Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63586

⸱

21 kwietnia 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Maryland, 2Department of Anatomy & Cell Biology, The George Washington University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy opartą na spektrometrii mas proteomiczną charakterystykę linii komórkowych ze znanymi losami tkanek u zarodka kręgowca Xenopus laevis.

Streszczenie

Charakterystyka zdarzeń molekularnych, gdy komórki dają początek tkankom i organom, zwiększa potencjał do lepszego zrozumienia normalnego rozwoju i zaprojektowania skutecznych środków na choroby. Technologie umożliwiające dokładną identyfikację i kwantyfikację różnych typów i dużej liczby białek dostarczyłyby wciąż brakujących informacji na temat mechanizmów molekularnych zarządzających rozwojem tkanek i organizmów w czasie i przestrzeni. W tym miejscu przedstawiamy protokół oparty na spektrometrii mas, który umożliwia pomiar tysięcy białek w zidentyfikowanych liniach komórkowych w zarodkach Xenopus laevis (żaby). Podejście to opiera się na odtwarzalnych mapach losu komórek i ustalonych metodach identyfikacji, znakowania fluorescencyjnego, śledzenia i pobierania próbek komórek i ich potomstwa (klonów) na podstawie tego modelu rozwoju kręgowców. Po zebraniu zawartości komórkowej za pomocą mikropróbkowania lub wyizolowaniu komórek przez preparację lub sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, białka są ekstrahowane i przetwarzane do oddolnej analizy proteomicznej. Chromatografia cieczowa i elektroforeza kapilarna są stosowane w celu zapewnienia skalowalnej separacji w celu wykrywania i oznaczania ilościowego białek za pomocą spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (HRMS). Podano reprezentatywne przykłady do charakterystyki proteomicznej komórek przeznaczonych w tkance nerwowej. Proteomika HRMS sterowana linią komórkową można dostosować do różnych tkanek i organizmów. Jest wystarczająco czuły, specyficzny i ilościowy, aby zajrzeć w czasoprzestrzenną dynamikę proteomu podczas rozwoju kręgowców.

Wprowadzenie

Nasze zrozumienie różnicowania komórkowego oraz genezy tkanek i organów jest wynikiem dziesięcioleci drobiazgowych, celowanych badań przesiewowych genów i ich produktów. Rozszerzenie wiedzy o wszystkie biomolekuły i ich ilości podczas kluczowych zdarzeń komórkowych pomogłoby w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych kontrolujących przestrzenne i czasowe wzorce budowy ciała kręgowców. Technologie umożliwiające amplifikację molekularną i sekwencjonowanie pozwalają obecnie rutynowo raportować o dużych liczbach genów i transkryptów, wspierając badania oparte na hipotezach w podstawowych badaniach biologicznych i translacyjnych. Aby zrozumieć rozwijające się układy, złożona zależność między transkrypcją a translacją wskazuje na konieczność bezpośredniej analizy wielu białek i ich modyfikacji potranslacyjnych. Proteomika globalna z wykorzystaniem biologicznych systemów in vitro, takich jak indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste, zaczęła wyznaczać mechanizmy indukcji tkanek1,2. W złożonych organizmach, takich jak zarodek kręgowca, rozwój opiera się na gradientach morfogenów w kontekście przestrzeni i czasu3. Z tego wynika, że zdobycie wiedzy o zmianach proteomicznych podczas różnicowania się komórek w wyspecjalizowane tkanki, takie jak tkanki nerwowe, stanowi klucz do odblokowania programów molekularnych kontrolujących prawidłowy i wadliwy rozwój oraz do opracowania terapii nowej generacji.

Kręgowca reprezentująca żaba południowoafrykańska (Xenopus laevis) jest uznanym modelem w biologii komórki, biologii rozwoju, neurobiologii oraz biologii regeneracyjnej. Nagroda Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny z 2012 roku4,5 przyznana sir Johnowi Gurdonowi za odkrycie pluripotencji jądra somatycznego podkreśliła znaczenie tego modelu dla odkryć w badaniach podstawowych i translacyjnych. Zarodki Xenopus rozwijają się poza organizmem matki, co ułatwia bezpośrednią manipulację komórkami, klonami komórkowymi oraz ekspresją genów na różnych etapach rozwoju. Asymetryczna pigmentacja i stereotypowe podziały komórkowe umożliwiły stworzenie powtarzalnych map losów komórek już od etapu zarodka 16-6 oraz 32-komórkowego7,8. W przypadku proteomiki opartej na wysokorozdzielczej spektrometrii mas (HRMS), dodatkowe zalety tego modelu obejmują stosunkowo duży rozmiar (~1 mm średnicy), co zapewnia obfitą zawartość białek do analizy (~130 µg w zarodkach na wczesnym etapie podziałów, ~10 µg zawartości białek w pojedynczych komórkach zarodka 16-komórkowego)9,10.

Obecnie HRMS jest wiodącą technologią z wyboru w wykrywaniu białek. Technologia ta umożliwia bezpośrednią, czułą i specyficzną detekcję oraz kwantyfikację wielu, zazwyczaj od setek do tysięcy różnych białek11. Proteomika bottom-up z wykorzystaniem HRMS obejmuje serię powiązanych ze sobą etapów. Po ekstrakcji z próbki komórkowej lub tkankowej białka są trawione enzymem proteolitycznym, takim jak trypsyna (proteomika bottom-up). Powstałe peptydy są rozdzielane na podstawie ich różnych właściwości fizykochemicznych, w tym hydrofobowości (cieczowa chromatografia odwróconej fazy, LC), ładunku netto (chromatografia wymiany jonowej), wielkości (chromatografia żelowa) lub ruchliwości elektroforetycznej (elektroforeza kapilarna, CE). Następnie peptydy są ładowane (jonizowane), zazwyczaj z użyciem jonizacji elektrycznej (ESI), a jony peptydowe są wykrywane i sekwencjonowane poprzez fragmentację w fazie gazowej za pomocą tandemowego HRMS. Uzyskane dane peptydowe są mapowane na proteom badanego organizmu. Dzięki temu, że intensywność sygnału jonów peptydów specyficznych dla białek (proteotypowych) koreluje z ich stężeniem, kwantyfikacja białek może być przeprowadzana metodami bezetykietowymi lub z użyciem etykiet (kwantyfikacja multipleksowa). Proteomika HRMS dostarcza bogatego zasobu informacji o stanie molekularnym badanego układu, co pozwala na formułowanie hipotez i przeprowadzanie dalszych badań funkcjonalnych.

