Artykuł metodologiczny

Obrazowanie biomolekularne wychwytu komórkowego nanocząstek przy użyciu multimodalnej nieliniowej mikroskopii optycznej

DOI:

10.3791/63637

⸱

16 maja 2022

 ,  ,  , 
1Biomedical Physics, School of Physics and Astronomy, University of Exeter

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia integrację modułu spektralnego ogniskowania i lasera impulsowego o podwójnym wyjściu, umożliwiającego szybkie obrazowanie hiperspektralne nanocząsteczek złota i komórek rakowych. Praca ta ma na celu zademonstrowanie szczegółów multimodalnych nieliniowych technik optycznych na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie nanocząsteczek złota (AuNPs) w żywych systemach jest niezbędne do odkrycia interakcji między AuNPs a tkankami biologicznymi. Co więcej, dzięki integracji nieliniowych sygnałów optycznych, takich jak wymuszone rozpraszanie Ramana (SRS), fluorescencja wzbudzona dwoma fotonami (TPEF) i absorpcja przejściowa (TA) w platformę obrazowania, można ją wykorzystać do ujawnienia kontrastu biomolekularnego struktur komórkowych i AuNP w sposób multimodalny. W artykule przedstawiono multimodalną nieliniową mikroskopię optyczną i zastosowano ją do wykonywania specyficznego chemicznie obrazowania AuNP w komórkach nowotworowych. Ta platforma obrazowania zapewnia nowatorskie podejście do opracowywania bardziej wydajnych funkcjonalizowanych AuNP i określania, czy znajdują się one w naczyniach krwionośnych otaczających guz, przestrzeniach okołokomórkowych lub komórkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanocząstki złota (AuNPs) wykazały duży potencjał jako biokompatybilne sondy obrazowania, na przykład jako skuteczne podłoża spektroskopii Ramana (SERS) w różnych zastosowaniach biomedycznych. Główne zastosowania obejmują takie dziedziny, jak biodetekcja, bioobrazowanie, spektroskopia wzmocniona powierzchniowo i terapia fototermiczna w leczeniu raka1. Co więcej, badanie AuNP w organizmach żywych ma kluczowe znaczenie dla oceny i zrozumienia interakcji między AuNP a systemami biologicznymi. Istnieją różne techniki analityczne, w tym spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR)2, spektrometria mas z indukcyjnie sprzężoną ablacją laserową (LA-ICP-MS)3 oraz obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI)4, które zostały z powodzeniem wykorzystane do zbadania rozmieszczenia AuNP w tkankach. Niemniej jednak metody te mają kilka wad, takich jak czasochłonność i skomplikowane przygotowanie próbki3, wymagające długiego czasu akwizycji, lub brak submikronowej rozdzielczości przestrzennej2,4.

W porównaniu z konwencjonalnymi technikami obrazowania, nieliniowa mikroskopia optyczna oferuje kilka zalet do badania żywych komórek i AuNPs: Nieliniowa mikroskopia optyczna osiąga większą głębokość obrazowania i zapewnia wewnętrzną zdolność do optycznego cięcia 3D przy użyciu ultraszybkich laserów bliskiej podczerwieni. Dzięki znacznej poprawie szybkości obrazowania i czułości wykrywania, dwufotonowa fluorescencja wzbudzona (TPEF)5,6,7 i generacja drugiej harmonicznej (SHG)8,9,10 Wykazano, że mikroskopia jeszcze bardziej usprawnia nieinwazyjne obrazowanie endogennych biomolekuł w żywych komórkach i tkankach. Ponadto, wykorzystując nowatorskie nieliniowe techniki optyczne z pompą i sondą, takie jak absorpcja przejściowa (TA)11,12,13,14 i stymulowane rozpraszanie Ramana (SRS)15,16,17,18możliwe jest wyprowadzenie bezznacznikowego kontrastu biochemicznego struktur komórkowych i AuNPs. Wizualizacja AuNP bez użycia znaczników zewnętrznych ma ogromne znaczenie, ponieważ zaburzenia chemiczne nanocząstek modyfikują ich właściwości fizyczne, a tym samym ich absorpcję w komórkach.

