Artykuł metodologiczny

Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców

DOI:

10.3791/63628

⸱

17 lutego 2022

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Boston University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy ulepszenia standardowej metody pomiaru sił trakcyjnych komórek, opartej na drukowaniu mikrokontaktowym z pojedynczym krokiem subtraktywnego tworzenia wzorów układów punktowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej na miękkich hydrożelach. Metoda ta pozwala na prostsze i bardziej spójne wytwarzanie wzorów wyspowych, niezbędnych do kontrolowania kształtu klastrów komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia trakcyjna mikrowzorów pozwala na kontrolę kształtu pojedynczych komórek i klastrów komórek. Co więcej, możliwość modelowania w skali długości mikrometrów pozwala na wykorzystanie tych wzorzystych stref kontaktu do pomiaru sił trakcyjnych, ponieważ każda kropka z mikrowzorem pozwala na utworzenie pojedynczej ogniskowej adhezji, która następnie deformuje miękki, leżący pod spodem hydrożel. Podejście to zastosowano w przypadku szerokiego zakresu typów komórek, w tym komórek śródbłonka, komórek mięśni gładkich, fibroblastów, płytek krwi i komórek nabłonkowych.

Ta recenzja opisuje ewolucję technik, które pozwalają na drukowanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej na hydrożelach poliakrylamidowych w regularnym układzie kropek o określonym rozmiarze i odstępach. Ponieważ wzory w skali mikrometrycznej są trudne do bezpośredniego wydrukowania na miękkich podłożach, wzory są najpierw generowane na szkiełkach nakrywkowych ze szkiełka nakrywkowego, które są następnie wykorzystywane do przenoszenia wzoru do hydrożelu podczas żelowania. Po pierwsze, opisano oryginalne podejście do drukowania mikrokontaktowego w celu generowania tablic małych kropek na szkiełku nakrywkowym. Drugi krok, który usuwa większość wzorca, aby pozostawić wyspy małych kropek, jest wymagany do kontrolowania kształtów komórek i klastrów komórek na takich tablicach wzorzystych kropek.

Następnie, opisana jest ewolucja tego podejścia, która pozwala na generowanie wysp kropek za pomocą pojedynczego kroku subtraktywnego wzorca. To podejście jest znacznie uproszczone dla użytkownika, ale ma tę wadę, że skraca się żywotność formy wzorcowej potrzebnej do wykonania wzorów. Na koniec opisano podejścia obliczeniowe, które zostały opracowane do analizy obrazów przemieszczonych kropek i późniejszych pól trakcyjnych generowanych przez komórki, a także przedstawiono zaktualizowane wersje tych pakietów analitycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Większość fenotypów komórkowych wywiera siłę przyciągania na swoje otoczenie. Te siły trakcyjne są generowane przez kurczliwy cytoszkielet komórki, który jest siecią aktyny i miozyny oraz innych nitkowatych biopolimerów i białek sieciujących1,2,3,4. Siły generowane w komórce mogą być przenoszone do środowiska zewnątrzkomórkowego lub sąsiednich komórek, głównie za pośrednictwem białek transbłonowych, takich jak odpowiednio integryny i kadheryny5,6. To, w jaki sposób komórka rozprzestrzenia się lub kurczy - i wielkość sił trakcyjnych związanych z tymi ruchami - jest wynikiem intymnej rozmowy z otoczeniem, która w dużej mierze zależy od rodzaju i ilości białka obecnego w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)7,8 oraz sztywności ECM. Rzeczywiście, mikroskopia sił trakcyjnych stała się nieocenionym narzędziem do zrozumienia reakcji komórek na bodźce lokalne, takie jak sztywność podłoża, narzucone naprężenia mechaniczne i odkształcenia lub kontakt z innymi komórkami. Informacje te są bezpośrednio związane ze zrozumieniem chorób, takich jak rak i astma9,10,11,12.

System, który może być użyty do pomiaru wywołanego siłą deformacji podłoża o znanych właściwościach materiału, jest wymagany do obliczania sił trakcyjnych. Zmiany te muszą być śledzone w czasie, co wymaga zarówno technik obrazowania, jak i przetwarzania obrazu. Jedną z pierwszych metod stosowanych do określania sił trakcyjnych komórkowych była obserwacja i analiza skurczu hydrożeli kolagenowych wysianych komórkami, choć metoda ta była tylko półilościowa13. Inną, bardziej udoskonaloną metodą było zmierzenie sił trakcyjnych wywieranych przez pojedyncze ogniwa poprzez wyznaczenie sił wynikających z odkształcenia cienkiego arkusza silikonu14. Później opracowano bardziej ilościowe techniki pomiarowe, które pozwoliły również na stosowanie miękkich hydrożeli, takich jak poliakryloamid (PAA)12,15,16. W przypadku korzystania z tych miękkich materiałów, siły trakcyjne można było określić na podstawie wywołanego siłą przemieszczenia losowo przemieszczonych kulek osadzonych w hydrożelu oraz właściwości mechanicznych żelu16,17. Kolejnym postępem było opracowanie układów mikrosłupków wykonanych z miękkiego polidimetylosiloksanu (PDMS), dzięki czemu ich ugięcie można było zmierzyć i przekształcić na siłę za pomocą teorii wiązki18.

Na koniec, metody mikromodelowania miękkich hydrożeli zostały opracowane, ponieważ te podejścia pozwalają na kontrolę obszarów kontaktu dla adhezji komórek. Mierząc deformację mikrowzoru w obszarze styku komórki, można łatwo obliczyć siły pociągowe, ponieważ obraz referencyjny bez siły nie jest wymagany19. Metoda ta została szeroko przyjęta, ponieważ pozwala na pośrednie wzorowanie regularnego układu dyskretnych punktów adhezji białek fluorescencyjnych o rozmiarach mikronów na żelach PAA w celu pomiaru komórkowych sił trakcyjnych20. Aby obliczyć te siły, opracowano algorytm przetwarzania obrazu, który może śledzić ruchy każdej kropki z mikrowzorem bez konieczności wprowadzania danych przez użytkownika21.

