Niniejsza praca opisuje eksperymentalny protokół stymulacji przezprzełykowego rozsadzania przedsionków w celu efektywnej indukcji migotania przedsionków (AF) u szczurów. Protokół może być stosowany u szczurów ze zdrowym lub przebudowanym sercem, umożliwiając badanie patofizjologii migotania przedsionków, identyfikację nowych celów terapeutycznych i ocenę nowych strategii terapeutycznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Stymulacja przezprzełykowego pęknięcia przedsionków w indukcji migotania przedsionków u szczurów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badania na zwierzętach przyniosły ważne informacje na temat patofizjologii migotania przedsionków (AF) i postępowania terapeutycznego. Ponowne wejście, jeden z głównych mechanizmów zaangażowanych w patogenezę AF, wymaga pewnej masy tkanki mięśnia sercowego, aby mogło wystąpić. Ze względu na mały rozmiar przedsionków gryzonie od dawna uważane są za "odporne" na migotanie przedsionków. Chociaż wykazano, że spontaniczne migotanie przedsionków występuje u szczurów, konieczna jest długotrwała obserwacja (do 50 tygodni), aby arytmia wystąpiła w tych modelach. W niniejszej pracy opisano eksperymentalny protokół stymulacji przezprzełykowej stymulacji pęknięcia przedsionków w celu szybkiej i skutecznej indukcji migotania przedsionków u szczurów. Protokół może być z powodzeniem stosowany u szczurów ze zdrowym lub przebudowanym sercem, w obecności wielu różnych czynników ryzyka, umożliwiając badanie patofizjologii migotania przedsionków, identyfikację nowych celów terapeutycznych oraz ocenę nowych strategii profilaktycznych i/lub terapeutycznych.
Wprowadzenie
Migotanie przedsionków (AF) jest najczęstszą długotrwałą arytmią serca spotykaną w praktyce klinicznej, a jej częstość występowania i rozpowszechnienie nadal dramatycznie wzrasta na całym świecie1. Według najnowszych badań ta arytmia dotyka do 4% światowej populacji2. Biorąc jednak pod uwagę, że napadowe migotanie przedsionków może przebiegać bezobjawowo i dlatego może uniknąć wykrycia, rzeczywista częstość występowania migotania przedsionków może być znacznie wyższa niż ta przedstawiona w literaturze.
Patofizjologia migotania przedsionków była intensywnie badana. Niemniej jednak mechanizmy leżące u podstaw tej złożonej arytmii pozostają nie w pełni wyjaśnione, co znajduje odzwierciedlenie w ograniczonych opcjach terapeutycznych, o wątpliwej skuteczności. Badania na zwierzętach przyniosły ważne informacje na temat patofizjologii migotania przedsionków i postępowania terapeutycznego. Reentry, jeden z głównych mechanizmów zaangażowanych w patogenezę AF3, wymaga pewnej masy tkanki mięśnia sercowego, aby mogło wystąpić. W związku z tym duże zwierzęta są generalnie preferowane w badaniach nad migotaniem przedsionków, podczas gdy ze względu na mały rozmiar ich przedsionków gryzonie od dawna uważane są za "odporne" na migotanie przedsionków. Jednak wykorzystanie dużych zwierząt jest utrudnione głównie ze względu na trudności w obsłudze. Tymczasem, chociaż wykazano, że spontaniczne migotanie przedsionków występuje u szczurów4, wymagana jest długotrwała obserwacja (do 50 tygodni), aby arytmia wystąpiła w tych modelach5. Opracowano również modele, które zapewniają szybkie wystąpienie AF u małych gryzoni. Najczęściej modele te wykorzystują ostrą stymulację elektryczną, często w obecności innych sprzyjających warunków, takich jak jednoczesna stymulacja przywspółczulna lub uduszenie, w celu sztucznego wywołania AF6,7. Chociaż takie modele są skuteczne, nie pozwalają na ocenę krytycznych cech związanych z migotaniem przedsionków, takich jak postępująca elektryczna, strukturalna, autonomiczna lub molekularna przebudowa przedsionków, ani wpływu konwencjonalnych lub niekonwencjonalnych leków przeciwarytmicznych na podłoże przedsionkowe lub na ryzyko komorowej proarytmii8,9.
