Artykuł metodologiczny

Mysi model tętniaka aorty brzusznej indukowany przez okołonaczyniowe zastosowanie elastazy

DOI:

10.3791/63608

⸱

11 lutego 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Frankel Cardiovascular Center, University of Michigan, Ann Arbor

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgiczną dla modelu AAA wywołanego elastazą poprzez bezpośrednie zastosowanie elastazy do przydanki podnerkowej aorty brzusznej u myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tętniak aorty brzusznej (AAA), choć początkowo bezobjawowy, jest potencjalnie zagrażający życiu, ponieważ pęknięcie AAA zwykle ma katastrofalne skutki. Obecnie istnieje kilka odrębnych modeli eksperymentalnych AAA, z których każdy podkreśla inny aspekt patogenezy AAA. Model AAA indukowany elastazą jest drugim najczęściej używanym modelem AAA gryzoni. Model ten polega na bezpośrednim wlewie lub aplikacji elastazy trzustkowej (PPE) świńskiej do odcinka podnerkowego aorty. Ze względu na wyzwania techniczne, większość modeli AAA indukowanych elastazą jest obecnie wykonywana z aplikacją zewnętrzną, a nie z doświetlną infuzją środków ochrony indywidualnej. Nacieknięcie elastazy spowoduje degradację blaszek elastycznych w warstwach przyśrodkowych, co spowoduje utratę integralności ściany aorty, a następnie rozszerzenie aorty brzusznej. Jednak jedną z wad modelu AAA indukowanego elastazą jest nieunikniona zmienność sposobu wykonywania operacji. W szczególności technika chirurgiczna izolowania odcinka podnerkowego aorty, materiał używany do owijania aorty i inkubacji środków ochrony indywidualnej, aktywność enzymatyczna środków ochrony indywidualnej oraz czas stosowania środków ochrony indywidualnej mogą być ważnymi czynnikami wpływającymi na ostateczną szybkość powstawania AAA i średnicę tętniaka. Warto zauważyć, że różnica w tych czynnikach w porównaniu z różnymi badaniami nad AAA może prowadzić do problemów z odtwarzalnością. W artykule opisano szczegółowy proces chirurgiczny modelu AAA indukowanego elastazą poprzez bezpośrednie zastosowanie środków ochrony indywidualnej do przydanki podnerkowej aorty brzusznej u myszy. Po tej procedurze możliwe jest osiągnięcie stabilnego tempa tworzenia AAA wynoszącego około 80% u samców i samic myszy. Spójność i powtarzalność badań AAA z wykorzystaniem modelu AAA indukowanego elastazą można znacznie zwiększyć poprzez ustanowienie standardowej procedury chirurgicznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tętniak aorty brzusznej (AAA) jest zdefiniowany jako segmentowe poszerzenie aorty brzusznej ze wzrostem średnicy naczynia o co najmniej 50%1. AAA jest potencjalnie śmiertelne, ponieważ pęknięcie może skutkować bardzo wysoką śmiertelnością, nawet przy interwencji2,3,4. Doniesiono, że AAA jest odpowiedzialne za około 13 000 zgonów rocznie w USA, co czyni je dziesiątą najczęstszą przyczyną zgonów1,5.

Patogeneza AAA nie jest jeszcze w pełni zrozumiała6,7,8. Aby zbadać molekularny mechanizm AAA i przetestować potencjalne cele terapeutyczne, stworzono kilka eksperymentalnych modeli AAA9,10. Modele AAA dla gryzoni obejmują elastazę, chlorek wapnia, angiotensynę II i modele ksenoprzeszczepów, wśród których model AAA indukowany elastazą jest drugim najczęściej używanym modelem10,11,12,13,14,15,16,17. Model ten polega na bezpośrednim wlewie lub aplikacji elastazy trzustkowej (PPE) świńskiej do odcinka podnerkowego aorty. Wnikanie elastazy do warstwy przyśrodkowej aorty spowoduje degradację blaszek elastycznych i infiltrację komórek zapalnych, co prowadzi do utraty integralności ściany aorty, a następnie rozszerzenia aorty brzusznej7,18. Model AAA indukowany elastazą został po raz pierwszy opisany przez Anidjara i in. w 1990 roku na szczurach, u których izolowany fragment aorty był perfundowany elastazą17. Później, w 2012 roku, zmodyfikowany model wykorzystujący okołoprzybytkowe zastosowanie środków ochrony osobistej został zgłoszony przez Bhamidipati et al.19. Obecnie większość operacji w modelu AAA indukowanym elastazą jest inspirowana przez grupę Bhamidipati i jest wykonywana przy użyciu aplikacji zewnętrznej, a nie perfuzji śródświetlnej środków ochrony indywidualnej. Chociaż aplikacja zewnętrzna ma mniejsze wymagania dotyczące precyzyjnych umiejętności chirurgicznych, częstość występowania AAA jest stosunkowo niższa i nieco mniejsza niż w przypadku perfuzji śródświetlnej11,19.