Chociaż ta metoda jest prosta do tworzenia całych siatek wzorów kropek, jest bardziej skomplikowana, gdy pożądane są wzory izolowanych plam (lub wysp) kropek. Wyspy z mikrowzorami są przydatne, gdy potrzebna jest kontrola kształtu i do pewnego stopnia wielkości skupisk komórek. Aby utworzyć te wyspy, wyżej wymieniona metoda drukowania mikrokontaktowego wymaga dwóch odrębnych kroków: i) użycia jednego stempla PDMS do stworzenia wzoru kropek o wysokiej wierności na szkiełku nakrywkowym, a następnie ii) użycia drugiego innego stempla PDMS w celu usunięcia większości tych kropek, pozostawiając izolowane wyspy kropek21. Trudność w tworzeniu wysp tą oryginalną metodą jest spotęgowana przez fakt, że tworzenie spójnych wzorów siatki w pierwszym kroku procesu jest wyzwaniem samym w sobie. Stemple do mikrodruku składają się z szeregu okrągłych mikrosłupków, których średnica odpowiada pożądanemu rozmiarowi kropki. Stemple te są następnie powlekane równą warstwą białka, a następnie tłoczone z precyzyjnym naciskiem na obrobione szkiełka nakrywkowe, aby stworzyć pożądany wzór. Z jednej strony, wywieranie zbyt dużego nacisku na stempel może skutkować nierównomiernym przenoszeniem białka i słabą wiernością wzoru z powodu wyboczenia filaru lub ugięcia między filarami, co prowadzi do kontaktu ze szkłem. Z drugiej strony, zastosowanie zbyt małego nacisku powoduje niewielki lub zerowy transfer białka i słabą wierność wzorca. Z tych powodów pożądany jest proces transferu, który można wykorzystać do konsekwentnego tworzenia wysokiej jakości mikrowzorów izolowanych wysp kropek w zaledwie jednym kroku.

Tutaj opisana jest metoda pośredniego mikrowzorowania wysp fluorescencyjnych punktów adhezji białek o rozmiarach mikronowych na żelu PAA, która jest bardziej spójna i wszechstronna niż poprzednio opracowane metody. Podczas gdy starsze metody pośredniego mikrowzorcowania polegają na przenoszeniu wzorców białkowych ze stempla PDMS na substrat pośredni, metoda wprowadzona tutaj wykorzystuje znaczniki PDMS zamiast tego jako naczynie do usuwania białka, a nie dodawania. Odbywa się to poprzez zasadniczą zmianę struktury używanych stempli PDMS. Zamiast tworzyć stemple, które składają się z wzoru równomiernie rozmieszczonych okrągłych filarów, w tej metodzie stemple składają się z wzoru równomiernie rozmieszczonych okrągłych otworów.

Dzięki tej nowej strukturze, powierzchnia tych znaczków PDMS może być następnie traktowana aldehydem glutarowym, jak opisano wcześniej20,29,30, dzięki czemu stempel może wiązać się kowalencyjnie z białkiem. W przypadku stosowania na szklanym szkiełku nakrywkowym równomiernie pokrytym białkiem fluorescencyjnym, te stemple PDMS poddane działaniu aldehydu glutarowego służą do usunięcia większości białka z powierzchni szkiełka nakrywkowego, pozostawiając tylko pożądany wzór kropek z góry określony przez położenie otworów o wielkości mikronów na stemplu. Ta zmiana zwiększa wskaźnik powodzenia generowania wzorców składających się z niemal ciągłej siatki kropek oraz tworzenia izolowanych wysp kropek za pomocą tylko jednego kroku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tworzenie mistrzów silikonu

UWAGA: Większość procesu projektowania, tworzenia i rozwiązywania problemów z wzorcami krzemowymi do wielokrotnego formowania pieczęci PDMS została już omówiona wcześniej21, więc tutaj zostaną opisane tylko kluczowe różnice w tym nowym podejściu.

