisyjny mikroskopelektronowy Philips, Holandiamodel CM100pracujący przy 80 kV
PęsetaSPI, Stany Zjednoczone
Wirówka

Bibliografia

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. Willms, E., Cabanas, C., Mager, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 738(2018).
  3. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).
  4. Cocucci, E., Racchetti, G., Meldolesi, J. Shedding microvesicles: Artefacts no more. Trends in Cell Biology. 19 (2), 43-51 (2009).
  5. Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 318 (1), 29-39 (2020).
  6. Tricarico, C., Clancy, J., D'Souza-Schorey, C. Biology and biogenesis of shed microvesicles. Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).
  7. Georgantzoglou, N., Pergaris, A., Masaoutis, C., Theocharis, S. Extracellular vesicles as biomarkers carriers in bladder cancer: Diagnosis, surveillance, and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2744(2021).
  8. Słomka, A., Urban, S. K., Lukacs-Kornek, V., Żekanowska, E., Kornek, M. Large extracellular vesicles: Have we found the holy grail of inflammation. Frontiers in Immunology. 9, 2723(2018).
  9. Han, L., Lam, E. W. F., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: Old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59(2019).
  10. Muralidharan-Chari, V., Clancy, J. W., Sedgwick, A., D'Souza-Schorey, C. Microvesicles: Mediators of extracellular communication during cancer progression. Journal of Cell Science. 123, 1603-1611 (2010).
  11. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
  12. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
  13. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  14. Severs, N. J. Freeze-fracture electron microscopy. Nature Protocols. 2 (3), 547-576 (2007).
  15. Severs, N. J., Robenek, H. Freeze-fracture cytochemistry in cell biology. Methods in Cell Biology. 88, 181-186 (2008).
  16. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  17. Hallett, F. R., Nickel, B., Samuels, C., Krygsman, P. H. Determination of vesicle size distributions by freeze-fracture electron microscopy. Journal of Electron Microscopy Technique. 17 (4), 459-466 (1991).
  18. Nigro, A., et al. Selective loss of microvesicles is a major issue of the differential centrifugation isolation protocols. Scientific Reports. 11, 3589(2021).
  19. Szatanek, R., et al. The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1153(2017).
  20. Iliev, D., et al. Stimulation of exosome release by extracellular DNA is conserved across multiple cell types. The FEBS Journal. 285 (16), 3114-3133 (2018).
  21. Zupančič, D., Zakrajšek, M., Zhou, G., Romih, R. Expression and localization of four uroplakins in urothelial preneoplastic lesions. Histochemistry and Cell Biology. 136 (4), 491-500 (2011).
  22. Wu, X. R., Manabe, M., Yu, J., Sun, T. T. Large scale purification and immunolocalization of bovine uroplakins I, II, and III. Molecular markers of urothelial differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 19170-19179 (1990).
  23. Kreft, M. E., Hudoklin, S., Jezernik, K., Romih, R. Formation and maintenance of blood-urine barrier in urothelium. Protoplasma. 246 (1-4), 3-14 (2010).
  24. Kreft, M. E., Robenek, H. Freeze-fracture replica immunolabelling reveals urothelial plaques in cultured urothelial cells. PLoS One. 7 (6), 38509(2012).
  25. Robenek, H., et al. Topography of lipid droplet-associated proteins: Insights from freeze-fracture replica immunogold labeling. Journal of Lipids. 2011, 409371(2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia mro eniowo frakcyjnap cherzyki zewn trzkom rkoweizolacja mikrop cherzyk wtransmisyjna mikroskopia elektronowaorganizacja b onyp cherzyki kom rek nowotworowychcieniowanie platyncieniowanie w glemkomunikacja mi dzykom rkowabia ka b onowe
Mikroskopia elektronowa zamrażalno-pękająca do analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.