Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63628

⸱

17 lutego 2022

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Boston University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy ulepszenia standardowej metody pomiaru sił trakcyjnych komórek, opartej na drukowaniu mikrokontaktowym z pojedynczym krokiem subtraktywnego tworzenia wzorów układów punktowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej na miękkich hydrożelach. Metoda ta pozwala na prostsze i bardziej spójne wytwarzanie wzorów wyspowych, niezbędnych do kontrolowania kształtu klastrów komórek.

Streszczenie

Mikroskopia trakcyjna mikrowzorów pozwala na kontrolę kształtu pojedynczych komórek i klastrów komórek. Co więcej, możliwość modelowania w skali długości mikrometrów pozwala na wykorzystanie tych wzorzystych stref kontaktu do pomiaru sił trakcyjnych, ponieważ każda kropka z mikrowzorem pozwala na utworzenie pojedynczej ogniskowej adhezji, która następnie deformuje miękki, leżący pod spodem hydrożel. Podejście to zastosowano w przypadku szerokiego zakresu typów komórek, w tym komórek śródbłonka, komórek mięśni gładkich, fibroblastów, płytek krwi i komórek nabłonkowych.

Ta recenzja opisuje ewolucję technik, które pozwalają na drukowanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej na hydrożelach poliakrylamidowych w regularnym układzie kropek o określonym rozmiarze i odstępach. Ponieważ wzory w skali mikrometrycznej są trudne do bezpośredniego wydrukowania na miękkich podłożach, wzory są najpierw generowane na szkiełkach nakrywkowych ze szkiełka nakrywkowego, które są następnie wykorzystywane do przenoszenia wzoru do hydrożelu podczas żelowania. Po pierwsze, opisano oryginalne podejście do drukowania mikrokontaktowego w celu generowania tablic małych kropek na szkiełku nakrywkowym. Drugi krok, który usuwa większość wzorca, aby pozostawić wyspy małych kropek, jest wymagany do kontrolowania kształtów komórek i klastrów komórek na takich tablicach wzorzystych kropek.

Następnie, opisana jest ewolucja tego podejścia, która pozwala na generowanie wysp kropek za pomocą pojedynczego kroku subtraktywnego wzorca. To podejście jest znacznie uproszczone dla użytkownika, ale ma tę wadę, że skraca się żywotność formy wzorcowej potrzebnej do wykonania wzorów. Na koniec opisano podejścia obliczeniowe, które zostały opracowane do analizy obrazów przemieszczonych kropek i późniejszych pól trakcyjnych generowanych przez komórki, a także przedstawiono zaktualizowane wersje tych pakietów analitycznych.

Wprowadzenie

Większość fenotypów komórkowych wywiera siłę przyciągania na swoje otoczenie. Te siły trakcyjne są generowane przez kurczliwy cytoszkielet komórki, który jest siecią aktyny i miozyny oraz innych nitkowatych biopolimerów i białek sieciujących1,2,3,4. Siły generowane w komórce mogą być przenoszone do środowiska zewnątrzkomórkowego lub sąsiednich komórek, głównie za pośrednictwem białek transbłonowych, takich jak odpowiednio integryny i kadheryny5,6. To, w jaki sposób komórka rozprzestrzenia się lub kurczy - i wielkość sił trakcyjnych związanych z tymi ruchami - jest wynikiem intymnej rozmowy z otoczeniem, która w dużej mierze zależy od rodzaju i ilości białka obecnego w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)7,8 oraz sztywności ECM. Rzeczywiście, mikroskopia sił trakcyjnych stała się nieocenionym narzędziem do zrozumienia reakcji komórek na bodźce lokalne, takie jak sztywność podłoża, narzucone naprężenia mechaniczne i odkształcenia lub kontakt z innymi komórkami. Informacje te są bezpośrednio związane ze zrozumieniem chorób, takich jak rak i astma9,10,11,12.

System, który może być użyty do pomiaru wywołanego siłą deformacji podłoża o znanych właściwościach materiału, jest wymagany do obliczania sił trakcyjnych. Zmiany te muszą być śledzone w czasie, co wymaga zarówno technik obrazowania, jak i przetwarzania obrazu. Jedną z pierwszych metod stosowanych do określania sił trakcyjnych komórkowych była obserwacja i analiza skurczu hydrożeli kolagenowych wysianych komórkami, choć metoda ta była tylko półilościowa13. Inną, bardziej udoskonaloną metodą było zmierzenie sił trakcyjnych wywieranych przez pojedyncze ogniwa poprzez wyznaczenie sił wynikających z odkształcenia cienkiego arkusza silikonu14. Później opracowano bardziej ilościowe techniki pomiarowe, które pozwoliły również na stosowanie miękkich hydrożeli, takich jak poliakryloamid (PAA)12,15,16. W przypadku korzystania z tych miękkich materiałów, siły trakcyjne można było określić na podstawie wywołanego siłą przemieszczenia losowo przemieszczonych kulek osadzonych w hydrożelu oraz właściwości mechanicznych żelu16,17. Kolejnym postępem było opracowanie układów mikrosłupków wykonanych z miękkiego polidimetylosiloksanu (PDMS), dzięki czemu ich ugięcie można było zmierzyć i przekształcić na siłę za pomocą teorii wiązki18.

Na koniec, metody mikromodelowania miękkich hydrożeli zostały opracowane, ponieważ te podejścia pozwalają na kontrolę obszarów kontaktu dla adhezji komórek. Mierząc deformację mikrowzoru w obszarze styku komórki, można łatwo obliczyć siły pociągowe, ponieważ obraz referencyjny bez siły nie jest wymagany19. Metoda ta została szeroko przyjęta, ponieważ pozwala na pośrednie wzorowanie regularnego układu dyskretnych punktów adhezji białek fluorescencyjnych o rozmiarach mikronów na żelach PAA w celu pomiaru komórkowych sił trakcyjnych20. Aby obliczyć te siły, opracowano algorytm przetwarzania obrazu, który może śledzić ruchy każdej kropki z mikrowzorem bez konieczności wprowadzania danych przez użytkownika21.

