Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie i charakterystyka biohybrydowego biotuszu hydrożelowego 3D na bazie grafenu do neuroinżynierii obwodowej

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63622

⸱

16 maja 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vocational School of Health Services, Istinye University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell, and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Vocational School of Health Services, Altinbas University, 7The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 8Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

W tym manuskrypcie demonstrujemy przygotowanie biohybrydowego hydrożelowego biotuszu zawierającego grafen do użycia w inżynierii tkanek obwodowych. Za pomocą tego biohybrydowego materiału 3D przeprowadzany jest protokół różnicowania neuronalnego komórek macierzystych. Może to być ważny krok w kierunku wprowadzenia podobnych biomateriałów do kliniki.

Streszczenie

Neuropatie obwodowe mogą wystąpić w wyniku uszkodzenia aksonów, a czasami z powodu chorób demielinizacyjnych. Uszkodzenie nerwów obwodowych jest globalnym problemem, który występuje u 1,5%-5% pacjentów w nagłych wypadkach i może prowadzić do znacznej utraty pracy. Obecnie podejścia oparte na inżynierii tkankowej, składające się z rusztowań, odpowiednich linii komórkowych i biosygnałów, stały się bardziej przydatne wraz z rozwojem technologii trójwymiarowego (3D) biodruku. Połączenie różnych biomateriałów hydrożelowych z komórkami macierzystymi, egzosomami lub cząsteczkami biosygnalizacyjnymi jest często badane w celu przezwyciężenia istniejących problemów związanych z regeneracją nerwów obwodowych. W związku z tym produkcja systemów iniekcyjnych, takich jak hydrożele lub wszczepialne struktury przewodów utworzone różnymi metodami biodruku, zyskała na znaczeniu w neuroinżynierii obwodowej. W normalnych warunkach komórki macierzyste są komórkami regeneracyjnymi organizmu, a ich liczba i funkcje nie zmniejszają się z czasem, aby chronić ich populacje; Nie są to wyspecjalizowane komórki, ale mogą różnicować się po odpowiedniej stymulacji w odpowiedzi na uraz. System komórek macierzystych znajduje się pod wpływem swojego mikrośrodowiska, zwanego niszą komórek macierzystych. W uszkodzeniach nerwów obwodowych, zwłaszcza w neurotmesis, tego mikrośrodowiska nie można w pełni uratować nawet po chirurgicznym związaniu ze sobą zerwanych zakończeń nerwowych. Podejście oparte na biomateriałach kompozytowych i łączonych terapiach komórkowych zwiększa funkcjonalność i możliwości zastosowania materiałów pod względem różnych właściwości, takich jak biodegradowalność, biokompatybilność i przetwarzalność. W związku z tym badanie to ma na celu zademonstrowanie przygotowania i zastosowania biohybrydowego modelowania hydrożelu na bazie grafenu oraz zbadanie skuteczności różnicowania komórek macierzystych w komórki nerwowe, które mogą być skutecznym rozwiązaniem w regeneracji nerwów.

Wprowadzenie

Układ nerwowy, który jest mechanizmem łączącym wewnętrzną strukturę organizmu i środowiska, dzieli się na dwie części: centralny i obwodowy układ nerwowy. Uszkodzenie nerwów obwodowych jest globalnym problemem, który stanowi 1,5%-5% pacjentów, którzy zgłaszają się na oddział ratunkowy i rozwija się z powodu różnych urazów, prowadząc do znacznej utraty pracy1,2,3.

Dzisiaj bardzo interesujące są podejścia komórkowe do neuroinżynierii obwodowej. Komórki macierzyste zajmują pierwsze miejsce wśród komórek stosowanych w tych podejściach. W normalnych warunkach komórki macierzyste są komórkami regeneracyjnymi organizmu, a ich liczba i funkcje nie zmniejszają się z czasem, aby chronić ich populacje; Komórki te są wyspecjalizowane, ale mogą różnicować się po odpowiedniej stymulacji w odpowiedzi na uraz4,5. Zgodnie z hipotezą komórek macierzystych, układ komórek macierzystych znajduje się pod wpływem swojego mikrośrodowiska, zwanego niszą komórek macierzystych. Zachowanie i różnicowanie komórek macierzystych jest niemożliwe bez obecności ich mikrośrodowiska6, które można odtworzyć za pomocą inżynierii tkankowej przy użyciu komórek i rusztowań7. Inżynieria tkankowa to multidyscyplinarna dziedzina, która obejmuje zarówno zasady inżynierii, jak i biologii. Inżynieria tkankowa dostarcza narzędzi do tworzenia sztucznych tkanek, które mogą zastąpić żywe tkanki i mogą być wykorzystywane do regeneracji tych tkanek poprzez usuwanie uszkodzonych tkanek i dostarczanie funkcjonalnych tkanek8. Rusztowania tkankowe, jeden z trzech filarów inżynierii tkankowej, są produkowane przy użyciu różnych metod z materiałów naturalnych i syntetycznych9. Druk trójwymiarowy (3D) to rozwijająca się technologia wytwarzania przyrostowego, która jest szeroko stosowana do zastępowania lub przywracania uszkodzonych tkanek poprzez prostą, ale wszechstronną produkcję skomplikowanych kształtów przy użyciu różnych metod. Bioprinting to metoda wytwarzania przyrostowego, która umożliwia współistnienie komórek i biomateriałów, zwanych bioinks10. Biorąc pod uwagę wzajemne oddziaływanie komórek nerwowych, badania przeniosły się na kandydatów na biomateriały przewodzące, takie jak grafen. Nanopłytki grafenowe, które mają takie właściwości, jak elastyczna elektronika, superkondensatory, baterie, optyka, czujniki elektrochemiczne i magazynowanie energii, są preferowanym biomateriałem w dziedzinie inżynierii tkankowej11. Grafen został wykorzystany w badaniach, w których przeprowadzono proliferację i regenerację uszkodzonych tkanek i narządów12,13.

