Artykuł metodologiczny

Badanie odporności dziedzicznej w modelu zakażenia mikrosporydiami Caenorhabditis elegans

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63636

⸱

6 kwietnia 2022

 ,  , 
1Department of Molecular Genetics, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

Zakażenie Caenorhabditis elegans pasożytem mikrosporydów Nematocida parisii umożliwia robakom wytwarzanie potomstwa, które jest wysoce odporne na ten sam patogen. Jest to przykład odporności dziedzicznej, słabo poznanego zjawiska epigenetycznego. Niniejszy protokół opisuje badanie odporności dziedzicznej w genetycznie podatnym modelu robaka.

Streszczenie

Dziedziczna odporność opisuje, jak niektóre zwierzęta mogą przekazać swoim potomstwu "wspomnienie" poprzedniej infekcji. Może to zwiększyć odporność na patogeny u ich potomstwa i sprzyjać przetrwaniu. Chociaż dziedziczną odporność odnotowano u wielu bezkręgowców, mechanizmy leżące u podstaw tego zjawiska epigenetycznego są w dużej mierze nieznane. Zakażenie Caenorhabditis elegans naturalnym patogenem mikrosporydów Nematocida parisii powoduje, że robaki produkują potomstwo, które jest silnie odporne na mikrosporydia. Niniejszy protokół opisuje badanie odporności międzypokoleniowej w prostym i genetycznie wykonalnym modelu zakażenia N. parisii -C. elegans. W niniejszym artykule opisano metody infekowania C. elegans i generowania potomstwa o uwarunkowanym usposobieniu immunologicznym. Podano również metody oznaczania odporności na zakażenie mikrosporydiami poprzez barwienie pod kątem mikrosporydiów i wizualizację infekcji za pomocą mikroskopii. W szczególności dziedziczna odporność zapobiega inwazji mikrosporydiów na komórki gospodarza, a fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) może być wykorzystana do ilościowego określenia zdarzeń inwazji. Względną ilość zarodników mikrosporydiów wytwarzanych u potomstwa zaszczepionego immunologicznie można określić ilościowo, barwiąc zarodniki barwnikiem wiążącym chitynę. Do tej pory metody te rzuciły światło na kinetykę i swoistość patogenów dziedzicznej odporności, a także na mechanizmy molekularne leżące u jej podstaw. Techniki te, wraz z obszernymi narzędziami dostępnymi do badań nad C. elegans, umożliwią dokonanie ważnych odkryć w dziedzinie odporności dziedzicznej.

Wprowadzenie

Dziedziczna odporność to zjawisko epigenetyczne, dzięki któremu kontakt rodziców z patogenami może umożliwić produkcję odpornego na infekcje potomstwa. Ten typ pamięci immunologicznej został zaobserwowany u wielu bezkręgowców, które nie mają adaptacyjnego układu odpornościowego i mogą chronić przed chorobami wirusowymi, bakteryjnymi i grzybiczymi1. Podczas gdy dziedziczna odporność ma ważne implikacje dla zrozumienia zarówno zdrowia, jak i ewolucji, mechanizmy molekularne leżące u podstaw tej ochrony są w dużej mierze nieznane. Dzieje się tak częściowo dlatego, że wiele zwierząt, u których opisano dziedziczną odporność, nie jest organizmami modelowymi do badań. W przeciwieństwie do tego, badania na przezroczystym nicieniu Caenorhabditis elegans korzystają z obszernego zestawu narzędzi genetycznych i biochemicznych2,3, wysoce opisany genom4,5 i krótki czas generacji. Rzeczywiście, badania nad C. elegans umożliwiły fundamentalne postępy w dziedzinie epigenetyki i odporności wrodzonej6,7, a obecnie jest to uznany model do badania pamięci immunologicznej8,9.