Niniejsza praca opisuje eksperymentalny protokół długotrwałego przezprzełykowego impulsu przedsionkowego w celu szybkiej i skutecznej indukcji migotania przedsionków u szczurów. Protokół nadaje się zarówno do badań ostrych, jak i długoterminowych i może być z powodzeniem stosowany u szczurów ze zdrowym lub przebudowanym sercem, w obecności wielu różnych czynników ryzyka, umożliwiając badanie patofizjologii migotania przedsionków, identyfikację nowych celów terapeutycznych oraz ocenę nowych strategii profilaktycznych i/lub terapeutycznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Uniwersytetu Medycznego, Farmaceutycznego, Naukowego i Technologicznego "George Emil Palade" z Târgu Mureș, przez rumuński Krajowy Urząd ds. Sanitarnych, Weterynaryjnych i Bezpieczeństwa Żywności oraz zgodne z wytycznymi Międzynarodowej Rady Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (Dyrektywa 2010/63/UE).
1. Protokół stymulacji impulsów przezprzełykowych przedsionków
- Dorosłe samce szczurów rasy Wistar (200-400 g masy ciała) należy losowo podzielić na dwie grupy: STIM i SHAM.
- Znieczulij zwierzęta.
- Do indukcji należy użyć 2,5% izofluranu, 4 l/min, 99,5%O2.
- W leczeniu podtrzymującym należy stosować mieszaninę ketaminy i medetomidyny (75,0/0,5 mg/kg mc.) podawaną dootrzewnowo.
- Sprawdź głębokość znieczulenia, badając odruch rogówkowy (5% roztwór glukozy) i odruch nocyceptywnego wycofania (szczypanie palca). Monitoruj częstość oddechów (spadek o 50% jest dopuszczalny podczas znieczulenia; normalne tempo wynosi od 70 do 120 oddechów / minutę) i temperaturę ciała za pomocą termometru doodbytniczego (normalna temperatura wynosi od 96,5 - 99,5 ° F lub 35,9 - 37,5 ° C).
UWAGA: Zabieg należy kontynuować dopiero po potwierdzeniu skuteczności znieczulenia. Okresowo monitoruj głębokość znieczulenia przez cały czas trwania protokołu. W razie potrzeby powtórzyć dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy/medetomidyny. - Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec uszkodzeniu rogówki.
- Połóż zwierzę w pozycji leżącej na plecach i połóż je na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie ~37 °C.
- Przymocuj trzy powierzchniowe elektrody EKG do kończyn szczura w konfiguracji odprowadzeniowej II (Rysunek 1A).
- Umieść elektrodę ujemną na prawej kończynie przedniej.
- Umieść elektrodę dodatnią na lewej kończynie tylnej.
- Umieść elektrodę uziemiającą na lewej kończynie przedniej.
- Przymocuj elektrody na miejscu za pomocą cienkich elastycznych sznurków do bransoletki.
- Włącz powierzchniowy zapis EKG i wykonuj ciągły zapis EKG przez cały czas trwania procedury (Rysunek 1B) za pomocą komercyjnego lub lokalnie opracowanego programu akwizycji10.
- Do stymulacji elektrycznej należy użyć cewnika czterobiegunowego 5-6 F podłączonego do rozrusznika serca opartego na mikrokontrolerze10.
- Po znieczuleniu zwierzęcia wprowadź cewnik przez jamę ustną do przełyku. Zmierz odległość między górnymi siekaczami a sercem (ocenianą palpacyjnie), aby w przybliżeniu określić głębokość, na której cewnik powinien zostać wprowadzony do przełyku.