Schemat mikroaspiracji i izolacji komórek; od embrionu do gastruli, sortowanie za pomocą FACS, układ eksperymentalny.
Rysunek 1: Proteomika skalowalna czasowo i przestrzennie umożliwiająca analizę proteomiczną HRMS sterowaną linią komórkową w rozwijającym się embrionie (żaby). (A) Wizualizacja preparatu (1) za pomocą stereomikroskopu (2) w celu iniekcji zidentyfikowanej komórki (wstawka), z wykorzystaniem wykonanej mikropipety (3) sterowanej przez stół przesuwny (4). (B) Pobieranie próbek podkomórkowych z zidentyfikowanej lewej komórki D11 w embrionie 16-komórkowym. (C) Wypreparowanie całej komórki D11 z embrionu 16-komórkowego. (D) Fluorescencyjne (zielone) śledzenie lewego i prawego potomstwa D111 od embrionu 32-komórkowego w celu przeprowadzenia sekcji ektodermy neuronalnej (NE) w gastruli (stadium 10) i izolacji tkanki pochodnej z kijanki za pomocą FACS. Paski skali: 200 µm dla embrionów, 1,25 mm dla fiolki. Rysunki zostały opracowane za zgodą autorów referencji15,19,21,59. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia ilościowe oznaczenie dużej liczby białek w zidentyfikowanych komórkach/tkankach rozwijających się zarodków X. laevis z wykorzystaniem HRMS. Podejście to opiera się na dokładnej identyfikacji komórek, powtarzalnych mapach losów komórkowych oraz uznanych metodologiach śledzenia linii komórkowych w tym modelu biologicznym6,7,8. Jak pokazano na Rysunku 1, badamy proteomy pojedynczych komórek, stosując mikrodysekcję całych komórek lub mikropróbkowanie kapilarne w celu aspiracji zawartości komórkowej. Monitorowanie linii komórkowej pozwala nam badać ewolucję czasowo-przestrzenną proteomu w miarę formowania się tkanek z komórek podczas gastrulacji. Potomstwo komórek jest znakowane fluorescencyjnie poprzez wstrzyknięcie fluoroforu sprzężonego z obojętnym dekstranem lub mRNA dla białka fluorescencyjnego (np. zielonego białka fluorescencyjnego, GFP). Znakowane potomstwo jest izolowane w wybranych punktach czasowych rozwoju. Podczas gastrulacji klony komórek, które tworzą ciasne skupiska, mogą być izolowane za pomocą dysekcji. Po gastrulacji klony komórek mogą być rozproszone w zarodku ze względu na ruchy migracyjne i mogą być izolowane z dysocjowanych tkanek za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS). Białka w tych komórkach i tkankach są mierzone za pomocą proteomiki bottom-up z zastosowaniem HPLC lub CE do rozdziału oraz tandemowej HRMS z jonizacją ESI do identyfikacji. Proteomika HRMS sterowana linią komórkową jest skalowalna dla różnych rozmiarów komórek i linii komórkowych w obrębie zarodka oraz jest specyficzna, czuła i ilościowa. Poprzez wybrane przykłady przedstawione w niniejszym opracowaniu wykazujemy również, że protokół ten jest skalowalny i szeroko adaptowalny do różnych typów komórek i linii komórkowych.

Schemat przepływu pracy podczas sekcji komórek i tkanek obejmujący trawienie peptydami, chromatografię oraz analizę ESI-HRMS.
Rysunek 2: Bioanalityczny schemat przepływu pracy. Mikrosekcja i aspiracja kapilarna lub pobieranie zawartości białek komórkowych i klonalnych wspomagane przez FACS. Usuwanie dominujących białek żółtka oraz rozdział za pomocą elektroforezy kapilarnej (CE) lub nanoprzepływowej chromatografii cieczowej (LC) zwiększyły czułość identyfikacji (ID) przy użyciu wysokorozdzielczej spektrometrii mas (HRMS) z jonizacją z rozpylania elektrycznego (ESI). Ilościowe oznaczenia ujawniły dysregulację, dostarczając nowych informacji do badań opartych na hipotezach w połączeniu z informacjami dostępnymi w ontologii genów (GO). Rysunki zostały dostosowane za zgodą z źródła15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły zapewniające humanitarne utrzymanie i obchodzenie się z dorosłymi żabami Xenopus laevis zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Maryland, College Park (numery zatwierdzenia R-DEC-17-57 i R-FEB-21-07).

1. Przygotuj roztwory

  1. Dla embriologii
    1. Przygotuj 1x, 0,5x i 0,2x roztwór Steinberga (SS), a następnie autoklawuj je (120 °C przez 20 min) do sterylności zgodnie ze standardowymi protokołami12.
    2. Przygotuj 3% (w/v) Ficoll w sterylizowanym 1x SS zgodnie ze standardowymi protokołami12.
    3. Do deżelacji należy przygotować świeżo 2% (w/v) roztwór cysteiny i dostosować jego pH do 8, dodając kroplami 10 M roztworu wodorotlenku sodu.
      UWAGA: Narażenie na cysteinę może spowodować uszkodzenie skóry i dróg oddechowych. Wodorotlenek sodu jest substancją, która może spowodować poważne uszkodzenie skóry i oczu przy bezpośrednim narażeniu. Podczas pracy z tymi chemikaliami należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE), takich jak rękawice i fartuch laboratoryjny.
    4. Do śledzenia linii należy przygotować 0,5% (v/v) fluorescencyjnego dekstranu w sterylnej wodzie dejonizowanej. Alternatywnie należy przygotować roztwór 0,2 μg/μL mRNA dla białek fluorescencyjnych w sterylnej wodzie dejonizowanej (np. GFP).
    5. Aby zdysocjować komórki, przygotuj bufor Newport 2.0 zawierający 0,1 M izetynianu sodu, 20 mM pirofosforanu sodu i 10 mM CAPS, a następnie doprowadź jego pH do 10,513,
      UWAGA: Narażenie na pirofosforan sodu może powodować podrażnienie skóry i oczu. Podczas obchodzenia się z tymi chemikaliami należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej.
  2. Dla proteomiki oddolnej
    1. Przygotuj bufor do lizy komórek, który zawiera: 250 mM sacharozy, 1% nonidetowy substytut P-40 (w/v), 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 10 μM cytochalazyny D i 10 μM combretastatyny 4A. Przygotuj zapas 10% (w/v) dodecylosiarczanu sodu14,15.
      UWAGA: Tris-HCl został wybrany w celu zminimalizowania zanieczyszczenia HEPES podczas nano-flow LC (nanoLC)-HRMS.
      UWAGA: Narażenie na substytut nonidet P-40 może powodować podrażnienie skóry. Cytochalazyna D jest teratogenna po spożyciu, a combretastatyna jest ostro toksyczna przy bezpośrednim narażeniu. Podczas obchodzenia się z tymi chemikaliami należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej.
    2. Aby oddzielić peptydy metodą CE, należy przygotować następujące rozpuszczalniki (v/v): Rozpuszczalnik próbki, 75% acetonitrylu (ACN) zawierający 0,05% kwasu octowego (AcOH) w wodzie; roztwór osłonowy, 10% ACN zawierający 0,05% AcOH w wodzie; elektrolit tła (BGE), 25% ACN zawierający 1 M kwas mrówkowy (FA) w wodzie.
      UWAGA: AcOH i FA są toksyczne w przypadku wdychania lub spożycia i mogą powodować poważne uszkodzenia skóry i oczu przy bezpośrednim narażeniu. Podczas obchodzenia się z tymi chemikaliami należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej.
    3. Aby rozdzielić peptydy za pomocą nanoLC z odwróconą fazą, należy przygotować (v/v): Faza ruchoma A (wodna), woda zawierająca 0,1% FA; faza ruchoma B (organiczna), 0,1% FA w ACN.
      UWAGA: Wszystkie mieszaniny powinny być przygotowywane przy użyciu rozpuszczalników klasy LC-MS, aby zminimalizować zakłócenia chemiczne podczas wykrywania HRMS.