Mikrosporydia to patogeny grzybowe, które infekują prawie wszystkie zwierzęta i powodują śmiertelne infekcje u ludzi z obniżoną odpornością10. Infekcja rozpoczyna się, gdy zarodnik mikrosporydiów wstrzykuje lub "wystrzeliwuje" swoją zawartość komórkową (sporoplazmę) do komórki gospodarza za pomocą struktury zwanej rurką polarną. Wewnątrzkomórkowa replikacja pasożyta powoduje powstawanie merontów, które ostatecznie różnicują się w dojrzałe zarodniki, które mogą opuścić komórkę11,12. Chociaż pasożyty te są szkodliwe zarówno dla zdrowia ludzkiego, jak i bezpieczeństwa żywnościowego, wciąż jest wiele do nauczenia się o ich biologii infekcji12. Nematocida parisii to naturalny pasożyt mikrosporydyczny, który replikuje się wyłącznie w komórkach jelitowych robaków, powodując zmniejszenie płodności i ostatecznie śmierć. Model infekcji N. parisii -C. elegans został wykorzystany do pokazania: (1) roli autofagii w usuwaniu patogenów13, (2) jak mikrosporydia mogą opuścić zakażone komórki nielitycznie14, (3) jak patogeny mogą rozprzestrzeniać się z komórki na komórkę, tworząc syncytia15, (4) białka, których N. parisii używa do łączenia się ze swoim gospodarzem16oraz (5) regulacja transkrypcyjnej wewnątrzkomórkowej odpowiedzi patogenu (IPR)17,18.

Protokoły dotyczące infekcji C. elegans są opisane w obecnej pracy i mogą być wykorzystane do ujawnienia unikalnej biologii mikrosporydiów i przeanalizowania reakcji gospodarza na infekcję. Mikroskopia utrwalonych robaków barwionych barwnikiem wiążącym chitynę Direct Yellow 96 (DY96) pokazuje rozprzestrzenianie się infekcji zarodników mikrosporydiów zawierających chitynę w jelicie. Barwienie DY96 umożliwia również wizualizację zarodków robaków zawierających chitynę w celu jednoczesnej oceny ciężaru robaków (zdolności do produkcji zarodków) jako odczytu przydatności gospodarza.

Ostatnie prace wykazały, że C. elegans zainfekowane N. parisii wydają potomstwo, które jest bardzo odporne na tę samą infekcję19. Ta dziedziczna odporność trwa jedno pokolenie i jest zależna od dawki, ponieważ potomstwo od silniej zakażonych rodziców jest bardziej odporne na mikrosporydia. Co ciekawe, potomstwo zaszczepione N. parisii jest również bardziej odporne na bakteryjny patogen jelitowy Pseudomonas aeruginosa, chociaż nie jest chronione przed naturalnym patogenem Orsay virus19. Niniejsza praca pokazuje również, że potomstwo uodpornione ogranicza inwazję mikrosporydiów na komórki gospodarza. Metoda opisuje również zbieranie potomstwa zaszczepionego immunologicznie oraz sposób, w jaki FISH może być używany do wykrywania RNA N. parisii w komórkach jelitowych w celu zbadania inwazji komórek gospodarza i wystrzeliwania zarodników20.

Razem, te protokoły stanowią solidną podstawę do badania mikrosporydiów i dziedzicznej odporności u C. elegans. Oczekuje się, że przyszłe prace nad tym modelowym systemem umożliwią dokonanie ważnych odkryć w rodzącej się dziedzinie odporności dziedzicznej. Techniki te mogą być również punktem wyjścia do badania dziedzicznej odporności indukowanej przez mikrosporydia w innych organizmach gospodarza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Niniejsze badanie wykorzystuje dziką odmianę C. elegans Bristol odmianę N2 uprawianą w temperaturze 21 °C.

1. Przygotowanie mediów

  1. Przygotuj nośnik M9 zgodnie z poprzednim raportem21,22.
  2. Przygotuj pożywkę dla nicieni (NGM) zgodnie z poprzednim raportem21,22. Wlej 12 ml NGM na płytkę 6 cm lub 30 ml na płytkę 10 cm.
  3. Przygotuj szczep Escherichia coli OP50-1 zgodnie z poprzednim raportem23.
  4. Przygotuj płytki NGM z nasionami OP50-1, wykonując poniższe czynności.
    1. Ponownie zawieś 10x skoncentrowany OP50-1 przez wirowanie.
    2. Użyj pipety powtarzalnej, aby wysadzić płytki pośrodku. W przypadku talerzy 6 cm i 10 cm nasiona o objętości odpowiednio 200 μl lub 500 μl.
    3. W przypadku talerzy o średnicy 10 cm użyj rozsiewacza do szkła, aby rozprowadzić OP50-1 i stworzyć trawnik z bakterii. Nie rozprzestrzeniaj bakterii na samą krawędź płytki.
      UWAGA: Etanol zanurzać i palić rozsiewacz co pięć płytek, aby zapewnić sterylność. Pozwól rozsiewaczowi ostygnąć przez kilka sekund przed rozprowadzeniem, aby zapobiec zabijaniu bakterii.
    4. Pozostaw talerze w temperaturze pokojowej na 2 dni do wyschnięcia i zapewnienia rozwoju trawnika bakteryjnego.
      UWAGA: Talerze z nasionami można przechowywać w temperaturze pokojowej przez 2-3 tygodnie lub w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.

