Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowy test kometowy do oceny uszkodzeń DNA komórkowego

DOI:

10.3791/63559

⸱

10 maja 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Oxidative Stress Group, Dept. Cell Biology, Microbiology and Molecular Biology, College of Arts and Sciences, University of South Florida, 2Cepheid (Danaher Corp.), US Technical Operations, 3Department of Clinical Laboratory Sciences, College of Applied Medical Sciences, King Saud University, 4Department of Chemistry and Biochemistry, Institute of Environment, Florida International University, 5Leicester School of Allied Health Sciences, Faculty of Health and Life Sciences, De Montfort University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test kometarny jest popularnym sposobem wykrywania uszkodzeń DNA. W tym badaniu opisano podejście do przeprowadzania slajdów w reprezentatywnych wariantach testu komety. Takie podejście znacznie zwiększyło liczbę próbek przy jednoczesnym skróceniu czasu trwania testu, liczby manipulacji szkiełkami i ryzyka uszkodzenia żeli.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki są stale narażone na czynniki powstające ze środowiska wewnętrznego i zewnętrznego, które mogą uszkadzać DNA. Uszkodzenie to może powodować nieprawidłowe funkcjonowanie komórek, a zatem uszkodzenie DNA może odgrywać kluczową rolę w rozwoju, prawdopodobnie wszystkich głównych chorób człowieka, np. raka, chorób neurodegeneracyjnych i sercowo-naczyniowych oraz starzenia się. Jednokomórkowa elektroforeza żelowa (tj. test kometowy) jest jedną z najczęstszych i najbardziej czułych metod badania powstawania i naprawy szerokiego zakresu rodzajów uszkodzeń DNA (np. pęknięć jedno- i dwuniciowych, miejsc alkalicznych, wiązań krzyżowych DNA-DNA oraz, w połączeniu z niektórymi enzymami naprawczymi, utlenionych puryn i pirymidyn), zarówno in vitro, jak i in vivo Systemów. Jednak niska przepustowość próbki w konwencjonalnym teście i pracochłonne badanie próbek są czynnikami ograniczającymi jego najszersze możliwe zastosowanie. Wraz z coraz większą automatyzacją "punktacji" komet, ograniczeniem jest obecnie możliwość przetwarzania znacznej liczby slajdów komet. W tym przypadku opracowano wariant wysokoprzepustowego (HTP) testu kometarnego (test kometa HTP), który znacznie zwiększa liczbę analizowanych próbek, skraca czas wykonywania testu, liczbę indywidualnych manipulacji szkiełkami, wymagania dotyczące odczynników i ryzyko fizycznego uszkodzenia żeli. Ponadto powierzchnia zajmowana przez zbiornik do elektroforezy jest znacznie zmniejszona dzięki pionowej orientacji suwaków i zintegrowanemu chłodzeniu. Doniesiono również o nowatorskim podejściu do schładzania szkiełek testowych komet, które wygodnie i skutecznie ułatwia krzepnięcie żeli kometowych. W tym artykule opisano zastosowanie tych urządzeń do reprezentatywnych metod oznaczania komet. Te proste innowacje w znacznym stopniu wspierają wykorzystanie testu komety i jego zastosowanie w obszarach badań, takich jak biologia ekspozycji, ekotoksykologia, biomonitoring, badania przesiewowe/testy toksyczności, a także zrozumienie patogenezy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki są stale narażone na czynniki powstające ze środowiska wewnętrznego i zewnętrznego, które mogą uszkadzać DNA1,2. To uszkodzenie może powodować nieprawidłowe funkcjonowanie komórek3, a zatem uszkodzenie DNA może odgrywać kluczową rolę w rozwoju wielu głównych chorób ludzkich, np. raka, chorób neurodegeneracyjnych i sercowo-naczyniowych oraz starzenia się4. Test komet (zwany również jednokomórkową elektroforezą żelową) jest coraz bardziej popularną metodą wykrywania i ilościowego określania uszkodzeń DNA komórek.

W swoim najprostszym sensie, alkaliczny test komet (ACA) wykrywa pęknięcia nici (SB; zarówno pojedyncze, jak i podwójne), wraz z miejscami apurinicz/apirymidinowymi i miejscami alkalicznymi (ALS), które w warunkach alkalicznych stają się pęknięciami jednoniciowymi5. Test komet o neutralnym pH może ocenić szczere pęknięcia jedno- i dwuniciowe6. Co więcej, ACA, w połączeniu z wieloma enzymami naprawy DNA, może wykryć znaczny zakres rodzajów uszkodzeń DNA, np. utlenione puryny (zidentyfikowane za pomocą ludzkiej glikozylazy DNA 8-oksoguaniny 1; hOGG17); utlenione pirymidyny (przy użyciu endonukleazy III; EndoIII) i dimery cyklobutanu pirymidyny (przy użyciu endonukleazy T4 V; T4endoV)8. Test kometarny może być również wykorzystany do oceny zmian w DNA wywołanych przez czynniki sieciujące, takie jak cisplatyna9,10,11. Jak wskazuje formalna nazwa testu, tj. elektroforeza żelowa z pojedynczymi komórkami, test opiera się na tym, że analizowane komórki są zawiesiną pojedynczej komórki; Najczęściej są to komórki hodowlane, ale mogą być wyizolowane z krwi pełnej12,13, lub można użyć samej krwi pełnej14,15. Alternatywnie, zawiesina pojedynczej komórki może być generowana z tkanek stałych.

Poza kilkoma wyjątkami, przede wszystkim raportami CometChip z laboratorium Engleward16, ogólny protokół testu komet nie zmienił się dramatycznie w stosunku do pierwotnie opisanego przez wynalazców testu (Östling i Johansson17 oraz Singh et al.18). Test komety składa się z wielu etapów (Rysunek 1). Wiele z tych etapów polega na przenoszeniu cienkich, zawierających komórki żeli agarozowych, szkiełko po szkiełku, a zatem stwarza ryzyko uszkodzenia lub utraty żelu, co zagraża powodzeniu eksperymentu. W związku z tym test komet może być czasochłonny, szczególnie jeśli przeprowadzana jest znaczna liczba slajdów. Zazwyczaj maksymalnie 40 szkiełek jest uruchamianych w dużym zbiorniku do elektroforezy (33 cm x 59 cm x 9 cm), który znajduje się w jeszcze większej tacy zawierającej mokry lód do chłodzenia. Niedawno doniesiono, że czas trwania testu można skrócić do 1 dnia, skracając czas trwania etapu lizy i nie susząc szkiełek przed barwieniem19.

