Artykuł metodologiczny

Przygotowanie i charakterystyka biohybrydowego biotuszu hydrożelowego 3D na bazie grafenu do neuroinżynierii obwodowej

DOI:

10.3791/63622

⸱

16 maja 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vocational School of Health Services, Istinye University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell, and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Vocational School of Health Services, Altinbas University, 7The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 8Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym manuskrypcie demonstrujemy przygotowanie biohybrydowego hydrożelowego biotuszu zawierającego grafen do użycia w inżynierii tkanek obwodowych. Za pomocą tego biohybrydowego materiału 3D przeprowadzany jest protokół różnicowania neuronalnego komórek macierzystych. Może to być ważny krok w kierunku wprowadzenia podobnych biomateriałów do kliniki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuropatie obwodowe mogą wystąpić w wyniku uszkodzenia aksonów, a czasami z powodu chorób demielinizacyjnych. Uszkodzenie nerwów obwodowych jest globalnym problemem, który występuje u 1,5%-5% pacjentów w nagłych wypadkach i może prowadzić do znacznej utraty pracy. Obecnie podejścia oparte na inżynierii tkankowej, składające się z rusztowań, odpowiednich linii komórkowych i biosygnałów, stały się bardziej przydatne wraz z rozwojem technologii trójwymiarowego (3D) biodruku. Połączenie różnych biomateriałów hydrożelowych z komórkami macierzystymi, egzosomami lub cząsteczkami biosygnalizacyjnymi jest często badane w celu przezwyciężenia istniejących problemów związanych z regeneracją nerwów obwodowych. W związku z tym produkcja systemów iniekcyjnych, takich jak hydrożele lub wszczepialne struktury przewodów utworzone różnymi metodami biodruku, zyskała na znaczeniu w neuroinżynierii obwodowej. W normalnych warunkach komórki macierzyste są komórkami regeneracyjnymi organizmu, a ich liczba i funkcje nie zmniejszają się z czasem, aby chronić ich populacje; Nie są to wyspecjalizowane komórki, ale mogą różnicować się po odpowiedniej stymulacji w odpowiedzi na uraz. System komórek macierzystych znajduje się pod wpływem swojego mikrośrodowiska, zwanego niszą komórek macierzystych. W uszkodzeniach nerwów obwodowych, zwłaszcza w neurotmesis, tego mikrośrodowiska nie można w pełni uratować nawet po chirurgicznym związaniu ze sobą zerwanych zakończeń nerwowych. Podejście oparte na biomateriałach kompozytowych i łączonych terapiach komórkowych zwiększa funkcjonalność i możliwości zastosowania materiałów pod względem różnych właściwości, takich jak biodegradowalność, biokompatybilność i przetwarzalność. W związku z tym badanie to ma na celu zademonstrowanie przygotowania i zastosowania biohybrydowego modelowania hydrożelu na bazie grafenu oraz zbadanie skuteczności różnicowania komórek macierzystych w komórki nerwowe, które mogą być skutecznym rozwiązaniem w regeneracji nerwów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Układ nerwowy, który jest mechanizmem łączącym wewnętrzną strukturę organizmu i środowiska, dzieli się na dwie części: centralny i obwodowy układ nerwowy. Uszkodzenie nerwów obwodowych jest globalnym problemem, który stanowi 1,5%-5% pacjentów, którzy zgłaszają się na oddział ratunkowy i rozwija się z powodu różnych urazów, prowadząc do znacznej utraty pracy1,2,3.

Dzisiaj bardzo interesujące są podejścia komórkowe do neuroinżynierii obwodowej. Komórki macierzyste zajmują pierwsze miejsce wśród komórek stosowanych w tych podejściach. W normalnych warunkach komórki macierzyste są komórkami regeneracyjnymi organizmu, a ich liczba i funkcje nie zmniejszają się z czasem, aby chronić ich populacje; Komórki te są wyspecjalizowane, ale mogą różnicować się po odpowiedniej stymulacji w odpowiedzi na uraz4,5. Zgodnie z hipotezą komórek macierzystych, układ komórek macierzystych znajduje się pod wpływem swojego mikrośrodowiska, zwanego niszą komórek macierzystych. Zachowanie i różnicowanie komórek macierzystych jest niemożliwe bez obecności ich mikrośrodowiska6, które można odtworzyć za pomocą inżynierii tkankowej przy użyciu komórek i rusztowań7. Inżynieria tkankowa to multidyscyplinarna dziedzina, która obejmuje zarówno zasady inżynierii, jak i biologii. Inżynieria tkankowa dostarcza narzędzi do tworzenia sztucznych tkanek, które mogą zastąpić żywe tkanki i mogą być wykorzystywane do regeneracji tych tkanek poprzez usuwanie uszkodzonych tkanek i dostarczanie funkcjonalnych tkanek8. Rusztowania tkankowe, jeden z trzech filarów inżynierii tkankowej, są produkowane przy użyciu różnych metod z materiałów naturalnych i syntetycznych9. Druk trójwymiarowy (3D) to rozwijająca się technologia wytwarzania przyrostowego, która jest szeroko stosowana do zastępowania lub przywracania uszkodzonych tkanek poprzez prostą, ale wszechstronną produkcję skomplikowanych kształtów przy użyciu różnych metod. Bioprinting to metoda wytwarzania przyrostowego, która umożliwia współistnienie komórek i biomateriałów, zwanych bioinks10. Biorąc pod uwagę wzajemne oddziaływanie komórek nerwowych, badania przeniosły się na kandydatów na biomateriały przewodzące, takie jak grafen. Nanopłytki grafenowe, które mają takie właściwości, jak elastyczna elektronika, superkondensatory, baterie, optyka, czujniki elektrochemiczne i magazynowanie energii, są preferowanym biomateriałem w dziedzinie inżynierii tkankowej11. Grafen został wykorzystany w badaniach, w których przeprowadzono proliferację i regenerację uszkodzonych tkanek i narządów12,13.