2. Utrzymanie C. elegans

  1. Utrzymuj robaki na stałym bakteryjnym źródle pożywienia na płytkach NGM z nasionami OP50-1.
    UWAGA: Głód może skutkować fenotypami międzypokoleniowymi, co może wpływać na wyniki. Płytka o średnicy 10 cm z nasionami OP50-1 podtrzymuje 2 500 L1 (najwcześniejsze stadium larwalne C. elegans) przez okres do 72 godzin.
  2. Jeśli robaki głodują, rosną przez trzy pokolenia na OP50-1, zanim użyjesz robaków do eksperymentów.

3. Synchronizacja populacji C. elegans za pomocą podchlorynu sodu (wybielanie)

UWAGA: Ten krok jest bardzo wrażliwy na czas, więc upewnij się, że wirówka jest dostępna przed rozpoczęciem. W literaturze dostępne są alternatywne, mniej szybkie protokoły wybielania, które mogą być stosowane, jeśli jest to preferowane. Aby zapobiec utracie aktywności 6% podchlorynu sodu z upływem czasu, odczynnik należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C i przechowywać przez okres do 1 roku.

  1. Przygotować 2 ml roztworu wybielacza dla każdej próbki, mieszając 400 μl 1 M NaOH, 250 μl 6% podchlorynu sodu (patrz tabela materiałów) i 1350 μl wody destylowanej.
  2. Zmyj dorosłe robaki (~72 godziny po wykluciu) z płytek do probówki mikrowirówkowej za pomocą 1 ml pożywki M9.
    UWAGA: Jeśli na płytkach pozostało wiele robaków, należy je osadzać przez odwirowanie przy 1,400 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml i wykonać dodatkowe płukanie płytki.
  3. Wirować przy 1,400 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej, aby otulić robaki, a następnie przemyć 2x 1 ml pożywki M9 w celu usunięcia bakterii.
  4. Usuń supernatant, dodaj 1 ml przygotowanego roztworu wybielacza (krok 3.1.) i ustaw minutnik na 1 minutę. Odwróć probówki 3-4x.
    UWAGA: Pod mikroskopem świetlnym można zobaczyć, jak robaki przestają się rzucać.
  5. Po 1 minutach odwirować przy 3 000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej w celu osadzenia robaków, następnie usunąć supernatant i dodać 1 ml świeżego roztworu wybielacza.
  6. Uważnie monitoruj probówkę (probówki) pod mikroskopem świetlnym, aby uwidocznić tusze robaków rozszczepiające się i uwalniające zarodki. Natychmiast przejdź do następnego kroku, gdy ~50%-80% tusz zostanie rozłupanych i wiele zarodków zostanie uwolnionych.
    UWAGA: W zależności od liczby zwierząt i szczepu robaka ten krok może zająć od 15 s do 4 minut. Z nieznanych przyczyn robaki zakażone N. parisii często wybielają się dłużej niż zwierzęta niezakażone.
  7. Wirować przy 3,000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej w celu osadzenia zarodków, a następnie przemyć 3x w 1 ml pożywki M9.
    UWAGA: Mycie rozcieńczyć pozostałym roztworem podchlorynu z probówek i należy je wykonać szybko, aby upewnić się, że roztwór wybielacza nie uszkodzi zarodków.
  8. Dodać 1 ml pożywki M9 do końcowej pożywki i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 4 ml pożywki M9. Zawiesić zarodki w końcowej objętości 5 ml.
  9. Obracać probówki na mechanicznym rotorze (patrz tabela materiałów) w temperaturze 21 °C przez 18-24 godziny, aby wykluć zarodki do L1s.
    UWAGA: Ponieważ N. parisii infekuje jelito robaka i nie atakuje linii zarodkowej, zakażeni rodzice nie przenoszą infekcji na swoje potomstwo przez transmisję pionową19. Bielenie zakażonych dorosłych osobników synchronizuje zwierzęta F1 i niszczy zarodniki N. parisii, zapewniając, że potomstwo F1 nie zostanie zainfekowane zarodnikami przeniesionymi od rodziców.
  10. Odwirować probówki przez 1 minutę przy 1,800 x g w temperaturze pokojowej w celu osadzenia L1 i wyrzucić wszystko oprócz 1 ml supernatantu.
  11. Odpipetować 1-5 μl mieszaniny L1 na nieziarnistą płytkę NGM i natychmiast policzyć liczbę L1 w kropli, wizualizując pod mikroskopem świetlnym. Powtórz 3 razy i uśrednij liczby, aby określić stężenie i całkowitą liczbę L1s.
    UWAGA: Większość zarodków powinna być wykluta, a L1 powinny szybko poruszać się w kropelce cieczy. Jeśli pozostaje duża część niewyklutych zarodków i ospałych (wolno poruszających się) L1, oznacza to zbyt długie bielenie.