Chociaż ta metoda jest prosta do tworzenia całych siatek wzorów kropek, jest bardziej skomplikowana, gdy pożądane są wzory izolowanych plam (lub wysp) kropek. Wyspy z mikrowzorami są przydatne, gdy potrzebna jest kontrola kształtu i do pewnego stopnia wielkości skupisk komórek. Aby utworzyć te wyspy, wyżej wymieniona metoda drukowania mikrokontaktowego wymaga dwóch odrębnych kroków: i) użycia jednego stempla PDMS do stworzenia wzoru kropek o wysokiej wierności na szkiełku nakrywkowym, a następnie ii) użycia drugiego innego stempla PDMS w celu usunięcia większości tych kropek, pozostawiając izolowane wyspy kropek21. Trudność w tworzeniu wysp tą oryginalną metodą jest spotęgowana przez fakt, że tworzenie spójnych wzorów siatki w pierwszym kroku procesu jest wyzwaniem samym w sobie. Stemple do mikrodruku składają się z szeregu okrągłych mikrosłupków, których średnica odpowiada pożądanemu rozmiarowi kropki. Stemple te są następnie powlekane równą warstwą białka, a następnie tłoczone z precyzyjnym naciskiem na obrobione szkiełka nakrywkowe, aby stworzyć pożądany wzór. Z jednej strony, wywieranie zbyt dużego nacisku na stempel może skutkować nierównomiernym przenoszeniem białka i słabą wiernością wzoru z powodu wyboczenia filaru lub ugięcia między filarami, co prowadzi do kontaktu ze szkłem. Z drugiej strony, zastosowanie zbyt małego nacisku powoduje niewielki lub zerowy transfer białka i słabą wierność wzorca. Z tych powodów pożądany jest proces transferu, który można wykorzystać do konsekwentnego tworzenia wysokiej jakości mikrowzorów izolowanych wysp kropek w zaledwie jednym kroku.

Tutaj opisana jest metoda pośredniego mikrowzorowania wysp fluorescencyjnych punktów adhezji białek o rozmiarach mikronowych na żelu PAA, która jest bardziej spójna i wszechstronna niż poprzednio opracowane metody. Podczas gdy starsze metody pośredniego mikrowzorcowania polegają na przenoszeniu wzorców białkowych ze stempla PDMS na substrat pośredni, metoda wprowadzona tutaj wykorzystuje znaczniki PDMS zamiast tego jako naczynie do usuwania białka, a nie dodawania. Odbywa się to poprzez zasadniczą zmianę struktury używanych stempli PDMS. Zamiast tworzyć stemple, które składają się z wzoru równomiernie rozmieszczonych okrągłych filarów, w tej metodzie stemple składają się z wzoru równomiernie rozmieszczonych okrągłych otworów.

Dzięki tej nowej strukturze, powierzchnia tych znaczków PDMS może być następnie traktowana aldehydem glutarowym, jak opisano wcześniej20,29,30, dzięki czemu stempel może wiązać się kowalencyjnie z białkiem. W przypadku stosowania na szklanym szkiełku nakrywkowym równomiernie pokrytym białkiem fluorescencyjnym, te stemple PDMS poddane działaniu aldehydu glutarowego służą do usunięcia większości białka z powierzchni szkiełka nakrywkowego, pozostawiając tylko pożądany wzór kropek z góry określony przez położenie otworów o wielkości mikronów na stemplu. Ta zmiana zwiększa wskaźnik powodzenia generowania wzorców składających się z niemal ciągłej siatki kropek oraz tworzenia izolowanych wysp kropek za pomocą tylko jednego kroku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Tworzenie matryc silikonowych

UWAGA: Większość procesu projektowania, tworzenia i rozwiązywania problemów związanych z formami matrycami z krzemu do wielokrotnego odlewania stempli z PDMS została omówiona wcześniej21, dlatego w niniejszej sekcji opisane zostaną jedynie kluczowe różnice w nowym podejściu.