Chociaż szeroko stosowany w badaniach AAA, model AAA indukowany elastazą posiada pewne ograniczenia. Jednym z zastrzeżeń tego modelu są nieuniknione różnice w sposobie wykonywania operacji, co może prowadzić do problemu z odtwarzalnością. Na przykład w procedurze chirurgicznej może istnieć różnica w sposobie izolacji odcinka podnerkowego aorty i która część segmentu jest wybierana do stosowania środków ochrony indywidualnej w różnych laboratoriach. Aktywność enzymatyczna ŚOI i czas trwania inkubacji ŚOI mogą się również różnić. Są to jednak wszystkie niezbędne determinanty, które wpływają na ostateczną szybkość powstawania AAA i średnicę tętniaka. Zmienność tych krytycznych determinantów sprawia, że porównywanie danych z badań AAA z różnych grup korzystających z tego modelu jest bardzo trudne. Dlatego potrzebna jest ustandaryzowana procedura chirurgiczna jako narzędzie do uzyskania porównywalnych wyników z różnych instytucji.

Ten artykuł opisuje ustandaryzowany protokół chirurgiczny dla modelu AAA wywołanego elastazą poprzez bezpośrednie zastosowanie PPE do przydanki podnerkowej aorty brzusznej u myszy. Omówione zostaną również szczegóły dotyczące materiału chirurgicznego i procedur niezbędnych do pomyślnego i solidnego generowania AAA u myszy przy użyciu tego modelu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Michigan (PRO00010092). Do eksperymentów wykorzystano samce i samice myszy typu dzikiego C57BL/6J (WT) w wieku ~7 tygodni.

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Karm myszy standardową dietą karm (patrz Tabela materiałów) przed i po operacji.
    UWAGA: Można stosować różne szczepy i wiek myszy. Jednak wiek od 5,5 do 12 tygodni jest zalecany, aby osiągnąć maksymalną częstość występowania.
  2. Każdej myszy należy podać podskórnie 5 mg/kg karprofenu na 30 minut przed indukcją znieczulenia.
  3. Po 30 minutach podać 100 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny we wstrzyknięciu dootrzewnowym w celu wywołania znieczulenia.

2. Przygotowanie do zabiegu

  1. Przygotuj materiał chirurgiczny.
    1. Pokrój rękawice nitrylowe na paski o wymiarach 4 cm x 4 mm. Pokrój waciki na kawałki o wymiarach 3 cm x 2 mm. Autoklaw je za pomocą innych narzędzi chirurgicznych, w tym nożyczek chirurgicznych, kleszczyków do tkanek i hemostatów Halsteda-Mosquito (patrz Tabela materiałów).
  2. Umieść mysz w pozycji leżącej na sterylnym chłonnym podkładzie opatrunkowym. Unieruchomij przednie i tylne łapy za pomocą taśmy chirurgicznej.
  3. Użyj aplikatorów z bawełnianą końcówką (patrz Tabela materiałów), aby przeczesać balsam do depilacji środkowej i dolnej części brzucha, a następnie przetrzyj obszar gazą chirurgiczną, aby usunąć włosy.
  4. Zdezynfekuj obszar operacyjny co najmniej trzy razy okrężnymi ruchami, naprzemiennie stosując 70% alkohol i peeling na bazie jodu lub chlorheksydyny. Pozostawić do wyschnięcia.