4. Przygotowanie zarodników N. parisii

  1. Przygotuj zarodniki N. parisii zgodnie z wcześniej opublikowanymi odniesieniami19,24.

5. Zakażenie C. elegans N. parisii w celu uzyskania potomstwa z odpornością

  1. Na dzień przed planowanymi infekcjami należy przesunąć wymaganą liczbę 10 cm nieobsianych płytek NGM z 4 °C do temperatury pokojowej.
  2. Bezpośrednio przed zakażeniem odwirować ~2,500 zsynchronizowanych robaków L1 przy 1,400 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej w probówce mikrowirówkowej w celu osadzenia robaków. Usunąć supernatant za pomocą końcówki pipety, aby pozostawić robaki w ~50 μl pożywki M9.
  3. Dodaj 1 ml 10x OP50-1 do L1 i zarodników N. parisii do pożądanego stężenia (zwykle ~ 2,5 miliona zarodników). Jako niezakażoną kontrolę przygotuj równoważną probówkę z L1 i OP50-1 o objętości pożywki M9 równej objętości użytego preparatu przetrwalnikowego.
    UWAGA: Aby uzyskać potomstwo zaszczepione immunologicznie, należy użyć dawki zarodników wystarczająco wysokiej, aby >90% zwierząt zostało zarażonych w ciągu 72 godzin (mierzonej za pomocą barwienia DY96, Krok 7), ale wystarczająco niskiej, aby >80% zwierząt nadal było ciężarnych. Gwarantuje to, że większość potomstwa pochodzi od zakażonych rodziców, a bielenie rodziców daje wystarczającą ilość zarodków do badania F1. Chociaż preparaty przetrwalnikowe różnią się stężeniem i zakaźnością, odpowiednia dawka rodzicielska wynosi zwykle od 5 do 15 μl preparatu zarodnikowego (~2,5 miliona zarodników) na 10 cm płytkę.
  4. Krótko przemieszaj, aby wymieszać i nałożyć powyższy 1 ml robaków na 10 cm niewysiewaną płytkę NGM. Zamieszaj, aby płyn rozprowadził się po całej płycie.
  5. Suszyć płytki w czystej szafce ze zdjętymi pokrywkami przez 10-20 minut lub do całkowitego wyschnięcia, a następnie inkubować w temperaturze 21 °C przez 72 godziny.
  6. Po 72 godzinach od zakażenia (hpi) zmyj robaki z płytek do probówki mikrowirówkowej za pomocą 1 ml pożywki M9. Jeśli na płytkach pozostaje wiele robaków, należy je ogranulować przez odwirowanie w stężeniu 1 400 x g przez 30 s, usunąć sklarowany sklarant i przeprowadzić dodatkowe płukanie płytki.
  7. Wirować przy 1 400 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej do osadzania robaków, przemywać 2x 1 ml pożywki M9 lub do momentu, gdy supernatant będzie klarowny. Zawiesić w końcowej objętości 1 ml pożywki M9.
  8. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać, a następnie przenieść 100 μl zawieszonych robaków do świeżej probówki.
    UWAGA: Ta próbka ~250 dorosłych osobników może być później utrwalona i wybarwiona w celu określenia zdolności rodzicielskiej robaka i statusu infekcji, zgodnie z opisem w Kroku 7 i na początku Kroku 3.
  9. Aby rozbić dorosłe robaki i uwolnić zarodki F1 do testów, należy wybielić pozostałe 900 μl zawieszonych robaków, jak opisano w kroku 3.
    UWAGA: Ten etap niszczy również wszelkie zarodniki N. parisii przed kolejnymi testami infekcji.