  1. Opracuj projekt fotomaski za pomocą programu AutoCAD lub podobnego oprogramowania do projektowania. Pokryj jedną stronę fotomaski (cienkiego kawałka szkła) cienką warstwą chromu, aby kontrolować rozpraszanie światła UV. Zaprojektuj fotomaskę w taki sposób, aby naświetlenie wybranego fotorezystu światłem UV przez maskę pozwoliło na stworzenie silikonowej formy z odwróceniem cech pożądanych w końcowych stemplach PDMS. Projekt tej maski przedstawiono na Rysunku 1.
    UWAGA: To, czy pożądane cechy, czy obszar poza nimi powinny być przezroczyste na fotomasce, zależy od wybranego fotorezystu. Tutaj zastosowano SU-8 2005 (UWAGA: łatwopalny, drażniący dla skóry i oczu; trzymać z dala od źródeł ciepła/płomieni/iskier i używać rękawic oraz okularów ochronnych podczas pracy), który jest fotorezystem negatywowym umożliwiającym tworzenie cech o wysokości 5 µm z niemal pionowymi ściankami bocznymi.
    1. Utwardź negatywowy fotorezyst poprzez naświetlanie światłem UV i usunięcie nieutwardzonego SU-8 za pomocą rozpuszczalnika chemicznego. W związku z tym zaprojektuj główne cechy maski jako przezroczyste, podczas gdy otaczający obszar maski ma być nieprzezroczysty.
    2. Dla tej nowej metody usuwania zaprojektuj fotomaskę tak, aby składała się z dwóch kwadratów o wymiarach 1,5 x 1,5 cm (Rysunek 1A), z czego jeden wypełniony jest równomierną siatką kółek o średnicy 2 µm rozstawionych co 6 µm od środka do środka, a drugi składa się z wielu kwadratowych wysp, które są mniejszymi, izolowanymi wersjami tego samego wzoru siatki (Rysunek 1B). Wykonaj wyspy o następujących rozmiarach: 6 x 6 punktów, 12 x 12 punktów, 25 x 25 punktów oraz 42 x 42 punkty.
      UWAGA: Średnicę punktów adhezyjnych (2 µm) wybrano na podstawie poprzednich badań, w których mierzono siły trakcyjne komórek22,23. Maska użyta w tej procedurze ma wymiary 101,6 x 101,6 mm i jest pokryta z jednej strony warstwą chromu o grubości 0,06 µm, co jest zalecane ze względu na małe elementy formy. Fotomaska użyta w tym doświadczeniu została zamówiona w zewnętrznej firmie zajmującej się drukowaniem fotomasek.
  2. W pomieszczeniu typu cleanroom równomiernie pokryj wybraną płytkę krzemową fotorezystem. Jako opcjonalny krok, poddaj powierzchnię płytki działaniu ashera plazmowego przed nałożeniem rezystu.
    UWAGA: Zastosowano płytki o średnicy 100 mm. Obróbka w asherze plazmowym sprawia, że płytka lepiej wiąże się z SU-8 i pomaga zapobiegać delaminacji SU-8 z płytki.
  3. Wykonaj następujące kroki zgodnie z instrukcjami producenta fotorezystu:
    1. Podwiruj pokrytą płytkę, aby uzyskać pożądaną grubość warstwy, dostosowując czas wirowania do wymaganej grubości i rodzaju rezystu. Dla SU-8 2005 o grubości 5 µm podziel zalecany program wirowania na następujące trzy etapy:
      1. Pokryj płytkę fotorezystem, wirując z prędkością 500 RPM przez 10 s przy rampie 100 RPM/s.
      2. Zredukuj grubość rezystu do około 5 µm, wirując płytkę z prędkością 3 000 RPM przy rampie 300 RPM/s przez 30 s.
      3. Powoli zatrzymaj płytkę po wirowaniu, redukując prędkość do 0 RMP przy rampie 500 RPM/s przez 1 s.
    2. Przygotuj rezyst do naświetlania UV, wygrzewając go krótko na płycie grzejnej o temperaturze 95 °C. Dostosuj czas przebywania na płycie grzejnej do pożądanej grubości rezystu; czas wygrzewania dla SU-8 2005 o grubości 5 µm wynosi 2 min.
    3. Naświetl rezyst światłem UV, aby w pełni utwardzić pożądane cechy. Unikaj prześwietlenia, ponieważ może to sprawić, że SU-8 stanie się kruchy i wpłynie na ogólną jakość otrzymanej formy.
      1. Użyj energii naświetlania 105 mJ/cm2 dla SU-8 2005 o grubości 5 µm. Na podstawie mocy dostępnej lampy UV oblicz czas naświetlania, dzieląc energię naświetlania przez moc lampy w mW.
        UWAGA: Ponieważ lampa użyta tutaj ma moc 8 mW, czas naświetlania powinien wynosić 13,1 s.
    4. Aby utrwalić cechy SU-8 po wywoływaniu, ponownie wygrzej płytkę na płycie grzejnej o temperaturze 95 °C, tym razem przez 3 min. Jeśli rezyst został prawidłowo naświetlony, pożądane cechy formy powinny pojawić się w ciągu 1 min podczas tego etapu wygrzewania.
    5. Usuń nieutwardzony SU-8 z płytki krzemowej za pomocą wywoływacza SU-8. Dokładnie usuń nieutwardzony SU-8, ponieważ może on utknąć pomiędzy mikrostrukturami na płytce.
      UWAGA: Wywoływacz SU-8 jest łatwopalny i drażniący dla skóry oraz oczu; trzymać go z dala od źródeł ciepła/płomieni/iskier i używać rękawic oraz okularów ochronnych podczas pracy.
    6. Po wywoływaniu przepłucz płytkę acetonem, aby usunąć nadmiar wywoływacza, a następnie całkowicie wysusz ją za pomocą pistoletu z azotem.
      UWAGA: Aceton jest łatwopalny i drażniący dla skóry oraz oczu; trzymać go z dala od płomieni/iskier i używać rękawic oraz okularów ochronnych podczas pracy.
    7. Opcjonalnie, w przypadku SU-8 2005, wygrzej płytkę na płycie grzejnej o temperaturze 200 °C przez 10 min.
      UWAGA: To twarde wygrzewanie zwiększa wytrzymałość mechaniczną fotorezystu.
  4. Po ostygnięciu umieść płytkę w tacy do przenoszenia płytek, a następnie odlej ją w PDMS. Najpierw wykonaj zabieg silanizacji płytki, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wiązania cech SU-8 krzemowej formy z PDMS, a tym samym zapobiec ich odrywaniu się od powierzchni płytki.
    1. Aby przeprowadzić silanizację powierzchni, umieść formę i małą szklaną podstawkę w deskryptorze przeznaczonym wyłącznie do pracy z silanami. Nanieś 1-2 małe krople trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silanu na podstawkę, zamknij deskryptor i poddaj działaniu próżni przez 30 min przy ciśnieniu 4 500 Pa24.
      UWAGA: Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silan jest łatwopalny i drażniący dla skóry oraz oczu; trzymać go z dala od źródeł ciepła/płomieni/iskier, używać rękawic i okularów ochronnych podczas pracy oraz pracować pod wyciągiem.
    2. Wyłącz próżnię i pozostaw formę oraz podstawkę w deskryptorze przez kolejne 30 min.
      UWAGA: Forma jest teraz gotowa do odlewania w PDMS.