3. Zabieg chirurgiczny

  1. Wykonaj następujące czynności, aby uzyskać dostęp do jamy brzusznej.
    1. Przetestuj mysz pod kątem braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi przed nacięciem skóry.
    2. Wykonaj 2,5 cm podłużne nacięcie na skórze wzdłuż linii środkowej środkowej i dolnej części brzucha za pomocą nożyczek chirurgicznych.
    3. Delikatnie podciągnij leżący pod spodem mięsień i wykonaj 2,5 cm podłużne nacięcie wzdłuż linii białej, aby uzyskać dostęp do jamy brzusznej.
  2. Odsłoń aortę brzuszną.
    1. Użyj zwilżonych aplikatorów z bawełnianą końcówką, aby przesunąć jelita i żołądek na prawą stronę myszy.
      UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby odsłoniło to podnerkowy odcinek aorty. Jeśli aorta jest trudna do zlokalizowania, prawa nerka i prawa tętnica nerkowa mogą zidentyfikować aortę (ponieważ prawa nerka ma nieco niższą lokalizację anatomiczną niż lewa nerka).
    2. Za pomocą kleszczy delikatnie usuń tkankę łączną pokrywającą aortę brzuszną i żyłę główną dolną (IVC).
      UWAGA: Aorta brzuszna i IVC znajdują się w tej samej osłonie naczynia. Nie ma potrzeby usuwania całej tkanki łącznej, ponieważ całkowite usunięcie zwiększyłoby ryzyko uszkodzenia tych dwóch naczyń.
    3. Użyj kleszczy, aby delikatnie wypreparować tylną stronę aorty brzusznej i IVC z leżących poniżej mięśni.
      UWAGA: Końcówki kleszczy powinny wchodzić w tył pochewki poprzecznie i tworzyć otwór w powięzi, który łączy pochewkę z leżącymi poniżej mięśniami. Po wykonaniu otworu zwiększ jego rozmiar, powoli zwalniając kleszcze.
    4. Umieść kawałek paska rękawicy o wymiarach 4 cm x 4 mm (jak wspomniano wcześniej, krok 2.1.1) przez tylną stronę aorty brzusznej i IVC, a następnie wyprostuj pasek. Umieść pasek w odległości ~0,5 cm od prawej tętnicy nerkowej.
      UWAGA: Upewnij się, że otwór jest wystarczająco duży, aby otaczająca deska rozdzielcza nie skręcała paska.
    5. Nad paskiem umieść kawałek wacika o wymiarach 3 cm x 2 mm przez tylną część aorty brzusznej i IVC, a następnie wyprostuj wacik.
  3. Inkubować elastazę.
    1. Za pomocą pipety upuść 30 μl elastazy trzustkowej świni (całkowita aktywność enzymatyczna 1,8 jednostki, patrz Tabela materiałów) na segment aorty powyżej wacika, a następnie owiń wacik i pasek wokół aorty i IVC. Opłucz kawałek gazy o wymiarach 10 cm x 10 cm sterylnym 0,9% soli fizjologicznej i umieść go na brzuchu.
      UWAGA: Gaza wymaga tylko częściowego spłukania, ponieważ przesada groziłaby rozcieńczeniem elastazy znajdującej się pod spodem.
    2. Po 30 minutach usuń pasek i wacik za pomocą kleszczy.
  4. Zamknij jamę brzuszną, wykonując poniższe czynności.
    1. Przepłukać aortę i jamę brzuszną 500 μl jałowego 0,9% soli fizjologicznej. Użyj gazy o wymiarach 10 cm x 10 cm, aby wchłonąć pozostałą sól fizjologiczną.
    2. Zreagtymuj warstwy mięśni za pomocą niewchłanialnego szwu monofilamentowego 6-0.
    3. Zamknij skórę za pomocą 3-4 przerywanych 6-0 niewchłanialnych szwów monofilamentowych.