Obecni autorzy wcześniej opisali nowatorskie podejście do wysokoprzepustowego alkalicznego testu kometalicznego (HTP ACA), w którym wiele (partie po 25) preparatów mikroskopowych do testów komet może być manipulowanych jednocześnie podczas procesu testowania komet20,21,22. To opatentowane podejście minimalizuje ryzyko uszkodzenia lub utraty żeli zawierających próbki, eliminując potrzebę indywidualnego manipulowania szkiełkami mikroskopowymi i może być stosowane do wszystkich wariantów testu kometowego, które wykorzystują szkiełka mikroskopowe. Stojaki zawierające szkiełka chronią żele podczas manipulacji, a co za tym idzie, przetwarzanie próbki jest szybsze i bardziej wydajne. Szkiełka mogą być również poddawane elektroforezie w regałach, utrzymywane w orientacji pionowej, a nie poziomej. To, w połączeniu z integralnym chłodzeniem, znacznie zmniejsza powierzchnię zajmowaną przez zbiornik do elektroforezy i eliminuje potrzebę stosowania mokrego lodu. Podsumowując, stanowi to znaczną poprawę w porównaniu z konwencjonalną procedurą. Używany sprzęt jest zilustrowany na Rysunek 2. Opisane tutaj protokoły, wykorzystujące to nowatorskie podejście, demonstrują reprezentatywne zastosowanie do hodowanych komórek i krwi pełnej14 do wykrywania miejsc alkaliczno-labilnych (ALS), wiązań krzyżowych między niciami DNA (ICL) oraz substratów różnych enzymów naprawy DNA.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym badaniu wykorzystano dostępne na rynku próbki krwi. W naszej placówce zgoda Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej nie jest wymagana do stosowania krwi dostępnej na rynku.

1. Przygotowanie materiałów do testu komety

  1. Przygotowanie preparatów mikroskopowych
    1. Wlać 1% (w/v) agarozy o normalnej temperaturze topnienia [rozpuszczonej w wodzie podwójnie destylowanej (ddH2O)] do probówki o pojemności 50 ml i mikrofalówki, aby rozpuścić agarozę w ddH2O. Przechowywać w temperaturze 37 °C, aby zapobiec zestaleniu się przed powlekaniem szkiełek. Jeśli dojdzie do zestalenia, wyrzuć i przygotuj świeże.
    2. Wstępnie pokryj szkiełka mikroskopowe, zanurzając je w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 1% (w/v) agarozy o normalnej temperaturze topnienia.
    3. Szybko wytrzyj tylną część szkiełek po zanurzeniu szkiełek.
      UWAGA: Niewłaściwe wytarcie tylnej części szkiełek zwiększy hałas tła szkiełek podczas analizy pod mikroskopem.
    4. Oznacz powlekane szkiełko trwałym markerem w prawym dolnym rogu matowej sekcji (Rysunek 3A). Pokazuje to, która strona prowadnicy jest wstępnie pokryta.
    5. Pozostaw agarozę do zastygnięcia i wyschnij przez noc w temperaturze pokojowej.
    6. Zawiń wysuszone szkiełka w bibułę i przechowuj je w pudełku.

2. Przygotowanie próbek

  1. Hodowane komórki
    UWAGA: Po pierwsze, należy potraktować komórki czynnikiem uszkadzającym (czynnikami) przed rozpoczęciem testu komety. Następnie wykonaj następujące czynności.
    1. Jeśli komórki przylegają, trypsynizuj komórki, aby uwolnić je z kolby do hodowli komórkowej lub szalki Petriego do hodowli komórkowych, przy odpowiednim zbieganiu się komórek. Zneutralizuj trypsynę, dodając pożywkę zawierającą surowicę.
    2. Przenieść komórki do probówki o pojemności 50 ml, odwirować (np. w przypadku HaCaT odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej), delikatnie usunąć supernatant i dodać 1 ml PBS do osadu komórkowego.
    3. Wykonaj zliczanie komórek.
    4. Przenieść 30 000 komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować przy 7 607 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Delikatnie usuń supernatant i przechowuj osad komórek na lodzie w ciemności przed wykonaniem testu komety.
      UWAGA: Komórki powinny być regularnie badane pod kątem zanieczyszczenia Mycoplasma przed wykonaniem testu komety, aby zapobiec, między innymi, powstawaniu artefaktowych uszkodzeń DNA i zmienionej odpowiedzi na uszkodzenia DNA, jak podano w innym miejscu23. Warunki wirowania mogą być zmieniane w razie potrzeby, w zależności od użytego typu ogniwa.
  2. Przygotowanie hodowanych komórek do testu naprawczego
    1. Hodowla komórek w kolbie do hodowli komórkowej lub na płytkach Petriego.
    2. Umyj komórki 1 ml PBS dwukrotnie przed potraktowaniem komórek czynnikami uszkadzającymi (np. w przypadku komórek BE-M17 należy potraktować 50 μMH2O2przez 20 minut) na lodzie, aby zapobiec naprawie podczas zabiegu.
    3. Delikatnie umyj komórki dwukrotnie 1 ml PBS, aby usunąć wszelkie pozostałości środków uszkadzających.
    4. Ponownie wprowadzić pożywkę do hodowli komórkowych i pozwolić komórkom na naprawę przez różny czas (np. 0 min, 30 min, 2 h, 6 h, 24 h i 30 h) w wilgotnym inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).
    5. W każdym punkcie czasowym zbierz 30 000 komórek w pożywce do hodowli komórkowych zawierających 10% dimetylosulfotlenek (DMSO) i przechowuj je w temperaturze -80 °C.
    6. Przed wykonaniem testu kometarnego należy szybko rozmrozić komórki w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej i odwirować je w temperaturze 7 607 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Usunąć supernatant i przechowywać osad komórek na lodzie przed wykonaniem testu (tj. od etapu 3).
  3. Przygotowanie krwi pełnej
    UWAGA: Poniższa metoda korzysta z tego, że (i) jest minimalnie inwazyjnym podejściem do uzyskania próbki krwi, (ii) nie wymaga izolacji PBMC przed testem komety oraz (iii) pozwala na przechowywanie próbek krwi (o objętości < 250 °C) w temperaturze -80 °C przez okres do 1 miesiąca (chociaż nowsze dowody sugerują, że możliwe jest dłuższe przechowywanie), Bez konieczności stosowania kriokonserwantów, bez ryzyka i tworzenia się artefaktów14. Zgoda etyczna lub jej odpowiednik może być potrzebna przed uzyskaniem próbek krwi od pacjentów lub zwierząt. Alternatywnie można wykorzystać dostępne na rynku próbki krwi, tak jak w niniejszym badaniu. W naszej placówce zgoda Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej nie jest wymagana do stosowania krwi dostępnej na rynku.
    1. Za pomocą pipety przenieść próbki krwi pełnej (<250 μl) (tabela materiałów) do probówki zbiorczej zawierającej minimalną objętość zawierającą 0,4 mg EDTA (na 250 μl krwi).
    2. Zamrozić próbki krwi w temperaturze -80 °C przed wykonaniem testu komety HTP.
    3. Przechowywane próbki krwi (<250 μl) rozmrozić w temperaturze pokojowej, bez podgrzewania.
    4. Przenieś 5 μl krwi pełnej do probówek mikrowirówkowych przed wykonaniem testu komety (patrz krok 3).