2. Przygotuj narzędzia do mikroiniekcji i preparacji

  1. Aby delikatnie przesunąć i zorientować zarodki, utwórz pętle do włosów, umieszczając czyste włosy w pipecie Pasteura, jak opisano w innym miejscu16.
  2. Do mikroiniekcji należy wykonać igły, ciągnąc kapilary borokrzemianowe (1 mm/500 μm średnicy zewnętrznej/wewnętrznej) za pomocą ściągacza do pipet, jak opisano w innym miejscu16.
    UWAGA: W tym przypadku do wytwarzania igieł użyto ściągacza do pipet P-1000 z następującymi ustawieniami: ciepło, 495; ciąg, 30, prędkość, 60; czas, 150; ciśnienie, 200.
  3. Obserwując pod mikroskopem stereoskopowym, przetnij końcówkę kapilary za pomocą pary ostrych kleszczyków, aby zasadniczo przekształcić kapilarnę w (mikro)igłę (np. Dumont #5)16.
    UWAGA: Wyciągnięte naczynia włosowate są bardzo ostre i należy obchodzić się z nimi ostrożnie.
    UWAGA: Końcówka igły powinna być wystarczająco ostra (średnica zewnętrzna 10-15 μm), aby móc przebić komórkę przy minimalnym uszkodzeniu błony komórkowej, tak aby zawartość wewnątrzkomórkowa nie wyciekała, a komórka mogła się zagoić i nadal być żywotna.
  4. Aby zatrzymać zarodki podczas mikroiniekcji, przygotuj studzienki w naczyniu wypełnionym gliną. Na szalce Petriego o średnicy 15 mm i głębokości ~0,5 mm odciśnij studzienki o średnicy ~1 mm i głębokości ~0,5 mm w nietoksycznej glinie plastelinowej zgodnie z opisem w innym miejscu16.
  5. Do mikrodysekcji przygotuj naczynia pokryte agarozą. Zrób 2% agarozy w 1x SS i autoklawuj w celu sterylizacji roztworu (120 °C przez 20 min). Napełnij szalki Petriego o średnicy 60 mm do połowy i pozwól talerzom zastygnąć. Wykonaj studzienki o średnicy ~1 mm x głębokości ~0,5 mm za pomocą kulkowego narzędzia do pipetowania Pasteura, jak opisano wcześniej16.

3. Wyizoluj linię komórkową

UWAGA: Następujące kroki są wykonywane w celu wyizolowania zidentyfikowanych pojedynczych komórek i/lub ich potomnych linii komórkowych. Zazwyczaj zarodek jest hodowany do stadium 16- lub 32-komórkowego, w którym losy tkanek każdej komórki są odtwarzalnie mapowane6,7,17. Komórki embrionalne są identyfikowane na podstawie morfologii, lokalizacji i w odniesieniu do map ich losu. Do analizy pojedynczych komórek zidentyfikowane komórki izoluje się przez ręczną preparację lub ich zawartość wewnątrzkomórkową zbiera się do pipety kapilarnej i umieszcza w 5 μl 0,5 mM wodorowęglanu amonu. Otrzymana próbka jest przechowywana w temperaturze -80 °C do czasu analizy (Rysunek 1)18,19,20,21. W celu analizy linii komórkowej zidentyfikowanym komórkom wstrzykuje się znacznik linii, a ich kolejne klony są izolowane na kluczowych etapach rozwoju (np. podczas gastrulacji w celu zbadania indukcji tkanki, po neurulacji w celu zbadania zaangażowania tkankowego). W dalszej części przedstawiono kroki mające na celu fluorescencyjne znakowanie linii zidentyfikowanych komórek w celu izolacji przez rozbiór lub FACS.