4. Opieka pooperacyjna

  1. Podawać 5 mg/kg karprofenu podskórnie w 1. dniu po operacji.
  2. Usuń szwy skórne w 10 dniu pooperacyjnym
    3. .

5. Pomiar średnicy tętniaka aorty brzusznej

  1. Poddaj myszy eutanazji przez przedawkowanie CO2 w 14. dniu po operacji. Reprezentuje to punkt czasowy maksymalnego dylatacji.
  2. Uzyskaj dostęp do jamy brzusznej zgodnie z opisem w kroku 3.1.
  3. Wykonaj perfuzję naczyniową, wstrzykując 10 ml 0,9% soli fizjologicznej do krążenia przez lewą komorę.
  4. Odsłonić podnerkowy odcinek aorty brzusznej zgodnie z opisem w krokach 3.1-3.2. Ostrożnie usuń otaczającą tkankę łączną i oddziel aortę brzuszną od IVC.
  5. Zmierz średnicę aorty brzusznej za pomocą suwmiarki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Łącznie dwadzieścia trzy 7-tygodniowe myszy dzikiego typu (WT), w tym 12 samic i 11 samców, zostało przebadanych zgodnie z przedstawionym protokołem. Wskaźnik przeżycia wynosił 100% (z wyłączeniem śmiertelności chirurgicznej). Maksymalną średnicę aorty brzusznej mierzono suwmiarką.

AAA zostało zdefiniowane jako rozszerzenie aorty brzusznej przy 50% wzroście średnicy naczynia. W związku z tym jako punkt odcięcia dla udanej indukcji AAA wybrano 50% wzrost maksymalnej średnicy aorty brzusznej. W ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model AAA indukowany elastazą został po raz pierwszy opisany przez Anidjara i wsp. na szczurach w 1990roku. W ciągu ostatnich trzydziestu lat wprowadzono wiele zmodyfikowanych wersji, a także znaczną poprawę technik chirurgicznych 19,20,21,22. Setki instytutów używają modeli AAA indukowanych elastazą jako drugiego najczęściej używanego modelu eksperymentalnego gryzoni w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Jednostce Medycyny Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Michigan za pomoc w karmieniu i hodowli zwierząt. Badanie to jest wspierane przez NIH RO1 HL138139, NIH RO1 HL153710 do J. Zhanga, NIH RO1 HL109946, RO1 HL134569 do Y.E. Chen oraz grant American Heart Association 20POST35110064 dla G. Zhao.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
6-0 niewchłanialny szew monofilamentowyPro AdvantageP420697
CarprofenZoetis Inc.NDC: 54771-8507
Chow DietLabDiet3005659-220PicoLab 5L0D
Dynarex4303
Podkładka bawełnianaRaelUPC: 810027130969
GraphPad Prism 8GraphPad Software Inc.Wersja 8.4.3
Kleszcze GrarfeNarzędzia do nauki11051-10
Hemotyty komarów HalstedNarzędzia naukowe13009-12
KetaminaPar PharmaceuticalNDC: 42023-0115-10
Rękawice nitryloweFisherbrand19-130-1597
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher15140122
Elastaza trzustkowa świniSigma-AldrichE1250-100MG
NożyczkiNarzędzia do nauki14068-12
Sterylny 0,9% roztwór soliBaxter2B1324X
XylazineAkorn NDC: 59399-110-20
Aplikator bawełniany