2. Subtraktywne mikrostrukturalne drukowanie kontaktowe

  1. Wymieszaj PDMS w odpowiednim stosunku utwardzacza do bazy zgodnie z instrukcjami producenta. Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej i pod ciśnieniem atmosferycznym przez 15 min, a następnie odgazuj w próżni przez 15 min.
  2. Wlej PDMS do formy matrycowej i umieść ją w inkubatorze ustawionym na 37 °C w celu utwardzenia przez noc.
  3. Wyjmij matrycę z inkubatora i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej.
  4. Podczas stygnięcia matrycy poddaj 25 mm szkiełka nakrywki sonikacji w etanolu przez 10 min. Użyj takiej liczby szkiełek, jaka odpowiada liczbie przygotowywanych stempli.
  5. Dokładnie opłucz 25 mm szkiełka nakrywki wodą dejonizowaną (DI) i wysusz za pomocą pistoletu z filtrowanym powietrzem.
  6. Odtwarzaj powierzchnię szkiełek nakrywek w urządzeniu do plazmy przez 1 min w próżni na wysokim ustawieniu (moc częstotliwości radiowej 30 W). Należy powoli wypuścić próżnię po zakończeniu procesu, aby zapobiec przesuwaniu się szkiełek wewnątrz komory.
    UWAGA: Obróbka plazmowa powierzchni szkła służy dwóm celom: oczyszcza powierzchnię szkła z zanieczyszczeń oraz generuje polarne grupy tlenowe na powierzchni szkła, czyniąc ją hydrofobową25. Ta hydrofobowość sprawia, że powierzchnia szkła jest bardziej podatna na wiązanie białek.
  7. W pomieszczeniu pozbawionym bezpośredniego światła słonecznego lub oświetlenia górnego, pokryj każde szkiełko 100 µL roztworu białka znakowanego fluorescencyjnie o stężeniu co najmniej 100 µg/mL, przykryj w celu dodatkowej ochrony przed światłem i pozostaw na 20 min.
    UWAGA: W tym przypadku zastosowano fibronektynę wyizolowaną z ludzkiej plazmy i zabarwioną barwnikiem AlexaFluor 488.
    1. Aby zabarwić fibronektynę, połącz nieznabarwioną fibronektynę o znanym stężeniu i objętości z odpowiednią ilością barwnika fluorescencyjnego w probówce 1,5 mL. Przykryj probówkę folią aluminiową, aby chronić barwnik przed światłem, i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 h, delikatnie mieszając co 10 min poprzez 5-10 krotne odwrócenie probówki dnem do góry.
      UWAGA: Wymagana ilość barwnika zależy od rodzaju zastosowanego barwnika i masy użytego białka. Patrz Supplemental File 1 w celu skorzystania z kalkulatora służącego do wyznaczenia odpowiedniej ilości barwnika dla fibronektyny znakowanej Alexa 488. Zgodnie z instrukcjami producenta, nadmiar barwnika można odfiltrować przy użyciu kolumn odsolających (patrz Table of Materials).
  8. Dokładnie opłucz każde szkiełko wodą DI i usuń nadmiar wody z powierzchni, delikatnie uderzając krawędziami każdego szkiełka o ręcznik papierowy lub inny materiał chłonny. Pozostaw nieprzykryte szkiełka w ciemności przez co najmniej 30 min, aby całkowicie wyschły.
  9. Podczas schnięcia pokrytych białkiem szkiełek, oddziel stempel PDMS od matrycy, odcinając go skalpelem lub innym ostrym ostrzem.
    UWAGA: Zaleca się, aby nie próbować przeciąć PDMS za pierwszym razem, ponieważ zastosowanie tak dużego nacisku może spowodować pęknięcie wafla krzemowego i uszkodzenie matrycy.
  10. Obrób plazmowo stemple PDMS przez 2 min w próżni na wysokim ustawieniu (moc częstotliwości radiowej 30 W).
  11. Wewnątrz dygestorium umieść stemple w pojemniku z pokrywką i pokryj każdy stempel bardzo cienką warstwą (<100 µL) 10% (3-aminopropyl)trimethoxysilane (3-APTMS) rozcieńczonego w 100% etanolu.
    OSTROŻNIE: 3-APTMS jest łatwopalny i działa drażniąco na skórę i oczy; trzymać z dala od otwartego ognia/iskier, podczas pracy używać rękawic ochronnych i okularów oraz pracować pod dygestorium. Zbyt obfite nałożenie roztworu 3-APTMS spowoduje powstanie pomarańczowego filmu w późniejszym etapie procesu. Ta obróbka powierzchniowa 3-APTMS wprowadza funkcjonalność aminową do powierzchni stempla PDMS, co umożliwi późniejszą derywatyzację powierzchni stempla26.
  12. Przykryj pojemnik ze stemplami i pozostaw je w temperaturze pokojowej na 5 min.
  13. Za pomocą wody DI dokładnie opłucz każdy stempel z obu stron.
  14. Umieść stemple w czystym pojemniku i obficie pokryj 2,5% glutaraldehydem w wodzie DI.
    OSTROŻNIE: Glutaraldehyd jest toksyczny; podczas pracy używaj rękawic ochronnych i okularów oraz pracuj pod dygestorium). Ta obróbka glutaraldehydem wraz z wcześniejszą obróbką 3-APTMS zapewnia grupy aldehydowe na powierzchni stempli PDMS, które mogą reagować z grupami aminowymi w białkach, tworząc wiązanie aminy wtórnej, co jest kluczowe dla procesu usuwania białek27.
  15. Przykryj stemple, pozostaw je w temperaturze pokojowej przez 30 min, a następnie ponownie dokładnie opłucz wodą DI. Usuń nadmiar wody z powierzchni stempli w ten sam sposób, co w przypadku szkiełek, i pozwól stemplom wyschnąć bez przykrycia przez ok. 30 min.
  16. Po 30 min sprawdź, czy zarówno pokryte białkiem szkiełka, jak i stemple są suche. Jeśli któraś z tych powierzchni nie jest całkowicie sucha, użyj pistoletu z filtrowanym powietrzem do ich całkowitego wysuszenia, dbając o to, aby szkiełka nie były wystawione na działanie światła przez dłuższy czas.
  17. Gdy szkiełka i stemple będą już suche, dociśnij stemple stroną z wzorem do szkiełek z naciskiem wystarczającym do pełnego kontaktu stempli z powierzchnią szkiełka. Pozostaw stemple w kontakcie ze szkiełkami przez 15 min.
    UWAGA: Dzięki kowalencyjnemu wiązaniu amidowemu między stemplami z glutaraldehydem a warstwą białek na szklanym szkiełku — które jest znacznie silniejsze niż słabe oddziaływania hydrofobowe między warstwą białek a szklanym szkiełkiem — białka powinny odkleić się od szkła zgodnie ze wzorem na stemplu PDMS po jego usunięciu.
  18. Po 15 min ostrożnie oddziel stemple PDMS od szkiełek.
    UWAGA: Jeśli proces usuwania przebiegł prawidłowo, stemple nie powinny odchodzić od szkiełek bez żadnego oporu, ale nie mogą być również tak mocno przytwierdzone, aby nie można ich było usunąć bez użycia nadmiernej siły.
  19. Sprawdź wierność wzoru na szkiełkach, używając odpowiedniego filtra w mikroskopie fluorescencyjnym (w zależności od tego, jakim barwnikiem fluorescencyjnym znakowano białka).
  20. Użyj wzorzystych szkiełek niezwłocznie lub przechowuj je w miejscu chronionym przed bezpośrednim światłem.

3. Aktywowane szkiełka nakrywki

UWAGA: W tym kroku przygotowuje się dolne szkiełka cover-slip do zastosowania w komorze eksperymentalnej dla żeli PAA. Dolne szkiełko jest specjalnie traktowane, aby żel PAA pozostał do niego trwale przytwierdzony podczas usuwania górnego, wzorowanego szkiełka w procesie tworzenia wzorów. Podobne techniki opisano również w innych źródłach10,12,15,28.

  1. Poddać działaniu ultradźwięków szkiełka podstawowe 30 mm w 100% etanolu przez 10 min, wypłukać wodą DI, a następnie dokładnie osuszyć pistoletem z filtrowanym powietrzem. Przygotować do 6 szkiełek jednocześnie w jednej partii w płytce 6-dołkowej.
  2. Poddać szkiełka obróbce plazmowej przez 1 min na wysokiej mocy (moc częstotliwości radiowej 30 W), a następnie umieścić każde szkiełko w dołku płytki 6-dołkowej.
  3. Pokryć każde szkiełko bardzo cienką warstwą 5% APTMS w etanolu w komorze dyfuzyjnej.
    UWAGA: W przypadku nadmiernego pokrycia w tym procesie powstanie pomarańczowy osad.
  4. Przykryć płytkę 6-dołkową i pozostawić szkiełka na 5 min.
  5. Dokładnie wypłukać szkiełka (z obu stron) oraz wnętrze każdego dołka wodą DI i usunąć nadmiar wody z dołków.
  6. Umieścić szkiełka z powrotem w płytce 6-dołkowej i dodać około 2 mL 0,5% glutaraldehydu w wodzie DI.
  7. Przykryć płytkę 6-dołkową i pozostawić szkiełka w roztworze glutaraldehydu na 30 min; następnie dokładnie wypłukać zarówno szkiełka, jak i dołki każdej płytki wodą DI.
  8. Przechowywać poddane obróbce szkiełka w wodzie DI w płytkach 6-dołkowych do dwóch tygodni lub użyć ich niezwłocznie. Przed użyciem upewnić się, że szkiełka są całkowicie suche.

