Artykuł metodologiczny

Ocena wiarygodnego biomarkera w mysim modelu sepsy wywołanym podwiązaniem i nakłuciem jelita ślepego

4.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63584

⸱

9 grudnia 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Vascular Surgery, Xiangya Hospital, Central South University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia szczegóły operacyjne podwiązania i nakłucia jelita ślepego (CLP) w mysim modelu sepsy. CLP jest jedną z najczęściej stosowanych technik tworzenia zwierzęcego modelu sepsy. W związku z tym do uzyskania wiarygodnych wyników badań wymagany jest ustandaryzowany protokół CLP.

Streszczenie

Sepsa jest poważną, zagrażającą życiu i szybko rozwijającą się chorobą, która powoduje miliony zgonów rocznie na całym świecie. Naukowcy poczynili ogromne wysiłki, aby wyjaśnić patofizjologię sepsy przy użyciu różnych modeli zwierzęcych; mysi model sepsy wywołanej podwiązaniem i nakłuciem jelita ślepego (CLP) jest szeroko stosowany w laboratoriach. Trzy aspekty techniczne, które wpływają na nasilenie i powtarzalność modelu CLP, to procent podwiązanego jelita ślepego, rozmiar igły użytej do nakłucia jelita ślepego oraz objętość kału wciśniętego do jamy brzusznej. Szybka i specyficzna diagnoza sepsy jest kluczowym czynnikiem wpływającym na wynik. Złotym standardem w diagnostyce sepsy jest posiew drobnoustrojów; Proces ten jest jednak czasochłonny i czasami niedokładny. Wykrywanie biomarkerów specyficznych dla sepsy jest szybkie, ale istniejące biomarkery są niezadowalające ze względu na krótki okres półtrwania, nieswoistość i niewystarczającą czułość. Dlatego istnieje pilna potrzeba opracowania wiarygodnego biomarkera sepsy we wczesnych stadiach. Wcześniejsze publikacje sugerują, że w sepsie występuje nadmierna ilość pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET). Cytrulinowany histon H3 (CitH3), jako składnik NET, jest podwyższony zarówno u zwierząt septycznych, jak i pacjentów, a obecność CitH3 jest wiarygodnym biomarkerem diagnostycznym sepsy. Niniejsze badanie miało na celu opisanie standaryzowanego mysiego modelu sepsy wywołanej CLP i ustalenie wiarygodnego biomarkera sepsy we krwi. Nasza praca może przyczynić się do wczesnej i trafnej diagnozy sepsy w przyszłości.

Wprowadzenie

Sepsa jest definiowana jako zagrażająca życiu dysfunkcja narządu spowodowana rozregulowaną odpowiedzią gospodarza na infekcję1, a wstrząs septyczny jest główną przyczyną zgonów w ciężkich przypadkach sepsy2. Sepsa i wstrząs septyczny powodują miliony zgonów na całym świecie każdego roku3. Kluczem do poprawy wyników leczenia pacjentów z sepsą jest szybkie rozpoczęcie leczenia, takiego jak antybiotyki4. Złotym standardem w diagnostyce sepsy jest posiew drobnoustrojów; Jednak hodowla drobnoustrojów jest czasochłonna i może prowadzić do wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych, co znacznie ogranicza znaczenie kliniczne5. W związku z tym wysoce pożądane jest zidentyfikowanie biomarkera sepsy we krwi. Prokalcytonina jest uznawana za idealny biomarker sepsy, ale ma ograniczoną skuteczność diagnostyczną, ponieważ nie jest w stanie odróżnić sepsy od chorób sterylnych6.

Podwiązanie i nakłucie kątnicy myszy (CLP) jest powszechnie używane do tworzenia modelu sepsy w badaniach naukowych. CLP jest jednym z najczęściej stosowanych modeli sepsy, ponieważ naśladuje wielobakteryjne zapalenie otrzewnej, aktywując zarówno prozapalne, jak i przeciwzapalne odpowiedzi immunologiczne7. Powszechnie przyjmuje się, że CLP tworzy bardziej istotny klinicznie model sepsy niż alternatywne techniki, takie jak wstrzyknięcie endotoksyny bakteryjnej. Dlatego CLP jest uważany za klasyczny model sepsy do użytku w researchu8. Jednak główną wadą CLP jest jego powtarzalność, ponieważ na nasilenie modelu wpływa kilka czynników, takich jak procent podwiązanego jelita ślepego, rozmiar igły, liczba nakłuć i technika laparotomii. W związku z tym istnieje potrzeba standaryzacji modelu sepsy indukowanej przez CLP. W niniejszym badaniu opisano szczegóły protokołu modelu sepsy indukowanej CLP, aby pokazać ustandaryzowaną procedurę i zwiększyć jej odtwarzalność.

