Budowa mikroelektrod potencjału lokalnego pola do nagrań in vivo z wielu struktur mózgu jednocześnie

Lokalne potencjały pola (LFP) to potencjały elektryczne rejestrowane z przestrzeni pozakomórkowej w mózgu. Są one generowane przez nierównowagę stężenia jonów poza neuronami i reprezentują aktywność małej, zlokalizowanej populacji neuronów, co pozwala na precyzyjne monitorowanie aktywności określonego obszaru mózgu w porównaniu z zapisami EEG w makroskali¹. Szacuje się, że mikroelektrody LFP oddalone od siebie o 1 mm odpowiadają dwóm zupełnie różnym populacjom neuronów. Podczas gdy sygnał EEG jest filtrowany przez tkankę mózgową, płyn mózgowo-rdzeniowy, czaszkę, mięśnie i skórę, sygnał LFP jest wiarygodnym markerem lokalnej aktywności neuronalnej¹.

Badacze często muszą jednocześnie rejestrować LFP z kilku struktur mózgu, ale komercyjnie dostępne układy mikroelektrod często nie oferują takiej elastyczności. W tym przypadku obecny protokół opisuje w pełni konfigurowalne, łatwe do skonstruowania mikroelektrody do jednoczesnego rejestrowania LFP z dowolnego pożądanego obszaru mózgu na różnych głębokościach. Chociaż LFP są szeroko stosowane do rejestrowania aktywności neuronalnej określonego regionu mózgu^2,3,4,5,6,7,8^,9, obecny, łatwy do dostosowania projekt pozwala na nagrywanie LFP z dowolnej wielu powierzchownych lub Głębokie regiony mózgu^11,12. Protokół można również zmodyfikować w celu skonstruowania dowolnej pożądanej matrycy mikroelektrod, określając współrzędne stereotaktyczne regionów mózgu i odpowiednio składając matrycę. Te mikroelektrody o częstotliwości próbkowania 10 kHz i rezystancji 60-70 kΩ (2 cm długości) pozwalają nam rejestrować LFP z milisekundową precyzją. Dane mogą być następnie wzmacniane przez 16-kanałowy wzmacniacz, filtrowane (dolnoprzepustowy 1 Hz, górnoprzepustowy 5 kHz) i digitalizowane.

Obecna praca została zatwierdzona przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Wirginii. Do eksperymentów wykorzystano myszy C57Bl/6 obu płci (7-12 tygodni). Zwierzęta były utrzymywane w cyklu 12 godzin światła/12 godzin ciemności i miały dostęp ad libitum do pożywienia i wody.