  1. Hodowla zarodków
    1. Pozyskiwanie zarodków poprzez naturalne krycie lub zapłodnienie in vitro (IVF) zgodnie z ustalonymi protokołami12.
      UWAGA: Naturalne krycie jest logistycznie prostsze, oszczędza dorosłe samce żab i daje zarodki na różnych etapach rozwoju, podczas gdy zapłodnienie in vitro zapewnia rozwojowo zsynchronizowane zarodki do eksperymentów, które wymagają dokładnej oceny stopnia.
    2. Dejelly zarodki. Usunąć galaretowatą powłokę otaczającą zarodki poprzez traktowanie roztworem dejellying zgodnie z opisem w innym miejscu12,16.
      UWAGA: Mikroiniekcje i preparacje wymagają dostępu do komórek i tkanek, co wymaga przeprowadzenia badań w zarodkach X. laevis.
    3. Wybierz 2-komórkowe zarodki o stereotypowej pigmentacji16,22.
      UWAGA: Ten krok jest ważny, aby zapewnić dokładność i odtwarzalność w identyfikacji komórki i jej linii.
    4. Hoduj zarodki do pożądanego etapu rozwoju. Przenieś zdejeliowane zarodki na szalkę Petriego zawierającą 1x SS i inkubuj je w temperaturze 14-25 °C, aby kontrolować szybkość rozwoju.
      UWAGA: Zależność rozwoju od temperatury jest odtwarzalna i przedstawiona na wykresie dla X. laevis, dostępnym na Xenbase23 (www.xenbase.org). Hodowla partii zarodków w różnych temperaturach pozwala na rozłożenie w czasie etapów rozwoju. Pomaga to w rozłożeniu liczby embrionów dostępnych w danym momencie do eksperymentów.
    5. Monitoruj wzorzec rozszczepienia zarodków i wybieraj zarodki ze stereotypowymi wzorcami pigmentacji i rozszczepienia do mikroiniekcji16.
      UWAGA: Wybierając zarodki 16- i 32-komórkowe, upewnij się, że podziały komórek są symetryczne, aby umożliwić powtarzalne śledzenie linii.
  2. Oznacz interesujące Cię komórki
    1. Ustawić igłę do wstrzykiwań zawierającą roztwór do śledzenia linii. Zamontuj igłę do mikroiniekcji w uchwycie na mikropipety sterowaną przez wieloosiowy mikromanipulator.
    2. Podłączyć uchwyt mikropipety do mikrowstrzykiwacza. Napełnij igłę znacznikiem pochodzenia, stosując podciśnienie zgodnie z opisem w innym miejscu16. Rysunek 1A ilustruje konfigurację.
    3. Skalibrować igłę. Dostosuj rozmiar końcówki igły i czas wstrzyknięcia, aby dostarczyć ~1 nL roztworu znacznika linii, mierzonego w oleju (mineralnym) zgodnie z protokołem dostępnym gdzie indziej16.
      UWAGA: Kapilary z szerszą końcówką mają tendencję do uszkadzania błony komórkowej, powodując wyciek treści subkomórkowej i wstrzykniętego znacznika linii, podczas gdy naczynia włosowate z mniejszymi końcówkami są podatne na zatykanie. Kapilary o średnicy zewnętrznej końcówki ~10 μm są idealne, wymagają impulsu ciśnienia 40 psi przez ~300 ms, aby dostarczyć ~1 nL.
    4. Zalej gliniane naczynie do mikroiniekcji 3% roztworem Ficollu i przenieś ~10 zarodków do glinianego naczynia za pomocą pipety transferowej. Użyj pętli do włosów, aby wprowadzić każdy zarodek do studzienki i delikatnie ustaw je tak, aby docelowa komórka zainteresowania była ustawiona pod kątem prostym do mikroigły.
    5. Zidentyfikuj komórkę prekursorową interesującej nas linii na podstawie map losu tkanek X. laevis. Na przykład, Rysunek 1 pokazuje etykietowanie klonów ektodermalnych neuronów na podstawie wstrzyknięcia ich komórek prekursorowych do 32-komórkowych zarodków (lewa i prawa komórka D111).
      UWAGA: Szczegółowe mapy losów dla 16-6 i 32-cell7,8 są dostępne na interaktywnej platformie za pośrednictwem Xenbase23. Ważne jest, aby zapewnić stereotypową pigmentację i rozszczepienia na zarodkach podczas wykorzystywania ich do eksperymentów z prześledzeniem linii.
    6. Wstrzyknij do interesującej komórki (komórki) ~1 nL fluorescencyjnego dekstranu lub ~200 pg mRNA, jak opisano wcześniej16.
      UWAGA: Używaj koniugatów dekstranu o mocy 10 000-40 000 MW. Mniejsze koniugaty dekstranu mogą przechodzić przez połączenia szczelinowe, podczas gdy większe koniugaty dekstranu mogą nie dyfundować równomiernie do wstrzykiwanej komórki. Zaplanuj wstrzyknięcie komórek do ~10 zarodków, aby mieć wystarczającą ilość tkanek do analiz proteomicznych.
    7. Potwierdź powodzenie znakowania komórek pod mikroskopem stereoskopowym. Upewnij się, że wstrzyknięta została tylko zamierzona komórka. Odrzucaj zarodki zawierające uszkodzone lub nieprawidłowo oznakowane komórki zgodnie z polityką instytucjonalną.
      UWAGA: Ponieważ X. laevis jest inwazyjny w wielu nienaturalnych środowiskach, zarodki mogą być zamrażane w celu zapewnienia śmiertelności przed odrzuceniem zarodków.
  3. Wyizolować znakowane potomstwo komórkowe
    1. Przenieść wstrzyknięte zarodki do 0,5x SS na szalce Petriego i hodować je w temperaturze 14-25 °C, aż do osiągnięcia pożądanego stadium rozwoju.
      UWAGA: Zapoznaj się z ustalonymi protokołami oceny zarodków zgłoszonymi na Xenbase.
    2. Przenieś 3-5 zarodków do naczynia agarowego z 0,2x roztworem SS do mikrodysekcji.
      UWAGA: Zmniejszenie stężenia soli w roztworze SS z 0,5x do 0,2x pomaga oddzielić komórki podczas sekcji.
    3. Użyj dwóch zaostrzonych kleszczy, aby delikatnie usunąć błonę witelinową otaczającą zarodek.
      UWAGA: Aby oszczędzić interesującemu się klonowi uszkodzenia, oderwij membranę od przeciwnej strony klonu znakowanego fluorescencyjnie.
    4. Wyizoluj oznakowany klon poprzez ręczną sekcję (kroki 3.3.5-3.3.6) lub FACS (kroki 3.3.7-3.3.8) w następujący sposób.
    5. Użyj kleszczy, aby wypreparować oznakowany klon z zarodka.
      UWAGA: Inne narzędzia, takie jak nożyczki mikrochirurgiczne, igły wolframowe lub noże do włosów do brwi, mogą być używane do preparowania oznaczonego klonu, jak opisano w innym miejscu16.
    6. Pobrać wypreparowaną tkankę za pomocą pipety o pojemności 0,5-10 μl i umieścić ją w fiolce z mikrowirówką. Za pomocą pipety transferowej odessać pożywkę otaczającą pobraną tkankę, aby ograniczyć sole w próbce, które zakłócają analizę HRMS w późniejszych etapach.
      UWAGA: Używaj fiolek, które minimalizują adsorpcję białek na powierzchniach plastikowych, aby zminimalizować straty białka na powierzchni fiolek podczas późniejszych etapów przepływu pracy.
    7. Aby wyizolować za pomocą FACS, przenieś ~ 5-8 dewitellizowanych zarodków do każdej studzienki 12-dołkowej płytki zawierającej ~ 5 ml buforu Newport 2.0. Rozdziel zarodki, nutując płytkę z prędkością 80 obr./min przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej13.
      UWAGA: Zarodki/larwy starsze niż stadium 22 mają obfite białka macierzy zewnątrzkomórkowej, co utrudnia dysocjację na oddzielne komórki. Dodatkowe podejścia enzymatyczne mogą być dostosowane do dysocjacji tkanek od starszych zarodków, jak opisano w innym miejscu24.
    8. Oczyść fluorescencyjnie znakowane komórki z zawiesiny za pomocą FACS, jak opisano w innym miejscu24.
    9. Osad komórek przez odwirowanie i odrzucić supernatant.
      UWAGA: Użyj niskiej prędkości wirowania (400 × g) i temperatury (4 °C), aby zapobiec lizie komórek. W przypadku stosowania albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do FACS, należy umyć osad komórkowy, aby zmniejszyć interferencję BSA podczas wykrywania HRMS. Delikatnie ponownie zawiesić komórki w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i ponownie odwirować, aby osadzać wypłukane komórki. Usunąć sklarowany nad nim płyn PBS.
    10. Szybko zamrozić wyizolowane komórki, umieszczając fiolkę z próbką na suchym lodzie lub ciekłym azocie.
      UWAGA: Próbki (tkanki lub komórki) należy przechowywać w chłodzie (np. na lodzie) podczas etapów przetwarzania. Zamrozić komórki z jak najmniejszą ilością pożywki wokół próbki, aby ułatwić dalsze przetwarzanie.
    11. Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu analizy HRMS.

4. Analizuj białka za pomocą spektrometrii mas

Charakterystyka proteomiczna izolowanych tkanek lub komórek opiera się na serii ustalonych kroków w HRMS. Rysunek 2 ilustruje etapy procesu bioanalitycznego. Zastosowany tutaj protokół pobierania próbek jest zgodny z przepływami pracy proteomiki bottom-up11, middle-down25 lub top-down26. W dalszej części opisano strategię oddolną zastosowaną w tym badaniu, która okazała się czuła, ilościowa i możliwa do dostosowania do różnych typów spektrometrów masowych. Po ekstrakcji i enzymatycznym trawieniu białek, powstałe peptydy są rozdzielane, a następnie przeprowadzana jest analiza HRMS.