3. Liza komórek

UWAGA: Wykonaj wszystkie procedury na lodzie.

  1. Użyj 12 000 komórek lub 2,5 μl krwi pełnej na żel.
  2. Przygotować 0,6% (w/v) niskotemperaturową agarozę rozpuszczoną w PBS za pomocą kuchenki mikrofalowej i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aby zapobiec jej zestaleniu.
  3. Oznacz matowy koniec wstępnie powlekanych szkiełek nazwiskiem badacza, datą i informacjami o leczeniu za pomocą markera permanentnego lub ołówka.
  4. Umieść talerz chłodzący na płaskiej ławce i włóż dwa zamrożone pakiety chłodzące do wysuwanej szuflady pod metalową powierzchnią (jak pokazano na Rysunek 4)21.
  5. Umieść szkiełka na płycie chłodzącej i pozwól im wstępnie schłodzić się przez 1-2 minuty przed dodaniem komórek zawierających agarozę o niskiej temperaturze topnienia 0,6% (w/v) (krok 3.7).
    UWAGA: Pozostawienie szkiełek na płycie chłodzącej na dłużej niż 1-2 minuty może spowodować kondensację pary wodnej na powierzchni szkiełka z powodu wilgotności otoczenia. Może to spowodować, że żele agarozowe o niskiej temperaturze topnienia będą mniej stabilne na szkiełkach.
  6. Rozprowadzić osad (etap 2.2.7) przez wirowanie. Upewnij się, że cały sklarowany osad został usunięty z osadu. Umieścić probówki z próbkami (zawierające granulowane komórki) natychmiast z powrotem na lodzie.
    UWAGA: Umieszczając probówki zawierające próbkę w wirówce, należy je umieścić zawiasem skierowanym na zewnątrz, tak aby osad został zebrany po tej stronie probówki. Czasami trudno jest dostrzec osad i łatwo go usunąć podczas usuwania supernatantu. Wirowanie z pokrywką probówki w tej orientacji pozwoli wiedzieć, gdzie będzie osad komórkowy.
  7. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 200 μl 0,6% agarozy o niskiej temperaturze topnienia (agarozy LMP) i mieszać, pipetując w górę iw dół, nie tworząc pęcherzyków. Następnie szybko przenieś 80 μl komórek zawierających agarozę LMP na schłodzone szkiełko i szybko umieść szkiełko nakrywkowe na żelu.
  8. Pozostaw żel do zastygnięcia na płycie chłodzącej na 1-2 minuty.
  9. W międzyczasie przygotuj 500 ml roztworu roboczego buforu do lizy (Tabela 1) i wlej go do naczynia do lizy (Rysunek 2).
  10. Po związaniu żeli należy szybko usunąć szkiełka nakrywkowe, delikatnie przytrzymując szkiełko między kciukiem a palcem wskazującym i zsuwając szkiełko nakrywkowe z żelu.
  11. Umieść szkiełka zawierające próbki wewnątrz nośnika szkiełka (wszystkie czarne znaki "kropki" na szkiełkach powinny być skierowane w tym samym kierunku, gdy są umieszczone w nośniku) (Rysunek 3B), a następnie umieść nośnik szkiełka w naczyniu do lizy (Rysunek 2).
  12. Zamknij pokrywę naczynia do lizy i przechowuj naczynie do lizy w lodówce przez noc w temperaturze 4 °C lub 30 minut w temperaturze pokojowej, w zależności od tego, co najlepiej odpowiada harmonogramowi operatora19.

4. Elektroforeza

  1. Ostrożnie wyjmij nośnik szkiełka z naczynia do lizy. Uważaj, aby nie naruszyć żeli.
  2. Delikatnie umieść nosidełko szkiełka w naczyniu do mycia wstępnie załadowanym lodowatym ddH2O i pozostaw na 30 minut, upewniając się, że szkiełka są całkowicie pokryte ddH2O.
  3. Włóż zamrożony pakiet chłodzący do wysuwanej szuflady pod zbiornikiem do elektroforezy, aby utrzymać optymalną temperaturę bufora.
  4. Ostrożnie dodać lodowaty roztwór roboczy do elektroforezy (Tabela 1) do zbiornika do elektroforezy i przenieść nośnik szkiełka do zbiornika do elektroforezy. Ustaw szkiełka tak, aby ich przezroczyste części z żelami zawierającymi ogniwa (tj. NIE matowe/etykietujące końce) były skierowane w stronę katody (czerwonej elektrody).
  5. Pozostaw szkiełka w zbiorniku do elektroforezy na 20 minut, aby DNA zrelaksowało się i odwinęło. Na tym etapie należy odłączyć zasilanie.
  6. W razie potrzeby włóż nowy zamrożony pakiet chłodzący, aby zmaksymalizować chłodzenie.
  7. Wykonuj elektroforezę przez 20 minut przy napięciu 1,19 V/cm lub w innych warunkach, które zostały zoptymalizowane.
    UWAGA: Optymalizacja warunków pracy elektroforezy i objętości bufora jest zalecana dla każdego laboratorium24. Użycie tylko jednego nośnika szkiełka podczas elektroforezy nie powoduje żadnego wpływu szkiełek na rezystancję bufora elektroforezy, a autorzy nie zaobserwowali istotnego wpływu napięcia lub prądu przy zmianie liczby szkiełek.
  8. Wyłącz zasilanie, ostrożnie wyjmij nośnik szkiełka ze zbiornika do elektroforezy i pozwól mu spłynąć na bibułce przez 30 sekund.
  9. Umieścić nośnik szkiełka w naczyniu zawierającym bufor neutralizacyjny (Tabela 1). Pozostaw na 20 minut.
  10. Wyjąć nośnik szkiełka z naczynia neutralizacyjnego, umieścić go w naczyniu do mycia zawierającym lodowaty ddH2O i pozostawić na 20 minut.
  11. Wyjmij nośnik szkiełka z wody i pozostaw szkiełka do wyschnięcia w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę lub w temperaturze pokojowej przez noc, lub nie susz, w zależności od harmonogramu operatora19.
    UWAGA: Jeśli w kroku 4.11 nie ma suszenia, wykonaj etap barwienia z punktu 5.2.

5. Barwienie jodkiem propidyny (PI)

  1. Przenieś nośnik szkiełka do naczynia myjącego zawierającego lodowaty ddH2O w celu nawodnienia szkiełek i pozostaw na 30 minut.
  2. Umieść nośnik szkiełka w naczyniu barwiącym zawierającym 2.5 μg/ml roztworu jodku propidyny.
    UWAGA: Jodek propidyny jest wrażliwy na światło, więc należy go obchodzić w zaciemnionym miejscu. Jest również toksyczny.
  3. Zamknij pokrywę naczynia do barwienia i inkubuj je przez 20 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
  4. Przenieś nosidełko do osobnego naczynia i myj je lodowatym dnH2O przez 20 minut.
  5. Wyjmij nośnik szkiełka z naczynia i wysusz go całkowicie w ciemności, w inkubatorze o temperaturze 37 °C lub w temperaturze pokojowej, w zależności od harmonogramu lub preferencji operatora.
  6. Gdy szkiełka całkowicie wyschną, wyjmij je z nośnika szkiełek i przechowuj w pudełku na szkiełka w ciemności, aż będą gotowe do analizy obrazu.
    UWAGA: Slajdy pozostaną czytelne przez czas nieokreślony i w razie potrzeby można je ponownie zabarwić.