4. Wytwarzanie żelu PAA i transfer wzoru

UWAGA: Po przygotowaniu preparatów z wzorowanymi szkiełkami kryształkami, należy niezwłocznie (<24 h) przenieść wzory białkowe na hydrożel PAA1,29,30. Poniższa receptura dotyczy żelu PAA o module Younga wynoszącym 3.6 kPa. Ilości bis-akryloamidu, akryloamidu i wody DI można zmieniać w celu dostosowania sztywności żeli PAA12.

  1. Tuż przed rozpoczęciem przygotowywania prekursora hydrożelu PAA, wyjmij ester N-hydroksysukcynimidowy (NHS) kwasu akrylowego z lodówki, aby osiągnął temperaturę pokojową przed otwarciem. Przygotuj zestaw wymiennych szalek z szkiełkami podstawowymi, sterylizując go 70% etanolem i pozostawiając pod światłem UV w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez co najmniej 30 min przed użyciem.
    OSTROŻNIE: NHS jest toksycznym środkiem drażniącym skórę i oczy; podczas pracy z nim należy używać rękawic ochronnych i okularów oraz pracować pod wyciągiem.
    1. Do probówki stożkowej o pojemności 15 mL dodaj 1,25 mL 40% akryloamidu w wodzie DI.
      OSTROŻNIE: Akryloamid jest toksycznym środkiem drażniącym skórę i oczy; podczas pracy z nim należy używać rękawic ochronnych i okularów oraz pracować pod wyciągiem.
    2. Do tej samej probówki (krok 4.1.1) dodaj 175 µL roztworu bis-akryloamidu w wodzie DI.
      OSTROŻNIE: Bis-akryloamid jest toksycznym środkiem drażniącym skórę i oczy; podczas pracy z nim należy używać rękawic ochronnych i okularów oraz pracować pod wyciągiem.
    3. Dodaj 500 µL 10x fosforanowego buforu solnego (PBS).
      OSTROŻNIE: PBS jest środkiem drażniącym oczy; podczas pracy należy używać rękawic ochronnych i okularów.
    4. Dodaj 2,915 mL wody DI.
  2. Pipetuj 969 µL tego prekursora do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL, a resztę przechowuj w temperaturze 4 °C do dwóch tygodni.
  3. Odważ ~50-100 mg persiarczanu amonu (APS) do drugiej probówki do mikrocentryfugi i rozcieńcz go w wodzie DI do stężenia 100 mg/mL; odstaw do późniejszego użycia. Otwórz ester NHS (obecnie w temperaturze pokojowej) pod wyciągiem i ostrożnie odważ do 3 mg NHS do probówki do mikrocentryfugi. Rozcieńcz ester NHS do stężenia 1 mg/mL w 1x PBS.
    OSTROŻNIE: APS jest środkiem drażniącym skórę i oczy; podczas pracy z nim należy używać rękawic ochronnych i okularów oraz pracować pod wyciągiem. Zarówno APS, jak i ester NHS ulegają z czasem hydrolizie, co powoduje zmienność aktywności tych substancji w roztworze stokowym. Dlatego oba te roztwory muszą być przygotowywane na świeżo za każdym razem (w przeciwieństwie do reszty prekursora).
  4. Następne trzy kroki wykonaj pod wyciągiem:
    1. Do probówki do mikrocentryfugi zawierającej alikwot 969 µL prekursora PAA dodaj 2 µL tetrametyloetylenodiaminy (TEMED).
      OSTROŻNIE: TEMED jest łatwopalnym środkiem drażniącym skórę i oczy; należy go trzymać z dala od źródeł ciepła, ognia i iskier, podczas pracy używać rękawic ochronnych i okularów oraz pracować pod wyciągiem. TEMED jest jednym z dwóch czynników sieciujących kluczowych dla polimeryzacji hydrożelu PAA, drugim jest APS.
    2. Dodaj 15 µL 1 M kwasu solnego, aby obniżyć pH roztworu hydrożelu i uniknąć hydrolizy estru NHS.
      OSTROŻNIE: Kwas solny jest żrącym środkiem drażniącym skórę i oczy; podczas pracy z nim należy używać rękawic ochronnych i okularów oraz pracować pod wyciągiem.
    3. Do probówki dodaj 10 µL roztworu estru NHS.
      UWAGA: NHS jest kluczowy dla procesu wzorowania. Reaguje on z grupami aminowymi w białkach na wzorowanym szkiełku podstawowym, tworząc trwałą wiązanie amidowe, co pozwala na przeniesienie wzoru ze szklanego szkiełka na powierzchnię żelu PAA podczas jego polimeryzacji31.
  5. Ostatnie kroki wykonaj w komorze z laminarnym przepływem powietrza:
    1. Ostrożnie umieść 30 mm szkiełko podstawowe w metalowej części zestawu szalek (stroną traktowaną 3-APTMS i glutaraldehydem do góry) i przykręć plastikowy pierścień na górze. Przygotuj wzorowane szkiełko tak, aby można było do niego łatwo sięgnąć w następnym kroku, nadal chroniąc je w miarę możliwości przed światłem.
    2. Pipetuj 5 µL roztworu APS do pozostałej części prekursora PAA w probówce do mikrocentryfugi, odwróć probówkę, aby wymieszać, a następnie natychmiast pipetuj 35 µL tego roztworu na 30 mm szkiełko podstawowe.
    3. Połóż wzorowane szkiełko stroną z białkiem do dołu na roztwór, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza w hydrożelu. Chroń hydrożel przed światłem i pozostaw do polimeryzacji na 90 min.
    4. Po spolimeryzowaniu hydrożelu użyj żyletki lub skalpela, aby usunąć górne szkiełko, upewniając się, że szkiełko nie zsunie się z żelu ani nie spadnie z powrotem na żel po jego usunięciu, ponieważ zniszczy to wzór na powierzchni żelu.
      UWAGA: Nie pozostawiaj żelu nieprzykrytego w miejscu o znacznym przepływie powietrza (np. w komorze z laminarnym przepływem powietrza).
    5. Aby pasywować pozostały w hydrożelu ester NHS, dodaj do żelu 2 mL sterylnego PBS i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 45 min. Natychmiast przygotuj żele do eksperymentów lub przechowuj je przez noc w sterylnym PBS w temperaturze 4 °C do czasu użycia.