Inżynieria tkankowa składa się z trzech podstawowych elementów budulcowych: rusztowania, komórek i cząsteczek biosygnału. W badaniach nad uszkodzeniem nerwów obwodowych występują braki w zakresie całkowitego zapewnienia tych trzech struktur. W biomateriałach produkowanych i wykorzystywanych w badaniach napotkano różne problemy, takie jak zawieranie przez nie wyłącznie komórek macierzystych lub cząsteczek biosygnałowych, brak bioaktywnej cząsteczki, która umożliwiłaby różnicowanie komórek macierzystych, brak biokompatybilności zastosowanego biomateriału oraz niewielki wpływ na proliferację komórek w niszy tkankowej, W związku z tym przewodnictwo nerwowe nie jest w pełni realizowane2,13,14,15,16. Wymaga to optymalizacji regeneracji nerwów, zmniejszenia atrofii mięśni17,18, oraz stworzenia niezbędnego homingu19 z czynnikami wzrostu przeciwko takim problemom. W tym momencie bardzo ważna jest charakterystyka i analiza neuroaktywności prototypu biomateriału chirurgicznego, który ma zostać przeniesiony do kliniki.

W związku z tym, ta metoda badania bada wzór hydrożelu biotuszu z nanopłytkami grafenowymi utworzonymi przez biodrukarkę 3D i jego skuteczność w neurogennym różnicowaniu komórek macierzystych, które zawiera. Badane są również wpływ grafenu na tworzenie i różnicowanie neurosfery.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych Galaretki Whartona

  1. Wyjmij galaretowe mezenchymalne komórki macierzyste Whartona (WJ-MSC, z ATCC) z zamrażarki w temperaturze -80 °C. Hodowla WJ-MSC w pożywce DMEM-F12 zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej (FBS), 1% Pen-Strep i 1% L-glutaminy w sterylnym przepływie laminarnym w temperaturze pokojowej, zgodnie z opisem w Yurie et al.20.
  2. Kriokonserwuj niektóre komórki w 1 x 106 komórek/ml za pomocą pożywki zamrażającej zawierającej 35% FBS, 55% DMEMF-12 i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO). W tym celu policz 1 x 106 komórek na szkiełku do liczenia komórek Thoma i dodaj roztwór zamrażający kroplami. Szybko przenieś szkiełko do pojemnika z ciekłym azotem.
  3. Gdy wyhodowane komórki są w 80% zlewające się w kolbie, wylać pożywkę i przemyć 5 ml PBS. Dodaj 5 ml 0,25% trypsyny i 2,21 mM EDTA-4Na. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  4. Dodać 10 ml pożywki DMEM-F12 z 10% FBS do komórek wyjętych z inkubatora. Zawieś go dobrze, zbierz pożywkę i przenieś pożywkę do probówki wirówkowej.
  5. Wirować z prędkością obrotową 101 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zasiać komórki w nowych kolbach ze świeżą pożywką zawierającą 10% FBS.
    UWAGA: Komercyjne WJ-MSC znakowane genem GFP metodą transdukcji mogą być używane do lepszej wizualizacji interakcji biomateriał-komórka, które mają być wyprodukowane21. Grupy, które mają być używane w tej metodzie, można utworzyć w sposób przedstawiony w tabeli 1.

Utworzone grupyPowody, dla których warto utworzyćLiczba powtórzeń
2D WJ-MSCs (2D-C)Kontrola 2Dx 5
2D WJ-MSCs & Grafen (2D-G)Oznaczanie dawki toksycznej grafenu w 2Dx 5 powtórzeń dla każdej z różnych koncentracji
WJ-MSC są zawarte w biotuszach (3D-B )Kontrola 3Dx 3
WJ-MSCs i 0,1% grafenu są zawarte w biotuszach (3D-G)3D Grupa Biohybrydowa Grafen-Biotuszx 3
WJ-MSC są w formie sferoidalnej na biotuszach (3D-BS )3D Kontrola formy sferoidalnejx 3
WJ-MSCs & 0,1% Grafen arein sferoid form na biotuszach (grupa 3D-GS)3D Grafenowo-Biotuszowa Biohybrydowa Grupa Formy Sferoidalnejx3
Kropla biotuszu 3DJest przeznaczony do analizy charakterystyki SEM i FTIR.x5
Kropla grafenu 3DJest przeznaczony do analizy charakterystyki SEM i FTIR.x5
3D Bioink z oznaczeniem GFP WJ-MSCs i 0,1%Obserwacja ruchów WJ-MsCs w tuszu biograficznym zawierającym odpowiednią dawkę grafenu.x3

Tabela 1. Grupy w metodzie. Uwzględniane są wszystkie grupy 2D i 3D w metodzie.