  1. Utwórz projekt fotomaski za pomocą programu AutoCAD lub podobnego oprogramowania do projektowania. Pokryj jedną stronę fotomaski, cienkim kawałkiem szkła, cienką warstwą chromu, aby kontrolować rozpraszanie światła UV. Zaprojektuj fotomaskę w taki sposób, aby świecenie przez nią światłem UV na wybrany fotorezystor stworzyło silikonowy wzorzec o odwrotności cech pożądanych na końcowych stemplach PDMS. Zobacz Rysunek 1 dla projektu tej maski.
    UWAGA: To, czy pożądane cechy, czy obszar poza nimi powinien być przezroczysty na fotomasce, zależy od wybranego fotorezystu. Zastosowany tutaj fotorezystor to SU-8 2005 (UWAGA: łatwopalny, działa drażniąco na skórę i oczy; przechowywać z dala od źródeł ciepła/płomieni/iskier, a podczas obsługi używać rękawic ochronnych i okularów), fotorezystor ujemny, który jest w stanie tworzyć elementy o wysokości 5 μm z prawie pionowymi ścianami bocznymi.
    1. Utwardź ujemny fotorezyst, wystawiając go na działanie światła UV i usuwając nieutwardzony SU-8 rozpuszczalnikiem chemicznym. Dlatego zaprojektuj podstawowe cechy maski tak, aby były przezroczyste, podczas gdy otaczający obszar maski jest nieprzezroczysty.
    2. W przypadku tej nowej metody usuwania zaprojektuj fotomaskę tak, aby składała się z dwóch kwadratów o wymiarach 1,5 x 1,5 cm (Rysunek 1A), jednego wypełnionego równą siatką okręgów o długości 2 μm rozmieszczonych od środka do środka, a drugiego składającego się z wielu kwadratowych wysp, które są mniejszymi, izolowanymi wersjami tego samego wzoru siatki (Rysunek 1B). Utwórz wyspy o następujących rozmiarach: 6 x 6 punktów, 12 x 12 punktów, 25 x 25 punktów i 42 x 42 kropki.
      UWAGA: Średnica punktów przylegania (2 μm) została wybrana na podstawie wcześniejszych badań, w których mierzono siły trakcji komórkowej22,23. Zastosowana tutaj maska ma wymiary 101,6 x 101,6 mm i jest pokryta z jednej strony warstwą chromu o grubości 0,06 μm, co jest zalecane ze względu na niewielkie cechy mistrza. Zastosowana tutaj fotomaska została zamówiona w zewnętrznej drukarni fotomasek.
  2. W pomieszczeniu czystym pokryj wybraną płytkę krzemową równomiernie fotorezystem. Opcjonalnie należy poddać płytkę działaniu środka do obróbki powierzchniowej w asherze plazmowym przed pokryciem jej powłoką resist.
    UWAGA: Tutaj używane są wafle o średnicy 100 mm. Obróbka w asherze plazmowym sprawia, że płytka jest bardziej podatna na wiązanie z SU-8 i pomaga zapobiegać rozwarstwianiu się SU-8 z płytki.
  3. Wykonaj następujące czynności zgodnie z instrukcjami producenta fotorezystu:
    1. Zakręć powlekaną płytkę, aby uzyskać pożądaną grubość elementu, zmieniając czas wirowania w zależności od pożądanej grubości i rodzaju oporu. W przypadku SU-8 2005 o grubości 5 μm należy podzielić zalecany program wirowania na następujące trzy kroki:
      1. Pokryj wafel fotorezystem, wirując z prędkością 500 obr./min przez 10 s z rampą 100 obr./min.
      2. Zmniejsz grubość rezystu do około 5 μm, obracając płytkę z prędkością 3 000 obr./min z rampą 300 obr./min przez 30 s.
      3. Powoli zwalniaj wafel po wirowaniu, zmniejszając prędkość do 0 RMP z rampą 500 RPM/s przez 1 s.
    2. Przygotuj rezystor do ekspozycji na promieniowanie UV, piecząc go krótko na płycie grzejnej o temperaturze 95 °C. Zmodyfikuj czas spędzony na płycie grzejnej zgodnie z pożądaną grubością rezystu; Czas pieczenia wynosi 2 minuty dla SU-8 2005 o grubości 5 μm.
    3. Wystaw rezystor na działanie światła UV, aby w pełni utwardzić pożądane cechy. Uważaj na prześwietlenie, ponieważ może to sprawić, że SU-8 stanie się kruchy i wpłynie na ogólną jakość powstałego wzorca.
      1. Użyj energii ekspozycji 105 mJ/cm2 dla SU-8 2005 o grubości 5 μm. Na podstawie mocy dostępnej lampy UV oblicz czas ekspozycji, dzieląc energię ekspozycji przez moc lampy w mW.
        UWAGA: Ponieważ zastosowana tutaj lampa ma moc 8 mW, czas naświetlania powinien wynosić 13,1 s.
    4. Aby ustawić funkcje SU-8 po opracowaniu, piecz ponownie na płycie grzejnej o temperaturze 95 °C, tym razem przez 3 minuty. Poczekaj, aż pożądane cechy wzorca pojawią się w ciągu 1 minuty podczas tego etapu pieczenia, jeśli rezystancja była prawidłowo odsłonięta.
    5. Usuń nieutwardzony SU-8 z płytki krzemowej za pomocą wywoływacza SU-8. Zachowaj ostrożność podczas usuwania nieutwardzonego SU-8, ponieważ może on utknąć między mikronowymi i rozstawionymi elementami na płytce.
      UWAGA: Wywoływacz SU-8 działa drażniąco na łatwopalną skórę i oczy; Trzymaj go z dala od źródeł ciepła/płomieni/iskier, a podczas obchodzenia się z nim używaj rękawic ochronnych i okularów.
    6. Po wywołaniu spłucz acetonem, aby usunąć nadmiar wywoływacza z płytki i całkowicie wysusz ją pistoletem do natryskiwania azotu.
      UWAGA: Aceton jest łatwopalnym środkiem drażniącym skórę i oczy; Trzymaj go z dala od płomieni/iskier i używaj rękawic ochronnych i okularów podczas obchodzenia się z nim.
    7. Opcjonalnie, dla SU-8 2005, piec na płycie grzewczej o temperaturze 200 °C przez 10 min.
      UWAGA: To twarde pieczenie zwiększa wytrzymałość mechaniczną fotorezystu.
  4. Po pozostawieniu do ostygnięcia włóż wafel do tacki na wafle, a następnie odlej go do PDMS. Po pierwsze, należy przeprowadzić zabieg silanizacji płytki, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wiązania się SU-8 z PDMS, a tym samym zmniejszenie prawdopodobieństwa usunięcia z powierzchni płytki.
    1. Aby zakończyć obróbkę powierzchni silanizacyjnej, umieść wzorzec i małe szklane szkiełko nakrywkowe w eksykatorze przeznaczonym do stosowania wyłącznie z silanami. Umieść 1-2 małe krople Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silanu na szkiełku nakrywkowym, zamknij eksykator i uruchom go pod próżnią przez 30 minut pod ciśnieniem 4,500 Pa24.
      UWAGA: Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silan jest łatwopalnym środkiem drażniącym skórę i oczy; Trzymaj go z dala od źródeł ciepła/płomieni/iskier, podczas obsługi używaj rękawic ochronnych i okularów oraz pracuj pod wyciągiem.
    2. Wyłączyć próżnię i pozostawić szkiełko główne i nakrywkowe w eksykatorze na kolejne 30 minut.
      UWAGA: Wzorzec jest teraz gotowy do rzutowania w PDMS.