  1. Przetwarzaj tkanki/pojedyncze komórki
    1. W przypadku analizy jednokomórkowej metodą CE, podgrzej próbkę do 60 °C przez ~15 minut, aby zdenaturować białka, a następnie zrównoważ próbkę do temperatury pokojowej (RT, ~5 min)18,21.
      UWAGA: W przeciwieństwie do pracy z tkankami, etapy redukcji i alkilacji są pomijane, aby ograniczyć straty białka podczas przygotowywania próbki z pojedynczych komórek. Przygotowanie próbek wspomagane filtrem (FASP)27,28, inne strategie jednogarnkowe29 i podejścia mikroprzepływowe30 mogą być stosowane w celu zminimalizowania strat białka podczas przygotowywania próbki.
    2. Do analizy za pomocą nanoLC należy poddać lizie do 5 wypreparowanych tkanek w 50 μl buforu do lizy (~100 μg białka całkowitego). Ułatw ten proces, kilkakrotnie pipetując próbkę w górę i w dół.
    3. Inkubować lizat w temperaturze 4 °C przez 10 minut, a następnie osadzać resztki komórek i płytki krwi żółtka przez odwirowanie w temperaturze 4 500 × g w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do czystej fiolki do mikrowirówki i dodać 10% SDS w celu uzyskania końcowego stężenia 1% SDS w lizacie (v/v).
    4. W przypadku tkanek wykonaj kroki 4.1.5-4.1.7.
    5. Dodać 0,5 M ditiotreitolu do lizatu, aby uzyskać końcowe stężenie ~25 mM (np. 2,5 μL 0,5 M ditiotretolu na 50 μl lizatu) i inkubować lizat przez 30 minut w temperaturze 60 °C w celu chemicznej redukcji wiązań dwusiarczkowych w białkach.
    6. Dodać 0,5 M jodoacetamidu, aby uzyskać końcowe stężenie ~ 75 mM w lizacie i inkubować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności (Rysunek 2).
    7. Dodać 0,5 M ditiotreitol, tyle samo co objętość początkowa (np. 2,5 μl 0,5 M ditiotretolu na 50 μl lizatu) do schładzania reagentów pozostałych po reakcji alkilacji.
      UWAGA: Jodoacetamid i ditiotreitol mogą powodować poważne uszkodzenia skóry i oczu przy bezpośrednim narażeniu. Podczas obchodzenia się z tymi chemikaliami należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej.
    8. Oczyść białka przez wytrącanie. Wytrącanie na bazie chloroformu i metanolu działa dobrze31. Protokół ten można również dostosować do innych typów podejść do opadów32.
      UWAGA: W przypadku analizy pojedynczej komórki, w której ubytki białka są niepokojące, należy pominąć etap wytrącania dla CE-HRMS.
    9. Wysuszyć osad białkowy w koncentratorze próżniowym (4–37 °C), a następnie ponownie zawiesić wyekstrahowany proteom w 50 μl 50 mM wodorowęglanu amonu. Oszacuj stężenie białka za pomocą testu kolorymetrycznego białka całkowitego w celu określenia ilości enzymu wymaganego do trawienia (np. test białka kwasu bicinchoninowego).
    10. Trawić białka do peptydów. Dodać trypsynę (1 μg/μl zapasu), aby uzyskać stosunek proteazy do białka 1:50 i inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez okres do 5 godzin w przypadku próbek jednokomórkowych i do 14 godzin w przypadku próbek tkanek. Zapoznaj się z zaleceniami producenta dotyczącymi reakcji.
      UWAGA: Trawienie trypsyną przez ponad 14 godzin lub wyższe stężenia może wprowadzić rozszczepienia, które są niespecyficzne dla sekwencji białka, co stanowi wyzwanie dla identyfikacji białek33.
    11. Określ ilościowo całkowite stężenie peptydu za pomocą testu kolorymetrycznego.
    12. OPCJONALNIE: W celu multipleksowania ilościowego oznacz peptydy z każdej próbki innym znacznikiem masy izobarycznej, postępując zgodnie z instrukcjami specyficznymi dla dostawcy. Wymieszaj peptydy oznaczone kodami kreskowymi w równych proporcjach na próbkę peptydu.
      UWAGA: Zapewnij dokładne etykietowanie i mieszanie, aby uniknąć błędów ilościowych. W przypadku próbek o ograniczonej ilości lub próbek jednokomórkowych można dołączyć kanał nośny oparty na TMT, składający się z połączonych tkanek/komórek, aby zminimalizować straty próbki podczas kolejnych etapów separacji i zwiększyć czułość białek o niższej liczebności34.
    13. OPCJONALNIE: Peptydy odsalające w celu usunięcia soli i zanieczyszczeń (np. nieprzereagowanych odczynników do oznaczania masy izobarycznej) na kolumnie/końcówce wirowej C18 z odwróconymi fazami w celu ochrony systemu LC-MS.
    14. OPCJONALNIE: Frakcjonowanie (np. frakcjonowanie z odwróconymi fazami o średnim lub wysokim pH) mieszaniny peptydów w celu głębszego wykrywania proteomu za pomocą platform ręcznych lub automatycznych. Do frakcjonowania małych ilości (1-10 μg) trawionych peptydów należy stosować fazę stacjonarną C18 zawierającą końcówki.
    15. Wysuszyć mieszaninę peptydów w temperaturze 60 °C w koncentratorze próżniowym.
    16. Przechowywać mieszaninę peptydów w temperaturze -80 °C do czasu pomiaru.
  2. Oddziel peptydy
    UWAGA: Po ekstrakcji i enzymatycznym trawieniu białek, powstałe peptydy są rozdzielane przez nanoLC lub CE i jonizowane przez ESI w celu sekwencjonowania przez tandemowy HRMS. Separacja nanoLC z odwróconymi fazami jest idealna dla peptydów gromadzących od ~150 ng do ~1 μg na analizę. CE zapewnia komplementarną czułość dla peptydów w zakresie od femtogramów do <100 ng. Różne niestandardowe i komercyjne interfejsy CE-ESI pozwalają na szybkie sprzężenie CE z HRMS z solidną wydajnością35 i są coraz częściej używane do analizy pojedynczych komórek18,36,37.
    1. Aby rozdzielić za pomocą CE, wykonaj kroki 4.2.2-4.2.7.
      UWAGA: W dalszej części opisano zastosowanie zbudowanej na zamówienie platformy CE do pomiaru peptydów. Protokoły do budowy i użytkowania tego instrumentu CE zostały dostarczone wcześniej38, wraz z wizualizacją eksperymentu dotyczącego użycia małych cząsteczek20. Alternatywnie, pomiary te można wykonać w komercyjnym systemie CE, takim jak AB SCIEX CESI, Agilent 7100 lub równoważny.
    2. Rozpuść trawienie białka w 1-2 μl rozpuszczalnika próbki, wirować w celu wymieszania próbki i odwirować ją przy 10 000 x g przez 2 minuty w celu osadzenia resztek komórek.
      UWAGA: Usunięcie resztek ogniw minimalizuje prawdopodobieństwo zatkania kapilary CE, przedłużając w ten sposób żywotność systemu separacji i zwiększając przepustowość pomiaru.
    3. Zainicjuj instrument CE-ESI, przepłukując kapilarnę CE za pomocą BGE.
    4. Walidacja wydajności instrumentalnej przy użyciu znanego wzorca (np. trawienie cytochromu C lub BSA, peptydy angiotensyny).