2. Toksyczność grafenu i obrazowanie 2D

  1. Przygotowanie stężeń grafenu i zastosowanie go do komórek
    UWAGA: Surowe nanocząstki grafenu zostały zakupione komercyjnie (typu przemysłowe nanopłytki grafenowe) i również zostały przekazane. Wymiary cząstek wynosiły 5-8 nm grubości, 5 μm średnicy i 120-150 m2/g powierzchni.
    1. Zważ grafen, aby uzyskać 1% roztwór (mg/ml). Przygotować roztwór podstawowy, dodając 10 ml pożywki DMEMF-12 z 10% FBS do zważonych 100 μg nanocząstek grafenu i oznaczyć ten roztwór jako roztwór podstawowy. Sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C pod ciśnieniem 1,5 atm przez 20 min.
      UWAGA: Sterylna mieszanina grafenu jest przechowywana w lodówce w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Może nie nadawać się do długotrwałego stosowania (maksymalnie 1 miesiąc). W takich przypadkach mieszaninę należy odtworzyć i wysterylizować.
    2. Przygotuj mieszaninę średniego grafenu o różnych stężeniach, aby określić dawki nietoksyczne. Ustaw początkowe rozcieńczenia na 1%, 0,1%, 0,01%, 0,001% i 0,0001% grafenu/podłoża.
    3. Zaczynając od 1% roztworu podstawowego, pobieraj kolejno 1 ml z każdego stężenia i przenieś go do nowej probówki. Dodaj 9 ml pożywki DMEMF-12 z 10% FBS do każdej probówki, tworząc pięć stopniowo rozcieńczanych próbek, a następnie wstrząsaj i wiruj roztwory, aby uzyskać równomierne rozprowadzenie. Używaj tylko 10 ml pożywki DMEMF-12 z 10% FBS jako kontrola.
      UWAGA: Ciężkie płatki grafenu wytrącają się, a zatem muszą być redystrybuowane.
    4. Wysiewaj WJ-MSC na płytkach 6-dołkowych z 2 ml świeżej pożywki zawierającej 10% FBS w proporcji 5 x 105 komórek na dołek. Inkubować przez 1 dzień w temperaturze 37 °C. Następnie podziel płytki na grupy równych i powtarzających się dołków. Wykonaj pięć powtórzeń dla każdej koncentracji.
    5. Wyrzuć pożywkę, a następnie zastąp pożywkę pożywką grafenową o stężeniu 2 ml na studzienkę. Używaj tylko pożywki dla grupy kontrolnej. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  2. Oznaczanie nietoksycznych stężeń grafenu za pomocą MTT
    1. Po 24 godzinach wyrzucić podłoża z grafenem. Umyć każdą studzienkę PBS. Dodaj świeżą pożywkę DMEMF-12 z 10% FBS w ilości 2 ml na studzienkę.
      UWAGA: Ważne jest, aby przemyć PBS po zastosowaniu stężeń grafenu na komórce, ponieważ nanocząsteczki grafenu, które nie są pobierane do komórki przez endocytozę, są usuwane ze środowiska. To sprawia, że test MTT jest bardziej wydajny.
    2. Użyj protokołu MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylo-tetrazoliowy), aby określić wartość IC50 wskazującą na 50% żywotność komórki, zgodnie z opisem w Kose et al.22 oraz w krokach 2.2.3.-2.2.6.
    3. Najpierw odważ 5 mg/ml soli MTT i rozpuść w PBS. Sterylizuj za pomocą filtra 0,45 μm. Owinąć roztwór MTT, umieszczony w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, folią aluminiową i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    4. Dodać 10 μl MTT do wszystkich studzienek i inkubować płytkę przez 4 godziny w temperaturze 37 °C. Po inkubacji obserwować pod mikroskopem formowanie się kryształów formazanu przy 10-krotnym powiększeniu.
    5. Aby rozpuścić kryształy utworzone w komórkach, dodaj 100 μl DMSO do każdego dołka i wymieszaj przez pipetowanie. Trzymaj talerz w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Włóż płytkę do czytnika płytek ELISA. Ustaw długość fali 570 nm z programu do pomiaru absorbancji i poproś go o odczytanie plate22.
      UWAGA: Ponadto, podczas gdy same cząstki grafenu są odczytywane przy 270 nm23, zakres odczytu 570 nm24 tutaj będzie służył tylko do odczytu żywotności komórki.
    6. Wykonaj analizę statystyczną uzyskanych wyników za pomocą jednoczynnikowej ANOVA z testem Tukeya w programie do analizy statystycznej.
  3. Obrazowanie ściegiem
    1. Aby zbadać interakcję różnych stężeń grafenu z komórkami, wykonaj film poklatkowy komórek za pomocą metody zwanej obrazowaniem ściegiem. Ta metoda tworzy obraz poklatkowy przy użyciu próbek obrazu pobranych w regularnych odstępach czasu pod mikroskopem.
    2. Aby to zrobić, najpierw włącz komputer. Włącz inkubator do obrazowania poklatkowego i ustaw go na 37 °C. Umieść płytkę MTT w gnieździe inkubatora poklatkowego.
    3. Otwórz program Stitch na komputerze. Określ studzienki, które mają być odczytywane w systemie. Przynieś czytnik do pierwszej studzienki, zlokalizuj i ustaw ostrość obszaru przy 10-krotnym powiększeniu w białym świetle. Uruchom program.
      UWAGA: Jest to program do tworzenia wysokiej jakości 4 wierszy x 5 kolumn wielu kolaży zdjęć. Program łączy zdjęcia wykonane jedno po drugim w jakości HD. Po naciśnięciu przycisku start systemu studzienki są automatycznie odczytywane, a on wykonuje i zszywa 4 rzędy x 5 kolumn wiele zdjęć.