2. Subtraktywny druk mikrokontaktowy

  1. Wymieszaj PDMS w odpowiednim stosunku utwardzacza do bazy zgodnie z instrukcjami producenta. Pozostaw w temperaturze i ciśnieniu pokojowym na 15 minut; Następnie odgazowuje się pod próżnią przez 15 minut.
  2. Wlać PDMS do urządzenia wzorcowego i umieścić go w inkubatorze nastawionym na 37 °C na noc w celu utwardzenia.
  3. Wyjmij urządzenie główne z inkubatora i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej.
  4. Podczas gdy mistrz stygnie, sonikować 25 mm szkiełka nakrywkowe w etanolu przez 10 minut. Użyj tylu szkiełek nakrywkowych, ile jest przygotowywanych stempli.
  5. Dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm wodą dejonizowaną (DI) i wysusz za pomocą pistoletu z filtrowanym powietrzem.
  6. Szkiełka nakrywkowe należy czyścić plazmowo przez 1 minutę za pomocą odkurzacza plazmowego pod wysokim ciśnieniem (moc częstotliwości radiowej 30 W). Pamiętaj, aby powoli uwalniać próżnię po zabiegu, aby zapobiec przesuwaniu się szkiełek nakrywkowych wewnątrz komory.
    UWAGA: Obróbka plazmowa powierzchni szkła służy dwóm celom: oczyszcza powierzchnię szkła w celu usunięcia zanieczyszczeń i generuje grupy polarne na bazie tlenu na powierzchni szkła, aby uczynić je hydrofobowym25. Ta hydrofobowość sprawia, że powierzchnia szkła jest bardziej podatna na wiązanie białek.
  7. W pomieszczeniu pozbawionym bezpośredniego światła słonecznego/górnego oświetlenia pokryj każde szkiełko nakrywkowe 100 μl roztworu białkowego znakowanego fluorescencyjnie o stężeniu co najmniej 100 μg/ml, przykryj dla dodatkowej ochrony przed światłem i pozostaw na 20 minut
    UWAGA: W tym przypadku stosuje się fibronektynę wyizolowaną z ludzkiego osocza i barwioną AlexaFluor 488.
    1. Aby zabarwić fibronektynę, połącz nieznakowaną fibronektynę o znanym stężeniu i objętości z odpowiednią ilością barwnika fluorescencyjnego w probówce o pojemności 1,5 ml. Przykryj probówkę folią aluminiową, aby chronić barwnik przed światłem i inkubuj go w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, delikatnie mieszając co 10 minut, obracając probówkę do góry nogami 5-10 razy.
      UWAGA: Wymagana ilość barwnika różni się w zależności od użytego barwnika i masy użytego białka. Zobacz plik uzupełniający 1, aby zapoznać się z kalkulatorem używanym do określania odpowiedniej ilości barwnika dla fibronektyny oznaczonej Alexa 488. Zgodnie z zaleceniami producenta nadmiar barwnika można odfiltrować za pomocą kolumn odsalających (patrz Tabela Materiałów).
  8. Dokładnie spłucz każde szkiełko nakrywkowe wodą DI i usuń nadmiar wody z powierzchni, delikatnie stukając bokami każdego szkiełka nakrywkowego o ręcznik papierowy lub podobnie chłonny materiał. Pozostaw szkiełka nakrywkowe odkryte w ciemności na co najmniej 30 minut, aby całkowicie wyschły.
  9. Gdy szkiełka nakrywkowe pokryte białkiem wyschną, usuń stempel PDMS z wzorca, przecinając go skalpelem lub innym ostrym ostrzem.
    UWAGA: Najlepiej nie próbować przecinać PDMS za pierwszym razem, ponieważ zastosowanie tak dużego nacisku spowoduje pęknięcie płytki krzemowej i uszkodzenie mastera.
  10. Plazma traktuje stemple PDMS przez 2 minuty w próżni na wysokim poziomie (moc częstotliwości radiowej 30 W).
  11. W dygestorium umieścić znaczki w pojemniku z pokrywką i pokryć każdy stempel bardzo cienką warstwą (<100 μl) 10% (3-aminopropylo)trimetoksysilanu (3-APTMS) rozcieńczonego w 100% etanolu.
    UWAGA: 3-APTMS jest łatwopalnym środkiem drażniącym skórę i oczy; Trzymaj go z dala od płomieni/iskier, podczas obsługi używaj rękawic ochronnych i okularów oraz pracuj pod wyciągiem. Nadmierne nałożenie roztworu 3-APTMS spowoduje powstanie pomarańczowego filmu w dalszej części tego procesu. Ta obróbka powierzchni 3-APTMS włącza funkcjonalność aminy do powierzchni stempla PDMS, co pozwoli na dalszą derywatyzację powierzchni stempla później26.
  12. Przykryj pojemnik stemplami i pozostaw je w temperaturze pokojowej na 5 minut.
  13. Używając wody DI, dokładnie spłucz każdy stempel po obu stronach.
  14. Umieść stemple w czystym pojemniku i obficie pokryj je 2,5% aldehydem glutarowym w wodzie DI.
    UWAGA: Aldehyd glutarowy jest toksyczny; Używaj rękawic ochronnych i okularów podczas obsługi i pracy pod wyciągiem). Ta obróbka aldehydem glutarowym wraz z poprzednią obróbką 3-APTMS zapewnia funkcje aldehydowe na powierzchni stempli PDMS, które mogą reagować z grupami aminowymi w białkach, tworząc drugorzędowe wiązanie aminowe, które ma kluczowe znaczenie dla procesu usuwania białek27.
  15. Przykryj stempele, pozostaw je w temperaturze pokojowej na 30 minut, a następnie ponownie dokładnie spłucz wodą DI. Usuń nadmiar wody z powierzchni stempli w taki sam sposób jak szkiełka nakrywkowe i pozostaw stemple do wyschnięcia bez przykrycia na ~30 min.
  16. Po 30 minutach sprawdź, czy zarówno szkiełka nakrywkowe pokryte białkiem, jak i stemple są suche. Jeśli którykolwiek z nich nie jest całkowicie suchy, użyj pistoletu na powietrze z filtrem, aby całkowicie je wysuszyć, upewniając się, że szkiełka nakrywkowe nie są wystawione na działanie światła przez dłuższy czas.
  17. Gdy zarówno szkiełka nakrywkowe, jak i stemple wyschną, dociśnij wzór stempli do dołu na szkiełka nakrywkowe z wystarczającym naciskiem, aby stemple w pełni stykały się z powierzchnią szkiełka nakrywkowego. Pozostawić stemple w kontakcie ze szkiełkami nakrywkowymi przez 15 min.
    UWAGA: Ze względu na kowalencyjne wiązanie amidowe między stemplem aldehydu glutarowego a warstwą białka na szklanym szkiełku nakrywkowym - które jest znacznie silniejsze niż słabe oddziaływania hydrofobowe między warstwą białka a szklanym szkiełkiem nakrywkowym - białka powinny odkleić się od szkła zgodnie ze wzorem na stemplu PDMS po jego usunięciu.
  18. Po 15 minutach ostrożnie odklej stemple PDMS od szkiełek nakrywkowych.
    UWAGA: Jeśli proces usuwania przebiegł prawidłowo, stemple nie powinny schodzić z szkiełek nakrywkowych bez oporu, ale też nie powinny być tak mocno przyklejone do szkiełek nakrywkowych, aby nie można było ich usunąć bez użycia nadmiernej siły.
  19. Sprawdź wierność wzorzystych szkiełek nakrywkowych za pomocą odpowiedniego filtra w mikroskopie fluorescencyjnym (w zależności od tego, jakim barwnikiem fluorescencyjnym oznaczone są białka).
  20. Wzorzyste szkiełka nakrywkowe należy zużyć natychmiast lub zachować i przechowywać z dala od bezpośredniego światła.

3. Aktywowane szkiełka nakrywkowe

UWAGA: Dolne szkiełka nakrywkowe do użytku w komorze doświadczalnej dla żeli PAA są wykonywane na tym etapie. To dolne szkiełko nakrywkowe jest specjalnie obrabiane, aby żel PAA pozostał bezpiecznie przylegający, gdy górne wzorzyste szkiełko nakrywkowe jest usuwane podczas procesu modelowania. Podobne techniki są również opisane w innym miejscu10,12,15,28.