UWAGA: Uważaj, aby nie wciskać cewnika na siłę, ponieważ istnieje ryzyko perforacji przełyku. - Potwierdź prawidłowe położenie cewnika stymulacyjnego na poziomie przedsionków w następujący sposób.
- Zastosuj stymulację elektryczną z częstotliwością 400 bodźców/minutę (czas trwania bodźca 6 ms).
- Sprawdź, czy zapis EKG pokazuje stałe wychwytywanie przedsionków (tj. po każdym bodźcu elektrycznym następuje wąski zespół QRS) (Rysunek 2).
- Określ próg rozkurczowy - tj. najniższe napięcie wymagane do uzyskania wychwytu przedsionkowego (zwykle od 10 V do 20 V).
UWAGA: Wykonaj następujące czynności dla zwierząt w grupie STIM. - Po ustaleniu prawidłowej pozycji cewnika należy ustawić stymulator na częstotliwość 4 000 bodźców/minutę (czas trwania bodźca 6 ms), pod napięciem 3 V powyżej progu rozkurczowego (Rysunek 3).
- Zastosuj do każdego zwierzęcia 15 kolejnych cykli stymulacji, każdy po 20 sekund, z 5-minutowym odstępem między cyklami11. W zależności od celów badania, powtarzaj protokół dla każdego szczura przez 10 dni, w tempie 5 dni w tygodniu, o tej samej porze każdego dnia.
- Sprawdź skuteczność stymulacji w następujący sposób.
- Zidentyfikuj czas regeneracji węzła zatokowego (SNRT), który pojawia się pod koniec szybkiej stymulacji jako przedział czasowy dłuższy niż długość cyklu zarejestrowana podczas rytmu zatokowego (Rysunek 4A) i reprezentuje przedział czasu wymagany do wznowienia rytmu zatokowego po zakończeniu tłumienia przesterowania.
UWAGA: Tłumienie nadbiegu oznacza hamowanie aktywności węzłów zatokowych poprzez elektryczną stymulację serca w tempie wyższym niż rytm wewnętrzny. - Zidentyfikuj występowanie epizodu migotania przedsionków, który definiuje się tutaj jako obecność trzech lub więcej następujących po sobie nieregularnych, nadkomorowych uderzeń (tj. nieregularnej odpowiedzi komorowej z wąskimi zespołami QRS), z nieobecnymi lub zastąpionymi przez małe, zniekształcone załamki "f" (Rysunek 4B).
- Zidentyfikuj czas regeneracji węzła zatokowego (SNRT), który pojawia się pod koniec szybkiej stymulacji jako przedział czasowy dłuższy niż długość cyklu zarejestrowana podczas rytmu zatokowego (Rysunek 4A) i reprezentuje przedział czasu wymagany do wznowienia rytmu zatokowego po zakończeniu tłumienia przesterowania.
- Jeśli epizod migotania przedsionków nie zakończy się samoistnie do czasu wykonania kolejnego cyklu stymulacji (tj. do końca pięciu wolnych minut między cyklami), nie należy stosować kolejnej stymulacji.
- Poczekaj kolejne 5 minut. Jeśli epizod migotania przedsionków nadal trwa po tych 10 minutach, zakończ protokół na ten dzień.
UWAGA: Jeśli pożądana jest ocena nasilenia migotania przedsionków wywołanych elektrycznie, można przeprowadzić dłuższe monitorowanie EKG.
- Poczekaj kolejne 5 minut. Jeśli epizod migotania przedsionków nadal trwa po tych 10 minutach, zakończ protokół na ten dzień.
- Jeśli ciężka bradykardia lub asystolia wystąpi pod koniec stymulacji (tj. z powodu elektrycznej stymulacji nerwu błędnego), zakończ protokół. Jeśli aktywność elektryczna nie wraca szybko do normy, należy wykonać zewnętrzny masaż serca i podać siarczan atropiny (0,05 mg/kg) dootrzewnowo.