3. Grafen - produkcja biohybrydowego hydrożelu Bioink i zróżnicowanie WJ-MSC

  1. Produkcja biotuszy
    UWAGA: Liofilizowane, dostępne na rynku proszki alginianowo-żelatynowe (3:5) są stosowane jako podstawa biotuszów. Tą samą metodą przygotowuje się grupę biotuszu grafenowego (3D-G; 3D-GS) i grupę kontrolną biotuszu bez grafenu (3D-B; 3D-BS) (tabela 1).
    1. Do przygotowania należy użyć stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Najpierw zważ 4,5 mg alginianu i 1,5 mg żelatyny i przenieś do probówki wirówkowej. Dodać do mieszaniny pożywkę DMEMF-12 zawierającą 10% FBS do całkowitej objętości 50 ml. Jest to grupa kontrolna (C) bez grafenu.
    2. Powtórzyć ważenie 4,5 mg alginianu i 1,5 mg żelatyny i przenieść do probówki wirówkowej. Następnie weź 50 μl przygotowanego 0,1% grafenu z kroku 2.1.3. i dodaj go do tubki. Dodaj DMEMF-12 z 10% FBS do całkowitej objętości 50 ml.
    3. Najpierw wymieszaj biotusze przez pipetowanie, a następnie wiruj. Sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C pod ciśnieniem 1,5 atm przez 20 minut. Alternatywnie przeprowadź sterylizację, podgrzewając w kuchence mikrofalowej do temperatury wrzenia.
    4. Po autoklawie mieszanin odwirować przy 280 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej w celu usunięcia powstałych pęcherzyków. Przechowywać biotusze w temperaturze 37 °C do czasu przygotowania komórek.
  2. Dodanie WJ-MSC i biodruku 3D
    1. Do liczenia umyj komórki, gdy dojdzie do 80% zbieżności z około 5 ml PBS i dodaj 5 ml 0,25% trypsyny i 2,21 mM EDTA 4Na. Pozostaw na 5 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Dodać 10 ml pożywki DMEM-F12 z 10% FBS do komórek po wyjęciu z inkubatora. Dobrze zawiesić, zebrać pożywkę i przenieść ją do probówki wirówkowej. Wirować przy 101 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odrzucić supernatant.
    3. Pozostawić około 250 μl podłoża z granulką. Ponownie rozpuścić osad w 1 ml świeżego podłoża. Do 48 μl podłoża dodać 2 μl zawiesiny komórek i 50 μl błękitu trypanowego (0,4 g błękitu trypanowego/100 ml) w stożkowej probówce (1,5 ml) do liczenia4. Dobrze odpipetuj pipetą.
    4. Dodać około 10 ml przygotowanej zawiesiny barwionych komórek do komory do liczenia komórek Thoma. Oblicz średnią liczbę komórek wpadających w kwadraty po obu stronach mikroskopu świetlnego.
      Obliczyć procent witalności (%) = (zliczone żywe komórki/całkowita liczba zliczonych komórek) x 100
      UWAGA: Interakcja komórka-biotusz jest badana na dwa sposoby: (1) Można go wydrukować, dodając go do biotuszy (3D-B; 3D-G); (2) Komórki są wysiewane na biotuszach po sprasowaniu, a komórki tworzą sferoidę (3D-BS; 3D-GS).
    5. W przypadku interakcji komórka-biotusz najpierw utwórz grupy biotuszu (Tabela 1). Grupa 1 obejmuje 3D-B i 3D-G drukowane za pomocą biotuszu do biodruku. Grupa 2 obejmuje biotusze 3D-BS i 3D-GS, na których po bioprintingu powstały sferoidy.
    6. Policz komórki grupy 1 tak, aby w 0,5 ml pożywki było około 1 x 107 komórek. Dodaj 4,5 ml biotuszu, aby uzyskać całkowitą objętość do 5 ml. Przenieść go do wkładów w sterylnej szafce za pomocą strzykawek. Zainstaluj wkłady w odpowiedniej sekcji ekstrudera biodrukarki.
    7. W przypadku drugiej grupy należy pobrać po 5 ml z każdej z grup biotuszu i przenieść je do sterylnych wkładów za pomocą wstrzykiwacza.
    8. Używaj biodrukarki z dwiema współosiowymi głowicami drukującymi i technologią wytłaczania napędzanego pneumatycznie. Ustaw rozdzielczość X/Y/Z na mikrokrok na 1,25 μm, szerokość wytłaczania na 400 μm, a wysokość wytłaczania na 200 μm. Siatka o wymiarach 20 mm x 20 mm x 5 mm jest jednym z najczęściej używanych modeli 3D do prac biodrukarskich 3D.
    9. Twórz modele 3D za pomocą internetowych programów CAD typu open source. Przed bioprintingiem stwórz proste modele 3D za pomocą jednej z platform open-source (np. Infill). Model może być liniowy (jak model użyty w tym miejscu), o strukturze plastra miodu lub w kształcie siatki. Eksport i pobieranie w formacie .stl po utworzeniu kwadratu o wymiarach 5 mm x 20 mm x 20 mm.
    10. Oprogramowanie bioprinter wykorzystuje pliki .stl i konwertuje je do formatu .gcode do druku za pomocą modułów slicer. Aby uzyskać kształt siatki do wydrukowania, wyłącz powłokę zewnętrzną w module slicera. Przed rozpoczęciem pracy przetrzyj urządzenie 70% etanolem, a następnie wysterylizuj przez sterylizację UV.
    11. W procesie biodruku przenieś grupy biotuszu do wkładów za pomocą wtryskiwacza. Zainstaluj wkłady w odpowiedniej sekcji ekstrudera biodrukarki.
    12. Ustaw średnie ciśnienie w drukarce 3D na 7,5 psi, a temperaturę wkładu i stołu na 37 °C. Ustaw prędkość na 60% i przeprowadź standardowy proces drukowania 3D.
      UWAGA: Planowanie przygotowanych modeli z przestrzeniami (jak model liniowy) pozwala na przeprowadzenie hodowli komórkowej w przestrzeniach po biodruku.
    13. Ustaw system w pozycji wyjściowej podczas fazy pisania. Ustaw osie (X, Y, Z) automatycznie, wybierz ekstruder i ustaw. Rozpocznij proces drukowania. Po procesie biodruku należy pobrać próbkę i umieścić ją w komorze z przepływem laminarnym.
    14. Po wydrukowaniu spryskać biotusze 0,1 N roztworem CaCl2 lub dodać 1 ml roztworu pipetą o temperaturze pokojowej. Odczekaj około 10-20 s i umyj wydrukowane wzory 2x PBS zawierającym Ca2+ i Mg2+.
    15. Dodaj 2 ml DMEMF-12 z 10% pożywką FBS na wierzch każdej z grup biotuszu zawierających komórki. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Następnie dodaj 2 ml pożywki zawiesinowej zawierającej 1 x 106 komórek do każdej grupy w celu utworzenia sferoidów.
    16. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Po 24 godzinach inkubacji obserwuj formację sferoidową pod odwróconym mikroskopem.
  3. Różnicowanie WJ-MSCs do komórek neuronopodobnych
    1. Obserwować i fotografować wszystkie partie biotuszu po 24 godzinach inkubacji. Dodać 2 ml pożywki do różnicowania neurogennego na dołek (z wyjątkiem grupy kontrolnej) i odświeżać co 2 dni. Obserwuj przez 7 dni, aby zaobserwować różnicowanie neuronalne.