1. Budowa mikroelektrod

1. Do budowy mikroelektrod należy użyć drutu niklowo-chromowego o średnicy 50 μm (średnica) (patrz tabela materiałów). Przyklej taśmą jeden koniec drutu z tyłu platformy i owiń drut trzy razy wokół najbliższego pokrętła na platformie ( Rysunek 1A,C).
   UWAGA: Zastosowano tu akrylową platformę z dwoma pokrętłami (2 x 5 cali), ale można użyć dowolnej platformy.
   1. Rozciągnij drut wokół najdalszego drugiego pokrętła, aby utworzyć dwie pętle między pokrętłami. Owiń drut jeszcze trzy razy wokół pierwszego pokrętła, aby zamocować drut na miejscu i ponownie przyklej koniec z tyłu platformy.
      UWAGA: Po rozdzieleniu przewodów (kroki 1.2-1.3.1) po każdej stronie muszą znajdować się dwa przewody (w sumie cztery przewody, Rysunek 1B).
2. Umieść pręty napinające pod drutami z taśmą owiniętą wokół nich (lepką stroną do góry) (Rysunek 1C).
   UWAGA: Do prętów napinających użyto trójkątnych kawałków akrylu, owiniętych wokół nich taśmą (lepka strona na zewnątrz do mocowania drutów). Lepka strona taśmy na zewnątrz prętów napinających utrzyma druty na miejscu, aby dostosować odległość między nimi. Pręty napinające muszą znajdować się w odległości ~2,5 cm od pokręteł, a przewody nie mogą być luźne.
3. Za pomocą mikroskopu i cienkich kleszczyków wykonaj 3 mm lub 4,5 mm odstęp między drutami (3 mm odstęp między drutami, aby wykonać mikroelektrody korowe (Ctx) - brzuszno-boczne jądro wzgórzowe (VL); odstęp 4,5 mm do wykonania mikroelektrod prążkowia (Str) - nikralny (SNR)) (Rysunek 1B).
   1. Jeśli w mikroskopie używane jest powiększenie, upewnij się, że obliczyłeś i dostosowałeś różnicę w powiększeniu i rzeczywistą odległość między przewodami.
      UWAGA: Jeśli mikroelektrody są konstruowane dla konstrukcji innych niż te użyte tutaj, odległość między drutami należy dostosować do odległości stereotaktycznej między strukturami. Rysunek 2B przedstawia przykład organizacji przewodów; W związku z tym współrzędne stereotaktyczne dla innych struktur muszą zostać dostosowane.
4. Wytnij cztery małe kawałki plastiku (grubość 0,5 mm) ~6 mm (szerokość) x 3 mm (wysokość) (Rysunek 1C).
   UWAGA: Można użyć dowolnych plastikowych elementów, o ile mają grubość 0,5 mm; tutaj zastosowano rurki kwadratowe, w których sprzedawano kołki (Kołki, patrz Tabela materiałów). Jeśli używana jest inna grubość, dodaj więcej lub mniej kawałków plastiku, aby dopasować wymagane współrzędne stereotaktyczne.
5. Nałóż klej (patrz Tabela Materiałów) na plastik i umieść go na drutach (Rysunek 1C). Umieść plastikowe kawałki w odległości ~1.0 cm od środka drutu, który jest oddalony o 1.0 cm od pręta napinającego. Usuń nadmiar superglue za pomocą bawełnianego wacika.
6. Po wyschnięciu kleju superglue przetnij druty za pomocą cienkich nożyczek, w kolejności wskazanej w Rysunek 1C.
7. Wytnij cztery szklane rurki o średnicy 7 mm za pomocą dostępnego w handlu zestawu (patrz Tabela materiałów) i włóż druty elektrody do szklanych rurek, jak wskazano w Rysunek 2A.
   1. Włóż pary elektrod VL i SNR do szklanych probówek.
      UWAGA: Tylko druty do głębokich struktur muszą być wkładane do szklanych rurek, aby wspomóc implantację chirurgiczną. Upewnij się, że nie wkładasz elektrod korowych do szklanej rurki.
8. Umieść klej u podstawy szklanych rurek, aby połączyć je z plastikiem. Poczekaj chwilę, aż klej wyschnie.
9. Przeciąć szklane rurki i druty za pomocą skalpela, jak wskazano w Tabeli 1; upewnić się, że długości mikroelektrod są prawidłowe. Jeśli mikroelektrody celują w różne struktury, dostosuj odległość cięcia zgodnie z wymaganymi współrzędnymi stereotaktycznymi.

Rysunek 1: Schemat budowy mikroelektrody. (A) Ustawienie przewodów na platformie z prętami napinającymi poniżej przewodów. (B) Przerwa między przewodami. (C) Cztery kawałki plastiku są przyklejone do drutów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Stereotaktyczne współrzędne implantacji i wymiary mikroelektrod.

2. Zespół matrycy mikroelektrod

1. Użyj kleju, aby przymocować tworzywa sztuczne w żądanej kolejności obszarów docelowych. Przykład elektrod korowych, wzgórzowych, prążkowiowych i nigralnych jest pokazany w Rysunek 2B,C.
   1. Umieść parę elektrod Ctx-VL stroną zadrukowaną do dołu (strona z drutami elektrody musi być skierowana w dół) i połącz dwa puste kawałki plastiku o wymiarach 6 mm x 3 mm na górze za pomocą kleju.
   2. Na trzech kawałkach plastiku umieść drugą parę elektrod Ctx-VL elektrodami skierowanymi do góry (użyj mikroskopu i upewnij się, że elektrody VL są wyrównane).
      UWAGA: Wyrównanie elektrod obustronnych (w tym przypadku wyrównanie lewej i prawej elektrody VL) jest niezbędne, aby odpowiednio celować w pożądane struktury dwustronne.
   3. Użyj kleju, aby przymocować elektrody SNR na górze, tak aby elektrody SNR były oddalone o 2.0 mm od elektrod VL i ~5.0 mm od elektrod korowych (druty elektrod SNR muszą być skierowane do góry).
   4. Powtórzyć krok 2.1.3. dla drugiej strony (przewody elektrod SNR muszą być skierowane na zewnątrz układu mikroelektrod).
2. Nałóż żywicę epoksydową na plastik, aby związać ze sobą elektrody. Unikaj nakładania żywicy epoksydowej na elektrody.
3. Weź gruby drut i zrób pętlę na jednym końcu. Zanurz pętlę w roztworze żywicy epoksydowej i umieść ją na plastiku, upewniając się, że gruby drut leży płasko (Rysunek 2D), aby w następnych krokach drut ten mógł służyć jako uchwyt. Poczekaj, aż elektrody całkowicie wyschną.
4. Przytnij przewody do 2 cm, jak pokazano na Rysunek 2E.