Inżynieria tkankowa składa się z trzech podstawowych elementów budulcowych: rusztowania, komórek i cząsteczek biosygnału. W badaniach nad uszkodzeniem nerwów obwodowych występują braki w zakresie całkowitego zapewnienia tych trzech struktur. W biomateriałach produkowanych i wykorzystywanych w badaniach napotkano różne problemy, takie jak zawieranie przez nie wyłącznie komórek macierzystych lub cząsteczek biosygnałowych, brak bioaktywnej cząsteczki, która umożliwiłaby różnicowanie komórek macierzystych, brak biokompatybilności zastosowanego biomateriału oraz niewielki wpływ na proliferację komórek w niszy tkankowej, W związku z tym przewodnictwo nerwowe nie jest w pełni realizowane2,13,14,15,16. Wymaga to optymalizacji regeneracji nerwów, zmniejszenia atrofii mięśni17,18, oraz stworzenia niezbędnego homingu19 z czynnikami wzrostu przeciwko takim problemom. W tym momencie bardzo ważna jest charakterystyka i analiza neuroaktywności prototypu biomateriału chirurgicznego, który ma zostać przeniesiony do kliniki.

W związku z tym, ta metoda badania bada wzór hydrożelu biotuszu z nanopłytkami grafenowymi utworzonymi przez biodrukarkę 3D i jego skuteczność w neurogennym różnicowaniu komórek macierzystych, które zawiera. Badane są również wpływ grafenu na tworzenie i różnicowanie neurosfery.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych z galaretki Whartona

  1. Wyjąć mezenchymalne komórki macierzyste z galaretki Whartona (WJ-MSCs, z ATCC) z zamrażarki o temperaturze −80 °C. Hodować WJ-MSCs w pożywce DMEM-F12 zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% Pen-Strep oraz 1% L-glutaminy w sterylnym przepływie laminarnym w temperaturze pokojowej, zgodnie z opisem Yurie i wsp.20.
  2. Kriokonserwować część komórek w stężeniu 1 x 106 cells/mL w medium do zamrażania zawierającym 35% FBS, 55% DMEMF-12 oraz 10% dimetylosulfotlenku (DMSO). W tym celu odliczyć 1 x 106 komórek za pomocą komory Thomy i dodać kroplowo roztwór do zamrażania. Szybko przenieść próbkę do pojemnika z ciekłym azotem.
  3. Gdy hodowane komórki osiągną 80% konfluencji w kolbie, odlać pożywkę i przemyć 5 mL PBS. Dodać 5 mL 0,25% trypsyny i 2,21 mM EDTA-4Na. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 5 min.
  4. Do komórek wyjętych z inkubatora dodać 10 mL pożywki DMEM-F12 z 10% FBS. Dokładnie zawiesić, zebrać pożywkę i przenieść ją do probówki wirówkowej.
  5. Wirować przy prędkości 101 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Odrzucić nadsącz i ponownie zasiać komórki w nowych kolbach ze świeżą pożywką odżywczą zawierającą 10% FBS.
    UWAGA: W celu lepszej wizualizacji powstających oddziaływań między biomateriałem a komórkami można zastosować komercyjne WJ-MSCs oznakowane genem GFP metodą transdukcji21. Grupy do wykorzystania w tej metodzie można utworzyć zgodnie z Tabelą 1.

Utworzone grupyPowody utworzeniaLiczba powtórzeń
2D WJ-MSCs (2D-C)Kontrola 2Dx 5
2D WJ-MSC & Grafen (2D-G)Wyznaczanie dawki toksycznej grafenu w 2D5 powtórzeń dla każdego z różnych stężeń
WJ-MSCs są zawarte w biotuszach (3D-B)Kontrola 3Dx 3
mezenchymalne komórki macierzyste z Wharton-Jerde (WJ-MSCs) & Do biotuszów włączono 0,1% grafenu (3D-G)Grupa biohybrydowa 3D z bioatramentu grafenowegox 3
WJ-MSC występują w formie sferoidów w bioatramentach (3D-BS)Trójwymiarowa kontrola kształtu sferoidówx 3
MSC z żurka pępowinowego & 0,1% grafenu w formie sferoidów w bioatramentach (grupa 3D-GS)Biohybrydowa grupa sferoidów w formie 3D z biotuszu grafenowegox3
Kropla biotuszu 3DJest on wytwarzany w celu przeprowadzenia analizy charakterystyki metodami SEM i FTIR.x5
Kropla grafenu 3DJest on wytwarzany w celu przeprowadzenia analizy charakteryzacyjnej metodami SEM i FTIR.x5
Bioatrament 3D z WJ-MSC znakowanymi GFP & 0.1%Obserwacja ruchów WJ-MsCs w bioatuszu zawierającym odpowiednią dawkę grafenu.x3

Tabela 1. Grupy w metodzie. Uwzględniono wszystkie grupy 2D i 3D zastosowane w metodzie.