  1. Szkiełka nakrywkowe o średnicy 30 mm zanurzać w 100% etanolu przez 10 minut, spłukiwać wodą DI, a następnie dokładnie wysuszyć pistoletem z filtrowanym powietrzem. Przygotuj do 6 szkiełek nakrywkowych na raz na partię na płytce 6-dołkowej.
  2. Plazma traktuje szkiełka nakrywkowe przez 1 minutę na wysokich obrotach (moc częstotliwości radiowej 30 W), a następnie umieszcza każde szkiełko nakrywkowe w studzience z 6-dołkową płytką.
  3. Pokryj każde szkiełko nakrywkowe bardzo cienką warstwą 5% APTMS w etanolu pod wyciągiem.
    UWAGA: W przypadku nadmiernego powlekania w tym procesie utworzy się pomarańczowy osad
    4. .
  4. Przykryj płytkę 6-dołkową i pozostaw szkiełka nakrywkowe na 5 minut.
  5. Dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe (po obu stronach) i wnętrze każdej studzienki wodą demineralizowaną i usuń nadmiar wody z wnętrza studzienek.
  6. Umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem w 6-dołkowej płytce i dodaj około 2 ml 0,5% aldehydu glutarowego do wody demineralizowanej.
  7. Przykryj płytkę 6-dołkową i pozostaw szkiełka nakrywkowe w roztworze aldehydu glutarowego na 30 minut; następnie dokładnie spłucz zarówno szkiełka nakrywkowe, jak i studzienki każdej płytki wodą demineralizowaną.
  8. Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w wodzie demineralizowanej w płytkach 6-dołkowych przez okres do dwóch tygodni lub natychmiast je zużyć. Przed użyciem upewnij się, że szkiełka nakrywkowe są całkowicie suche.

4. Wytwarzanie żelu PAA i transfer wzoru

UWAGA: Po wykonaniu wzorzystych szkiełek nakrywkowych, muszą one zostać użyte do przeniesienia tych wzorów białkowych do hydrożelu PAA wkrótce potem (<24 h)1,29,30. Poniższy przepis dotyczy żelu PAA o module Younga wynoszącym 3,6 kPa. Ilości bis-akrylamidu, akrylamidu i wody DI można zmieniać, aby dostosować sztywność żeli PAA12.

  1. Tuż przed rozpoczęciem wytwarzania prekursora hydrożelu PAA wyjmij ester N-hydroksysukcynimidu kwasu akrylowego (NHS) z lodówki, aby mógł osiągnąć temperaturę pokojową przed otwarciem. Przygotuj wymienny zestaw naczyń nakrywkowych, sterylizując je 70% etanolem i pozostawiając pod wpływem światła UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez co najmniej 30 minut przed użyciem.
    UWAGA: NHS działa drażniąco na skórę i oczy; Podczas obchodzenia się z nim należy używać rękawic ochronnych i okularów oraz pracować pod wyciągiem.
    1. Dodaj 1,25 ml 40% akrylamidu w wodzie DI do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Akrylamid działa toksycznie drażniąco na skórę i oczy; Podczas obchodzenia się z nim należy używać rękawic ochronnych i okularów oraz pracować pod wyciągiem.
    2. Dodać 175 μl roztworu bis-akrylamidu w wodzie demineralizowanej do tej samej probówki (krok 4.1.1).
      UWAGA: Bis-akrylamid działa toksycznie drażniąco na skórę i oczy; Podczas obchodzenia się z nim należy używać rękawic ochronnych i okularów oraz pracować pod wyciągiem.
    3. Dodać 500 μl 10x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
      UWAGA: PBS działa drażniąco na oczy; Podczas obsługi należy używać rękawic ochronnych i okularów.
    4. Dodaj 2,915 ml wody DI.
  2. Odpipetować 969 μl tego prekursora do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, a resztę przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni.
  3. Odmierz ~50-100 mg nadsiarczanu amonu (APS) w innej probówce do mikrowirówki i rozcieńcz ją w wodzie DI do 100 mg / ml; odłóż na bok do późniejszego wykorzystania. Otwórz ester NHS (teraz w temperaturze pokojowej) w okapie i ostrożnie odmierz do 3 mg NHS w probówce do mikrowirówki. Rozcieńczyć ester NHS do 1 mg/ml w 1x PBS.
    UWAGA: APS działa drażniąco na skórę i oczy; Podczas obchodzenia się z nim należy używać rękawic ochronnych i okularów oraz pracować pod wyciągiem. Zarówno APS, jak i ester NHS ulegają hydrolizie w czasie, powodując zmianę aktywności substancji chemicznych w roztworze podstawowym. Dlatego oba te roztwory muszą być za każdym razem przygotowywane na świeżo (w przeciwieństwie do reszty prekursora).
  4. Wykonaj kolejne trzy kroki w dygestorium:
    1. Dodać 2 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) do probówki mikrowirówki zawierającej 969 μl podwielokrotności prekursora PAA.
      UWAGA: TEMED jest łatwopalnym środkiem drażniącym skórę i oczy; Trzymaj go z dala od źródeł ciepła/płomienia/iskier, podczas obsługi używaj rękawic ochronnych i okularów oraz pracuj pod wyciągiem. TEMED jest jednym z dwóch środków sieciujących o krytycznym znaczeniu dla polimeryzacji hydrożelu PAA, drugim jest APS.
    2. Dodać 15 μl 1 M kwasu solnego, aby obniżyć pH roztworu hydrożelu i uniknąć hydrolizy estru NHS.
      UWAGA: Kwas solny działa żrąco drażniąco na skórę i oczy; Podczas obchodzenia się z nim należy używać rękawic ochronnych i okularów oraz pracować pod wyciągiem.
    3. Dodać 10 μl roztworu estru NHS do probówki.
      UWAGA: NHS ma kluczowe znaczenie dla procesu tworzenia wzorców. Będzie reagować z grupami aminowymi w białkach na wzorzystym szkiełku nakrywkowym, tworząc stabilne wiązanie amidowe, które pozwoli na przeniesienie wzoru ze szklanego szkiełka nakrywkowego na powierzchnię żelu PAA podczas polimeryzacji31.
  5. Wykonaj te ostatnie kroki w komorze bezpieczeństwa biologicznego:
    1. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe o średnicy 30 mm w metalowej części zestawu naczyń nakrywkowych (3-APTMS i stroną nasączoną aldehydem glutarowym do góry) i przykręć plastikowy pierścień na górze. Ustaw wzorzyste szkiełko nakrywkowe tak, aby było łatwo dostępne w następnym kroku, nadal chroniąc je przed światłem w jak największym stopniu.
    2. Odpipetować 5 μl roztworu APS do pozostałej części prekursora PAA w probówce do mikrowirówki, odwrócić go w celu wymieszania, a następnie natychmiast odpipetować 35 μl tego roztworu na szkiełko nakrywkowe o średnicy 30 mm.
    3. Upuść wzorzystą stronę z białka szkiełka nakrywkowego w dół na roztwór, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków powietrza w hydrożelu. Chronić hydrożel przed światłem i pozostawić do polimeryzacji przez 90 minut.
    4. Gdy hydrożel ulegnie polimeryzacji, użyj żyletki lub skalpela, aby usunąć górne szkiełko nakrywkowe, upewniając się, że szkiełko nakrywkowe nie zsunie się z żelu ani nie spadnie z powrotem na żel po jego usunięciu, ponieważ zniszczy to wzór na powierzchni żelu.
      UWAGA: Nie pozostawiaj żelu odkrytego w miejscu o znacznym przepływie powietrza (takim jak szafka bezpieczeństwa biologicznego).
    5. Aby pasywować pozostały ester NHS w hydrożelu, dodać 2 ml sterylnego PBS do żelu i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut. Natychmiast przygotować żele do eksperymentów lub przechowywać je przez noc w sterylnym PBS w temperaturze 4 °C do czasu użycia.