6. Test komet alkalicznych modyfikowany enzymami

UWAGA: Modyfikowany enzymatycznie alkaliczny test komet wykorzystuje etap leczenia enzymatycznego po lizie, ale przed elektroforezą. Aktywność enzymu powoduje pęknięcia w DNA w miejscach, które są substratami enzymu. Przed wykonaniem tego testu należy zoptymalizować stężenie enzymu i czas trwania inkubacji enzymu.

  1. Po lizie komórek (krok 3) przemyj szkiełka dwukrotnie lodowatym ddH2O przez 20 minut każda.
  2. Wyjmij uchwyt na szkiełka z wody i przenieś szkiełka na tacę wyłożoną ręcznikami papierowymi.
  3. Dodać 80 μl enzymu w optymalnym stężeniu (np. 3,2 U/ml hOGG1 dla komórek BE-M17, rozcieńczony w buforze reakcji enzymatycznej) i przykryć szkiełkiem nakrywkowym w celu rozprowadzenia enzymu na próbce zawierającej żel.
  4. Inkubować szkiełka w temperaturze 37 °C przez optymalny czas (np. 45 minut dla hOGG1).
  5. Po inkubacji delikatnie usunąć szkiełka nakrywkowe i przenieść je do nośnika.
    UWAGA: Nie myć szkiełek po leczeniu enzymatycznym; Bezpośrednio wykonaj elektroforezę od kroku 4.3.

7. Test usieciowania międzyniciowego DNA (ICL) zmodyfikowany alkalicznym testem komet

UWAGA: Koncepcja tego wariantu ICL-ACA polega na tym, że obecność ICL w DNA opóźni elektroforetyczną migrację uszkodzonego DNA, wywołaną po ekspozycji na zniewagę generowaną przez utlenianie. W tym przypadku im krótszy warkocz komety, tym większa liczba ICL25,26,27,28.

  1. Potraktuj komórki odczynnikiem, który indukuje ICL (np. cisplatyną; patrz plik uzupełniający).
  2. Poddaj leczone komórki jednemu z następujących środków, aby wywołać wystarczające pęknięcia nici, aby utworzyć odpowiednio duży warkocz komety (~20% DNA warkocza): nadtlenek wodoru (50 μM H2O2 przez 30 min), promieniowanie jonizujące (2-5 Gy) lub ultrafiolet B (UVB) (0,5 J/cm2).
  3. Dodatkowo należy wytworzyć kontrolę pozytywną przerywającą nić, traktując partię komórek tym samym środkiem i dawką, jak zastosowano w kroku 7.2 (tj. bez leczenia środkiem indukującym ICL).
  4. Odwirować komórki przy 7,607 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant, przemyć osad komórkowy trzykrotnie 1 ml PBS i postępować jak w alkalicznym teście komet (kroki 3-5).
  5. Oblicz poziomy sieciowania międzyniciowego DNA, korzystając z poniższego wzoru.
    figure-protocol-1
    UWAGA: MOTM (Mean Olive Tail Moment) jest punktem końcowym testu komety szeroko stosowanym przy opisywaniu testu komety zmodyfikowanego przez ICL i jest definiowany jako iloczyn długości ogona i ułamka całkowitego DNA w ogonie (tj. moment ogonowy = długość ogona x % DNA w ogonie)29; TMdi: moment ogonowy próbek poddanych działaniu zarówno środka sieciującego, jak iH2O2(lub innego induktora łamiącego pasma); TMcu: moment ogonowy próbek niepoddanych działaniu środka sieciującego i niepoddanych działaniuH2O2(brak obróbki), oraz TMci: moment ogonowy próbek niepoddanych działaniu środka sieciującego, ale poddanych działaniuH2O2.

8. Punktacja komety i analiza danych

UWAGA: Termin "kometa" pochodzi od obrazów uszkodzonych komórek oglądanych pod mikroskopem po przeprowadzeniu testu (Rysunek 5). W warunkach elektroforezy DNA w nieuszkodzonych komórkach w dużej mierze nie migruje, ale pozostaje w sferoidzie określanej jako "głowa" komety. Jednak obecność pęknięć nici pozwala DNA komórki migrować z głowy i uformować "ogon", co prowadzi do wyglądu komety (Ryc. 5). Im więcej DNA w ogonie, tym więcej uszkodzeń jest obecnych.

  1. Włącz mikroskop fluorescencyjny z filtrem PI (czerwonym) (λ = 536/617 nm) i oprogramowaniem do oceny testu komet.
  2. Dodaj kroplę wody za pomocą pipety Pasteura do żelu i przykryj szkiełkiem nakrywkowym.
  3. Umieść szkiełka w mikroskopie fluorescencyjnym i "nacień" komety.
    UWAGA: Punktacja jest środkiem, za pomocą którego komety są oceniane, w celu określenia ilości uszkodzeń obecnych w każdej komecie. Ogólnie rzecz biorąc, można to osiągnąć za pomocą dwóch podejść, zgodnie z wybranymi preferencjami użytkownika, albo na oko (mierząc rozmiar komet w skali od zera do czterech), albo za pomocą swobodnie lub komercyjnie dostępnego oprogramowania30. Ogólnie rzecz biorąc, oba podejścia oceniają rozmiar warkocza komety, chociaż można określić różne punkty końcowe związane z kometą. Jeśli korzystasz z oprogramowania, kliknij na środek głowy komety i poczekaj, aż oprogramowanie automatycznie wykryje kometę, a następnie oceni wybrany punkt końcowy (Rysunek 5).
  4. Zdobądź 50 komet na żel i 100 komet na próbkę (tj. każda próbka odpowiada różnym zabiegom uszkadzania DNA lub ich powtórzeniom).
  5. Powtórzyć doświadczenia (n = 2) lub potroić je (n = 3).
    UWAGA: Jeśli przeprowadza się tylko n=2 powtórzone eksperymenty, nie można przeprowadzić analizy statystycznej, ale jeśli n=3, należy wykonać test normalności D'agostino. Większość danych z testów komet nie przechodzi testu normalności. W takim przypadku należy użyć testu nieparametrycznego (test Kruskala-Wallisa z testem wielokrotnych porównań Dunna oraz test istotności Manna-Whitneya ustawiony na p < 0,05).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optymalizacja napięcia elektroforezy dla HTP ACA
Ludzkie keratynocyty (HaCaT; Tabela materiałów) były naświetlane różnymi dawkami promieniowania ultrafioletowego A (UVA) (5 lub 10 J/cm2; Rysunek 6A), UVB (0,5 lub 1 J/cm2; Rysunek 6B), lub potraktowana 50 μM H2O2 (Rysunek 6C) w celu wywołania uszkodzeń. Przetestowano trzy różne napięcia elektroforezy w celu określenia optymalnego napięcia dla elektroforezy. Wyniki wszystkich trzech terapii uszkadzających DNA ujawniły, że podczas gdy wszystkie napięcia generowały liniowe reakcje na dawkę, najbardziej czułą odpowiedź uzyskano przy 1,19 V/cm. HaCaTs wykazały najwyższe wyjściowe uszkodzenia DNA przy użyciu 1,19 V/cm podczas elektroforezy w porównaniu do 1 V/cm i 1,09 V/cm (Figura 6A-C). Ponadto, stosując 1,19 V/cm, obserwuje się największy % DNA ogona, po wszystkich szkodliwych zabiegach (Rysunek 6)31.