6. Testowanie dziedzicznej odporności na N. parisii u C. elegans

  1. Wykonaj infekcje zgodnie z opisem w krokach 5.1.-5.6., z modyfikacjami wymienionymi poniżej.
    UWAGA: Testy infekcji na F1 można zmniejszyć i przeprowadzić na 6-centymetrowych płytkach NGM przy użyciu ~1,000 robaków L1 i 400 μL 10x OP50-1. Należy również użyć "wysokiej" dawki zarodników, tak aby ~100% naiwnych F1 (tj. robaków od niezainfekowanych rodziców) było zainfekowanych, a tylko ~10% naiwnych F1 było grawigodnych. Chociaż preparaty przetrwalnikowe różnią się stężeniem i zakaźnością, odpowiednia dawka wynosi zwykle od 5 do 15 μl (~ 2,5 miliona zarodników) na 6 cm płytkę.
  2. Przy 72 hpi utrwal i wybarwij, aby określić przydatność robaka i stan infekcji, zgodnie z opisem w kroku 7.

7. Barwienie DY96 C. elegans w celu wizualizacji zarodków zarodków i mikrosporydiów

UWAGA: DY96 to zielony fluorescencyjny barwnik wiążący chitynę, który barwi zarodki robaków i ścianki zarodników mikrosporydiów19,15,25. Pozwala to na jednoczesne monitorowanie kondycji i stanu infekcji robaków.

  1. Zmyj robaki z płytek do probówki mikrowirówkowej, używając 1 ml pożywki M9 zawierającej 0,1% Tween-20. Jeśli na płytkach pozostaje wiele robaków, należy je osadzać przez odwirowanie w temperaturze 1 400 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant za pomocą końcówki pipety i przeprowadzić dodatkowe płukanie płytki.
  2. Wirować przy 1,400 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej w celu osadzenia robaków i przemyć 2x 1 ml pożywki M9 zawierającej 0,1% Tween-20 lub do momentu, gdy supernatant będzie klarowny.
  3. Usunąć sklarowany nadłat, dodać 700 μl acetonu i pozostawić robaki do utrwalenia w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    UWAGA: W tym momencie robaki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do przetworzenia do kilku miesięcy później, jeśli jest to pożądane.
  4. Wirować przy 10 000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej w celu osadzenia stałych robaków i przemyć 2x 1 ml PBS zawierającego 0,1% Tween-20 (PBST).
  5. Przygotować 50 ml roztworu roboczego DY96: PBST, 0,1% (v/v) dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 20 μg/ml DY96 (z roztworu podstawowego o stężeniu 5 mg/ml w wodzie destylowanej) (patrz tabela materiałów). Zawiń tubę w folię i przechowuj ją w szufladzie, aby zapobiec ekspozycji na światło.
    UWAGA: Roztwory podstawowe i robocze DY96 można przechowywać przez >1 rok w temperaturze pokojowej, jeśli są przechowywane w ciemności.
  6. Wirować przy 10 000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej w celu osadzenia robaków i usunięcia supernatantu. Do granulatu dodać 500 μl roztworu roboczego DY96 i obracać przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Wirować przy 10 000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej, aby granulować robaki. Usunąć supernatant i dodać 15 μl podłoża montażowego z/bez DAPI (patrz Tabela Materiałów).
  8. Pobrać pipetą 10 μl roztworu zawierającego barwione robaki na szkiełko mikroskopowe i nałożyć na nie szkiełko nakrywkowe.
    UWAGA: Szkiełka podstawowe i dodatkowe próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności w celu długotrwałego przechowywania.