5. Obrazowanie

  1. Aby przygotować się do eksperymentów z komórkami, włącz ogrzewanie (37 °C) i wilgotność (70%) w mikroskopie po południu przed planowanym eksperymentem, aby umożliwić urządzeniom wewnątrz komory mikroskopu zrównoważenie się do wyższej temperatury.
    UWAGA: Ten krok minimalizuje dryft z spowodowany wahaniami temperatury.
  2. Tuż przed rozpoczęciem eksperymentu włącz źródło CO2 w komorze.
  3. Aby zapobiec dryfowaniu x-y spowodowanemu powtarzającym się ruchem stolika mikroskopu podczas eksperymentu, zamocuj wymienny zestaw nakrywek przytrzymujących hydrożel z nasionami komórek do stolika za pomocą taśmy dwustronnej.
  4. Przejrzyj żel, aby znaleźć interesujące go klatki do zobrazowania, zapisując każdą pozycję etapu sekcji, które mają być zobrazowane.
  5. Zarówno w widoku jasnego pola, jak i w widoku fluorescencyjnym odpowiadającym znakowanemu białku, ustaw oprogramowanie mikroskopu tak, aby obrazowało każdą klatkę raz na 5 minut przez 2 godziny.

6. Analiza obrazu

UWAGA: Opracowano system, który może mierzyć deformację wzorzystych żeli PAA, określając położenie punktów trakcyjnych, interpolując początkowe lokalizacje zdeformowanych punktów, a następnie obliczając siły trakcji komórkowej w każdym miejscu. Można zastosować dowolny system oprogramowania zdolny do przetwarzania obrazu i obliczeń numerycznych. Program ma na celu szybkie określenie sił uciągu, eliminując dane wejściowe użytkownika i procedury wstępnego przetwarzania, które mogłyby przyczynić się do błędów związanych z użytkownikiem. Użyty tutaj kod jest dostępny tutaj jako Pliki Uzupełniające 2-10, a pliki te, wraz z parą obrazów ćwiczeniowych, są dostępne pod adresem www.bu.edu/mml/downloads.