Rysunek 2: Budowa i wymiary mikroelektrody. (A) Cztery pary elektrod powstałe po przecięciu drutów nożyczkami, jak pokazano w Rysunek 1C (2 pary elektrod Ctx-VL i 2 pary elektrod Str-SNR). Włóż elektrody o głębokiej strukturze (VL i SNR) do szklanych rurek i przyklej ich podstawy do tworzywa sztucznego (czerwone kropki). (B) Widok z góry: Pary elektrod z (A) są sklejone w stos w celu utworzenia rdzenia mikroelektrody. Czerwone linie oznaczają linie klejenia. (C) Widok z przodu (B). (D) Gruby drut był przymocowany do mikroelektrod. (E) Przewody są pogrupowane jak pokazano, a izolowane końce są zeskrobywane i cięte na 2 cm. Kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Podłączenie mikroelektrody do zestawu słuchawkowego

1. Pogrupuj druty, jak pokazano w Rysunek 2E i zeskrob 1 mm izolowanych końców skalpelem.
2. Zegnij elektrody korowe, jak pokazano na Rysunek 3A. Oddziel przewody, jak pokazano na Rysunek 3B. Za pomocą cienkich kleszczyków wykonaj pętlę na końcu każdego drutu (Rysunek 3B).
3. Trzymaj 10-pinowy zestaw słuchawkowy z hemostatem (patrz Tabela materiałów) i użyj drewnianego końca bawełnianego wacika, aby nałożyć minimalną ilość topnika na szpilki (Rysunek 3C). Upewnij się, że nie umieszczasz topnika na zewnątrz kołków, aby zapobiec zwarciu między kołkami.
4. Za pomocą drewnianej końcówki bawełnianego wacika nałóż topnik na pętle z drutu.
5. pętle przewodów do 10-pinowego zestawu słuchawkowego, jak pokazano na rysunku Rysunek 3C. Po wysusz zestaw słuchawkowy, aby zapobiec zwarciu między pinami.
6. Weź cienki drut (0.005-0.008 cala) na przewód odniesienia i uziemiający i zdejmij plastik z jednego końca. Zrób pętlę na drugim końcu drutu.
7. odizolowaną stronę przewodów odniesienia i uziemiającego do odpowiednich pinów ( Rysunek 3A, C).
8. Trzymając się grubego drutu (Rysunek 2D), nałóż cement do kranioplastyki wokół mikroelektrod, szczególnie w miejscu, w którym druty łączą się z kołkami. Unikaj dotykania właściwych końców elektrody cementem.
9. Po wyschnięciu cementu umieść żywicę epoksydową u podstawy szklanych rurek, drutów mikroelektrod prążkowia i całej elektrody. Unikaj dotykania właściwych końców elektrody żywicą epoksydową. Poczekaj, aż elektrody całkowicie wyschną.
10. Elektrody są gotowe. Wywierć otwory w czaszce myszy (zgodnie z wymaganymi współrzędnymi stereotaktycznymi) za pomocą wiertła dentystycznego i wszczep zestaw słuchawkowy, jak pokazano na Rysunek 3D, opuszczając zestaw słuchawkowy z mikroelektrodami skierowanymi w stronę czaszki i odpowiednimi otworami. Zestaw słuchawkowy można przymocować do ramienia stereotaktycznego w celu podparcia podczas implantacji.

Rysunek 3: Implantacja mikroelektrod. (A) Elektrody korowe są wygięte zgodnie ze wskazaniami. (B) Przewody są oddzielone, aby utworzyć pętle na końcach. (C) Topnik (na czerwonych kropkach) i zapętlone przewody są przylutowane do 10-pinowego zestawu słuchawkowego, upewniając się, że każdy przewód przechodzi do odpowiedniego pinu. (D) Zestaw słuchawkowy jest wszczepiony w celu nagrywania LFP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Oznaczanie lokalizacji elektrody po nagraniach