5. Obrazowanie

  1. Aby przygotować się do eksperymentów z komórkami, włącz ogrzewanie (37 °C) i nawilżanie (70%) w mikroskopie po południu w dniu poprzedzającym planowany eksperyment, aby umożliwić wyrównanie temperatury elementów wewnątrz komory mikroskopu.
    UWAGA: Krok ten minimalizuje dryft w osi z spowodowany wahaniami temperatury.
  2. Bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentu włącz źródło CO2 w komorze.
  3. Aby zapobiec dryftowi w osi x-y spowodowanemu wielokrotnym ruchem stolika mikroskopu podczas eksperymentu, przymocuj do stolika za pomocą dwustronnej taśmy wymienny zestaw szalek z lamellkami zawierający hydrożel z wysianymi komórkami.
  4. Przejrzyj żel, aby znaleźć interesujące pola widzenia do obrazowania, zapisując pozycję stolika dla każdego z wybranych fragmentów.
  5. Zarówno w trybie jasnego pola, jak i w trybie fluorescencji odpowiadającym znakowanemu białku, skonfiguruj oprogramowanie mikroskopu tak, aby wykonywać obraz każdego pola raz na 5 min przez 2 h.

6. Analiza obrazu

UWAGA: Opracowano system umożliwiający pomiar odkształcenia wzorcowanych żeli PAA poprzez wyznaczanie położenia punktów trakcyjnych, interpolację początkowych położeń punktów odkształconych, a następnie obliczenie komórkowych sił trakcyjnych w każdym z tych miejsc. Można użyć dowolnego systemu oprogramowania zdolnego do przetwarzania obrazów i obliczeń numerycznych. Program ma na celu szybkie wyznaczanie sił trakcyjnych, eliminując wprowadzanie danych przez użytkownika oraz procedury wstępnego przetwarzania, które mogłyby przyczynić się do błędów wynikających z czynników ludzkich. Kod wykorzystany w tej procedurze jest dostępny jako Pliki uzupełniające 2-10, a pliki te, wraz z zestawem obrazów ćwiczeniowych, można pobrać ze strony www.bu.edu/mml/downloads.