2. Toksyczność grafenu i obrazowanie 2D

  1. Przygotowanie stężeń grafenu i aplikacja do komórek
    UWAGA: Surowe nanocząsteczki grafenu zostały zakupione komercyjnie (typ nanopłytek grafenowych przemysłowych), a także przekazane jako darowizna. Wymiary cząsteczek wynosiły 5-8 nm grubości, 5 µm średnicy oraz 120-150 m2/g powierzchni właściwej.
    1. Odważyć grafen w celu przygotowania 1% roztworu (mg/mL). Przygotować roztwór zapasowy, dodając 10 mL pożywki DMEMF-12 z 10% FBS do odważonych 100 µg nanocząsteczek grafenu i oznaczyć go jako roztwór zapasowy. Sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C pod ciśnieniem 1,5 atm przez 20 min.
      UWAGA: Sterylna mieszanina grafenu jest przechowywana w lodówce w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Może być ona nieprzydatna do długotrwałego stosowania (maksymalnie 1 miesiąc). W takich przypadkach mieszaninę należy ponownie przygotować i wysterylizować.
    2. Przygotować mieszaninę pożywki z grafenem o różnych stężeniach w celu określenia dawek nietoksycznych. Ustalić rozcieńczenia początkowe na poziomie 1%, 0,1%, 0,01%, 0,001% i 0,0001% grafenu/pożywki.
    3. Zaczynając od 1% roztworu zapasowego, pobrać kolejno 1 mL z każdego stężenia i przenieść do nowej probówki. Do każdej probówki dodać 9 mL pożywki DMEMF-12 z 10% FBS, tworząc pięć stopniowo rozcieńczonych próbek, a następnie wymieszać roztwory za pomocą wstrząsania i wortexowania, aby uzyskać równomierny rozkład. Jako kontrolę zastosować wyłącznie 10 mL pożywki DMEMF-12 z 10% FBS.
      UWAGA: Ciężkie płatki grafenu osadzają się, w związku z czym wymagają ponownego wymieszania.
    4. Wysiać WJ-MSCs na płytki 6-dołkowe z 2 mL świeżej pożywki zawierającej 10% FBS w zagęszczeniu 5 x 105 komórek na dołek. Inkubować przez 1 dzień w temperaturze 37 °C. Następnie podzielić płytki na grupy o równej liczbie powtórzeń. Wykonać pięć powtórzeń dla każdego stężenia.
    5. Usunąć pożywkę, a następnie zastąpić ją pożywką z grafenem o odpowiednich stężeniach w ilości 2 mL na dołek. W grupie kontrolnej zastosować samą pożywkę. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 24 h.
  2. Wyznaczenie nietoksycznych stężeń grafenu za pomocą testu MTT
    1. Po 24 h usunąć pożywki z grafenem. Przemyć każdy dołek PBS. Dodać 2 mL świeżej pożywki DMEMF-12 z 10% FBS na dołek.
      UWAGA: Ważne jest przemycie PBS po aplikacji stężeń grafenu na komórki, ponieważ nanocząsteczki grafenu, które nie zostały pobrane do wnętrza komórek drogą endocytozy, zostaną usunięte z otoczenia. Zwiększa to efektywność testu MTT.
    2. Zastosować protokół MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-difenylotetrazoliumu) w celu wyznaczenia wartości IC50 wskazującej na 50% żywotności komórek, zgodnie z opisem w Kose et al.22 oraz w krokach 2.2.3.-2.2.6.
    3. Najpierw odważyć sól MTT w stężeniu 5 mg/mL i rozpuścić w PBS. Sterylizować za pomocą filtra 0,45 µm. Roztwór MTT przygotowany w 15 mL probówce wirówkowej owinąć folią aluminiową i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    4. Dodać 10 µL MTT do wszystkich dołków i inkubować płytkę przez 4 h w temperaturze 37 °C. Po inkubacji zaobserwować tworzenie się kryształów formazanu przy powiększeniu 10x pod mikroskopem.
    5. Aby rozpuścić kryształy powstałe w komórkach, dodać 100 µL DMSO do każdego dołka i wymieszać poprzez pipetowanie. Przechowywać płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 min. Włożyć płytkę do czytnika płytek ELISA. W programie ustawić długość fali 570 nm do pomiaru absorbancji i odczytać płytkę22.
      UWAGA: Dodatkowo, podczas gdy same cząsteczki grafenu są odczytywane przy 270 nm23, zakres odczytu 570 nm24 zostanie tutaj zastosowany wyłącznie do pomiaru żywotności komórek.
    6. Przeprowadzić analizę statystyczną uzyskanych wyników za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem Tukeya w programie do analizy statystycznej.
  3. Obrazowanie mozaikowe (stitch imaging)
    1. Aby zbadać interakcję różnych stężeń grafenu z komórkami, przeprowadzić obrazowanie time-lapse komórek metodą zwaną stitch imaging. Metoda ta tworzy obraz time-lapse przy użyciu próbek obrazów pobieranych w regularnych odstępach czasu pod mikroskopem.
    2. W tym celu najpierw włączyć komputer. Włączyć inkubator do obrazowania time-lapse i ustawić temperaturę 37 °C. Umieścić płytkę MTT w slocie inkubatora time-lapse.
    3. Otworzyć program Stitch na komputerze. Określić w systemie dołki, które mają zostać odczytane. Przesunąć czytnik do pierwszego dołka, zlokalizować i ustawić ostrość obszaru przy powiększeniu 10x w świetle białym. Uruchomić program.
      UWAGA: Jest to program do tworzenia wysokiej jakości wielofotograficznych kolaży o układzie 4 rzędów x 5 kolumn. Program łączy zdjęcia wykonane sekwencyjnie w jakości HD. Po naciśnięciu przycisku start systemu dołki są odczytywane automatycznie, a system wykonuje i składa w mozaikę zdjęcia w układzie 4 rzędów x 5 kolumn.