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kent, K. C. Clinical practice: Abdominal aortic aneurysms. The New England Journal of Medicine. 371 (22), 2101-2108 (2014).
  2. Karthikesalingam, A., et al. Mortality from ruptured abdominal aortic aneurysms: Clinical lessons from a comparison of outcomes in England and the USA. Lancet. 383 (9921), 963-969 (2014).
  3. Noel, A. A., et al. Ruptured abdominal aortic aneurysms: The excessive mortality rate of conventional repair. Journal of Vascular Surgery. 34 (1), 41-46 (2001).
  4. Lederle, F. A., et al. Rupture rate of large abdominal aortic aneurysms in patients refusing or unfit for elective repair. JAMA. 287 (22), 2968-2972 (2002).
  5. Kochanek, K. D., Xu, J., Murphy, S. L., Minino, A. M., Kung, H. C. Deaths: Final data for 2009. National Vital Statistics Reports. 60 (3), 1(2011).
  6. Daugherty, A., Cassis, L. A. Mechanisms of abdominal aortic aneurysm formation. Current Atherosclerosis Reports. 4 (3), 222-227 (2002).
  7. Quintana, R. A., Taylor, W. R. Cellular mechanisms of aortic aneurysm formation. Circulation Research. 124 (4), 607-618 (2019).
  8. Kuivaniemi, H., Ryer, E. J., Elmore, J. R., Tromp, G. Understanding the pathogenesis of abdominal aortic aneurysms. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 13 (9), 975-987 (2015).
  9. Trollope, A., Moxon, J. V., Moran, C. S., Golledge, J. Animal models of abdominal aortic aneurysm and their role in furthering management of human disease. Cardiovascular Pathology. 20 (2), 114-123 (2011).
  10. Patelis, N., et al. Animal models in the research of abdominal aortic aneurysms development. Physiological Research. 66 (6), 899-915 (2017).
  11. Senemaud, J., et al. Translational relevance and recent advances of animal models of abdominal aortic aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (3), 401-410 (2017).
  12. Lysgaard Poulsen, J., Stubbe, J., Lindholt, J. S. Animal models used to explore abdominal aortic aneurysms: A systematic review. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 52 (4), 487-499 (2016).
  13. Tsui, J. C. Experimental models of abdominal aortic aneurysms. Open Cardiovascular Medicine Journal. 4, 221-230 (2010).
  14. Manning, M. W., Cassi, L. A., Huang, J., Szilvassy, S. J., Daugherty, A. Abdominal aortic aneurysms: Fresh insights from a novel animal model of the disease. Vascular Medicine. 7 (1), 45-54 (2002).
  15. Chiou, A. C., Chiu, B., Pearce, W. H. Murine aortic aneurysm produced by periarterial application of calcium chloride. Journal of Surgical Research. 99 (2), 371-376 (2001).
  16. Allaire, E., Guettier, C., Bruneval, P., Plissonnier, D., Michel, J. B. Cell-free arterial grafts: Morphologic characteristics of aortic isografts, allografts, and xenografts in rats. Journal of Vascular Surgery. 19 (3), 446-456 (1994).
  17. Anidjar, S., et al. Elastase-induced experimental aneurysms in rats. Circulation. 82 (3), 973-981 (1990).
  18. Sun, J., et al. Mast cells modulate the pathogenesis of elastase-induced abdominal aortic aneurysms in mice. Journal of Clinical Investigation. 117 (11), 3359-3368 (2007).
  19. Bhamidipati, C. M., et al. Development of a novel murine model of aortic aneurysms using peri-adventitial elastase. Surgery. 152 (2), 238-246 (2012).
  20. Pyo, R., et al. Targeted gene disruption of matrix metalloproteinase-9 (gelatinase B) suppresses development of experimental abdominal aortic aneurysms. Journal of Clinical Investigation. 105 (11), 1641-1649 (2000).
  21. Tanaka, A., Hasegawa, T., Chen, Z., Okita, Y., Okada, K. A novel rat model of abdominal aortic aneurysm using a combination of intraluminal elastase infusion and extraluminal calcium chloride exposure. Journal of Vascular Surgery. 50 (6), 1423-1432 (2009).
  22. Busch, A., et al. Four surgical modifications to the classic elastase perfusion aneurysm model enable haemodynamic alterations and extended elastase perfusion. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 56 (1), 102-109 (2018).
  23. Liang, W., et al. KLF11 protects against venous thrombosis via suppressing tissue factor expression. Thrombosis and Haemostasis. , (2021).
  24. Marinov, G. R., et al. Can the infusion of elastase in the abdominal aorta of the Yucatan miniature swine consistently produce experimental aneurysms. Journal of Investigative Surgery. 10 (3), 129-150 (1997).
  25. Shannon, A. H., et al. Porcine model of infrarenal abdominal aortic aneurysm. Journal of Visualized Experiments. (153), e60169(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model indukowany elastazmodel t tniaka u myszyoko onaczyniowa aplikacja elastazydegradacja ciany aortypodnerkowa aorta brzusznaelastaza trzustkowa winiprotok chirurgiczny dla myszytechnika izolacji aortytempo formowania t tniaka

Powiązane artykuły