4. Charakterystyka biohybrydowego hydrożelu grafenowo-bioinkowego

UWAGA: Obrazowanie poklatkowe, spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT/IR) i analizy skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) są wykonywane w celu scharakteryzowania biohybrydowego hydrożelu grafenowo-bioinkowego. Próbki są tworzone z grup biotuszu 3D-B i 3D-G metodą kroplową do analizy FT/IR i SEM.

  1. Analiza FT/IR
    UWAGA: FT/IR to chemiczna metoda analityczna oparta na matematycznej transformacie Fouriera, niezbędna do charakteryzacji materiałów. Użyć urządzenia FT/IR opartego na zasadzie interferometru Michelsona o temperaturze 28 °C, z lampą halogenową, chłodzonym wodą rtęciowym źródłem światła, o proporcji sygnału 4 cm−1, mierzonym przez 1 min, przy 2,200 cm−1.
    1. Przygotuj mikroskop FT/IR i upewnij się, że optyka instrumentu jest wyrównana. Skalibruj urządzenie.
    2. Ponieważ próbka znajduje się w kropli, weź kawałek hydrożelu o grubości 1-2 mm i umieść go kleszczami na części próbki. Skoncentruj się na próbce i podnieś ją, aż dojdzie do bliskiego kontaktu. Zbierz widmo próbki, rozpoczynając proces z systemu.
  2. Analiza skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)
    UWAGA: Morfologia powierzchni, struktura wewnętrzna, rozmieszczenie komórek i interakcje biotusz-komórka mogą być badane za pomocą analizy SEM w różnych wymiarach.
    1. Wrzuć hydrożel do 6-dołkowych płytek zawierających 1 ml środka sieciującego CaCl2 przy użyciu metody kropelkowej końcówki pipety (patrz Rysunek 1).
    2. Umyj płytki 2x około 1 ml PBS, aby uwolnić roztwór soli. Następnie umieść te krople w probówce sokoła zawierającej 5 ml 5% paraformaldehydu za pomocą kleszczy.
    3. Wykonaj cienkie sekcje z kropli biotuszów za pomocą skalpela. Przyklej próbki po lepkiej stronie na metalowej płytce. Włożyć do urządzenia powlekającego, gdzie złoty pallad, który przechodzi do fazy plazmowej poprzez zastąpienie powietrza argonem, pokrywa próbkę.
    4. Umieść go w mikroskopie elektronowym (SEM). Otwórz program mikroskopu, z którym jest połączony SEM. Wykonaj skalowanie i zrób zdjęcia różnych części próbki. Do tego protokołu użyto skal 5 μm, 10 μm i 200 μm. Łącznie wykonano 40 zdjęć dla grup 3D-B i 3D-G.
  3. Obrazowanie poklatkowe
    UWAGA: Podczas obrazowania poklatkowego wykorzystano nie tylko próbki biotuszu zawierające komórki transformowane przez gen GFP, ale także biotusze ze sferoidami są obrazowane przez 16 godzin. Obrazowanie poklatkowe wykonuje się w celu zbadania wpływu grafenu na komórki macierzyste i monitorowania interakcji komórkowych w biotuszu.
    1. Dodać dostępne w handlu 1 x 107 MSCs z oznaczeniem GFP do 5 ml biotuszu i bioprintu, jak w kroku 3.2.11. Dodaj 1 ml środka sieciującego, przytrzymaj przez 20-30 s i przemyj 2x PBS.
    2. Włącz monitor poklatkowy i otwórz program na komputerze. Ustaw około 16 godzin w trybie poklatkowym i ustaw temperaturę na 37 °C. Naciśnij przycisk Start. System nagrywa filmy w postaci 40-sekundowych próbek filmów poklatkowych.
    3. Ustaw ostrość mikroskopu przy 10-krotnym powiększeniu co 2 godziny. Wizualizuj także sferoidy utworzone, wykonując te same kroki.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Grupy biotuszu 3D-B i 3D-G wytworzone jako krople do wykorzystania w charakterystyce. (A) Próbki biotuszu (obraz przed charakterystyką) na płytce z środkiem sieciującym. (B) Upuszczony obraz 3D-B biotuszu. (C) Obraz kropli biotuszu 3D-G. Biomateriał, który ma zostać scharakteryzowany, oraz zawarte w nim komórki mogą łatwiej przejść przez procesy takie jak złocenie, pobieranie próbek itp. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Oznaczanie różnicowania neurogennego metodą barwienia immunologicznego