3. Produkcja biohybrydowego hydrożelu z grafenu i bioatramentu oraz różnicowanie WJ-MSCs

  1. Produkcja bioatramentów
    UWAGA: Jako baza bioatramentów wykorzystywane są liofilizowane, dostępne komercyjnie proszki alginianowo-żelatynowe (3:5). Grupę bioatramentu z grafenem (3D-G; 3D-GS) oraz grupę kontrolną bioatramentu bez grafenu (3D-B; 3D-BS) przygotowuje się tą samą metodą (Tabela 1).
    1. Do przygotowania należy użyć stożkowych probówek o pojemności 50 mL. Najpierw odważ 4,5 mg alginianu i 1,5 mg żelatyny, a następnie przenieś je do probówki wirówkowej. Do mieszaniny dodaj pożywkę DMEMF-12 zawierającą 10% FBS do uzyskania całkowitej objętości 50 mL. Jest to grupa kontrolna (C) bez grafenu.
    2. Powtórz odważanie 4,5 mg alginianu i 1,5 mg żelatyny i przenieś je do probówki wirówkowej. Następnie pobierz 50 µL przygotowanego 0,1% grafenu z kroku 2.1.3. i dodaj go do probówki. Dodaj DMEMF-12 z 10% FBS do całkowitej objętości 50 mL.
    3. Bioatramenty wymieszaj najpierw za pomocą pipetowania, a następnie w wirówce typu vortex. Sterylizuj w autoklawie w temperaturze 121 °C pod ciśnieniem 1,5 atm przez 20 min. Alternatywnie przeprowadź sterylizację w kuchence mikrofalowej do momentu osiągnięcia temperatury wrzenia.
    4. Po autoklawowaniu mieszanin wiruj je przy 280 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej, aby usunąć powstałe pęcherzyki powietrza. Przechowuj bioatramenty w temperaturze 37 °C do czasu przygotowania komórek.
  2. Dodanie WJ-MSCs i biodruk 3D
    1. W celu policzenia komórek, przy 80% konfluencji przemyj je około 5 mL PBS i dodaj 5 mL 0,25% trypsyny oraz 2,21 mM EDTA 4Na. Pozostaw na 5 min w temperaturze 37 °C.
    2. Po wyjęciu z inkubatora dodaj do komórek 10 mL pożywki DMEM-F12 z 10% FBS. Dobrze zawieś, zbierz pożywkę i przenieś ją do probówki wirówkowej. Wiruj przy 101 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej, a następnie odlej nadsącz.
    3. Pozostaw około 250 µL pożywki z osadem. Ponownie rozpuść osad w 1 mL świeżej pożywki. Do 48 µL pożywki dodaj 2 µL zawiesiny komórkowej i 50 µL błękitu trypanu (0,4 g błękitu trypanu/100 mL) w probówce stożkowej (1,5 mL) w celu policzenia komórek4. Dobrze wymieszaj za pomocą pipety.
    4. Dodaj około 10 mL przygotowanej zabarwionej zawiesiny komórkowej do komory licznikowej Thommy. Oblicz średnią liczbę komórek przypadających na pola po obu stronach mikroskopu świetlnego.
      Oblicz procent żywotności (%) = (liczba policzonych żywych komórek/całkowita liczba policzonych komórek) x 100
      UWAGA: Interakcję komórka-bioatrament bada się na dwa sposoby: (1) poprzez dodanie komórek do bioatramentów przed drukiem (3D-B; 3D-G); (2) poprzez wysianie komórek na bioatramenty po ich wydrukowaniu, co prowadzi do formowania się sferoidów (3D-BS; 3D-GS).
    5. W celu zbadania interakcji komórka-bioatrament, najpierw przygotuj grupy bioatramentów (Tabela 1). Grupa 1 obejmuje 3D-B i 3D-G wydrukowane z bioatramentu do biodruku. Grupa 2 obejmuje bioatramenty 3D-BS i 3D-GS, na których po biodruku formowały się sferoidy.
    6. Policz komórki dla grupy 1 tak, aby w 0,5 mL pożywki znajdowało się około 1 x 107 komórek. Dodaj 4,5 mL bioatramentu, aby uzyskać całkowitą objętość 5 mL. Przenieś zawiesinę do kartridży w komorze sterylnej za pomocą strzykawek. Zainstaluj kartridże w odpowiedniej sekcji ekstrudera biodrukarki.
    7. Dla drugiej grupy pobierz 5 mL z każdej grupy bioatramentu i przenieś je do sterylnych kartridży za pomocą injektora.
    8. Użyj biodrukarki z dwiema koaksjalnymi głowicami drukującymi i technologią ekstruzji napędzanej pneumatycznie. Ustaw rozdzielczość X/Y/Z na mikrokrok 1,25 µm, szerokość ekstruzji na 400 µm i wysokość ekstruzji na 200 µm. Kratka o wymiarach 20 mm x 20 mm x 5 mm jest jednym z najczęściej stosowanych modeli 3D w pracach nad biodrukiem 3D.
    9. Stwórz modele 3D przy użyciu darmowych, internetowych programów CAD. Przed biodrukiem stwórz proste modele 3D na jednej z platform open-source (np. wypełnienie/infill). Model może być liniowy (jak model użyty w tej pracy), plastromiodowy lub w kształcie kratki. Po stworzeniu kwadratu o wymiarach 5 mm x 20 mm x 20 mm wyeksportuj i pobierz plik w formacie .stl.
    10. Oprogramowanie biodrukarki wykorzystuje pliki .stl i konwertuje je na format .gcode możliwy do wydruku za pomocą modułów slicera. Aby uzyskać kształt kratki nadający się do druku, wyłącz zewnętrzną powłokę w module slicera. Przed uruchomieniem przetrzyj urządzenie 70% etanolem, a następnie przeprowadź sterylizację UV.
    11. W procesie biodruku przenieś grupy bioatramentów do kartridży za pomocą injektora. Zainstaluj kartridże w odpowiedniej sekcji ekstrudera biodrukarki.
    12. Ustaw średnie ciśnienie drukarki 3D na 7,5 psi oraz temperaturę kartridża i stołu na 37 °C. Ustaw prędkość na 60% i przeprowadź standardowy proces druku 3D.
      UWAGA: Zaplanowanie przygotowanych modeli z wolnymi przestrzeniami (jak w modelu liniowym) pozwala na prowadzenie hodowli komórkowej w tych przestrzeniach po biodruku.
    13. Przed fazą druku ustaw system w pozycji domyślnej. Automatycznie spozycjonuj osie (X, Y, Z), wybierz ekstruder i zatwierdź. Rozpocznij proces drukowania. Po zakończeniu biodruku pobierz próbkę i umieść ją w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    14. Po druku spryskaj bioatramenty roztworem 0,1 N CaCl2 lub dodaj 1 mL roztworu za pomocą pipety w temperaturze pokojowej. Odczekaj około 10-20 s i przemyj wydrukowane wzory 2x PBS zawierającym Ca2+ i Mg2+.
    15. Dodaj 2 mL pożywki DMEMF-12 z 10% FBS na każdą z grup bioatramentów zawierających komórki. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przy 5% CO2. Następnie dodaj 2 mL pożywki zawiesinowej zawierającej 1 x 106 komórek do każdej grupy w celu formowania sferoidów.
    16. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przy 5% CO2. Po 24 h inkubacji obserwuj formowanie sferoidów pod mikroskopem odwróconym.
  3. Różnicowanie WJ-MSCs w kierunku komórek neuronopodobnych
    1. Obserwuj i fotografuj wszystkie partie bioatramentu po 24 h inkubacji. Dodaj 2 mL pożywki do różnicowania neurogennego na każdą studzienkę (z wyjątkiem grupy kontrolnej) i odświeżaj ją co 2 dni. Obserwuj różnicowanie neuronalne przez 7 dni.