  1. W oprogramowaniu do przetwarzania obrazu otwórz wszystkie pojedyncze obrazy wykonane podczas eksperymentu poklatkowego z każdego użytego widoku mikroskopu w kolejności, od pierwszego do ostatniego zarejestrowanego obrazu, i zamień je w pojedynczy stos obrazów (klikając Obraz | Stosy | Obrazy do stosu). Upewnij się, że istnieją dwa oddzielne stosy obrazów: jeden z widoku jasnego pola komórek, a drugi z fluorescencyjnego widoku wzoru, do którego są dołączone.
    1. Jeśli obrazy fluorescencyjne występują dryfowania (tj. wyspa zainteresowania porusza się w kierunku x i/lub y między każdą klatką o >1-2 μm), najpierw przetwórz stos obrazów za pomocą wtyczki StackReg (P. Thévenaz, Szwajcarski Federalny Instytut Technologii w Lozannie), aby ponownie wyśrodkować każdy obraz w stosie na podstawie pozycji pierwszego (klikając Wtyczki | Reg stosu |Tłumaczenie | OK).
      UWAGA: Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ nawet dryft poniżej μm może znacząco wpłynąć na końcowe obliczenia sił pociągowych, szczególnie w przypadku sztywniejszych żeli, gdzie ten dryft x-y wykracza poza zakres oczekiwanego hałasu. Ten kod zapisze obrazy po usunięciu dryfu, które można następnie przekształcić w nowy stos obrazów do analizy.
  2. Wprowadź stosy obrazów jasnego pola i fluorescencji do CTFTimelapse.m (plik uzupełniający 2).
    1. Określ katalog plików, w którym znajdują się stosy obrazów w wierszu 7.
    2. W wierszach 8 i 9 określ odpowiednio nazwy stosu obrazów fluorescencyjnych i odpowiadającego mu stosu obrazów fluorescencyjnych w jasnym polu.
    3. Określ sztywność żelu PAA (Pa):
      1. W wierszach 11-14, które zawierają kilka różnych modułów sprężystości najczęściej używanych hydrożeli PAA, zakomentuj (wpisz % na początku wiersza) wszystkie oprócz modułu sprężystości żelu na analizowanych obrazach. Alternatywnie dodaj moduł sprężystości, jeśli jeszcze nie występuje, i skomentuj resztę (3658,19 Pa dla obrazów testowych).
    4. Określ promień punktu (m) w wierszu 15 (1 × 10-6 m dla obrazów testowych).
    5. Określ maksymalną możliwą średnicę punktu (μm) w wierszu 16 (2,5 μm dla obrazów testowych).
    6. Określ proporcje pikseli (μm/piksel):
      1. W wierszach 17-20, które zawierają kilka różnych proporcji pikseli obrazu w oparciu o używane wcześniej konfiguracje obrazowania, zakomentuj (wpisz % na początku wiersza) wszystkie oprócz proporcji pikseli analizowanych obrazów. Możesz też dodać użyty współczynnik pikseli, jeśli jeszcze go nie ma, i skomentuj resztę (0,1613 μm/piksel w przypadku obrazów testowych).
    7. W wierszach 35 i 87 określ katalog plików, w którym znajdują się niezbędne pliki przetwarzania obrazu.
      UWAGA: Na podstawie stosu obrazów fluorescencyjnych kod określa położenie każdej kropki fluorescencyjnej i śledzi ruch każdej kropki między każdym obrazem w stosie20. Początkowa pozycja wydrukowanych punktów mikrostyku jest znana, ponieważ nie odkształcają się one po prawidłowym przeniesieniu do hydrożelu32.
  3. Poczekaj, aż pojawią się dwie cyfry i jedno okno dialogowe, gdy program znajdzie kropki. Użyj Rysunek 1, aby upewnić się, że program znalazł właściwe kropki i nie znalazł wielu kropek tam, gdzie ich nie było. Użyj Rysunek 2, aby wybrać prostokątną siatkę, która pomoże programowi zlokalizować i obliczyć siły pociągowe komórki.
    UWAGA: Rysunek 1 to obraz komórki w jasnym polu z kropkami znalezionymi przez program (które będą czerwone) nałożonymi na nią (zobacz Rysunek 3A). Rysunek 2 to obraz przedstawiający te same kropki, które pokazano w Rysunek 1, ale bez obrazu w jasnym polu w tle.
    1. Poczekaj, aż w oknie dialogowym pojawi się monit o naciśnięcie Enter po wybraniu punktu - w którym każdy punkt jest jedną z czerwonych kropek znalezionych przez program - i ma w sobie jeden duży przycisk oznaczony Enter.
    2. Wybierz cztery różne kropki w Rysunek 2, aby utworzyć prostokątną siatkę wokół i włącznie z komórką/klastrem na tym wzorze. Zaznacz każdą kropkę jeden po drugim lewym kliknięciem myszy i potwierdź ją, naciskając Enter na przycisku we wspomnianym oknie dialogowym. Policz, ile kropek znajduje się między pierwszą a drugą kropką, a także pierwszą i trzecią kropką, ponieważ program poprosi o te wartości po wybraniu wszystkich kropek w czterech rogach. Wprowadź te wartości w oknie poleceń (wpisz liczbę kropek i kliknij przycisk Enter na klawiaturze, gdy zostaniesz o to poproszony).
  4. Po wybraniu siatki prostokątnej poczekaj, aż skrypt obliczy siły uciągu, które znajdzie w siatce na podstawie lokalizacji fluorescencyjnych punktów. Zauważ, że skrypt najpierw znajduje wektor przemieszczenia (u) środka geometrycznego każdej kropki, a następnie oblicza odpowiadający mu wektor siły pociągowej (F) za pomocą Eq (1):
    figure-protocol-1 (1)
    Gdzie E jest modułem Younga substratu PAA, a jest promieniem fluorescencyjnych znaczników punktowych, a ν jest stosunkiem Poissona podłoża PAA32. Korektor (1) zakłada, że podłoże jest nieskończoną sprężystą półprzestrzenią, że siły pociągowe są przykładane do środka każdego okrągłego znacznika kropkowego i że odstępy między znacznikami kropkowymi są wystarczająco duże, aby ich odpowiednie przemieszczenia nie oddziaływały ze sobą23.
    UWAGA: W opisanych tutaj eksperymentach stosuje się znaczniki punktowe o promieniu a = 1 μm i odstępach między środkami, wynoszących 6 μm. Strzałki siły ciągnięcia wewnątrz komórki/klastra skierowane do wewnątrz w kierunku środka komórki powinny być obecne, podczas gdy obszar na zewnątrz komórki/klastra nie powinien mieć obecnych strzałek trakcji (patrz Rysunek 3C-E). Strzałki trakcyjne skierowane na zewnątrz z wnętrza komórki/klastra lub wiele dużych strzałek trakcyjnych znajdujących się na zewnątrz komórki wskazują na źle wybraną prostokątną siatkę.
  5. Po znalezieniu właściwego pola trakcji wybierz odpowiedni obszar zainteresowania (ROI) otaczający komórkę/klaster, który zawiera wszystkie strzałki trakcji w komórce za pomocą kursora.
    1. Aby narysować ROI, kliknij lewym przyciskiem myszy tyle razy, ile to konieczne, aby narysować kształt wielokąta o tylu bokach, ile chcesz, dostosować kształt lub przesunąć ROI po jego narysowaniu, klikając lewym przyciskiem myszy odpowiednio rogi lub krawędzie. Po narysowaniu ROI kliknij dwukrotnie lewym przyciskiem myszy, aby przejść do następnego obrazu w stosie. Powtórz to dla wszystkich obrazów w stosie jasnego pola.
      UWAGA: Kod zapisze dane dotyczące siły uciągu i przemieszczenia dla każdego punktu czasowego w tym samym folderze, co oryginalne stosy obrazów, które można następnie dalej analizować.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PAA hydrożele o module Younga E = 3,6 kPa i współczynniku Poissona ν = 0,445 zostały stworzone do użycia tą subtraktywną metodą mikromodelowania. Hydrożele zostały wykonane tak, aby miały grubość ~100 μm, co pozwala na ich obrazowanie za pomocą zastosowanego tutaj zestawu do obrazowania, jednocześnie zapobiegając wykrywaniu przez komórki sztywnego szkiełka nakrywkowego pod żelem, co spowodowałoby problemy w badaniach skoncentrowanych na wykrywaniu sztywności komórkowej23,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule opisano ulepszoną metodę pośredniego modelowania hydrożeli PAA. Podejście to opiera się na metodach, które były używane wcześniej 20,35,36,37,38,39,40,41,42. Podstawowa zmiana polega na tym, że stemple PDMS są t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować dr Paulowi Barbone z Wydziału Inżynierii Mechanicznej Uniwersytetu Bostońskiego za pomocne dyskusje i pomoc w analizie danych. Badanie to było wspierane przez grant NSF CMMI-1910401.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(3-aminopropylo)trimetoksysilanSigma Aldrich#281778
1,5 ml probówka do mikrowirówekFisher Scientific#05-408-129
Rurka stożkowa 15 mlFisher Scientific#05-539-12
4 x 4 w 0,060 kwarcowa chromowana maska fotograficzna LRAdvance Reproductions CorporationN/ASpecjalnie zaprojektowana maska
6-dołkowe płytkiFisher Scientific#07-200-83
AcetonFisher Scientific#A18P-4
Roztwór akrylamidu, 40%Sigma Aldrich#A4058
AlexaFluor 488Thermo Fisher#A20000
Nadsiarczan aminonuFisher Scientific#BP179-25
BisakryloamidFisher Scientific#PR-V3141
etanoluGreenfield Global#111000200C1GL
okrągłe 25 mmFisher Scientifc#12-545-102
Szkiełka nakrywkowe, okrągłe 30 mmWarner#64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 KameraHamamatsu#C10600-10B
Human PlasmaValley Biomedyczna#HP1051PSłuży do izolacji Kwas solny fibronektyny
, 1,0 NMillipore Sigma#1.09057
ImageJWayne Rasband#1.53n
Zestaw wymiennych naczyń nakrywkowychBioptechs#190310-35
Kim WipesFisher Scientific#06-666-11C
Maska AlingerKarl Suss#MA6
Matlab 2021Mathworks#R2021a
MetaMorph Podstawoweurządzenia molekularne#v7.7.1.0
Ester N-hydroksysukcynimiduSigma Aldrich#130672-5G
NucBlue Barwienie żywymi komórkamiThermo Fisher#R37605
Mikroskop odwrócony Olympus IX2-ZDCKolumny
PD-10GE Healthcare#52-1308-00
Photoresist Spinner HoodHeadway Research#PWM32
Środek do czyszczenia plazmyHarrick#PDC-001
Wytrawiacz plazmowyTePla#M4L
Prior Lumen 200Pro Źródło światłaPrior Scientific#L200
Wafle krzemowe, 100 mmWafel uniwersytecki#809
SU-8 2005Kayaku Advanced Materials Inc.
Deweloper SU-8Kayaku Advanced Materials Inc.
Sylgard 184 Elastomersilikonowy Essex Brownell#DC-184-1.1
TetrametyloetylenodiaminaFisher Scientific#BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silanSigma Aldrich#448931
UAPON-40XW340 ObiektywOlympus#N2709300
Ekspozycjana promieniowanie UVNewport#69910
Taca na wafle, 110 x 11 mmTed Pella, Inc.#19395-40
Szkiełka nakrywkowe z okrągłe odsalające Olympus#IX81 #NC9463827#NC9901158