1. Na końcu nagrań LFP potwierdź prawidłowe położenie elektrod w obszarze docelowym, przykładając prąd do końcówek elektrod, aby wykonać zmianę i odczekaj 30 minut przed perfuzją myszy.
   UWAGA: Ustawienia zmian w celu potwierdzenia lokalizacji końcówek elektrod: Pojedynczy impuls, 40 μA, monofazowy impuls prostokątny 0,75 ms, 50 Hz, 30 s.
2. Znieczulenie myszy izofluranem (dopóki mysz nie zaśnie) i perfuse^{10 transcardially} z 4% paraformaldehydem (PFA) w 0,1 M buforze fosforanu sodu. Przekrojć mózgi (o grubości 40 μm) na kriostacie (patrz tabela materiałów) i wybarwić DAPI (0,02% w PBS). Potwierdź prawidłowe położenie elektrod poprzez obecność uszkodzeń końcówki elektrody, jak pokazano na Rysunek 4B,C.
   UWAGA: Procentową zawartość izofluranu należy stosować zgodnie z wytycznymi danej instytucji.

5. Pomiar rezystancji elektrody

1. Zmierz rezystancję elektrod i sprawdź zwarcie między elektrodami za pomocą omomierza wielozakresowego (patrz Tabela materiałów). Ustaw skalę rezystancji na R x 10 000, wskazując, że jednostka ugięcia we wskazówce odpowiada rezystancji 1 kΩ. Elektrody o długości 2 cm muszą mieć rezystancję 60-70 kΩ.
2. Dostosuj zestaw słuchawkowy, biorąc dziesięć pojedynczych szpilek (patrz Tabela materiałów). każdy pin cienkim, wielożyłowym drutem miedzianym w.
   1. Wciśnij wlutowane piny wraz z odpowiadającymi im końcówkami kablowymi do 10-pinowego dwurzędowego gniazda współpracującego (pasujące gniazda). Wciśnij otwarte styki pasującego gniazda do zestawu słuchawkowego LFP. W ten sposób każda elektroda LFP ma wyznaczony przewód kablowy w zespole.
3. Zanurz końcówkę każdej elektrody LFP (której rezystancja ma być mierzona) w 0,9% roztworze soli fizjologicznej NaCl (stężenie NaCl we krwi). Podłącz koniec przewodu kablowego odpowiadający elektrodzie LFP do dodatniego zacisku omomierza.
   1. Użyj drutu o niskiej rezystancji (100 Ω), którego jedna strona jest zanurzona w wodzie z solą, a druga strona jako otwarty koniec. Podłącz otwarty koniec przewodu o niskiej rezystancji do masy wskaźnika omomierza.
      UWAGA: Ten układ zamyka obwód i powoduje odchylenie wskaźnika omomierza.
4. Upewnij się, że nie ma połączenia elektrycznego między żadnymi dwiema elektrodami w zestawie słuchawkowym. Sprawdź izolację elektryczną elektrod LFP parami (masa: jeden odpowiada jednej elektrodzie; dodatnia: inny odpowiada innej elektrodzie). Wyrzuć elektrody, jeśli w takim przypadku zaobserwuje się jakiekolwiek ugięcie.

W tej pracy mikroelektrody LFP zostały użyte do mapowania rozprzestrzeniania się napadu przez zwoje podstawy 11. Równoczesne zapisy LFP wykonano z prawej kory przedruchowej (gdzie znajdowało się ognisko napadu) oraz z lewej VL, prążkowia i SNR (Ryc. 4). Początek zatarcia został zidentyfikowany jako odchylenie ścieżki napięcia co najmniej dwukrotnie w stosunku do linii podstawowej (Rysunek 4A, czerwona strzałka). Wykres widma mocy11 pokazuje rozkłady częstotliwości dla zarejestrowanych LFP (Rysunek 4A). Opóźnienia początku napadu (czerwone paski) można porównać między każdą strukturą z dokładnością do milisekundy (Rysunek 4A). Na końcu nagrań zastosowano impuls prądowy, aby zaznaczyć i potwierdzić położenie końcówek elektrod, tworząc zmianę (Rysunek 4B,C).

Rysunek 4: Reprezentatywne nagrania LFP. (A) Napad został zarejestrowany z prawej kory przedruchowej i lewego VL, prążkowia i SNR przy użyciu mikroelektrod LFP o odpowiednich widmach mocy. Czerwona strzałka wskazuje początek napadu. Czerwone poziome paski wskazują opóźnienie początku napadu w każdej strukturze. Schemat mózgu pokazuje położenie mikroelektrod (czerwone kropki). (B,C) Struktury zostały uszkodzone po nagraniach w celu oznaczenia lokalizacji końcówek mikroelektrod w VL i SNR. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.