4. Charakterystyka biohybrydowego hydrożelu z bioatramentu grafenowego

UWAGA: W celu charakterystyki biohybrydowego hydrożelu z biotuszu grafenowego przeprowadzono obrazowanie time-lapse, spektroskopię w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT/IR) oraz analizę za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Próbki do analiz FT/IR i SEM zostały przygotowane z grup biotuszy 3D-B i 3D-G metodą kroplowania.

  1. Analiza FT/IR
    UWAGA: FT/IR jest chemiczną metodą analityczną opartą na matematycznej transformacie Fouriera, niezbędną do charakterystyki materiałów. Należy użyć urządzenia FT/IR opartego na zasadach interferometru Michelsona w 28 °C, z lampą halogenową, chłodzonym wodą źródłem światła rtęciowego, stossem sygnału 4 cm−1, pomiarem trwającym 1 min, przy 2,200 cm−1.
    1. Przygotować mikroskop FT/IR i upewnić się, że optyka instrumentu jest wyrównana. Skalibrować urządzenie.
    2. Ponieważ próbka ma postać kropli, należy pobrać fragment hydrożelu o grubości 1-2 mm i umieścić go pęsetą w części przeznaczonej na próbkę. Ustawić ostrość na próbce i podnosić ją, aż do uzyskania bliskiego kontaktu. Zebrać widmo próbki, uruchamiając proces w systemie.
  2. Analiza za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)
    UWAGA: Morfologię powierzchni, strukturę wewnętrzną, rozkład komórek oraz interakcje bioatramentu z komórkami można badać za pomocą analizy SEM w różnych wymiarach.
    1. Nanieść hydrożel do płytek 6-dołkowych zawierających 1 mL sieciującego CaCl2, stosując metodę kroplowania z końcówki pipety (patrz Rysunek 1).
    2. Przemyć płytki 2x około 1 mL PBS, aby usunąć z roztworu sole. Następnie, przy pomocy pęsety, przenieść te krople do probówki typu Falcon zawierającej 5 mL 5% paraformaldehydu.
    3. Przygotować cienkie przekroje z kropli bioatramentu za pomocą skalpela. Przykleić próbki stroną lepką do płytki metalowej. Włożyć do urządzenia do napylania, w którym złoto-pallad, przechodzący w fazę plazmy po zastąpieniu powietrza gazem argonem, pokrywa próbkę.
    4. Umieścić w mikroskopie elektronowym (SEM). Otworzyć program mikroskopu, z którym połączony jest SEM. Wykonać skalowanie i wykonać zdjęcia różnych części próbki. W tym protokole zastosowano skale 5 µm, 10 µm i 200 µm. Dla grup 3D-B i 3D-G wykonano łącznie 40 zdjęć.
  3. Obrazowanie time-lapse
    UWAGA: Podczas obrazowania time-lapse stosowano nie tylko próbki bioatramentu zawierające komórki z transformowanym genem GFP, ale obrazowano również bioatramenty ze sferoidami przez 16 h. Obrazowanie time-lapse wykonuje się w celu zbadania wpływu grafenu na komórki macierzyste oraz monitorowania interakcji komórkowych wewnątrz bioatramentu.
    1. Dodać komercyjnie dostępne 1 x 107 MSCs znakowanych GFP do 5 mL bioatramentu i wydrukować biologicznie zgodnie z krokiem 3.2.11. Dodać 1 mL sieciującego, pozostawić na 20-30 s i przemyć 2x PBS.
    2. Włączyć monitor time-lapse i otworzyć program na komputerze. Ustawić około 16 h w trybie Time-Lapse i ustawić temperaturę na 37 °C. Nacisnąć przycisk Start. System zarejestruje materiały wideo w formie 40-sekundowych próbek wideo time-lapse.
    3. Ustawiać ostrość mikroskopu przy powiększeniu 10x co 2 h. Należy również zwizualizować sferoidy, postępując zgodnie z tymi samymi krokami.