  1. Zbierz sferoidy, nie przerywając form kuli, i ponownie zasiej na nowych płytkach, aby odpocząć łatwiejszą metodą, zamiast zatapiać w parafinie w celu cięcia tkanek.
  2. Przykryj 48-dołkowe płytki około 20 ml wstępnie autoklawizowanego 0,1% roztworu żelatyny i trzymaj w inkubatorze przez co najmniej 1 godzinę. Odpipetować około 500 μl przygotowanej 0,1% żelatyny do płytek 48-dołkowych. Pozostawić galaretowate płytki w inkubatorze na 10 min.
    UWAGA: Pozwoli to żelatynie lekko pęcznieć, pokrywając powierzchnię i tworząc lepsze środowisko do przyczepiania się zebranych sferoid.
  3. Zebrać sferoidy przez pipetowanie, rozprowadzić zebrane sferoidy z inkubatora do dołków płytki 48-dołkowej i dodać świeże podłoże. Następnie inkubować przez 12-24 h.
    UWAGA: Rozprowadzenie sferoid przez liczenie jest dość trudne. Zbierz sferoidy w jednej probówce i równomiernie rozprowadź całkowitą objętość do studzienek. W tym badaniu każda studzienka zawierała około 4-6 sferoidów.
    UWAGA: W przypadku próbek 2D wystarczające jest wstępne mycie plam i nie jest wymagana wymiana nośnika.
  4. Usuń pożywkę i powoli umyj komórki PBS, ponieważ sferoidy będą znajdować się na górze. Utrwal w 4% paraformaldehydzie przez 2 godziny.
  5. Ponownie przemyć próbki PBS i zablokować około 10 ml 2% BSA i 0,1% TritonX przez 30 minut. Następnie umyj PBS 3x.
  6. Rozcieńczyć wybrane przeciwciała starterowe (N-kadheryna-królik i β-III tubulina-mysz) w stosunku 1:100 roztworem odczynnika rozcieńczającego przeciwciała. Dodać 100 μl roztworu przeciwciał do każdej z próbek i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  7. Przemyć próbki 3x PBS. Inkubować z anty-mysim IgG-FTIC-królikiem dla tubuliny β-III i anty-mysim przeciwciałem wtórnym IgG-SC2781-koza dla N-Cad rozcieńczonym do 1:200 w temperaturze pokojowej przez 30 min. Wykonuj wszystkie operacje w ciemności.
    UWAGA: Niezależnie od tego, jaki szczep jest używany jako przeciwciało pierwszorzędowe (np. mysz) w podwójnym barwieniu, inny szczep (np. koza lub królik) powinien być użyty jako przeciwciało drugorzędowe.
  8. Przemyć przeciwciało drugorzędowe PBS 3x, a następnie wlać roztwór DAPI (1:1) do każdej z próbek. Odczekaj 15-20 min. Wykonaj obrazowanie immunofluorescencyjne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toksyczność grafenu i obrazowanie 2D
Analizę statystyczną uzyskanych wyników MTT przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej ANOVA z testem Tukeya w oprogramowaniu do analizy statystycznej, a uzyskany wykres przedstawiono w Rysunek 2. Procentowa zawartość grafenu w porównaniu z grupą kontrolną wykazała istotny spadek tylko dla stężenia grafenu 0,001% (**p < 0,01). Nie stwierdzono istotnych różnic pomiędzy pozostałymi grupami a grupą kontrolną (p > 0,05). W związku z tym określ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zalety zabiegów stosowanych za pomocą inżynieryjnych rusztowań 3D w porównaniu z konwencjonalnymi metodami 2D stają się z dnia na dzień coraz bardziej zauważalne. Komórki macierzyste stosowane samodzielnie w tych terapiach lub wraz z rusztowaniami wytwarzanymi z różnych biomateriałów o niskiej biokompatybilności i biodegradowalności są zwykle niewystarczające w regeneracji nerwów obwodowych. Mezenchymalne komórki macierzyste Whartona (WJ-MSC) wydają się być odpowiednim kandydatem na linię komórkową, zwłaszcza biorąc pod ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów. Projekt został zrealizowany we współpracy z firmą HD Bioink, twórcą technologii biodruku 3D.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gracen użyty w tym badaniu został opracowany na Wydziale Inżynierii Mechanicznej Uniwersytetu Kirklareli. Został on podarowany przez dr Karabeyoğlu. Test toksyczności grafenu został sfinansowany ze środków projektu pt. "Printing and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells on 3D Bioprinters with Graphene Doped Bioinks" (nr wniosku: 1139B411802273) realizowanego w ramach TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented Undergraduate Thesis Support Program. Druga część badania została wsparta przez fundusz badawczy zapewniony przez Projekty Naukowo-Badawcze Uniwersytetu Technicznego Yildiz (TSA-2021-4713). Mezenchymalne komórki macierzyste z GFP wykorzystywane w obrazowaniu poklatkowym zostały przekazane przez firmę Virostem Biotechnology. Autorzy dziękują Darıcı LAB i zespołowi YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB za owocne dyskusje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze

Odśrodkowy		HitachiStosowany w hodowli komórkowej i etapie biomateriału
0,1N CaCl2HD BioinkUżywany do sieciowania
0,22 i mikro; m filtr membranowyAι sι Używany do sterylizacji
0,45 i mikro; m filtr strzykawkowyAι sι Używany do sterylizacji
1,5 ml stożkowarurka EppendorfaUżywany do kropli biotuszu
komórek
50 ml probówka FalconGniazdoUżywane w etapie hodowli komórkowej
Płytki 6/24/48/96 dołków (Falcon, mikropłytki TPP)Merck MilliporeUżywane w etapie hodowli komórkowej
Kolby do hodowli komórkowych o powierzchni 75 cm2 (Falcon, kolby do hodowli tkankowej TPPGniazdoUżywane do hodowli komórkowej
Anty mysie IgG-FTIC-królikSanta Cruz BiotechnologyJ1514Przeciwciało sekundowe, używane do barwnika
Przeciw myszom IgG-SC2781-kozaSanta Cruz BiotechnologyC3109Drugie przeciwciało, używane do barwnika
Au urządzenie do powlekania EM ACE600Leicado złocenia sekcji biomateriału przed obrazowaniem SEM
AutoklawNUVE-OT 90LUżywany do procesu sterylizacji.
AutoklawNUVE-OT 90LSłuży do procesu sterylizacji.
Cell Cultre CabineHera Safe KSUżywany do procesu hodowli komórkowej
Zmodyfikowana mieszanka pożywki i składników odżywczych Dulbecco-F12SigmaRNBJ7249Stosowany jako pożywka do hodowli komórkowych
FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEMQuantaFEG 450dla SEM
Surowica bydlęca płodu-FBSKoziorożecFBS-16AStosowano go przez dodanie do pożywki do hodowli komórkowych.
Zamrażarka -80° CPanasonicMDF-U5386S-PEByliśmy używani do przechowywania komórek i powstałych egzosomów
Biotusz żelatynowo-alginianowy w proszkuHD BiotuszUżywany do produkcji biotuszu etap
GFP oznaczony -WJ-MSCsVirostemUżywany do obrazowania do interakcji komórka-biotusz
Nanopłytki grafenu (Graphene-IGP2)Grafen Chemical Industries Co.Używany do produkcji biotuszu 3D-G
Przeciwciała immunofluorescencyjne (N-CAD; β-III Tubulina)Sygnalizacja komórkowa i Santa CruzUżywany do barwnika
JASCO 6600Tetrado
testu FTIR MTTTestowanie żywotnościSigma
Roztwór penicyny/streptomycynyKoziorożecPB-SDodano go do pożywki, aby zapobiec zanieczyszczeniu w hodowli komórkowej.
Szkiełko ThomaIsolabSłuży do liczenia komórek
System obrazowania poklatkowegoZeiss Axio.Observer.Z1Obrazowanie
Tripsin-EDTAMulticellKolba służyła do usuwania komórek pokrywających powierzchnię.
VorteksBiobaseDo wyprodukowanego biotuszu
etap WJ-MSCsATCCUżywany w procesie hodowli komórkowej
mo mo 15 ml probówka Falcon Gniazdo Używany w etapie hodowli komórkowej 25 cm2 kolby do hodowli komórkowych (Sokół, kolby do hodowli tkankowych TPP Gniazdo Używane do hodowli Bioprinting 3D Axolotl Biosystems Bio A2 (Turcja)Bioprinting Step