Ten protokół przedstawia implementację modułu SF-TRU (Spectral Focusing Timing and Recombination Unit) dla lasera impulsowego o podwójnej długości fali, umożliwiając szybkie multimodalne obrazowanie AuNP i komórek nowotworowych. Praca ta ma na celu zademonstrowanie szczegółów zintegrowanych technik TPEF, TA i SRS w laserowym mikroskopie skaningowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Włączanie systemu laserowego

  1. Włącz system blokad i wybierz laser ramienia przed uruchomieniem systemu.
  2. Włącz komputer z oprogramowaniem, aby sterować laserem femtosekundowym z podwójnym wyjściem.
  3. Załaduj oprogramowanie dla lasera femtosekundowego z podwójnym wyjściem; oprogramowanie to umożliwia włączanie i wyłączanie lasera oraz bezpośrednio kontroluje długość fali wiązki pompy.
  4. Włącz emisję lasera, przytrzymując ikonę zasilania, aby policzyć do 3.
  5. Poczekaj, aż laser się rozgrzeje, a kontrolka gotowości do pracy z laserem zaświeci się na zielono w oprogramowaniu.
  6. Długość fali wiązki pompy jest bezpośrednio kontrolowana przez oprogramowanie i może wynosić od 680 do 1 300 nm. Do obrazowania komórkowego w obszarze wibracyjnym Ramana C-H wybierz 802 nm.
  7. Otwórz żaluzje przestrajalnej wiązki pompy i wiązki Stokesa 1,045 nm, przytrzymując obrazy przysłony przez 3 s.
    UWAGA: Wskazówki dotyczące bezpieczeństwa lasera Laser femtosekundowy z podwójnym wyjściem jest laserem impulsowym na podczerwień klasy IV i może spowodować trwałe uszkodzenie wzroku. Dlatego podczas wykonywania tej procedury należy przestrzegać wszystkich lokalnych przepisów dotyczących bezpieczeństwa lasera: (i) Tylko upoważnieni użytkownicy, którzy przeszli szkolenie w zakresie bezpieczeństwa lasera, mogą wykonywać tę procedurę. (ii) Wejście do laboratorium odbywa się za pomocą karty magnetycznej z zamkiem w drzwiach pomieszczenia. (iii) Przez większość operacji wiązki laserowe są całkowicie zamknięte. (iv) Gdy wiązka laserowa jest naświetlona, należy nosić laserowe okulary ochronne (użyj laserowych okularów ochronnych LG9, które blokują OD 7+ zarówno pompę, jak i wiązki Stokesa).

2. Włączanie jednostki rekombinacji i czasu ogniskowania spektralnego (SF-TRU)

  1. Załaduj oprogramowanie ATM na ten sam komputer co oprogramowanie laserowe, które steruje stopniami opóźnienia i tłumikami lasera w jednostce SF-TRU.
    UWAGA: To urządzenie jest odpowiedzialne za upewnienie się, że pompa i belki Stokesa zachodzą przestrzennie na siebie, kontrolowanie dyspersji w pompie i belkach Stokesa oraz kontrolowanie opóźnienia czasowego między pompą a belkami Stokesa. Polaryzacja zarówno pompy, jak i belek Stokesa jest pionowa. Należy pamiętać, że każda wiązka jest wyposażona w płytkę półfalową, która niezależnie kontroluje polaryzację przed wyjściem z SF-TRU.
  2. Upewnij się, że zarówno pompa, jak i lasery Stokesa są osłabione do <10% (pompa) i <15% (wiązki Stokesa). Jeśli wiązki nie są tłumione, moc lasera może spowodować uszkodzenie systemu i spalenie próbek biologicznych.
  3. W przypadku obrazowania komórkowego ustaw optymalne ustawienia lasera na 6% (pompa) i 10% (Stokes), co odpowiada 12 mW i 30 mW na próbce.
  4. SF-TRU ma dwa ustawienia: tryb femtosekundowy (fs) i tryb pikosekundowy (ps).
  5. W trybie fs wciśnij pokrętła po obu stronach pudełka (spowoduje to usunięcie siatek dyspersyjnych ze ścieżki wiązki).
  6. W trybie ps wyciągnij pokrętła po obu stronach pudełka (spowoduje to umieszczenie siatek dyspersyjnych na ścieżce wiązki).
  7. W przypadku obrazowania hiperspektralnego wybierz tryb ps.
  8. Upewnij się, że stopień opóźniający znajduje się we właściwej pozycji, aby pompa i wiązki Stokesa czasowo zachodziły na siebie w celu obrazowania C-H w tym systemie.
  9. Upewnij się, że ustawienia dyspersji pompy i wiązki Stokesa są prawidłowe; dla pompy 802 nm jest to 5 mm dla belki pompy i 30 mm dla belki Stokesa.