Wykrywanie uszkodzeń DNA w ludzkiej krwi pełnej za pomocą zmodyfikowanego Fpg HTP ACA
Ludzka krew (tabela materiałów) była napromieniowywana różnymi dawkami 10 J/cm2 UVA w celu wywołania uszkodzenia. Cztery różne stężenia Fpg (1, 2, 4 lub 8 U/ml) zastosowano w celu określenia optymalnego stężenia do leczenia enzymatycznego w HTP ACA. Wyniki wykazały, że optymalne poziomy uszkodzeń DNA ujawniono przy użyciu 4 U/mL Fpg (Figura 7A). Reprezentatywne obrazy komety z próbek krwi napromieniowanych promieniowaniem UVA (Rysunek 7B).

Wykrywanie DNA ICL w reprezentatywnej linii komórkowej raka jajnika przy użyciu zmodyfikowanego przez ICL HTP ACA
Linia komórkowa raka jajnika (SKOV-3; Tabela materiałów) poddano działaniu kombinacji 200 μM cisplatyny i (lub) następnie podano 50 μM H2O2 przez 30 minut na lodzie. Nie stwierdzono znaczących uszkodzeń w nienaświetlonych komórkach (Ryc. 8A). Sama ekspozycja naH2O2 wygenerowała znaczący MOTM (Rysunek 8B). W przeciwieństwie do tego, komórki, w których indukowano ICL, wykazywały obniżony MOTM (Rysunek 8C)28.

Tworzenie i naprawa ICL DNA indukowanego cisplatyną w reprezentatywnej linii komórkowej raka jajnika
Zmodyfikowany ICL HTP ACA został wykorzystany do określenia przebiegu czasu powstawania i naprawy ICL DNA indukowanego przez cisplatynę w linii komórkowej raka jajnika (A2780; Tabela materiałów). Komórki traktowano cisplatyną o stężeniu 100 μM przez 1 godzinę, a następnie inkubowano w pożywce wolnej od cisplatyny (pożywka RPMI 1640 uzupełniona 10% (v/v) płodową surowicą bydlęcą (FBS)) przez kolejny cykl czasowy. W różnych punktach czasowych przeprowadzono zmodyfikowane ICL HTP ACA w celu ustalenia poziomów ICL (Rysunek 9)28. Nie wykryto ICL przed leczeniem cisplatyną. Jednak po pojedynczym zabiegu cisplatyną 100 μM poziomy ICL znacznie wzrosły, osiągając szczyt po 12 godzinach, po czym poziomy spadły z powrotem do zera po 30 godzinach.

Korelacja między poziomem DNA ICL a poziomem platyny w DNA
Trzy komórki raka jajnika leczono cisplatyną o stężeniu 100 μM w celu wywołania różnych poziomów DNA-ICL, przed analizą za pomocą zmodyfikowanego ICL HTP ACA i indukcyjnie sprzężonej spektrometrii mas (ICP-MS; szczegółowe informacje można znaleźć w pliku uzupełniającym). Jak pokazano na Rysunek 10, w trzech liniach komórkowych indukowano różne poziomy DNA-ICL, wraz z różnymi poziomami Pt w DNA. Zaobserwowano dodatnią korelację (R2 = 0,9235) między poziomami ICL DNA a stężeniami platyny, co wskazuje na związek między poziomami platyny DNA a odpowiadającą im klasą ICL28.

Naprawa przez wycinanie zasady w komórkach BE-M17 zakażonych i niezakażonych Mykoplazmą
Zakażone i niezakażone komórkami BE-M17 zakażone Mykoplazmą traktowano 50 μM H2O2 przez 30 minut i inkubowano z kompletną pożywką (zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco uzupełniona 10% (v / v) FBS) przez różne czasy (0 min, 30 min, 1 h, 2 h, 6 godzin, 24 godziny lub 30 godzin), podczas których komórki mogły się naprawić. W każdym punkcie czasowym komórki zostały zebrane i zamrożone w temperaturze -80 °C, w 10% pożywce zawierającej DMSO, przed wykonaniem zmodyfikowanego hOGG1 HTP ACA (krok 6). Po 30 minutach poziomy SB / ALS spadły do 21% TD (procentowego DNA ogonowego) w niezakażonych komórkach, podczas gdy zakażone komórki wykazywały 49% TD (Ryc. 11A). Po ~15 godzinach poziomy SB/ALS powróciły do wartości wyjściowej zarówno w zakażonych, jak i niezakażonych komórkach. W przypadku utlenionych puryn niezainfekowany BE-M17 początkowo wykazywał niewielki wzrost uszkodzeń, po czym powrócił do stanu wyjściowego w ciągu 30 godzin (Rysunek 11B). W przeciwieństwie do tego, zakażone komórki wykazały trwały, znaczący wzrost utlenionych puryn, które pozostały podwyższone i nie powróciły do poziomów wyjściowych nawet po 30 godzinach (Rysunek 11B)23.