- Na zakończenie zabiegu należy odwrócić znieczulenie atipamezolem (1 mg/kg) podawanym dootrzewnowo. Szczury należy trzymać pojedynczo w czystych klatkach z dodatkowym ciepłem i okresowo obserwować, aż w pełni wyzdrowieją. Na końcu protokołu nie jest wymagana żadna inna szczególna opieka nad zwierzętami.
- Przeanalizuj powierzchniowe zapisy EKG i określ następujące elementy.
- Indukowalność migotania przedsionków, która jest wyrażona w procentach (tj. [liczba cykli stymulacji, po których następują epizody migotania przedsionków / całkowita liczba zastosowanych cykli stymulacji] x 100).
- Czas trwania każdego epizodu migotania przedsionków.
- Obecność "trwałych" (tj. >10 min) epizodów migotania przedsionków.
UWAGA: Dla zwierząt z grupy SHAM należy wykonać następujące czynności.
- W przypadku szczurów z grupy SHAM należy wykonać kroki od 1.1 do 1.7, jak opisano powyżej, bez stosowania stymulacji elektrycznej.
- Utrzymuj cewnik w odpowiedniej pozycji przez 80 minut (tj. czas wymagany do wypełnienia protokołu u szczurów STEM) bez stosowania stymulacji elektrycznej, jednocześnie stale rejestrując powierzchniowe EKG.
- Pod koniec zabiegu należy odwrócić znieczulenie atipamezolem (1 mg/kg). Na końcu protokołu nie jest wymagana żadna inna szczególna opieka nad zwierzętami.
- Przeanalizuj powierzchniowe zapisy EKG i określ parametry opisane w kroku 1.16.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W badaniu dowodu koncepcji 22 dorosłe samce szczurów Wistar (200-400 g) zostały losowo przydzielone do dwóch grup: STIM (n = 15) i SHAM (n = 7). Wszystkie zwierzęta przebywały indywidualnie w klatkach z poliwęglanu, w pomieszczeniu z kontrolowaną temperaturą (21-22 °C), mając swobodny dostęp do wody i suchej karmy przez cały okres badania. Opisany powyżej protokół stymulacji przezezoesofagealnej stosowano u wszystkich zwierząt przez 10 dni, 5 dni w tygodniu. Wszystkie zwierzęta przeszły ten sam protokół, z wyjątkiem szcz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej pracy opisano eksperymentalny protokół długotrwałego przezprzełykowego impulsu rozrostu przedsionków w celu szybkiej i skutecznej indukcji migotania przedsionków u szczurów, odpowiedni zarówno do ostrych, jak i długotrwałych badań migotania przedsionków. Opisany w niniejszym dokumencie 10-dniowy protokół stymulacji został z powodzeniem wykorzystany do opracowania "wtórnego spontanicznego modelu migotania przedsionków" (tj. modelu, w którym po okresie indukcji migotania przedsionków przez stymulację elektrycz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant rumuńskiego Ministerstwa Edukacji i Badań, CNCS - UEFISCDI, numer projektu PN-III-P1-1.1-TE-2019-0370, w ramach PNCDI III.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Antisedan (chlorowodorek atipamezolu) 5 mg / ml, roztwór do wstrzykiwań | Orion Corporation | 06043/4004 | dla szczurów stosować 1 mg / kg |
| Dormitor (chlorowodorek medetomidyny) 1 mg / ml, roztwór do wstrzykiwań | Orion Corporation | 06043/4003 | dla szczurów 0,5 mg / kg |
| E-Z Anestezjologiczny system dla pojedynczych zwierząt | EZ Systems Inc | EZ-SA800 | Umożliwia manipulację jednym zwierzęciem na raz |
| Izofluran 99,9%, 100 ml | Rompharm Company | N01AB06 | |
| Ketamina 10%, 25 ml | dla szczurów stosować 75 mg / kg | ||
| Rozrusznik serca oparty na mikrokontrolerze dla małych zwierząt | Opracowany w naszym laboratorium (patrz numer referencyjny 10 w manuskrypcie) | ||
| Powierzchniowy system | Opracowany w naszym laboratorium (patrz numer referencyjny 10 w manuskrypcie) |
Bibliografia
- Kornej, J., Börschel, C. S., Benjamin, E. J., Schnabel, R. B. Epidemiology of atrial fibrillation in the 21st century: Novel methods and new insights. Circulation Research. 127 (1), 4-20 (2020).