  1. W oprogramowaniu do przetwarzania obrazów otwórz wszystkie pojedyncze obrazy wykonane podczas eksperymentu timelapse dla każdego użytego widoku mikroskopu w kolejności, od pierwszego do ostatniego przechwyconego obrazu, i połącz je w jeden stos obrazów (klikając Image | Stacks | Images to Stack). Upewnij się, że istnieją dwa oddzielne stosy obrazów: jeden z widokiem komórek w świetle przechodzącym i jeden z widokiem fluorescencyjnym wzorca, do którego są one przytwierdzone.
    1. Jeśli w obrazach fluorescencyjnych występuje dryf (t.j. interesująca wyspa przemieszcza się w kierunku x i/lub y między poszczególnymi klatkami o >1-2 µm), najpierw przetwórz stos obrazów za pomocą wtyczki StackReg (P. Thévenaz, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne), aby ponownie wycentrować każdy obraz w stosie na podstawie pozycji pierwszego (klikając Plugins | StackReg |Translation | OK).
      UWAGA: Jest to kluczowe, ponieważ nawet dryf poniżej 1 µm może znacząco wpłynąć na końcowe obliczenia sił trakcyjnych, szczególnie w przypadku sztywniejszych żeli, gdzie ten dryf w osiach x-y wykracza poza zakres oczekiwanego szumu. Kod ten zapisze obrazy po usunięciu dryfu, z których można następnie utworzyć nowy stos obrazów do analizy.
  2. Wprowadź stosy obrazów w świetle przechodzącym i fluorescencyjnych do pliku CTFTimelapse.m (Supplemental File 2).
    1. W linii 7 określ katalog plików, w którym znajdują się stosy obrazów.
    2. W liniach 8 i 9 określ odpowiednio nazwy stosu obrazów fluorescencyjnych oraz odpowiadającego mu stosu w świetle przechodzącym.
    3. Określ sztywność żelu PAA (Pa):
      1. W liniach 11-14, które obejmują kilka różnych modułów sprężystości hydrożeli PAA najczęściej stosowanych, zakomentuj (wpisz % na początku linii) wszystkie wartości poza modułem sprężystości żelu w analizowanych obrazach. Alternatywnie dodaj moduł sprężystości, jeśli nie jest on obecny, i zakomentuj pozostałe (3658.19 Pa dla obrazów testowych).
    4. W linii 15 określ promień kropki (m) (1 × 10-6 m dla obrazów testowych).
    5. W linii 16 określ maksymalną możliwą średnicę kropki (µm) (2.5 µm dla obrazów testowych).
    6. Określ stosunek pikseli (µm/pixel):
      1. W liniach 17-20, które obejmują kilka różnych stosunków pikseli obrazu w zależności od wcześniej użytych konfiguracji obrazowania, zakomentuj (wpisz % na początku linii) wszystkie wartości poza stosunkiem pikseli dla analizowanych obrazów. Alternatywnie dodaj używany stosunek pikseli, jeśli nie jest on obecny, i zakomentuj pozostałe (0.1613 µm/pixel dla obrazów testowych).
    7. W liniach 35 i 87 określ katalog plików, w którym znajdują się niezbędne pliki do przetwarzania obrazów.
      UWAGA: Na podstawie stosu obrazów fluorescencyjnych kod wyznacza położenie każdej fluorescencyjnej kropki i śledzi ruch każdej z nich pomiędzy poszczególnymi obrazami w stosie20. Początkowa pozycja punktów naniesionych metodą mikrodruku kontaktowego jest znana, ponieważ nie odkształcają się one przy prawidłowym przeniesieniu na hydrożel32.
  3. Po tym, jak program znajdzie kropki, poczekaj na pojawienie się dwóch rysunków i jednego okna dialogowego. Użyj Rysunku 1, aby upewnić się, że program znalazł poprawne kropki i nie wykrył wielu kropek tam, gdzie ich nie było. Użyj Rysunku 2, aby wybrać siatkę prostokątną, która pomoże programowi zlokalizować i obliczyć komórkowe siły trakcyjne.
    UWAGA: Rysunek 1 to obraz komórki w świetle przechodzącym z nałożonymi kropkami znalezionymi przez program (które będą koloru czerwonego) (patrz Rysunek 3A). Rysunek 2 to obraz wyświetlający te same kropki, co na Rysunku 1, ale bez obrazu w świetle przechodzącym w tle.
    1. Poczekaj na komunikat w oknie dialogowym Press Enter After Selecting Point (Naciśnij Enter po wybraniu punktu) – gdzie każdy punkt jest jedną z czerwonych kropek znalezionych przez program – z jednym dużym przyciskiem wewnątrz opisanym jako Enter.
    2. Wybierz cztery różne kropki na Rysunku 2, aby stworzyć siatkę prostokątną wokół i obejmującą komórkę/klaster na danym wzorcu. Wybieraj każdą kropkę po kolei za pomocą lewego przycisku myszy i potwierdzaj wybór, naciskając przycisk Enter w wyżej wspomnianym oknie dialogowym. Policz, ile kropek znajduje się między pierwszą a drugą oraz między pierwszą a trzecią kropką, ponieważ program poprosi o te wartości po wybraniu wszystkich czterech kropek narożnych. Wprowadź te wartości w oknie poleceń (wpisz liczbę kropek i naciśnij klawisz enter na klawiaturze po wystąpieniu prośby).
  4. Po wybraniu siatki prostokątnej poczekaj, aż skrypt obliczy siły trakcyjne znalezione wewnątrz siatki na podstawie położenia kropek fluorescencyjnych. Należy zauważyć, że skrypt najpierw wyznacza wektor przemieszczenia (u) środka geometrycznego każdej kropki, a następnie oblicza odpowiadający mu wektor siły trakcyjnej (F) zgodnie z równaniem (1):
    Wzór na siłę równowagi statycznej, F=πEau/(2+ν−ν²), ilustrujący zasadę dynamiki płynów.    (1)
    Gdzie E to moduł Younga podłoża PAA, a to promień fluorescencyjnych markerów kropek, a ν to współczynnik Poissona podłoża PAA32. Równanie (1) zakłada, że podłoże jest nieskończoną elastyczną półprzestrzenią, że siły trakcyjne są przyłożone w centrum każdego kolistego markera kropki oraz że odstępy między markerami kropek są wystarczająco duże, aby ich poszczególne przemieszczenia nie oddziaływały na siebie23.
    UWAGA: W opisanych tutaj eksperymentach zastosowano markery kropek o promieniu a = 1 µm i odstępach od środka do środka wynoszących 6 µm. Powinny być obecne strzałki sił trakcyjnych wewnątrz komórki/klastra, skierowane do wewnątrz w stronę centrum komórki, natomiast w obszarze poza komórką/klastrem nie powinny występować strzałki trakcyjne (patrz Rysunek 3C-E). Strzałki trakcyjne skierowane na zewnątrz z wnętrza komórki/klastra lub wiele dużych strzałek trakcyjnych poza komórką świadczą o źle dobranej siatce prostokątnej.
  5. Po znalezieniu poprawnego pola trakcyjnego wybierz za pomocą kursora odpowiedni obszar zainteresowania (ROI) otaczający komórkę/klaster, który obejmuje wszystkie strzałki trakcyjne wewnątrz komórki.
    1. Aby narysować ROI, klikaj lewym przyciskiem myszy tyle razy, ile jest konieczne, by narysować wielokąt o żądanej liczbie boków; dostosuj kształt lub przesuń ROI po jego narysowaniu, klikając lewym przyciskiem odpowiednio w narożnikach lub na krawędziach. Po narysowaniu ROI wykonaj podwójne kliknięcie lewym przyciskiem myszy, aby przejść do następnego obrazu w stosie. Powtórz to dla wszystkich obrazów w stosie w świetle przechodzącym.
      UWAGA: Kod zapisze dane o sile trakcyjnej i przemieszczeniu dla każdego punktu czasowego w tym samym folderze, co oryginalne stosy obrazów, co umożliwi ich dalszą analizę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Do zastosowania w tej metodzie subtraktywnego mikrowzorowania przygotowano hydrożele PAA o module Younga E = 3.6 kPa i współczynniku Poissona ν = 0.445. Hydrożele wykonano o grubości ~100 µm, co umożliwia ich obrazowanie za pomocą zastosowanego tutaj układu optycznego, a jednocześnie zapobiega wyczuwaniu przez komórki sztywnego szkiełka przedmiotowego pod żelem, co mogłoby powodować problemy w badaniach skoncentrowanych na komórkowym wyczuwaniu sztywności23,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule opisano ulepszoną metodę pośredniego modelowania hydrożeli PAA. Podejście to opiera się na metodach, które były używane wcześniej 20,35,36,37,38,39,40,41,42. Podstawowa zmiana polega na tym, że stemple PDMS są t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować dr Paulowi Barbone z Wydziału Inżynierii Mechanicznej Uniwersytetu Bostońskiego za pomocne dyskusje i pomoc w analizie danych. Badanie to było wspierane przez grant NSF CMMI-1910401.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(3-aminopropylo)trimetoksysilanSigma Aldrich#281778
1,5 ml probówka do mikrowirówekFisher Scientific#05-408-129
Rurka stożkowa 15 mlFisher Scientific#05-539-12
4 x 4 w 0,060 kwarcowa chromowana maska fotograficzna LRAdvance Reproductions CorporationN/ASpecjalnie zaprojektowana maska
6-dołkowe płytkiFisher Scientific#07-200-83
AcetonFisher Scientific#A18P-4
Roztwór akrylamidu, 40%Sigma Aldrich#A4058
AlexaFluor 488Thermo Fisher#A20000
Nadsiarczan aminonuFisher Scientific#BP179-25
BisakryloamidFisher Scientific#PR-V3141
etanoluGreenfield Global#111000200C1GL
okrągłe 25 mmFisher Scientifc#12-545-102
Szkiełka nakrywkowe, okrągłe 30 mmWarner#64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 KameraHamamatsu#C10600-10B
Human PlasmaValley Biomedyczna#HP1051PSłuży do izolacji Kwas solny fibronektyny
, 1,0 NMillipore Sigma#1.09057
ImageJWayne Rasband#1.53n
Zestaw wymiennych naczyń nakrywkowychBioptechs#190310-35
Kim WipesFisher Scientific#06-666-11C
Maska AlingerKarl Suss#MA6
Matlab 2021Mathworks#R2021a
MetaMorph Podstawoweurządzenia molekularne#v7.7.1.0
Ester N-hydroksysukcynimiduSigma Aldrich#130672-5G
NucBlue Barwienie żywymi komórkamiThermo Fisher#R37605
Mikroskop odwrócony Olympus IX2-ZDCKolumny
PD-10GE Healthcare#52-1308-00
Photoresist Spinner HoodHeadway Research#PWM32
Środek do czyszczenia plazmyHarrick#PDC-001
Wytrawiacz plazmowyTePla#M4L
Prior Lumen 200Pro Źródło światłaPrior Scientific#L200
Wafle krzemowe, 100 mmWafel uniwersytecki#809
SU-8 2005Kayaku Advanced Materials Inc.
Deweloper SU-8Kayaku Advanced Materials Inc.
Sylgard 184 Elastomersilikonowy Essex Brownell#DC-184-1.1
TetrametyloetylenodiaminaFisher Scientific#BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silanSigma Aldrich#448931
UAPON-40XW340 ObiektywOlympus#N2709300
Ekspozycjana promieniowanie UVNewport#69910
Taca na wafle, 110 x 11 mmTed Pella, Inc.#19395-40
Szkiełka nakrywkowe z okrągłe odsalające Olympus#IX81 #NC9463827#NC9901158