      UWAGA: Przed pomiarem cennych próbek zaleca się ocenę przyrządu pod względem dokładności masy, czułości wykrywania, odtwarzalności i liniowego dynamicznego zakresu kwantyfikacji. Dodatkowe uwagi dotyczące walidacji i rozwiązywania problemów z wydajnością CE-ESI-MS znajdują się w innym miejscu18,20,38.
    5. Wstrzyknąć ~1-10 nL próbki do kapilary separacji CE.
      UWAGA: W tym badaniu wykorzystano kapilarnę z topionej krzemionki o długości ~1 m (średnica wewnętrzna/zewnętrzna 40/110 μm) z elektrokinetycznie pompowanym układem płaszcz-przepływ. Komercyjne instrumenty CE zwykle wymagają przedstawienia 5-10 μl próbki w mikrofiolce do wstrzykiwań. Specjalnie zbudowana platforma CE 18,38 jest kompatybilna z ~250 nL do 1 μL próbki zdeponowanej w mikrofiolce ładującej próbkę.
    6. Przenieś końcówkę wlotową kapilary separacji CE do BGE.
    7. Rozpocznij separację elektroforetyczną od stopniowego zwiększania napięcia separacji CE od uziemienia (np. krok przez 1 min). Potencjały 20-28 kV przy prądzie poniżej ~10 μA zapewniają stabilną i powtarzalną wydajność instrumentalną do analizy.
    8. Aby rozdzielić za pomocą nanoLC, wykonaj kroki 4.2.9-4.2.12.
    9. Zawiesić próbkę peptydu w ruchomej fazie A. Stężenie próbki i jej objętość do wtrysku zależy od dostępnego układu LC i kolumny. W tym badaniu ~250 ng-1 μg trawienia białka wstrzykuje się do 1-20 μl objętości próbki na kolumnie C18 ze złożem upakowanym (średnica wewnętrzna 75 μm, wielkość cząstek 2 μm z porami 100 A, kolumna separacyjna o długości 25 cm).
    10. Przenieść próbkę do fiolki LC.
      UWAGA: Upewnij się, że w fiolce nie ma pęcherzyków powietrza, które mogą uszkodzić kolumnę analityczną. Fiolki z wkładkami mogą być używane do próbek tkanek o małej objętości lub pojedynczych komórek.
    11. Załadować od ~200 ng do 2 μg próbki peptydu do kolumny analitycznej C18.
      UWAGA: Opcjonalnie peptydy można załadować na kolumnę pułapkową w celu odsalania przed separacją analityczną. Na przykład kolumna pułapka C18 o średnicy wewnętrznej 0,1 mm, wielkości cząstek 5 μm, wielkości porów 100 A i długości 20 mm. Peptydy odsalać 100% buforem A przy natężeniu przepływu 5 μl/min przez 5 minut przed rozpoczęciem gradientu separacji.
    12. Oddzielić peptydy za pomocą elucji gradientowej. Przy natężeniu przepływu 300 nL/min 120-minutowy gradient zastosowany w tym badaniu jest następujący: 0-5 min 2% B, 5-85 min 2-35% B, 86-90 min 70% B, 91-120 min 2% B.
  3. Jonizuj peptydy przez ESI
    UWAGA: Kapilara CE lub nanoLC jest najczęściej sprzężona ze źródłem ESI w celu jonizacji. Interfejsy CE-ESI do ultraczułej detekcji opracowane zostały wcześniej opracowane w modelu Micro-flow (blunt-tip) i nano-flow (tapered-tip39 oraz projekt Electrokinetic pumped sheath-flow36).
    1. Dostarczyć separujące peptydy do źródła jonów w celu elektrorozpylania w celu jonizacji za pomocą komercyjnego lub niestandardowego interfejsu ESI. Do jednokomórkowej analizy CE-ESI-MS w zarodkach Xenopus należy użyć elektrokinetycznie pompowanego interfejsu o niskim przepływie, w którym wylot kapilary CE jest zamknięty w ciągniętym emiterze borokrzemianowym.
    2. Sprawdź przepływ cieczy przez emiter elektrorozpylania za pomocą kamery i sprawdź wzrokowo konfigurację pod kątem ewentualnych wycieków.
    3. Ustaw napięcie elektrorozpylania na ~2,5 kV, aby uruchomić źródło ESI (w porównaniu z uziemieniem).
    4. Zapewnij stabilny nanospray do analizy HRMS, monitorując całkowity prąd jonów. Dostosuj napięcie elektronatrysku i odległość emitera od wlotu HRMS, aby uzyskać stabilny rozpylany strumień (<15% względne odchylenie standardowe całkowitej intensywności).
  4. Wykryj peptydy
    UWAGA: Wykrywanie peptydów odbywa się zgodnie z różnymi instrumentalnymi względami dla peptydów znakowanych i nieznakowanych masowo izobarycznie i zależy od typu dostępnego spektrometru masowego. W tym badaniu wykorzystano spektrometr mas orbitrap tribrid zgodnie z następującymi krokami.
    1. Pobieraj zdarzenia MS1 z ustawieniami: Analyzer, orbitrap; Rozdzielczość spektralna, 120 000 pełnej szerokości przy połowie maksimum (FWHM); maksymalny czas wtrysku (IT), 50 ms; automatyczna kontrola wzmocnienia (AGC), 4 x 105 zliczeń; Mikroskopy, 1.
    2. Aby sekwencjonować peptydy, fragmentuj jony prekursorowe do wykrywania w analizatorze pułapki jonowej przy użyciu ustawień: tryb fragmentacji, dysocjacja zderzeń o wyższej energii (HCD); gaz zderzeniowy, azot; energia zderzenia, 32% znormalizowana energia zderzenia (NCE); maksymalny IT, 70 ms; AGC, 1 x 104 zliczenia; Mikroskopy, 1.
    3. OPCJONALNIE: Ilościowe oznaczanie peptydów znakowanych TMT za pomocą tandemowego/wielostopniowego HRMS (MS2/MS3). Dla MS3 wykorzystującego synchroniczną selekcję prekursorów, typowe ustawienia instrumentalne są następujące. Jednostopniowe (MS1) skany badające najliczniejsze jony są dysocjowane poprzez akwizycję zależną od danych przy użyciu parametrów: tryb fragmentacji MS2, dysocjacja wywołana zderzeniem (CID); gaz zderzeniowy, hel; energia zderzenia, 35% NCE; analizator jonów fragmentacyjnych, pułapka jonowa następujące ustawienia: maksymalny IT, 50 ms; AGC, 5 x 104 zliczenia; Mikroskopy, 1. Wybierz 10 jonów fragmentacyjnych MS2 i rozdrobnij je za pomocą HCD w azocie (65% NCE). Wykrywanie jonów fragmentacyjnych MS3 przy użyciu następujących ustawień: rozdzielczość Orbitrap 15 000 FWHM, maksymalne IT, 120 ms; AGC, 1 × 105 zliczeń; Mikroskopy, 1.
      UWAGA: Różne metody i parametry pozyskiwania MS mogą być używane dla oznaczonych próbek zgodnie z zaleceniami dostawcy, jak opisano w innym miejscu11,40.
  5. Analizowanie danych
    UWAGA: Białka są identyfikowane i oznaczane ilościowo przy użyciu zaawansowanych pakietów bioinformatycznych. Wierność identyfikacji oblicza się przy użyciu bazy danych wabików, wyrażoną jako wskaźnik fałszywych odkryć (FDR) na poziomie peptydów i białek.
    1. Przetwarzaj dane za pomocą komercyjnych lub otwartych pakietów oprogramowania (przejrzanych w reference41). Dopasuj surowe dane do bazy danych, która została przygotowana przez połączenie proteomu Xenopus 9.2 z bazą danych PHROG pochodzącą z mRNA42.
      UWAGA: Parametry wyszukiwania to: enzym trawienny, trypsyna; brakujące dekolty, do 2; zmienna modyfikacja, utlenianie metioniny; modyfikacja statyczna, karbamidometylowania cysteiny; tolerancja masy prekursora, 10 ppm; tolerancja masy fragmentu, 0,6 Da; minimalna długość peptydu, 5; wierność identyfikacji, <1% FDR dla peptydów i białek. Bez alkilacji peptydów, karbamidometylacja jako modyfikacja statyczna jest wykluczona podczas przeszukiwania bazy danych (np. do analizy pojedynczych komórek).