Formowanie hydrożelu w szalce Petriego, kształty kulek, pokazana manipulacja pęsetą, eksperyment naukowy.
Rycina 1: Grupy biotuszy 3D-B i 3D-G przygotowane w formie kropel do celów charakterystyki. (A) Próbki biotuszy (obraz przed charakterystyką) na płytce z sieciujączym. (B) Obraz kropli biotuszu 3D-B. (C) Obraz kropli biotuszu 3D-G. Biomateriał przeznaczony do charakterystyki oraz zawarte w nim komórki mogą w łatwiejszy sposób przejść przez procesy takie jak napylanie złotem, pobieranie próbek itp. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

5. Określanie różnicowania neurogennego metodą immunobarwienia

  1. Zebrać sferoidy, nie naruszając ich formy, i ponownie wysiać do nowych płytek w celu ponownego barwienia metodą łatwiejszą niż zatapianie w parafinie do sekcjonowania tkanek.
  2. Przykryć płytki 48-dołkowe około 20 mL uprzednio autoklawowanego 0,1% roztworu żelatyny i pozostawić w inkubatorze na co najmniej 1 h. Pipetować około 500 µL przygotowanej 0,1% żelatyny do dołków płytki 48-dołkowej. Pozostawić płytki z żelatyną w inkubatorze na 10 min.
    UWAGA: Pozwoli to żelatynie lekko napęcznieć, pokryć powierzchnię i stworzyć lepsze środowisko do przylegania zebranych sferoidów.
  3. Zebrać sferoidy za pomocą pipety, rozdzielić zebrane sferoidy z inkubatora do dołków płytki 48-dołkowej i dodać świeżą pożywkę. Następnie inkubować przez 12-24 h.
    UWAGA: Rozdzielenie sferoidów poprzez ich odliczanie jest dość trudne. Należy zebrać sferoidy do jednej probówki i równomiernie rozdzielić całkowitą objętość do dołków. W niniejszym badaniu każdy dołek zawierał około 4-6 sferoidów.
    UWAGA: W przypadku próbek 2D wystarczy płukanie przed barwieniem, a wymiana pożywki nie jest wymagana.
  4. Usunąć pożywkę i powoli przemyć komórki PBS, ponieważ sferoidy będą znajdować się na górze. Utrwalić w 4% paraformaldehydzie przez 2 h.
  5. Ponownie przemyć próbki PBS i blokować za pomocą około 10 mL 2% BSA i 0,1% TritonX przez 30 min. Następnie przemyć PBS 3x.
  6. Rozcieńczyć wybrane przeciwciała pierwszorzędowe (N-cadherin-rabbit oraz β-III tubulin-mouse) w stosunku 1:100 w odczynniku rozcieńczającym przeciwciała. Dodać 100 µL roztworu przeciwciał do każdej z próbek i inkubować przez noc w 4 °C.
  7. Przemyć próbki 3x PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min z przeciwciałem wtórnym anti-mouse IgG-FTIC-rabbit dla β-III tubulin oraz anti-mouse IgG-SC2781-goat dla N-Cad rozcieńczonym 1:200. Wszystkie czynności wykonywać w ciemności.
    UWAGA: Niezależnie od tego, jaki szczep zostanie użyty jako przeciwciało pierwszorzędowe (np. mysi) w barwieniu podwójnym, do przeciwciała wtórnego należy użyć innego szczepu (np. koziego lub króliczego).
  8. Przemyć przeciwciała wtórne PBS 3x, a następnie nanieść kroplowo roztwór DAPI (1:1) do każdej z próbek. Odczekać 15-20 min. Wykonać obrazowanie immunofluorescencyjne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Toksyczność grafenu i obrazowanie 2D
Analizę statystyczną uzyskanych wyników testu MTT przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem Tukeya w oprogramowaniu do analizy statystycznej, a otrzymany wykres przedstawiono na Rysunku 2. Procent przeżywalności w obecności grafenu w porównaniu z grupą kontrolną wykazał istotny spadek jedynie dla stężenia grafenu 0,001% (**p < 0,01). Między pozostałymi grupami a grupą kontrolną nie stwierdzono ist...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zalety zabiegów stosowanych za pomocą inżynieryjnych rusztowań 3D w porównaniu z konwencjonalnymi metodami 2D stają się z dnia na dzień coraz bardziej zauważalne. Komórki macierzyste stosowane samodzielnie w tych terapiach lub wraz z rusztowaniami wytwarzanymi z różnych biomateriałów o niskiej biokompatybilności i biodegradowalności są zwykle niewystarczające w regeneracji nerwów obwodowych. Mezenchymalne komórki macierzyste Whartona (WJ-MSC) wydają się być odpowiednim kandydatem na linię komórkową, zwłaszcza biorąc pod ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów. Projekt został zrealizowany we współpracy z firmą HD Bioink, twórcą technologii biodruku 3D.