Reakcja zapalna występuje we wczesnym stadium sepsy, gdzie neutrofile uwalniają nadmierne ilości utleniaczy i proteaz, które powodują uszkodzenia narządów8. Kluczowym czynnikiem w patofizjologii sepsy jest tworzenie się zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET), które uwalniają składniki jądrowe i cytozolowe, takie jak DNA, cytrulinowane histony i proteinazy przeciwdrobnoustrojowe9. Ostatnie badania sugerują, że nadmierne wytwarzanie NET pośredniczy w patologii sepsy; tymczasem zmniejszenie NET, poprzez enzymatyczne hamowanie deiminazy peptydyloargininy (PAD) przez substancje chemiczne, takie jak YW3-56 lub Cl-amidyna, wywiera efekt pro-przeżycia w mysich modelach sepsy 10,11. Cytrulinowany histon H3 (CitH3) został zidentyfikowany jako białko specyficzne dla sepsy w 201112, a kolejne publikacje wykazały, że stężenie krążącego CitH3 jest wiarygodnym biomarkerem diagnostycznym sepsy < sup class='xref'>13,14. CitH3 jest uważany za bardziej czuły i długotrwały biomarker niż prokalcytonina i jest bardziej specyficzny w odróżnianiu sepsy niż cytokin zapalnych13.

W tym badaniu oceniliśmy wiarygodny diagnostyczny biomarker sepsy w mysim modelu sepsy wywołanym CLP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez Komitet ds. Oceny Zwierząt w Szpitalu Xiangya i Uniwersytecie Środkowo-Południowym (nr 202103149).

1. Przygotowanie

  1. Wybierz samce myszy C57BL/6J (waga: 20-25 g; wiek: 8-12 tygodni) i trzymaj je w domu przez 3 dni przed wykonaniem jakichkolwiek zabiegów.
  2. Zważ mysz.
  3. Znieczulij mysz 1,5% izofluranem przez drogi oddechowe i uszczypnij palce u stóp, aby sprawdzić głębokość znieczulenia.
  4. Zamocuj mysz na poduszce grzewczej. Nałóż krem do depilacji na brzuch i pozostaw na nie dłużej niż 1 minutę przed usunięciem kremu i włosów.
    UWAGA: Normalną temperaturę ciała należy utrzymywać, umieszczając ciepłą podkładkę pod znieczuloną myszą podczas operacji.

2. Operacja

  1. Przygotuj sterylne narzędzia chirurgiczne odpowiednie do chirurgii gryzoni. Nosić sterylne rękawiczki, maskę na twarz i fartuch chirurgiczny, aby zapewnić warunki aseptyki.
  2. Zdezynfekuj skórę brzucha chusteczkami jodowymi co najmniej trzy razy. Przykryj operacyjne pole operacyjne sterylnymi obłożeniami chirurgicznymi.
  3. Użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby wykonać około 2 cm nacięcie w ścianie brzucha wzdłuż kresy białej.
    UWAGA: Nie uszkadzaj narządów.
  4. Zidentyfikuj i odizoluj jelito ślepe z jamy otrzewnej za pomocą sterylnej pęsety.
  5. Podwiązać 75% objętości jelita ślepego za pomocą jedwabnych szwów 4-0. Nie należy podwiązywać naczyń krwionośnych krezki.
    UWAGA: Procent jelita ślepego, który jest podwiązany, określa nasilenie sepsy.
  6. Nakłuć jelito ślepe, wykonując jedną perforację na wylot (dwa otwory) za pomocą igły 21 G (z jednej strony przez ścianę jelita ślepego na przeciwną) w punkcie środkowym między końcem ogona a zestawem podwiązania.
  7. Wyrzucić igłę. Delikatnie wyciśnij małą kropelkę kału z jelita ślepego przez otwory penetracyjne.
    UWAGA: Ilość kału wciśniętego do jamy otrzewnej powinna być stała, ponieważ określa to również nasilenie sepsy. Kroki 2.5-2.7 należy pominąć w przypadku myszy pozorowanych.
  8. Delikatnie włóż jelito ślepe do jamy brzusznej.
  9. Zamknij mięśnie brzucha i skórę oddzielnie za pomocą jedwabnych szwów 6-0.
  10. Zdezynfekuj nacięcie jodem.
  11. Wstrzyknąć ketoprofen (5 mg/kg) w lewy dolny kwadrant brzucha, aby uniknąć jelita ślepego. Umieść mysz na ciepłej podkładce, aż w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia.
  12. Umieść mysz w klatce w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (22 °C) i zapewnij swobodny dostęp do jedzenia i wody. Sprawdzaj mysz co 6 godzin przez pierwszy tydzień po operacji.
    1. Poddaj mysz eutanazji przez przedawkowanie dwutlenku węgla, gdy objawy sepsy spełniają wcześniej zdefiniowane punkty końcowe.