Bibliografia

  1. Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  2. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  3. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), 55172(2013).
  4. Bhadriraju, K., et al. Activation of ROCK by RhoA is regulated by cell adhesion, shape, and cytoskeletal tension. Experimental Cell Research. 313 (16), 3616-3623 (2007).
  5. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  6. Ganz, A., et al. Traction forces exerted through N-cadherin contacts. Biology of the Cell. 98 (12), 721-730 (2006).
  7. Chopra, A., et al. Reprogramming cardiomyocyte mechanosensing by crosstalk between integrins and hyaluronic acid receptors. Journal of Biomechanics. 45 (5), 824-831 (2012).
  8. Winer, J. P., Chopra, A., Kresh, J. Y., Janmey, P. A. Substrate elasticity as a probe to measure mechanosensing at cell-cell and cell-matrix junctions. Mechanobiology of cell-cell and cell-matrix interactions. , Springer. Boston, MA. 11-22 (2011).
  9. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
  10. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), 32572(2012).
  11. Lavoie, T. L., et al. Disrupting actin-myosin-actin connectivity in airway smooth muscle as a treatment for asthma. Proceedings of the American Thoracic Society. 6 (3), 295-300 (2009).
  12. Kraning-Rush, C. M., et al. Quantifying traction stresses in adherent cells. Methods in Cell Biology. 110, 139-178 (2012).
  13. Halliday, N. L., Tomasek, J. J. Mechanical properties of the extracellular matrix influence fibronectin fibril assembly in vitro. Experimental Cell Research. 217 (1), 109-117 (1995).
  14. Harris, A. K., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
  15. Aratyn-Schaus, Y., et al. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (46), e2173(2010).
  16. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  17. Sniadecki, N. J., Chen, C. S. Microfabricated silicone elastomeric post arrays for measuring traction forces of adherent cells. Methods in Cell Biology. 83, 313-328 (2007).
  18. Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (4), 1484-1489 (2003).
  19. Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
  20. Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
  21. Polio, S. R., et al. Topographical control of multiple cell adhesion molecules for traction force microscopy. Integrative Biology. 6 (3), 357-365 (2014).
  22. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
  23. Maloney, J. M., et al. Influence of finite thickness and stiffness on cellular adhesion-induced deformation of compliant substrata. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 78 (1), Pt 1 041923(2008).
  24. Gilles, S. Chemical modification of silicon surfaces for the application in soft lithography. Technical Report Juel-4249. , Available from: https://www.osti.gov/etdeweb/biblio/21084355 (2007).
  25. Lim, K. B., Lee, D. C. Surface modification of glass and glass fibers by plasma surface treatment. Surface and Interface Analysis. 36, 254-258 (2004).
  26. Beal, J. H. L., Bubendorfer, A., Kemmitt, T., Hoek, I., Arnold, W. M. A rapid, inexpensive surface treatment for enhanced functionality of polydimethylsiloxane microfluidic channels. Biomicrifluidics. 6 (3), 36503(2012).
  27. Goddard, J. M., Erickson, D. Bioconjugation techniques for microfluidic biosensors. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394 (2), 469-479 (2009).
  28. Rajagopalan, P., et al. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophysical Journal. 87 (4), 2818-2827 (2004).
  29. Tang, X., Yakut Ali, M., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 3197-3206 (2012).
  30. Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2010).
  31. Rusmini, F., Zhong, Z., Feijen, J. Protein immobilization strategies for protein biochips. Biomacromolecules. 8 (6), 1775-1789 (2007).
  32. Polio, S. R., et al. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8 (1), 82-88 (2012).
  33. Buxboim, A., et al. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116(2010).
  34. Xu, H., et al. Focal adhesion displacement magnitude is a unifying feature of tensional homeostasis. Acta Biomaterialia. 113, 327-379 (2020).
  35. Shen, K., et al. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (22), 7791-7796 (2008).
  36. Eichinger, C. D., Hsiao, T. W., Hlady, V. Multiprotein microcontact printing with micrometer resolution. Langmuir. 28 (4), 2238-2243 (2012).
  37. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (22), e1065(2008).
  38. Zollinger, A. J., et al. Dependence of tensional homeostasis on cell type and on cell-cell interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (3), 175-184 (2018).
  39. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Extending microcontact printing as a microlithographic technique. Langmuir. 13 (7), 2059-2067 (1997).
  40. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  41. Rottmar, M., et al. Stem cell plasticity, osteogenic differentiation and the third dimension. Journal of Materials Science-Materials in Medicine. 21 (3), 999-1004 (2010).
  42. Desai, R. A., et al. Subcellular spatial segregation of integrin subtypes by patterned multicomponent surfaces. Integrative Biology. 3 (5), 560-567 (2011).
  43. Kim, S. H., Lee, S., Ahn, D., Park, J. Y. PDMS double casting method enabled by plasma treatment and alcohol passivation. Sensors and Actuators B: Chemical. 293, 115-121 (2019).
  44. Butler, J. P., Tolić-Nǿrrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  45. Canović, E. P., et al. Biomechanical imaging of cell stiffness and prestress with subcellular resolution. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 665-678 (2014).
  46. Stamenović, D., Smith, M. L. Tensional homeostasis at different length scales. Soft Matter. 16 (30), 6946-6963 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikrowzory białkowemikrodośladkowy drukhydrogele poliakrylamidowepomiar siły trakcyjnejstemple PDMSwzorowanie macierzy zewnątrzkomórkowejkształt skupiska komórekmikroskopia fluorescencyjnaadhezja ogniskowa
Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.