8. Obrazowanie i analiza robaków barwionych DY96 w celu oceny przydatności robaków i stanu infekcji

  1. Aby przeanalizować robaki zabarwione DY96 (zamontowane na szkiełkach, jak w kroku 7.8), wykonaj obrazowanie za pomocą kanału GFP mikroskopu fluorescencyjnego.
  2. Aby określić przydatność populacji robaków, użyj obiektywu 5x lub 10x, aby ocenić ciężarność >100 robaków na warunek.
    UWAGA: Robaki zawierające zarodek ≥1 są uważane za ciężarne. Mechaniczne liczniki komórek mogą pomóc zminimalizować błąd ludzki podczas liczenia. Zarodki robaków są mniej wybarwione (mniej fluorescencyjne) niż zarodniki mikrosporydiów19. Zarodki są jajowate, ~50 μm x ~30 μm i znajdują się w środkowej części ciała zdrowych dorosłych C. elegans. Zdrowe, niezakażone dorosłe osoby noszą 10-20 zarodków ułożonych w rzędy wzdłuż długości ciała26.
  3. Aby ujawnić bardziej subtelne różnice w sprawności, wykonaj liczenie zarodków. W tym celu ręcznie policz liczbę zarodków w 20-30 pojedynczych robakach na stan.
  4. Aby określić, jak zainfekowane są populacje robaków, użyj obiektywu 5x-40x, aby ocenić stan infekcji >100 robaków na stan. Robaki zawierające dowolną liczbę wewnątrzkomórkowych zarodników jelitowych są uważane za zakażone.
    UWAGA: Zarodniki Microsporidia są jaśniejsze niż zarodki robaków. Zarodniki N. parisii w kształcie fasoli mają wymiary ~2,2 μm x ~0,8 μm i są wytwarzane w komórkach jelitowych robaka z ~48 hpi15. Robaki, w których zarodniki są widoczne wyłącznie w świetle jelita, a nie wzdłuż ścian jelita, nie są uważane za zakażone19. Dzieje się tak, ponieważ zarodniki te prawdopodobnie reprezentują nowo połknięte zarodniki, które nie wynikają z infekcji osobnika.
  5. Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu (patrz tabela materiałów), określ ilościowo obciążenie pasożytami i rozmiar robaka, wykonując poniższe czynności.
    1. Obraz 20-30 robaków zamontowanych na szkiełkach mikroskopowych za pomocą fluorescencyjnego pionowego stereoskopu dla każdej próbki. Przechwytuj obrazy w kanałach Brightfield, DAPI i GFP. Należy wybrać odpowiednią ekspozycję w kanale GFP, tak aby fluorescencja w większości zakażonych próbek nie była nasycona.
      UWAGA: Infekcję można nadal uwidocznić w najmniej zainfekowanych próbkach. Zdjęcia są zwykle robione przy użyciu obiektywu 5x.
    2. Otwórz pliki w formacie FIJI/ImageJ. W zależności od typu pliku do otwierania obrazów w ImageJ może być wymagana wtyczka Bio-Formats Importer.
    3. Narysuj 20-30 pojedynczych robaków na obrazach, korzystając z obrazów w jasnym polu lub DAPI i narzędzia do zaznaczania wielokątów na pasku narzędzi. Zapisz każdy konspekt za pomocą narzędzi do analizy > > menedżera regionów zainteresowania (ROI) w menu rozwijanym, klikając Dodaj [t]. Obrysuj zwierzęta, które są w pełni widoczne w kadrze.
      UWAGA: Kontury robaków można później odwiedzić, zapisując plik z konturami jako plik Tiff.
    4. Kliknij Odznacz w menedżerze ROI, aby usunąć wszystkie kontury z obrazu, a następnie kliknij Obraz > Duplikuj w menu rozwijanym. Wpisz numer odpowiadający interesującemu Cię kanałowi w polu "Kanały", aby zduplikować kanał GFP dla obciążenia pasożytami (np. 2).
    5. Proguj ten kanał za pomocą Image > Dostosuj > Threshold do poziomu, przy którym jasne obciążenie pasożytem jest wychwytywane, ale ciemniejsza fluorescencja z zarodków robaków nie jest, a następnie kliknij Zastosuj. Zanotuj zastosowane wartości progowe i używaj ich konsekwentnie dla wszystkich obrazów tego samego eksperymentu.
      UWAGA: Przed analizą wszystkich obrazów należy sprawdzić, czy wartość progowa jest odpowiednia zarówno dla najmniejszej, jak i najbardziej zainfekowanej próbki.
    6. Wybierz opcję Analizuj > Ustaw pomiary i zaznacz pole wyboru Ułamek powierzchniowy. Wybierz kolejno kontury pojedynczych robaków z menedżera ROI i kliknij funkcję Analizuj > Mierz. Okno wyników dostarczy pomiar dla %Area (tj. % obciążenia pasożytami).
      UWAGA: Jeśli fluorescencja z zarodków jest tak jasna, że przekracza próg, narzędzie Pędzel w kolorze czarnym na pasku narzędzi może być użyte do ręcznego wymazania tych obszarów przed pomiarem %Area.
    7. Aby określić rozmiar robaka jako odczyt przydatności, narysuj robaki zgodnie z opisem w kroku 8.3. Wybierz opcję Analizuj > Ustaw pomiary i zaznacz pole wyboru Obszar. Wybierz kolejno kontury pojedynczego robaka z menedżera ROI i kliknij funkcję Analizuj > Mierz. W oknie Wyniki zostanie wyświetlony pomiar dla parametru %Area.