3. Leczenie

  1. Losowo podziel myszy na grupę pozorowaną, grupę CLP, grupę CLP + YW3-56 (Rysunek 2a) i grupę CLP + Cl-amidynę (Rysunek 1).
    UWAGA: Grupa fikcyjna została poddana tym samym procedurom, co grupy CLP, z wyjątkiem CLP. YW3-56 (5 mg/kg) lub Cl-amidyna (40 mg/kg) podawano we wstrzyknięciu otrzewnowym 1 godzinę po kroku 2,9 podczas zszywania warstwy mięśniowej i skórnej.
  2. Zbiór próbek
    1. Pobrać krew obwodową ze splotu zagałkowego15 24 godziny po operacji.
  3. Przygotować surowicę przez odwirowanie (1 000 x g, 5 min) i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
  4. Zmierz stężenie CitH3 za pomocą pośredniego zestawu ELISA typu sandwich, jak opisano wcześniej13.
    1. Pokryj przeciwciało monoklonalne anty-CitH3 na 96-dołkowej płytce, aby wychwycić białko CitH3.
    2. Potraktuj surowicę DNazą I (150 jednostek/ml, 37° przez 1 godzinę) i inkubuj w studzienkach (20 μl, temperatura pokojowa).
    3. Dodaj przeciwciało poliklonalne anty-CitH3 (0,33 μg/ml, 100 μl, 2 h) w celu wykrycia wychwyconego białka CitH3.
    4. Inkubować przeciwciało drugorzędowe znakowane peroksydazą króliczą (0,02 μg/ml, 100 μl, 1 h) w studzienkach.
    5. Po dokładnym umyciu rozbudować studzienki za pomocą 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (100 μL, 20 min).
      UWAGA: Dalsze szczegóły protokołu zestawu ELISA znajdują się w poprzedniej publikacji13.
  5. analiza statystyczna
    1. Wykonaj jednokierunkową ANOVA, aby przeanalizować różnice między trzema grupami, a następnie wykonaj testy post hoc Bonferroni w celu wielokrotnych porównań. Użyj oprogramowania statystycznego do przeprowadzenia analizy. Wartości p wynoszące 0,05 lub mniej uznano za istotne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jak pokazano w Rycina 2A, w grupie pozorowanej nie stwierdzono obecności CitH3 w analizie western blotting. Stężenie CitH3 w surowicy znacznie wzrosło po CLP, a wzrost ten został zablokowany poprzez hamowanie tworzenia NET. poprzez podanie YW3-56, inhibitora PAD10. Rycina 2B przedstawia stężenia CitH3 w surowicy oznaczone metodą ELISA. W 24. godzinie po CLP stężenie CitH3 w surowicy było podwyższone w grupach CLP w porównaniu z g...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