figure-results-1
Rysunek 1: Przegląd konwencjonalnej procedury alkalicznego testu komet. (i) Jednokomórkowa zawiesina hodowanych komórek lub próbka krwi pełnej jest mieszana z 0,6% (w/v) agarozy LMP. (ii) Mieszaninę komórek i agarozy nakłada się na wstępnie powlekane szkiełka mikroskopowe i przykrywa szkiełkiem nakrywkowym aż do zestalenia. (iii) Komórki są poddawane lizie przy użyciu buforu do lizy o wysokim pH przez noc, tworząc ciała nukleoidowe, przed (iv) myciem ddH2O. (v) DNA komórkowe rozwija się w buforze do elektroforezy o wysokim pH. Obecność pęknięć nici pozwala DNA zrelaksować się i odwinąć, a pod wpływem elektroforezy DNA jest wyciągane z ciała nukleoidowego, tworząc ogon. Szkiełka są następnie (vi) osuszane, suszone, (vii) neutralizowane i (viii) myte ddH2O przed (ix) suszeniem przez noc. Szkiełka są następnie (x) ponownie nawilżane za pomocą ddH2O, (xi) barwione, (xii) myte, a na koniec (xiii) oceniane i analizowane, zwykle przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i oprogramowania do analizy obrazu. Ten rysunek jest odtworzony z poprzedniej publikacji20. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Materiały składające się na wysokoprzepustowy system elektroforezy komet. Pokazano zbiornik do elektroforezy HTP, stojaki HTP oraz naczynia do lizy, mycia, neutralizacji i barwienia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy szkiełka testowego komety i stojaka HTP (nośnika szkiełek mikroskopowych). (A) Dla prawidłowej orientacji, wstępnie pokryta powierzchnia szkiełka mikroskopowego jest rozpoznawana przez czarną kropkę w prawym rogu szkiełka mikroskopowego. (B) Obraz stojaka HTP ilustruje, w jaki sposób szkiełka są utrzymywane w ciasnej orientacji pionowej, z wypustkami na nośniku, aby ustalić jego orientację w zbiorniku do elektroforezy. Każdy nośnik może pomieścić do 25 prowadnic. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Przedstawienie płyty chłodzącej z przykładowymi preparatami i opakowaniami do zamrażania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Zrzut ekranu reprezentatywnych komet zrobiony podczas oceniania. HaCaTs (A) bez leczenia i (B) leczone 1 J/cm2 UVB przed wykonaniem HTP ACA. Większość pakietów oprogramowania może obliczać różne punkty końcowe komety, ale najczęstszymi z nich są % DNA warkocza (preferowane) lub moment warkocza na podstawie tych obrazów (niebieski: początek głowy, zielony: środek głowy i fioletowy: koniec warkocza). Podziałka wynosi 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Reprezentatywne wykresy ilustrujące wpływ napięcia elektroforezy na procentowy ślad DNA, wyznaczony za pomocą HTP ACA. Komórki wystawiono na działanie (A) 5 lub 10 J/cm2 UVA, (B) 0,5 lub 1,0 J/cm2 UVB lub (C) 50 μM H2O2 przed HTP ACA, przy napięciu elektroforezy wynoszącym 1, 1,09 lub 1,19 V/cm. Dane reprezentują średnią z 200 oznaczeń z n = 2 zduplikowanych eksperymentów31. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Reprezentatywny wykres i obrazy ludzkiej krwi przeanalizowane przez zmodyfikowany przez zmodyfikowane przez Fpg HTP ACA. Próbki krwi ludzkiej poddano napromienianiu 10 J/cm2 UVA lub napromienianiu pozorowanemu ("ctrl") na lodzie przed etapem lizy. Różne stężenia Fpg (1, 2, 4 lub 8 U/ml) stosowano do leczenia enzymatycznego przed elektroforezą. (A) Dane reprezentują średnią ± SEM z 300 oznaczeń z n=3 eksperymentów. (B) Reprezentatywne obrazy komet dla każdego stężenia Fpg w próbkach krwi napromieniowanych promieniowaniem UVA o mocy 10 J/cm2. Podziałka wynosi 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Reprezentatywne obrazy komety ilustrujące detekcję ICL po leczeniu cisplatyną. (A) komórki kontrolne bez żadnego leczenia, (B) komórki, które były traktowane tylkoH2O2 (50 μM), (C) komórki, które były traktowaneH2O2 (50 μM) i cisplatyną (200 μM), ilustrujące to, że warkocz jest krótszy niż w (B)), ze względu na obecność ICL28. Podziałka wynosi 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 9: Demonstracja kinetyki powstawania i naprawy ICL wywołanego cisplatyną. Komórki A2780 traktowano 100 μM cisplatyny w pożywce hodowlanej przez 1 godzinę. Pożywkę zawierającą cisplatynę usunięto następnie, a komórki hodowano w różnych punktach czasowych, przed analizą za pomocą zmodyfikowanego ICL HTP ACA. Dane reprezentują średnią ± SEM z n = 3 eksperymentów28. P < 0,0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rysunek 10: Korelacja między DNA ICL a stężeniem platyny. DNA ICL oznaczono za pomocą zmodyfikowanego ICL HTP ACA, a poziomy platyny mierzono za pomocą ICP-MS (z pojedynczą dyskryminacją energii kinetycznej, SQ-KED) w trzech liniach komórkowych raka jajnika. R2 = 0,9235. Zobacz plik uzupełniający dla metodologii ICP-MS do ilościowego określania poziomów platyny w DNA28. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-11
Rysunek 11: Reprezentatywny wykres ilustrujący uszkodzenia i naprawy DNA, określone za pomocą testu komety zmodyfikowanego przez hOGG1, w komórkach zakażonych Mykoplazmą w porównaniu z niezakażonymi komórkami BE-M17. Po traktowaniu 50 μM H2O2 przez 30 minut, komórkom pozwolono na naprawę przez różny czas (0, 30 min, 1 h, 2 h, 6 h, 24 h lub 30 h). Zmodyfikowany hOGG1 HTP ACA został użyty do pomiaru (A) SB / ALS i (B) utlenionych puryn w zakażonych (czerwone punkty danych) i niezainfekowanych (czarne punkty danych) komórkach BE-M17. Dane reprezentują średnią z 200 oznaczeń z n = 2 zduplikowanych eksperymentów. Ten rysunek jest reprodukowany za zgodą z poprzedniej publikacji23. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

OdczynnikRoztwór podstawowyRozwiązanie robocze
Bufor do lizy100 mM Na2EDTA, 2,5 M NaCl i 10 mM Tris Base w ddH2O; dostosuj pH do 10 za pomocą 10 M NaOH1% Triton X-100 w roztworze podstawowym do lizy
Bufor do elektroforezy10 M NaOH i 200 mM Na2EDTA w ddH2O300 mM NaOH i 1 mM Na2EDTA; pH > 13
Bufor neutralizacyjny0,4 M Tris Base in ddH2O; dostosuj pH do 7,5 za pomocą HCl
Bufor do barwienia1 mg/ml jodku propidyny2,5 μg/ml jodku propidyny w ddH2O

Tabela 1: Skład odczynników stosowanych w HTP ACA. Pokazano podstawowe i robocze stężenia do lizy, elektroforezy, neutralizacji i barwienia.