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  2. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  3. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), 55172(2013).
  4. Bhadriraju, K., et al. Activation of ROCK by RhoA is regulated by cell adhesion, shape, and cytoskeletal tension. Experimental Cell Research. 313 (16), 3616-3623 (2007).
  5. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  6. Ganz, A., et al. Traction forces exerted through N-cadherin contacts. Biology of the Cell. 98 (12), 721-730 (2006).
  7. Chopra, A., et al. Reprogramming cardiomyocyte mechanosensing by crosstalk between integrins and hyaluronic acid receptors. Journal of Biomechanics. 45 (5), 824-831 (2012).
  8. Winer, J. P., Chopra, A., Kresh, J. Y., Janmey, P. A. Substrate elasticity as a probe to measure mechanosensing at cell-cell and cell-matrix junctions. Mechanobiology of cell-cell and cell-matrix interactions. , Springer. Boston, MA. 11-22 (2011).
  9. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
  10. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), 32572(2012).
  11. Lavoie, T. L., et al. Disrupting actin-myosin-actin connectivity in airway smooth muscle as a treatment for asthma. Proceedings of the American Thoracic Society. 6 (3), 295-300 (2009).
  12. Kraning-Rush, C. M., et al. Quantifying traction stresses in adherent cells. Methods in Cell Biology. 110, 139-178 (2012).
  13. Halliday, N. L., Tomasek, J. J. Mechanical properties of the extracellular matrix influence fibronectin fibril assembly in vitro. Experimental Cell Research. 217 (1), 109-117 (1995).
  14. Harris, A. K., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
  15. Aratyn-Schaus, Y., et al. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (46), e2173(2010).
  16. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  17. Sniadecki, N. J., Chen, C. S. Microfabricated silicone elastomeric post arrays for measuring traction forces of adherent cells. Methods in Cell Biology. 83, 313-328 (2007).
  18. Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (4), 1484-1489 (2003).
  19. Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
  20. Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
  21. Polio, S. R., et al. Topographical control of multiple cell adhesion molecules for traction force microscopy. Integrative Biology. 6 (3), 357-365 (2014).
  22. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
  23. Maloney, J. M., et al. Influence of finite thickness and stiffness on cellular adhesion-induced deformation of compliant substrata. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 78 (1), Pt 1 041923(2008).
  24. Gilles, S. Chemical modification of silicon surfaces for the application in soft lithography. Technical Report Juel-4249. , Available from: https://www.osti.gov/etdeweb/biblio/21084355 (2007).
  25. Lim, K. B., Lee, D. C. Surface modification of glass and glass fibers by plasma surface treatment. Surface and Interface Analysis. 36, 254-258 (2004).
  26. Beal, J. H. L., Bubendorfer, A., Kemmitt, T., Hoek, I., Arnold, W. M. A rapid, inexpensive surface treatment for enhanced functionality of polydimethylsiloxane microfluidic channels. Biomicrifluidics. 6 (3), 36503(2012).
  27. Goddard, J. M., Erickson, D. Bioconjugation techniques for microfluidic biosensors. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394 (2), 469-479 (2009).
  28. Rajagopalan, P., et al. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophysical Journal. 87 (4), 2818-2827 (2004).
  29. Tang, X., Yakut Ali, M., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 3197-3206 (2012).
  30. Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2010).
  31. Rusmini, F., Zhong, Z., Feijen, J. Protein immobilization strategies for protein biochips. Biomacromolecules. 8 (6), 1775-1789 (2007).
  32. Polio, S. R., et al. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8 (1), 82-88 (2012).
  33. Buxboim, A., et al. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116(2010).
  34. Xu, H., et al. Focal adhesion displacement magnitude is a unifying feature of tensional homeostasis. Acta Biomaterialia. 113, 327-379 (2020).
  35. Shen, K., et al. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (22), 7791-7796 (2008).
  36. Eichinger, C. D., Hsiao, T. W., Hlady, V. Multiprotein microcontact printing with micrometer resolution. Langmuir. 28 (4), 2238-2243 (2012).
  37. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (22), e1065(2008).
  38. Zollinger, A. J., et al. Dependence of tensional homeostasis on cell type and on cell-cell interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (3), 175-184 (2018).
  39. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Extending microcontact printing as a microlithographic technique. Langmuir. 13 (7), 2059-2067 (1997).
  40. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  41. Rottmar, M., et al. Stem cell plasticity, osteogenic differentiation and the third dimension. Journal of Materials Science-Materials in Medicine. 21 (3), 999-1004 (2010).
  42. Desai, R. A., et al. Subcellular spatial segregation of integrin subtypes by patterned multicomponent surfaces. Integrative Biology. 3 (5), 560-567 (2011).
  43. Kim, S. H., Lee, S., Ahn, D., Park, J. Y. PDMS double casting method enabled by plasma treatment and alcohol passivation. Sensors and Actuators B: Chemical. 293, 115-121 (2019).
  44. Butler, J. P., Tolić-Nǿrrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  45. Canović, E. P., et al. Biomechanical imaging of cell stiffness and prestress with subcellular resolution. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 665-678 (2014).
  46. Stamenović, D., Smith, M. L. Tensional homeostasis at different length scales. Soft Matter. 16 (30), 6946-6963 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikrowzory bia kowemikrodo ladkowy drukhydrogele poliakrylamidowepomiar si y trakcyjnejstemple PDMSwzorowanie macierzy zewn trzkom rkowejkszta t skupiska kom rekmikroskopia fluorescencyjnaadhezja ogniskowa

Powiązane artykuły