    2. Określ ilościowo obfitość białka za pomocą label-free43 lub strategii opartych na etykietach44,45.
    3. OPCJONALNIE: Adnotacja białek dla ontologii genów. Można użyć PantherDB46, Reactome47 lub Xenbase23.
    4. OPCJONALNIE: Określ ilościowo obfitość białek i różnice w obfitości białek między typami komórek/tkanek za pomocą pakietów oprogramowania/narzędzi internetowych, takich jak Trans-Proteomic Pipeline48, Perseus49 i Orange50.
      UWAGA: Dodatkowe rozważania na temat projektu eksperymentalnego i opcji oprogramowania zostały omówione w innym miejscu41,51.
    5. OPCJONALNIE: Oceń wyniki dalej, korzystając z baz wiedzy, takich jak STRING52 i BioPlex Display53 dla znanych interakcji białko-białko oraz PhosphoSiteplus54 dla fosforylacji. Do analizowania motywów i domen, które są reprezentowane w proteomie, użyj narzędzi internetowych, takich jak Simple Modular Architecture Research (SMART)55.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół umożliwił badanie białek w pojedynczych komórkach i ich liniach komórkowych podczas tworzenia tkanek w *X. laevis* zarodki Rysunek 1 ilustruje jedną z takich aplikacji tego podejścia do badania białek w komórkach przeznaczonych na tkankę nerwową oraz w nowo indukowanym ektodermie nerwowym w embrionie. Jak pokazano w Rycina 1Aprzepływ pracy bioanalitycznej integrował tradycyjne narzędzia biologii komórki i biologii rozwoju w celu ident...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten umożliwia scharakteryzowanie ekspresji białek w zidentyfikowanych liniach komórkowych w zarodkach z gatunku Xenopus . Metodologia ta, wywodząca się z HRMS, łączy w sobie wyjątkową specyficzność w identyfikacji molekularnej, zdolność do wykrywania wielu białek bez sond molekularnych (zwykle od setek do tysięcy różnych białek) oraz zdolność do kwantyfikacji. Zdolność adaptacji do klasycznych narzędzi i procesów pracy w (neuro)biologii komórkowej i rozwojowej rozszerza proteomikę HRMS o ekscytujące zas...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Jie Li (University of Maryland, College Park) za cenne dyskusje na temat dysocjacji embrionalnej i FACS. Dziękujemy Vi M. Quach i Camille Lombard-Banek za pomoc w przygotowaniu próbek i zebraniu danych w poprzednich badaniach, które ilustrują zastosowania proteomiczne, które zostały podkreślone w tym protokole. Część tych prac była wspierana przez National Science Foundation w ramach nagrody o numerze IOS-1832968 CAREER (dla P.N.), National Institutes of Health pod numerem nagrody R35GM124755 (dla P.N.), University of Maryland-National Cancer Institute Partnership Program (dla P.N.) oraz nagrody badawcze COSMOS Club Foundation (dla A.B.B. i L.R.P.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Acetonitryl (klasa LC-MS)Fisher ScientificA955
AgarozaThermoFisher ScientificR0492
Wodorowęglan amonuFisher ScientificA643-500
Kolumna analitycznaThermo Scientific164941
Mikrowaga analitycznaMettler-ToledoXSE105DU
Automatyczna platforma do frakcjonowania peptydówAgilent1260 Infinity II
Kapilary borokrzemianoweSutter Instruments Co.B100-50-10
Kapilary borokrzemianowe (do wytwarzania emiterów)Sutter InstrumentsB100-75-10
Kolumny wirujące C18 (do odsalania)ThermoFisher Scientific89870
Kamera ro monitor elektrosprayEdmund Optics Inc.EO-2018C
Combretastatin A4Millipore SigmaC7744
Komercyjny system CESIAB SCIEXCESI
(Cykloheksyloamino)-1-propanosulfonowy kwas (CAPS)VWR97061-492
Cytochalazyna DMilipora SigmaC8273
Dextran, Alexa Fluor 488; 10 000 MW, anionowy, naprawialnyThermoFisher ScientificD22910
DiothiothreitolFisher ScientificFERR0861
Dumont #5 KleszczeFine Science Tools11252-30
EDTAFisher ScientificAAJ62786AP
Epifluorescencyjne źródło światłaLumencoreAURA III
Eppendorf LoBing mikrowirówki  probówki: białkoFisher Scientific13-698-793
Kwas mrówkowy (klasa LC-MS)Zamrażarka Fisher ScientificA117-50
(-20 ° C)Fisher Scientific97-926-1 
Zamrażarka (-80 ° C)Thermo ScientificTSX40086A
Kapilarna z topionej krzemionkiMolex1088150596
Heat BlockBenchmarkBSH300
Wysokociśnieniowy system chromatografii cieczowejThermoFisher ScientificDionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem
wysokiego napięciaSpellmanCZE1000R
Spektrometr masowy o wysokiej rozdzielczościThermoFisher ScientificOrbitrap Fusion Lumos Tribrid Spektrometr
masowy Nakrętki HPLCFiolki Thermo ScientificC4013-40A
HPLCThermo ScientificC4013-11
Illuminator np. Gęsia szyjaNikonC-FLED2
Ingenuity Analiza ścieżkiQiagen
JodoacetamidFisher ScientificAC122275000
Metanol (klasa LC-MS)Metanol FisherScientific A456
(klasa LC-MS)ŚciągaczScientific A456-4
Suttor InstrumentsP-2000
MikrowtryskiwaczWarner Instrument, Handem, CTPLI-100A
Ściągacz do mikropipetSutter Instruments Co.P-1000
MS, komercyjneProteomeDiscoverer
MS, opensourceMaxQuant
non-idet 40 substytutMillipore Sigma11754599001
szalka Petriego 60 mm i 80 mmFisher ScientificS08184
Pierce 10 µ Łóżko L Końcówki zamków błyskawicznych (do odsalania)ThermoFisher Scientific87782
Zestaw do oznaczania białek z kwasem bicynchoninowymThermoFisher Scientific23225
Pierce Ilościowy test peptydowy kolorymetrycznyThermoFisher Scientific23275
Pierce Trypsin (klasa MS)Fiolki
Protein LoBindEppendorf0030108434
, 0030108442
wirówka z chłodzeniemEppendorf5430R
Inkubator z chłodzeniemThermo ScientificPR505755R/3721
MiliporeSigma220078
pirofosforan soduSigma Aldrich221368-100G
Fiolka BGE ze stali nierdzewnejWykonane
fiolki na próbki ze stali nierdzewnejNiestandardowy
mikroskop stereoskopowy (obiektyw 10x)NikonSMZ 1270, SZX18
SacharozaVWR97063-790
Pompy strzykawkowe (2)Aparat Harvard704506
Strzykawki (gazoszczelne): 500– 1000 &mikro; LHamilton1750TTL
Pipety transferowe (plastikowe, jednorazowe)Fisher Scientific13-711-7M
Kolumna pułapkowaThermo Scientific164750
Tris-HCl (roztwór 1 M)Fisher ScientificAAJ22638AP
Koncentrator próżni zdolny do pracy z prędkością 4– 10 stopni Celsjusza; CLabconco7310022
Vortex-mixerBenchmarkBS-VM-1000
Woda (klasa LC-MS)Fisher ScientificW6
Woda (klasa LC-MS)Fisher ScientificW6
XYZ Etap tłumaczeniaThorlabsPT3
XYZZbudowany
Zasilacz mikrokapilarny Fisher Oprogramowanie do analizy danych oprogramowanie do analizy danych Fisher Scientific PI90058 na zamówienie na zamówienie