Plik uzupełniający. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to pokazuje wszechstronność zapewnianą przez obecny sprzęt, który może być wykorzystany do osiągnięcia wysokiej przepustowości z różnymi reprezentatywnymi, powszechnymi wariantami testu kometarnego (tj. alkaliczne, modyfikowane enzymami, krew i ICL, a inne warianty również będą odpowiednie). Ponadto obecne podejście niesie ze sobą szereg korzyści20,21: a) czas wykonywania testu jest skrócony ze względu na równoległą manipulację wieloma szkiełkami (czas obsługi skraca się o 60%); b) ryzyko uszkodzenia żeli, a tym samym zmniejszenie ryzyka dla eksperymentu; c) zmniejsza się zapotrzebowanie na odczynniki (np. objętość zbiornika do elektroforezy jest mniejsza niż w zbiorniku konwencjonalnym); (d) zwiększa się liczba uruchamianych slajdów. Jeden zbiornik może zapewnić 20% wzrost liczby przebiegów zjeżdżalni w porównaniu z pojedynczym konwencjonalnym zbiornikiem; Jednak wiele zbiorników do elektroforezy może być eksploatowanych lub niewolniczo eksploatowanych (tj. Wiele zbiorników sterowanych przez jeden zasilacz), równolegle z tego samego źródła zasilania i nadal wymaga mniejszej powierzchni niż pojedynczy konwencjonalny zbiornik z tacką na lód; oraz (e) powierzchnia zajmowana przez zbiornik jest zmniejszona dzięki pionowej orientacji prowadnic i zintegrowanemu chłodzeniu (oszczędność miejsca w laboratorium); zbiornik HTP składa się z wysokowydajnej ceramicznej podstawy chłodzącej z wysuwaną szufladą, w której może zmieścić się jeden zamrożony pakiet chłodzący, aby utrzymać optymalną temperaturę bufora bez konieczności wykonywania procesu w chłodni.

Co więcej, opracowana przez nas płyta chłodząca mieści 26 szkiełków kometowych, umożliwia szybkie zestalanie agarozy o niskiej temperaturze topnienia na szkiełkach testowych komet i ułatwia łatwe pobieranie szkiełek po zestaleniu się żelu agarozowego. Powyższe innowacje sprawiają, że proces oznaczania komet jest prostszy i łatwiejszy.

Chociaż opracowano inne podejścia o wysokiej przepustowości (np. 12-żelowy test kometowy, CometChip lub 96 formatów mini-żeli)25, wielu naukowców preferuje stosowanie konwencjonalnych szkiełek mikroskopowych (w tym dostępnych na rynku wstępnie powlekanych szkiełek lub innych specjalistycznych szkiełek). Obecne podejście może pomieścić wszystkie typy szkiełek mikroskopowych, umożliwiając skalowanie eksperymentów z wykorzystaniem tych szkiełek dzięki szybszemu przetwarzaniu i obsłudze szkiełek. Jak wspomniano powyżej, system komet HTP ma wiele zalet, ale jest jedno znaczące ograniczenie: obecne podejście zapewnia tylko 20% wzrost liczby próbek w porównaniu z konwencjonalnym zbiornikiem poziomym (chociaż przetwarzanie szkiełek jest znacznie szybsze). Formaty CometChip i 96 mini-żeli obsługują większą liczbę próbek. Do tej pory nie wiemy, czy obecne podejście jest w stanie pomieścić formaty mini-żeli CometChip lub 96, chociaż przewidujemy, że tak się stanie. Jak wspomniano powyżej, liczbę próbek można dodatkowo zwiększyć, niewolniczo podłączając zbiorniki do jednego źródła zasilania. Podobnie jak w przypadku wszystkich podejść, nadal istnieje ryzyko utraty lub uszkodzenia żeli podczas ładowania próbek i analizowania ich pod mikroskopem, ale jest to bardziej spowodowane błędem operatora, a szanse na to są zminimalizowane przy obecnym podejściu.