Podziękowania

Gracen użyty w tym badaniu został opracowany na Wydziale Inżynierii Mechanicznej Uniwersytetu Kirklareli. Został on podarowany przez dr Karabeyoğlu. Test toksyczności grafenu został sfinansowany ze środków projektu pt. "Printing and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells on 3D Bioprinters with Graphene Doped Bioinks" (nr wniosku: 1139B411802273) realizowanego w ramach TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented Undergraduate Thesis Support Program. Druga część badania została wsparta przez fundusz badawczy zapewniony przez Projekty Naukowo-Badawcze Uniwersytetu Technicznego Yildiz (TSA-2021-4713). Mezenchymalne komórki macierzyste z GFP wykorzystywane w obrazowaniu poklatkowym zostały przekazane przez firmę Virostem Biotechnology. Autorzy dziękują Darıcı LAB i zespołowi YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB za owocne dyskusje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze

Odśrodkowy		HitachiStosowany w hodowli komórkowej i etapie biomateriału
0,1N CaCl2HD BioinkUżywany do sieciowania
0,22 i mikro; m filtr membranowyAι sι Używany do sterylizacji
0,45 i mikro; m filtr strzykawkowyAι sι Używany do sterylizacji
1,5 ml stożkowarurka EppendorfaUżywany do kropli biotuszu
komórek
50 ml probówka FalconGniazdoUżywane w etapie hodowli komórkowej
Płytki 6/24/48/96 dołków (Falcon, mikropłytki TPP)Merck MilliporeUżywane w etapie hodowli komórkowej
Kolby do hodowli komórkowych o powierzchni 75 cm2 (Falcon, kolby do hodowli tkankowej TPPGniazdoUżywane do hodowli komórkowej
Anty mysie IgG-FTIC-królikSanta Cruz BiotechnologyJ1514Przeciwciało sekundowe, używane do barwnika
Przeciw myszom IgG-SC2781-kozaSanta Cruz BiotechnologyC3109Drugie przeciwciało, używane do barwnika
Au urządzenie do powlekania EM ACE600Leicado złocenia sekcji biomateriału przed obrazowaniem SEM
AutoklawNUVE-OT 90LUżywany do procesu sterylizacji.
AutoklawNUVE-OT 90LSłuży do procesu sterylizacji.
Cell Cultre CabineHera Safe KSUżywany do procesu hodowli komórkowej
Zmodyfikowana mieszanka pożywki i składników odżywczych Dulbecco-F12SigmaRNBJ7249Stosowany jako pożywka do hodowli komórkowych
FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEMQuantaFEG 450dla SEM
Surowica bydlęca płodu-FBSKoziorożecFBS-16AStosowano go przez dodanie do pożywki do hodowli komórkowych.
Zamrażarka -80° CPanasonicMDF-U5386S-PEByliśmy używani do przechowywania komórek i powstałych egzosomów
Biotusz żelatynowo-alginianowy w proszkuHD BiotuszUżywany do produkcji biotuszu etap
GFP oznaczony -WJ-MSCsVirostemUżywany do obrazowania do interakcji komórka-biotusz
Nanopłytki grafenu (Graphene-IGP2)Grafen Chemical Industries Co.Używany do produkcji biotuszu 3D-G
Przeciwciała immunofluorescencyjne (N-CAD; β-III Tubulina)Sygnalizacja komórkowa i Santa CruzUżywany do barwnika
JASCO 6600Tetrado
testu FTIR MTTTestowanie żywotnościSigma
Roztwór penicyny/streptomycynyKoziorożecPB-SDodano go do pożywki, aby zapobiec zanieczyszczeniu w hodowli komórkowej.
Szkiełko ThomaIsolabSłuży do liczenia komórek
System obrazowania poklatkowegoZeiss Axio.Observer.Z1Obrazowanie
Tripsin-EDTAMulticellKolba służyła do usuwania komórek pokrywających powierzchnię.
VorteksBiobaseDo wyprodukowanego biotuszu
etap WJ-MSCsATCCUżywany w procesie hodowli komórkowej
mo mo 15 ml probówka Falcon Gniazdo Używany w etapie hodowli komórkowej 25 cm2 kolby do hodowli komórkowych (Sokół, kolby do hodowli tkankowych TPP Gniazdo Używane do hodowli Bioprinting 3D Axolotl Biosystems Bio A2 (Turcja)Bioprinting Step