9. Test FISH do oceny inwazji C. elegans przez mikrosporydia i wystrzeliwanie zarodników

UWAGA: Sonda MicroB FISH rozpoznaje konserwatywny region mikrosporydiów 18s rRNA i może być używana do oznaczania wewnątrzkomórkowych sporoplazm (tj. zaatakowanych komórek gospodarza) oraz materiału genetycznego w zarodnikach.

  1. Zainfekuj 6 000 zsynchronizowanych wybielaczem robaków L1 za pomocą 4 milionów zarodników N. parisii i 10 μl 10x OP50-1 w końcowej objętości 400 μl, która jest przygotowana z pożywką M9.
  2. Umieść mieszaninę na 6 cm niewysiewanej płytce NGM, susz w czystej szafce przez 10-20 minut i umieść w temperaturze 21 °C.
  3. Po 30 minutach zmyć zwierzęta z płytek 1 ml pożywki M9 zawierającej 0,1% Tween-20.
  4. Granulować robaki, odwirowując przy 1 400 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
  5. Usunąć supernatant za pomocą końcówki pipety, dodać 700 μl acetonu i pozostawić na 10 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: W tym momencie robaki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do późniejszego przetworzenia.
  6. Wykonaj nocny test FISH za pomocą sondy MicroB zgodnie z wcześniej opublikowanymi raportami27,19.
    UWAGA: Aby ocenić wypalanie zarodników, uzupełnij ostatnie 500 μl buforu płuczącego o 20 μg/ml DY96 do próbek i obracaj przez 30 minut w temperaturze 21 °C przed kontynuowaniem protokołu jak zwykle.
  7. Przechowywać szkiełka w pudełku na szkiełka w temperaturze 4 °C. W przypadku długotrwałego przechowywania (tj. przez kilka miesięcy) dodatkowe próbki należy przechowywać w probówkach do mikrowirówek w temperaturze 4 °C w ciemności.
  8. Aby ocenić inwazję robaków barwionych FISH, spójrz na robaki za pomocą czerwonego kanału mikroskopu fluorescencyjnego. Wizualizuj zdarzenia infekcji w dużym powiększeniu (obiektyw 63x), ponieważ zwierzęta L1 są małe, a sporoplazmy będą we wczesnych stadiach replikacji. Aby ocenić wystrzeliwanie zarodników, użyj obiektywu 63x oraz kanałów fluorescencyjnej czerwonej i zielonej.
    UWAGA: Zarodniki, w których kolokalizują się sygnał GFP i mCherry, są uważane za niewystrzelone; puste skrzynki po zarodnikach GFP uważa się za wystrzelone.
  9. Aby ocenić inwazję lub wystrzelenie zarodników, ręcznie policz liczbę sporoplazm (ogniska mCherry w komórkach jelitowych) lub procent zarodników wystrzelonych w 20-30 robakach na stan. Dostosuj ostrość w płaszczyźnie z, aby uchwycić wszystkie zdarzenia infekcji i zarodniki, które często znajdują się na różnych płaszczyznach.
    UWAGA: Sporoplazmy znajdują się wyłącznie w komórkach jelitowych. Najwyższe stężenie sporoplazm zwykle znajduje się bezpośrednio po gardle. Jeśli próbki są również barwione DY96, poszukaj obecności sporoplazm, które nie kolokalizują się z zarodnikiem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W obecnym badaniu, populacje rodzicielskie C. elegans (P0) zostały zainfekowane w stadium L1 niską dawką zarodników N. parisii. Te warunki infekcji są zwykle wykorzystywane do uzyskania dużej liczby potomstwa F1 odpornego na mikrosporydia poprzez bielenie rodziców. Zainfekowane populacje rodzicielskie i niezakażone grupy kontrolne utrwalono na poziomie 72 hpi i wybarwiono DY96 w celu uwidocznienia zarodków robaków i zarodników mikrosporydiów (Rysunek 1A). Zakażone zwierzęta są małe, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje badanie mikrosporydiów i odporności dziedzicznej w prostym i genetycznie wykonalnym modelu infekcji N. parisii -C. elegans .