Zastosowanie systemu komet HTP może znacznie pomóc w analizie uszkodzeń DNA, ułatwiając wykorzystanie testu kometarnego w szerokim zakresie zastosowań, takich jak epidemiologia molekularna, nauki o rozrodczości mężczyzn, badania genotoksykologiczne i toksykologia środowiskowa. Jest to szczególnie ważne dla tych użytkowników, którzy chcą mieć wszystkie korzyści płynące z lepszej przepustowości i łatwości obsługi, bez odchodzenia od znanych, ekonomicznych, konwencjonalnych szkiełek mikroskopowych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr Cooke i dr Karbaschi są wynalazcami trzech przyznanych patentów związanych z opisanymi tutaj technologiami.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca opisana w tej publikacji była częściowo wspierana przez Narodowy Instytut Nauk o Zdrowiu Środowiskowym Narodowych Instytutów Zdrowia pod numerem nagrody: 1R41ES030274. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne stanowisko National Institutes of Health.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełka nakrywkowe szklane 22 x 22 mmFisher Scientific, Hampton, NH, USA631-0124
A2780ECACC, 
Louis, MO,
  USA		93112519
Stężony kwas azotowy (klasa OptimaTM)Fisher Scientific Fair Lawn, NJ, USAA467-250
Mikroskop fluorescencyjny wyposażony w kameręZeiss, Jena, Niemcy
Świeża ludzka krew pełnaZen Bio IncSER-WB10MLKomercyjna próbka ludzkiej krwi pełnej
GraphPad PrismGraphPad Software, San Diego, KaliforniaOprogramowanie do analizy danych
HTP Comet Assay SystemCleaver ScientificCOMPAC-  50
Ludzka Keratynocyta (HaCaTs)American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USAWycofaneMożna kupić od innej firmy
ADDEXBIO TECHNOLOGIES
Cat# T0020001
Nadtlenek wodoru (H2O2)
30% w wodzie		Fisher Scientific, Hampton, NH, USABP2633-500
ICP-MS
iCAP RQ ICP-MS System Thermo		Scientific,
Waltham, MA,
USA		IQLAAGGAAQFAQKMBIT
Oprogramowanie do analizy obrazów i danychInstrument percepcyjny,
Bury St Edmunds, Anglia,
Wielka Brytania		125525 Dostępne jest bezpłatne oprogramowanie do analizy obrazu, np. ImageJ
Internal Standard MixSPEX Certiprep,
Metuchen, NJ, USA		CL-ISM1-500Bismuch (monitorowany izotopem 209 Bi)-konknetacja 10 &mikro; g / ml w 5% HNO3
Niska temperatura topnienia AgarozaInvitrogen
Waltham, MA, USA		P4864
Na2EDTA (kwas disodowy etylenodiaminotetraoctowy)Sigma Aldrich,
St. Louis, MO,
USA		E5134
NaCl (chlorek sodu)Sigma Aldrich,
St. Louis, MO,
USA		S7653
NanoDrop OneThermo Scientific,
Waltham, MA,
USA		701-058108Nanodrop do pomiaru stężenia DNA
Nanopure Infinity Ultrapure Water System (Barnstead Nanopure)Thermo Scientific, 
Waltham, MA,
USA		D11901Woda ultraczysta (16 MΩ cm-1)
NaOH (wodorotlenek sodu)Sigma Aldrich,
St. Louis, MO, USA		E5134
Normalna temperatura topnienia AgaroseFisher Scientific,
Hampton, NH, USA		16520100Do szkiełek do wstępnego powlekania
OCI-P5XUniwersytet w Miami,
Miami, FL,
USA		N/ALive Tumor Culture Core facility dostarczył komórki
Platynowy (Pt) standard referencyjnySPEX Certiprep,
Metuchen, NJ, USA		PLPT3-2Y(1000 µ g / ml w 10% HCl) zawierające
jodek bismuch propidium
(1,0 mg / ml w wodzie)		Sigma Aldrich,
St. Louis, MO,
USA		12-541BP486410ML
QIAamp DNA Mini KitQiagen
Walencja, CA,
USA		51304Zestaw do ekstrakcji DNA
Szkiełka mikroskopowe z pojedynczego matowego szkłaFisher Scientific,
Hampton, NH, USA		12-541B
SKOV3ECACC,
Louis, MO,
USA		91091004
Pudełko na suwakiFisher Scientific,
Hampton, NH, USA		03-448-2Odporny na światło, w celu ochrony komórek przed przypadkowym uszkodzeniem (zgodnie z szeroko rozpowszechnionym poglądem) i zapobiegania blaknięciu barwnika fluorescencyjnego
Slide Płyta chłodzącaCleaver Scientific,
Rugby, Anglia,
Wielka Brytania Naczynie		CSL-CHILLPLATE
Cleaver Scientific,
Rugby, Anglia,
Wielka Brytania		STAINDISH4X
Tris-baseSigma Aldrich,
St. Louis, MO,
USA		93362
Triton X-100Fisher Scientific,
Hampton, NH, Stany		Zjednoczone BP151-500
Trypsyna EDTA (0,5%)Invitrogen
Gibco,
Waltham, MA, USA		15400054
Pionowy tasak transportowy do prowadnicScientific,
Rugby, Anglia,
Wielka Brytania		COMPAC-25
zabiegowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. The FASEB Journal. 17 (10), 1195-1214 (2003).
  2. Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L. Carcinogens and DNA damage. Biochemical Society Transactions. 46 (5), 1213-1224 (2018).
  3. Evans, M. D., Cooke, M. S. Factors contributing to the outcome of oxidative damage to nucleic acids. Bioessays. 26 (5), 533-542 (2004).
  4. Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Cooke, M. S. Oxidative DNA damage and disease: induction, repair and significance. Mutatation Research. 567 (1), 1-61 (2004).
  5. Miyamae, Y., et al. Detection of DNA lesions induced by chemical mutagens using the single-cell gel electrophoresis (comet) assay. 2. Relationship between DNA migration and alkaline condition. Mutatation Research. 393 (1-2), 107-113 (1997).
  6. Angelis, K. J., Dusinská, M., Collins, A. R. Single cell gel electrophoresis: detection of DNA damage at different levels of sensitivity. Electrophoresis. 20 (10), 2133-2138 (1999).
  7. Duarte, T. L., Cooke, M. S., Jones, G. D. Gene expression profiling reveals new protective roles for vitamin C in human skin cells. Free Radical Biology & Medicine. 46 (1), 78-87 (2009).
  8. Karbaschi, M., et al. Rescue of cells from apoptosis increases DNA repair in UVB exposed cells: implications for the DNA damage response. Toxicology Research. 4 (3), 725-738 (2015).
  9. Wu, J. H., Jones, N. J. Assessment of DNA interstrand crosslinks using the modified alkaline comet assay. Methods in Molecular Biology. 817, 165-181 (2012).
  10. Merk, O., Speit, G. Detection of crosslinks with the comet assay in relationship to genotoxicity and cytotoxicity. Environmental and Molecular Mutagenesis. 33 (2), 167-172 (1999).
  11. Spanswick, V. J., Hartley, J. M., Hartley, J. A. Measurement of DNA interstrand crosslinking in individual cells using the Single Cell Gel Electrophoresis (Comet) assay. Methods in Molecular Biology. 613, 267-282 (2010).
  12. Saha, D. T., et al. Quantification of DNA repair capacity in whole blood of patients with head and neck cancer and healthy donors by comet assay. Mutation Research. 650 (1), 55-62 (2008).
  13. Giovannelli, L., Pitozzi, V., Riolo, S., Dolara, P. Measurement of DNA breaks and oxidative damage in polymorphonuclear and mononuclear white blood cells: a novel approach using the comet assay. Mutatation Research. 538 (1-2), 71-80 (2003).
  14. Al-Salmani, K., et al. Simplified method for the collection, storage, and comet assay analysis of DNA damage in whole blood. Free Radical Biology & Medicine. 51 (3), 719-725 (2011).
  15. Akor-Dewu, M. B., et al. Leucocytes isolated from simply frozen whole blood can be used in human biomonitoring for DNA damage measurement with the comet assay. Cell Biochemistry and Function. 32 (3), 299-302 (2014).
  16. Ge, J., et al. CometChip: a high-throughput 96-well platform for measuring DNA damage in microarrayed human cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e50607(2014).
  17. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Reseach Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
  18. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
  19. Karbaschi, M., et al. Evaluation of the major steps in the conventional protocol for the alkaline comet assay. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 6072(2019).
  20. Karbaschi, M., Cooke, M. S. Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay. Scientific Reports. 4 (1), 7200(2014).
  21. Karbaschi, M., Cooke, M. S. Chilling apparatus. USA patent. , 10690574 (2020).
  22. Cooke, M. S., Karbaschi, M. Method and apparatus for performing electrophoresis. USA patent. , 20160195494 (2019).
  23. Ji, Y., Karbaschi, M., Cooke, M. S. Mycoplasma infection of cultured cells induces oxidative stress and attenuates cellular base excision repair activity. Mutatation Research. 845, 403054(2019).
  24. Møller, P., et al. Minimum Information for Reporting on the Comet Assay (MIRCA): recommendations for describing comet assay procedures and results. Nature Protocols. 15 (12), 3817-3826 (2020).
  25. Almeida, G. M., Duarte, T. L., Steward, W. P., Jones, G. D. Detection of oxaliplatin-induced DNA crosslinks in vitro and in cancer patients using the alkaline comet assay. DNA Repair (Amst). 5 (2), 219-225 (2006).
  26. Moneef, M. A., et al. Measurements using the alkaline comet assay predict bladder cancer cell radiosensitivity. British Journal of Cancer. 89 (12), 2271-2276 (2003).
  27. Bowman, K. J., et al. Comet assay measures of DNA damage are predictive of bladder cancer cell treatment sensitivity in vitro and outcome in vivo. International Journal of Cancer. 134 (5), 1102-1111 (2014).
  28. Abdulwahed, A. M. S. Investigation of DNA Damage and Genomic Organization in the Cellular Response to Platinum Chemotherapy. , Florida International University. Doctor of Philosophy thesis (2020).
  29. Olive, P. L., Banáth, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the "comet" assay. Radiation Research. 122 (1), 86-94 (1990).
  30. Kumaravel, T. S., Vilhar, B., Faux, S. P., Jha, A. N. Comet Assay measurements: a perspective. Cell Biology and Toxicology. 25 (1), 53-64 (2009).
  31. Ji, Y. Formation and Repair of Environmetally-induced damage to Mitochondrial and Nuclear Genomess. , Florida International University. Doctor of Philosophy thesis (2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza wysokoprzepustowaelektroforeza w eluocena genotoksyczno cino nik do szkie ekalkaliczny test kometowytraktowanie nadtlenkiem wodorubarwienie jodkiem propidynywi zania krzy owe DNA

Powiązane artykuły