- Hindricks, G., et al. 2020 ESC Guidelines for the diagnosis and management of atrial fibrillation developed in collaboration with the European Association for Cardio-Thoracic Surgery (EACTS): The Task Force for the diagnosis and management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 42 (5), 373(2021).
- Veenhuyzen, G. D., Simpson, C. S., Abdollah, H. Atrial fibrillation. Canadian Medical Association Journal. 171 (7), 755-760 (2004).
- Lau, D. H., et al. Atrial arrhythmia in ageing spontaneously hypertensive rats: unraveling the substrate in hypertension and ageing. PloS One. 8 (8), 72416(2013).
- Scridon, A., et al. Unprovoked atrial tachyarrhythmias in aging spontaneously hypertensive rats: The role of the autonomic nervous system. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (3), 386-392 (2012).
- Haugan, K., Lam, H. R., Knudsen, C. B., Petersen, J. S. Atrial fibrillation in rats induced by rapid transesophageal atrial pacing during brief episodes of asphyxia: a new in vivo model. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 44 (1), 125-135 (2004).
- Sugiyama, A., Takahara, A., Honsho, S., Nakamura, Y., Hashimoto, K. A simple in vivo atrial fibrillation model of rat induced by transesophageal atrial burst pacing. Journal of Pharmacological Sciences. 98 (3), 315-318 (2005).
- Scridon, A. Dissociation between animal and clinical studies. where do we go wrong. Romanian Journal of Cardiology. 31 (3), 497-500 (2021).
- Mulla, W., et al. Rapid atrial pacing promotes atrial fibrillation substrate in unanesthetized instrumented rats. Frontiers in Physiology. 10, 1218(2019).
- Scridon, A., et al. Spontaneous atrial fibrillation after long-term transesophageal atrial burst pacing in rats. Technical and procedural approach to a new in vivo atrial fibrillation model. Romanian Journal of Laboratory Medicine. 26 (1), 105-112 (2018).
- Halatiu, V. B., et al. Chronic exposure to high doses of bisphenol A exhibits significant atrial proarrhythmic effects in healthy adult rats. Romanian Journal of Cardiology. 31 (3), 587-595 (2021).
- Zaciragić, A., Nakas-ićindić, E., Hadzović, A., Avdagić, N. Average values of electrocardiograph parameters in healthy, adult Wistar rats. Medical Archives. 58 (5), 268-270 (2004).
- Cheshire, W. P. Thermoregulatory disorders and illness related to heat and cold stress. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 196, 91-104 (2016).
- Șerban, R. C., Scridon, A. Data linking diabetes mellitus and atrial fibrillation-how strong is the evidence? From epidemiology and pathophysiology to therapeutic implications. Canadian Journal of Cardiology. 34 (11), 1492-1502 (2018).
- Nishida, K., Michael, G., Dobrev, D., Nattel, S. Animal models for atrial fibrillation: clinical insights and scientific opportunities. Europace. 12 (2), 160-172 (2010).
- Qiu, H., et al. DL-3-n-Butylphthalide reduces atrial fibrillation susceptibility by inhibiting atrial structural remodeling in rats with heart failure. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 391 (3), 323-334 (2018).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