Bibliografia

  1. Kamasak, B., et al. Peripheral Nerve Injuries and Physiotherapy. Clinical Physiotherapy. 19, Vize Publishing, Istanbul. (2019).
  2. Yegiyants, S., Dayicioglu, D., Kardashian, G., Panthaki, Z. J. Traumatic peripheral nerve injury: A wartime review. Journal of Craniofacial Surgery. 21 (4), 998-1001 (2010).
  3. Mushtaq, S., et al. Frequency of peripheral nerve injury in trauma in emergency settings. Cureus. 13 (3), 14195(2021).
  4. Allahverdiyev, A. Basic Principles of Somatic and Stem Cell Culture Systems, 1st Edition. , Nobel Medicine Bookstore. Istanbul. (2018).
  5. Allahverdiyev, A. M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a new host cell in latent leishmaniasis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 85 (3), 535-539 (2011).
  6. Schofield, R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the hemopoietic stem cell. Blood Cells. 4 (1-2), 7-25 (1978).
  7. Goodman, S. R. Stem Cells and Regenerative Medicine (Chapter 13). Goodman's Medical Cell Biology, Fourth Edition. , Academic Press. 361-380 (2021).
  8. Kaya, T. I. Tissue engineering. International Journal of Medical Sciences. 1 (48), 165-169 (2018).
  9. Sensharma, P., Madhumathi, R. G., Jayant, R. D., Jaiswal, A. K. Biomaterials and cells for neural tissue engineering: Current choices. Materials Science and Engineering: C. 7, 1302-1315 (2017).
  10. Hölzl, K., et al. Bioink properties before, during, and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002(2016).
  11. Zheng, Y., et al. 2D nanomaterials for tissue engineering and regenerative nanomedicines: Recent advances and future challenges. Advanced Healthcare Materials. 10 (7), 2001743(2021).
  12. Shin, S. R. Graphene-based materials for tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 105, 255-274 (2016).
  13. Chen, M., Qin, X., Zeng, G. Biodegradation of carbon nanotubes, graphene, and their derivatives. Trends in Biotechnology. 35 (9), 836-846 (2017).
  14. Chen, S., et al. PAM/GO/Gel/SA composite hydrogel conduit with bioactivity for repairing peripheral nerve injury. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 1273-1283 (2019).
  15. Chiriac, S., Facca, S., Diaconu, M., Gouzou, S., Liverneaux, P. Experience of using the bioresorbable copolyester poly(DL-lactide-ε-caprolactone) nerve conduit guide Neurolac™ for nerve repair in peripheral nerve defects: Report on a series of 28 lesions. Journal of Hand Surgery (European Volume). 37 (4), 342-349 (2011).
  16. Karaaltin, A. B., et al. Human olfactory stem cells for injured facial nerve reconstruction in a rat model). Head & Neck. 38, 2011-2020 (2016).
  17. Bingham, J. R., et al. Stem cell therapy to promote limb function recovery in peripheral nerve damage in a rat model. Annals of Medicine and Surgery. 41, 20-28 (2019).
  18. Zhuang, H., et al. Gelatin-methacrylamide gel loaded with microspheres to deliver GDNF in bilayer collagen conduit promoting sciatic nerve growth. International Journal of Nanomedicine. 11, 1383-1394 (2016).
  19. Scheib, J., Hoke, A. Advances in peripheral nerve regeneration. Nature Reviews: Neurology. 9 (12), 668-676 (2013).
  20. Yurie, H., et al. The efficacy of a scaffold-free bio 3D conduit developed from human fibroblasts on peripheral nerve regeneration in a rat sciatic nerve model. PLOS ONE. 12 (2), 0171448(2017).
  21. Guo, Y., et al. Assessment of the green florescence protein labeling method for tracking implanted mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 64 (4), 391-401 (2012).
  22. Kose, C., Kacar, R., Zorba, A. P., Bagirova, M., Allahverdiyev, A. The effect of CO2 laser beam welded AISI 316L austenitic stainless steel on the viability of fibroblast cells, in vitro. Materials Science and Engineering: C. 60, 211-218 (2016).
  23. Liu, Y., et al. Bio-adenine-bridged molecular design approach toward non-covalent functionalized graphene by liquid-phase exfoliation. Journal of Materials Science. 55, 140-150 (2020).
  24. Rehman, S. Reduced graphene oxide incorporated GelMA hydrogel promotes angiogenesis for wound healing applications. International Journal of Nanomedicine. 14, 9603-9617 (2019).
  25. Bei, H. P., et al. Graphene-based nanocomposites for neural tissue engineering. Molecules. 24 (4), 658(2019).
  26. Othman, S. A., et al. Alginate-gelatin bioink for bioprinting of HeLa spheroids in alginate-gelatin hexagon-shaped scaffolds. Polymer Bulletin. 78, 6115-6135 (2021).
  27. Peng, X. L., Li, Y., Zhang, G., Zhang, F., Fan, X. Functionalization of graphene with nitrile groups by cycloaddition of tetracyanoethylene oxide. Journal of Nanomaterials. 2013, 841789(2013).
  28. Zorba Yildiz, A. P., et al. 3D therapeutic approaches for peripheral nerve damage. 9th International Molecular Biology and Biotechnology Congress Abstract Book. , E- ISBN: 978-605-70057-4-8 (2020).
  29. Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells. Current Research in Translational Medicine. 68 (1), 5-16 (2020).
  30. Yoo, J., et al. Augmented peripheral nerve regeneration through elastic nerve guidance conduits prepared using a porous PLCL membrane with a 3D printed collagen hydrogel. Biomaterials Science. 22, 1-12 (2020).
  31. Jansen, K., Meek, M. F., vander Werff, J. F. A., van Wachem, P. B., van Luyn, M. J. A. Long-term regeneration of the rat sciatic nerve through a biodegradable poly (DL-lactide-Ɛ-caprolactone) nerve guide: Tissue reactions with a focus on collagen III/IV reformation. Journal of Biomedical Materials Research. 69 (2), 334-341 (2016).
  32. Pathre, P., et al. PTP1B regulates neurite extension mediated by cell-cell and cell-matrix adhesion molecules. Journal of Neuroscience Research. 15, 143-150 (2001).
  33. Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: New players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabilitation and Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Bioatrament z hydro elu grafenowegobiodruk 3Dr nicowanie kom rek macierzystychregeneracja nerw wtworzenie sferoid wmezenchymalne kom rki macierzysteimmunobarwienieoddzia ywanie kom rek z rusztowaniem
Przygotowanie i charakterystyka biohybrydowego biotuszu hydrożelowego 3D na bazie grafenu do neuroinżynierii obwodowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.