CLP wprowadza patogeny do jamy brzusznej w celu stworzenia przedklinicznego modelu sepsy. Podczas wykonywania CLP ważne jest, aby stosować warunki sterylne w celu wyeliminowania interferencji bakterii egzogennych i stosowania dokładnych dawek środków znieczulających16. Trzy techniczne aspekty CLP, które wpływają na nasilenie i powtarzalność modelu sepsy, to procent podwiązanego jelita ślepego, rozmiar igły użytej do nakłucia jelita ślepego oraz objętość kału wciśniętego do jamy brzusznej. Podwiąza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy profesorowi Wang Wei i doktorowi Liu Shuai za pomoc w przeprowadzaniu eksperymentów. Praca ta została sfinansowana z grantów z Young Research Funding of Xiangya Hospital, Central South University (nr 2019Q10), z Narodowej Fundacji i Nauki prowincji Hunan (nr 2020JJ4902) oraz z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 82202394).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igła
3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna R& D Systems IncDY999
przeciwciało monoklonalne anty-CitH3laboratorium samodzielnie opracowane
przeciwciało poliklonalne anty-CitH3Abcamab5103
anty-królicze przeciwciało wtórneJackson ImmunoResearch111-035-003
C57BL/6 myszyXiangya School of Medicine, Central South University
Cl-amidynaSigma AldrichSML2250
do depilacji
Dnaza ISigma Aldrich11284932001
izofluranSigma-Aldrich26675-46-7
ketoprofenSigmaAldrich PHR1375
jedwabne szwy (4-0 i 6-0)
narzędzia chirurgiczne& nbsp;
YW3-56GLPBIOGC48263
21Gkrem

Bibliografia

  1. Singer, M., et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
  2. Shankar-Hari, M., et al. Developing a new definition and assessing new clinical criteria for septic shock: For the Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 775-787 (2016).
  3. Fleischmann-Struzek, C., et al. Incidence and mortality of hospital- and ICU-treated sepsis: results from an updated and expanded systematic review and meta-analysis. Intensive Care Medicine. 46 (8), 1552-1562 (2020).
  4. Evans, L., et al. Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of sepsis and septic shock 2021. Intensive Care Medicine. 47 (11), 1181-1247 (2021).
  5. Hughes, J. A., Cabilan, C. J., Williams, J., Ray, M., Coyer, F. The effectiveness of interventions to reduce peripheral blood culture contamination in acute care: a systematic review protocol. Systematic Reviews. 7 (1), 216(2018).
  6. Kibe, S., Adams, K., Barlow, G. Diagnostic and prognostic biomarkers of sepsis in critical care. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 66, 33-40 (2011).
  7. Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).
  8. Hotchkiss, R., Karl, I. The pathophysiology and treatment of sepsis. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 138-150 (2003).
  9. Madhi, R., Rahman, M., Taha, D., Morgelin, M., Thorlacius, H. Targeting peptidylarginine deiminase reduces neutrophil extracellular trap formation and tissue injury in severe acute pancreatitis. Journal of Cellular Physiology. 234 (7), 11850-11860 (2019).
  10. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  11. Liang, Y., et al. Inhibition of peptidylarginine deiminase alleviates LPS-induced pulmonary dysfunction and improves survival in a mouse model of lethal endotoxemia. European Journal of Pharmacology. 833, 432-440 (2018).
  12. Deng, Q., et al. Citrullinated histone H3 as a therapeutic target for endotoxic shock in mice. Frontiers in Immunology. 10, 2957(2019).
  13. Li, Y. Q., et al. Identification of citrullinated histone H3 as a potential serum protein biomarker in a lethal model of lipopolysaccharide-induced shock. Surgery. 150 (3), 442-451 (2011).
  14. Pan, B., et al. CitH3: a reliable blood biomarker for diagnosis and treatment of endotoxic shock. Scientific Reports. 7 (1), 8972(2017).
  15. Park, Y., et al. An integrated plasmo-photoelectronic nanostructure biosensor detects an infection biomarker accompanying cell death in neutrophils. Small. 16 (1), 1905611(2020).
  16. Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S. P., Sorensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
  17. Brook, B., et al. A controlled mouse model for neonatal polymicrobial sepsis. Journal of Visualized Experiments. (143), e58574(2019).
  18. Rittirsch, D., Huber-Lang, M., Flierl, M., Ward, P. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).
  19. Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94 (2), 331-335 (1983).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model nak uciabiomarker sepsymysi model sepsycytrulinowana histona H3zewn trzkom rkowe pu apki neutrofilowebiomarker krwiWestern blotzestaw ELISAinhibicja PAD

Powiązane artykuły