Bibliografia

  1. Shoemaker, L. D., Kornblum, H. I. Neural Stem Cells (NSCs) and Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 344-354 (2016).
  2. Cervenka, J., et al. Proteomic characterization of human neural stem cells and their secretome during in vitro differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 612560(2021).
  3. Christian, J. L. Morphogen gradients in development: From form to function. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 1 (1), 3-15 (2012).
  4. Gurdon, J. B., Elsdale, T. R., M, F. Sexually mature individuals of Xenopus laevis from the transplantation of single somatic nuclei. Nature. 182, 64-65 (1958).
  5. Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends in Genetics. 27 (12), 507-515 (2011).
  6. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Developmental Biology. 119 (2), 560-578 (1987).
  7. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo. Developmental Biology. 122 (2), 300-319 (1987).
  8. Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
  9. Sun, L. L., et al. Single cell proteomics using frog (Xenopus laevis) blastomeres isolated from early stage embryos, which form a geometric progression in protein content. Analytical Chemistry. 88 (13), 6653-6657 (2016).
  10. Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry for discovery proteomics: quantifying translational cell heterogeneity in the 16-cell frog (Xenopus) embryo. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (7), 2454-2458 (2016).
  11. Zhang, Y. Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R. Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics. Chemical Reviews. 113 (4), 2343-2394 (2013).
  12. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2000).
  13. Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
  14. Gupta, M., Sonnett, M., Ryazanova, L., Presler, M., Wuhr, M. Quantitative proteomics of xenopus embryos I, sample preparation. Xenopus. Methods in Molecular Biology. Vleminckx, K. 1865, Humana Press Inc. NY. 175-194 (2018).
  15. Baxi, A. B., Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. Proteomic characterization of the neural ectoderm fated cell clones in the Xenopus laevis embryo by high-resolution mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 2064-2073 (2018).
  16. Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods in Molecular Biology. 135, 331-347 (2000).
  17. Sater, A. K., Moody, S. A. Using Xenopus to understand human diseases and developmental disorders. Genesis. 55 (1-2), 1-14 (2017).
  18. Lombard-Banek, C., Choi, S. B., Nemes, P. Enzyme Activity in Single Cells. Methods in Enzymology. Allbritton, N. L., Kovarik, M. L. 628, 263-292 (2019).
  19. Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. High-sensitivity mass spectrometry for probing gene translation in single embryonic cells in the early frog (Xenopus) embryo. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 11(2016).
  20. Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. Microprobe capillary electrophoresis mass spectrometry for single-cell metabolomics in live frog (Xenopus laevis) embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56956(2017).
  21. Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Manzin, M. C., Nemes, P. Microsampling capillary electrophoresis mass spectrometry enables single-cell proteomics in complex tissues: developing cell clones in live Xenopus laevis and zebrafish embryos. Analytical Chemistry. 91 (7), 4797-4805 (2019).
  22. Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Developmental Biology. 120 (1), 299-304 (1987).
  23. Karimi, K., et al. Xenbase: a genomic, epigenomic and transcriptomic model organism database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 861-868 (2018).
  24. Kakebeen, A. D., Chitsazan, A. D., Wills, A. E. Tissue disaggregation and isolation of specific cell types from transgenic Xenopus appendages for transcriptional analysis by FACS. Developmental Dynamics. 250 (9), 1381-1392 (2021).
  25. Garcia, B. A. What does the future hold for top down mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (2), 193-202 (2010).
  26. Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in top-down proteomics and the analysis of proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. (Palo Alto Calif). 9 (1), 499-519 (2016).
  27. Zhang, Z. B., Dubiak, K. M., Huber, P. W., Dovichi, N. J. Miniaturized filter-aided sample preparation (MICRO-FASP) method for high throughput, ultrasensitive proteomics sample preparation reveals proteome asymmetry in Xenopus laevis Embryos. Analytical Chemistry. 92 (7), 5554-5560 (2020).
  28. Wisniewski, J. R. Microbial Proteomics: Methods and Protocols.Methods in Molecular Biology. Becher, D. 1841, Humana Press Inc. NY. 3-10 (2018).
  29. Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
  30. Zhu, Y., et al. Nanodroplet processing platform for deep and quantitative proteome profiling of 10-100 mammalian cells. Nature Communications. 9, 882(2018).
  31. Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute-solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  32. Jiang, L., He, L., Fountoulakis, M. Comparison of protein precipitation methods for sample preparation prior to proteomic analysis. Journal of Chromatography A. 1023 (2), 317-320 (2004).
  33. Hildonen, S., Halvorsen, T. G., Reubsaet, L. Why less is more when generating tryptic peptides in bottom-up proteomics. Proteomics. 14 (17-18), 2031-2041 (2014).
  34. Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology. 19, 161(2018).
  35. Drouin, N., et al. Capillary electrophoresis-mass spectrometry at trial by metabo-ring: effective electrophoretic mobility for reproducible and robust compound annotation. Analytical Chemistry. 92 (20), 14103-14112 (2020).
  36. Sun, L. L., Zhu, G. J., Zhang, Z. B., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-generation electrokinetically pumped sheath-flow nanospray interface with improved stability and sensitivity for automated capillary zone electrophoresis-mass spectrometry analysis of complex proteome digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
  37. DeLaney, K., Sauer, C. S., Vu, N. Q., Li, L. J. Recent advances and new perspectives in capillary electrophoresis-mass spectrometry for single cell "omics". Molecules. 24 (1), 21(2019).
  38. Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nature Protocols. 8 (4), 783-799 (2013).
  39. Choi, S. B., Zamarbide, M., Manzini, M. C., Nemes, P. Tapered-tip capillary electrophoresis nano-electrospray ionization mass spectrometry for ultrasensitive proteomics: the mouse cortex. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (4), 597-607 (2017).
  40. Pino, L. K., Rose, J., O'Broin, A., Shah, S., Schilling, B. Emerging mass spectrometry-based proteomics methodologies for novel biomedical applications. Biochemical Society Transactions. 48 (5), 1953-1966 (2020).
  41. Chen, C., Hou, J., Tanner, J. J., Cheng, J. L. Bioinformatics methods for mass spectrometry-based proteomics data analysis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 25(2020).
  42. Peshkin, L., et al. On the relationship of protein and mRNA dynamics in vertebrate embryonic development. Developmental Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
  43. Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
  44. Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
  45. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  46. Mi, H. Y., et al. PANTHER version 16: a revised family classification, tree-based classification tool, enhancer regions and extensive api. Nucleic Acids Research. 49, 394-403 (2021).
  47. Schmidt, E., et al. On the Move Federated Workshops. , Springer, Verlag. Berlin. 710-719 (2006).
  48. Deutsch, E. W., et al. Trans-Proteomic pipeline, a standardized data processing pipeline for large-scale reproducible proteomics informatics. Proteomics Clinical Applications. 9 (7-8), 745-754 (2015).
  49. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  50. Demsar, J., et al. Orange: Data mining toolbox in Python. Journal of Machine Learning Research. 14, 2349-2353 (2013).
  51. Oberg, A. L., Vitek, O. Statistical design of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. Journal of Proteome Research. 8 (5), 2144-2156 (2009).
  52. Jensen, L. J., et al. STRING 8 - a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms. Nucleic Acids Research. 37, 412-416 (2009).
  53. Schweppe, D. K., Huttlin, E. L., Harper, J. W., Gygi, S. P. BioPlex display: an interactive suite for large-scale AP-MS protein-protein interaction data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 722-726 (2018).
  54. Hornbeck, P. V., et al. PhosphoSitePlus, 2014: mutations, PTMs and recalibrations. Nucleic Acids Research. 43, 512-520 (2015).
  55. Letunic, I., Khedkar, S., Bork, P. SMART: recent updates, new developments and status in 2020. Nucleic Acids Research. 49, 458-460 (2021).
  56. Lombard-Banek, C., et al. In vivo subcellular mass spectrometry enables proteo-metabolomic single-cell systems biology in a chordate embryo developing to a normally behaving tadpole (X. laevis). Angewandte Chemie-International Edition. 60 (23), 12852-12858 (2021).
  57. Lombard-Banek, C., Reddy, S., Moody, S. A., Nemes, P. Label-free quantification of proteins in single embryonic cells with neural fate in the cleavage-stage frog (Xenopus laevis) embryo using capillary electrophoresis electrospray ionization high-resolution mass spectrometry (CE-ESI-HRMS). Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2756-2768 (2016).
  58. Saha-Shah, A., et al. Single cell proteomics by data-independent acquisition to study embryonic asymmetry in Xenopus laevis. Analytical Chemistry. 91 (14), 8891-8899 (2019).
  59. Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Analytical Chemistry. 89 (13), 7069-7076 (2017).
  60. Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Proteomika linii komórkowychzarodek Xenopusoznaczanie ilości białekznakowanie fluorescencyjnemikrodysekcja komórekelektroforeza kapilarnachromatografia cieczowawysokorozdzielcza spektrometria masproteomika tkanki nerwowej
Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.