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kamasak, B., et al. Peripheral Nerve Injuries and Physiotherapy. Clinical Physiotherapy. 19, Vize Publishing, Istanbul. (2019).
  2. Yegiyants, S., Dayicioglu, D., Kardashian, G., Panthaki, Z. J. Traumatic peripheral nerve injury: A wartime review. Journal of Craniofacial Surgery. 21 (4), 998-1001 (2010).
  3. Mushtaq, S., et al. Frequency of peripheral nerve injury in trauma in emergency settings. Cureus. 13 (3), 14195(2021).
  4. Allahverdiyev, A. Basic Principles of Somatic and Stem Cell Culture Systems, 1st Edition. , Nobel Medicine Bookstore. Istanbul. (2018).
  5. Allahverdiyev, A. M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a new host cell in latent leishmaniasis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 85 (3), 535-539 (2011).
  6. Schofield, R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the hemopoietic stem cell. Blood Cells. 4 (1-2), 7-25 (1978).
  7. Goodman, S. R. Stem Cells and Regenerative Medicine (Chapter 13). Goodman's Medical Cell Biology, Fourth Edition. , Academic Press. 361-380 (2021).
  8. Kaya, T. I. Tissue engineering. International Journal of Medical Sciences. 1 (48), 165-169 (2018).
  9. Sensharma, P., Madhumathi, R. G., Jayant, R. D., Jaiswal, A. K. Biomaterials and cells for neural tissue engineering: Current choices. Materials Science and Engineering: C. 7, 1302-1315 (2017).
  10. Hölzl, K., et al. Bioink properties before, during, and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002(2016).
  11. Zheng, Y., et al. 2D nanomaterials for tissue engineering and regenerative nanomedicines: Recent advances and future challenges. Advanced Healthcare Materials. 10 (7), 2001743(2021).
  12. Shin, S. R. Graphene-based materials for tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 105, 255-274 (2016).
  13. Chen, M., Qin, X., Zeng, G. Biodegradation of carbon nanotubes, graphene, and their derivatives. Trends in Biotechnology. 35 (9), 836-846 (2017).
  14. Chen, S., et al. PAM/GO/Gel/SA composite hydrogel conduit with bioactivity for repairing peripheral nerve injury. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 1273-1283 (2019).
  15. Chiriac, S., Facca, S., Diaconu, M., Gouzou, S., Liverneaux, P. Experience of using the bioresorbable copolyester poly(DL-lactide-ε-caprolactone) nerve conduit guide Neurolac™ for nerve repair in peripheral nerve defects: Report on a series of 28 lesions. Journal of Hand Surgery (European Volume). 37 (4), 342-349 (2011).
  16. Karaaltin, A. B., et al. Human olfactory stem cells for injured facial nerve reconstruction in a rat model). Head & Neck. 38, 2011-2020 (2016).
  17. Bingham, J. R., et al. Stem cell therapy to promote limb function recovery in peripheral nerve damage in a rat model. Annals of Medicine and Surgery. 41, 20-28 (2019).
  18. Zhuang, H., et al. Gelatin-methacrylamide gel loaded with microspheres to deliver GDNF in bilayer collagen conduit promoting sciatic nerve growth. International Journal of Nanomedicine. 11, 1383-1394 (2016).
  19. Scheib, J., Hoke, A. Advances in peripheral nerve regeneration. Nature Reviews: Neurology. 9 (12), 668-676 (2013).
  20. Yurie, H., et al. The efficacy of a scaffold-free bio 3D conduit developed from human fibroblasts on peripheral nerve regeneration in a rat sciatic nerve model. PLOS ONE. 12 (2), 0171448(2017).
  21. Guo, Y., et al. Assessment of the green florescence protein labeling method for tracking implanted mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 64 (4), 391-401 (2012).
  22. Kose, C., Kacar, R., Zorba, A. P., Bagirova, M., Allahverdiyev, A. The effect of CO2 laser beam welded AISI 316L austenitic stainless steel on the viability of fibroblast cells, in vitro. Materials Science and Engineering: C. 60, 211-218 (2016).
  23. Liu, Y., et al. Bio-adenine-bridged molecular design approach toward non-covalent functionalized graphene by liquid-phase exfoliation. Journal of Materials Science. 55, 140-150 (2020).
  24. Rehman, S. Reduced graphene oxide incorporated GelMA hydrogel promotes angiogenesis for wound healing applications. International Journal of Nanomedicine. 14, 9603-9617 (2019).
  25. Bei, H. P., et al. Graphene-based nanocomposites for neural tissue engineering. Molecules. 24 (4), 658(2019).
  26. Othman, S. A., et al. Alginate-gelatin bioink for bioprinting of HeLa spheroids in alginate-gelatin hexagon-shaped scaffolds. Polymer Bulletin. 78, 6115-6135 (2021).
  27. Peng, X. L., Li, Y., Zhang, G., Zhang, F., Fan, X. Functionalization of graphene with nitrile groups by cycloaddition of tetracyanoethylene oxide. Journal of Nanomaterials. 2013, 841789(2013).
  28. Zorba Yildiz, A. P., et al. 3D therapeutic approaches for peripheral nerve damage. 9th International Molecular Biology and Biotechnology Congress Abstract Book. , E- ISBN: 978-605-70057-4-8 (2020).
  29. Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells. Current Research in Translational Medicine. 68 (1), 5-16 (2020).
  30. Yoo, J., et al. Augmented peripheral nerve regeneration through elastic nerve guidance conduits prepared using a porous PLCL membrane with a 3D printed collagen hydrogel. Biomaterials Science. 22, 1-12 (2020).
  31. Jansen, K., Meek, M. F., vander Werff, J. F. A., van Wachem, P. B., van Luyn, M. J. A. Long-term regeneration of the rat sciatic nerve through a biodegradable poly (DL-lactide-Ɛ-caprolactone) nerve guide: Tissue reactions with a focus on collagen III/IV reformation. Journal of Biomedical Materials Research. 69 (2), 334-341 (2016).
  32. Pathre, P., et al. PTP1B regulates neurite extension mediated by cell-cell and cell-matrix adhesion molecules. Journal of Neuroscience Research. 15, 143-150 (2001).
  33. Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: New players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabilitation and Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bioatrament z hydro elu grafenowegobiodruk 3Dr nicowanie kom rek macierzystychregeneracja nerw wtworzenie sferoid wmezenchymalne kom rki macierzysteimmunobarwienieoddzia ywanie kom rek z rusztowaniem

Powiązane artykuły