Przygotowanie zarodników to intensywny protokół, który zazwyczaj daje wystarczającą ilość zarodników na 6 miesięcy eksperymentów, w zależności od produktywności24. Co ważne, zakaźność musi być określona dla każdej nowej "partii" zarodników przed użyciem jej do eksperymentów. Ze względu na zmienność zaka...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Winnie Zhao i Yin Chen Wan za pomocne komentarze do manuskryptu. Prace te były wspierane przez Kanadyjską Radę ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (Grant #522691522691).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Koraliki cyrkonowe 2,0 mmBiospec Products Inc.11079124ZX
Strzykawka 10 mlFisher Scientific1482613
5 μ m filterMillipore SigmaSLSV025LS
Axio Imager 2Zeiss-Mikroskopfluorescencyjny do obrazowania robaków barwionych DY96 i FISH- na szkiełkach mikroskopowych
Axio Zoom V.16 Fluorescencyjny mikroskop stereo zmiennoogniskowyZeiss-Doobrazowania na żywo fluorescencyjnych zwierząt transgenicznych w celu wizualizacji IPR
Baked EdgeGARD Horizontal Flow CleanBench Baker-
Zaburzacz koralikowy, Genie SI-D238 Analogowy zakłócacz Destabilizator komórek Genie, 120 VGlobalny ślizg T9FB893150
przemysłowego Cell-VU, Millennium Sciences Jednorazowe cytometry do liczenia plemnikówFisher ScientificDRM600
Direct Yellow 96Sigma-AldrichS472409-1G
EverBrite Podłoże montażowe z DAPIBiotium23001
EverBrite Medium montażowe bez DAPIBiotium23002
Oprogramowanie Fiji/ImageJImageJhttps://imagej.net/software/fiji/downloads
Wirnik mechanicznyThermo Sceintific415110 / 1834090806873Służy do przędzenia probówek z bielonymi zarodkami do nocnego wylęgu
Sonda MicroB FISHBiosearch Technologies Inc.-Zsyntetyzowany z modyfikacją Quasar 570 (Cy3) 5' i oczyszczony HPLC, CTCTCGGCACTCCTTCCTG
N2Typ dziki, szczep BristolDomyślny szczepCaenorhabditis Genetics Center (CGC)
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma-AldrichL3771-100G
Roztwór wodorotlenku sodu (5 N)Fisher ChemicalFLSS256500
Roztwór podchlorynu sodu (6% )Fisher ChemicalSS290-1
Stemi 508Zeiss-Docodziennej konserwacji robaków i liczenia robaków L1 do zestawów testowych
Tween-20Sigma-AldrichP1379-100ML
Vectashield + A16BiolynxVECTH1500
Mikroskop stereoskopowy

Bibliografia

  1. Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects. Frontiers in Immunology. 10, 1938(2019).
  2. Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
  3. Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  4. The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
  5. Yoshimura, J., et al. Recompleting the Caenorhabditis elegans genome. Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).
  6. Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model. Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).
  7. Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity. Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).
  8. Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans. TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).
  9. Burton, N. O., et al. Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection. Nature Communications. 11, 1741(2020).
  10. Wadi, L., Reinke, A. W. Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites. PLoS Pathogens. 16, 1008276(2020).
  11. Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. Invasion of host cells by microsporidia. Frontiers in Microbiology. 11, 172(2020).
  12. Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit. Cellular Microbiology. 22 (11), 13247(2020).
  13. Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PLoS ONE. 14, 0216011(2019).
  14. Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells. Worm. 1 (4), 207-211 (2012).
  15. Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia. Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).
  16. Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8, 14023(2017).
  17. Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLoS Pathogen. 10, 1004200(2014).
  18. Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
  19. Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
  20. Tamim El Jarkass, H., et al. An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans. eLife. 11, 72458(2022).
  21. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. 49, 2496(2011).
  22. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  23. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152(2009).
  24. Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells. PLOS Pathogens. 7, 1002227(2011).
  25. Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host. G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).
  26. Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  27. Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).
  28. Zhang, G., et al. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLoS Pathogens. 12, 1006093(2016).
  29. Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLoS Pathogens. 12, 1005724(2016).
  30. Troemel, E. R., Félix, M. -A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, 309(2008).
  31. Burton, N. O., et al. Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs. eLife. 10, 73425(2021).
  32. Jaroenlak, P., et al. 3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery. PLoS Pathogens. 16, 1008738(2020).
  33. Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube. The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Odporno mi dzypokoleniowaNematocida parisiimikroskopia fluorescencyjnabarwienie DY96fluorescencyjna hybrydyzacja in situobci enie paso ytniczekondycja nicieni

Powiązane artykuły