3. Modulacja wiązki Stokesa do obrazowania SRS

  1. W celu wykrycia SRS moduluj intensywność wiązki Stokesa.
  2. Włączyć generator sygnału do modulacji wiązki.
  3. Przywołaj poprzednie ustawienia, które są następujące:
    WYJŚCIE 1: Fala prostokątna: Częstotliwość = 19,5 MHz, Amplituda = 1,4 V.
    WYJŚCIE 2: Fala prostokątna: Częstotliwość = 19,5 MHz, Amplituda = 300 mV.
  4. Włączyć wyjścia 1 i 2.
  5. Podłącz wyjście 1 do amplifier dla EOM w skrzynce SF-TRU za pomocą BNC.
  6. Podłącz wyjście 2 do wzmacniacza lock-in używanego do wykrywania SRS za pomocą BNC.
  7. Włączyć zasilanie wzmacniacza na suwnicy.

4. Włączanie wzmacniacza lock-in

  1. Do obrazowania SRS należy użyć modułu detekcji SRS, który składa się z fotodiody o dużej powierzchni i specjalnie zaprojektowanego wzmacniacza typu lock-in.
  2. Włączyć zasilanie do wzmacniacza lock-in na suwnicy.
  3. Załaduj oprogramowanie wzmacniacza typu lock-in "SRS detection Module" na komputer.
  4. W oprogramowaniu wybierz następujące ustawienia: Faza = 0°, Przesunięcie = -80 mW, Wzmocnienie = 58 dB.
  5. Wybierz stałą czasową integracji wzmacniacza typu lock-in w oprogramowaniu: w przypadku obrazowania komórek stała czasowa 2 μs zapewnia obrazy o dobrej jakości.

5. Operowanie na laserowym mikroskopie skaningowym

  1. Włącz wtyczki wszystkich urządzeń z wyjątkiem skrzynki pilota zdalnego sterowania. Poczekaj, aż zaświeci się tryb czuwania na skrzynce sterowniczej znajdującej się w górnej części suwnicy.
  2. Włącz skrzynkę zdalnego sterowania na suwnicy i włącz z tyłu skrzynki. Poczekaj, aż kontrolka pilota zmieni kolor na niebieski (na skrzynce sterowniczej) i naciśnij Rozpocznij operację.
  3. Włącz komputer laserowego mikroskopu skaningowego.
  4. Uruchom oprogramowanie mikroskopu konfokalnego.
  5. Sprawdź drogę światła mikroskopu za pomocą oprogramowania komputerowego.
    UWAGA: W mikroskopie wprowadzono pewne modyfikacje, aby nadawał się do obrazowania SRS: (i) W ścieżce wiązki do koła filtrów dodano krótki przebieg 775 nm, w którym wiązki laserowe wchodzą do jednostki skanującej, można to wybrać w zakładce Lightpath w oprogramowaniu komputerowym. (ii) Zamiast używać wbudowanych w mikroskop konfokalny PMT do wykrywania, do ścieżki światła przechodzącego dodano specjalnie zaprojektowany detektor, który umożliwia wykrywanie zarówno SRS, jak i CARS. (iii) Wyjścia z tych detektorów są podłączone do skrzynki analogowej na suwnicy. Sygnał CARS z PMT podłączany jest BNC do CD1, a sygnał SRS ze wzmacniacza lock-in podłączany jest BNC do CD2.
  6. Steruj ostrością za pomocą ekranu dotykowego, pokręteł pilota zdalnego sterowania lub oprogramowania komputerowego.
  7. Wybierz żądane ustawienia obrazu w oprogramowaniu, w tym powiększenie, rozmiar obrazu w pikselach i czas przebywania pikseli.
  8. Upewnij się, że szybkość obrazowania (czas przebywania piksela) jest większa niż czas integracji ustawiony w oprogramowaniu wzmacniacza lock-in.
    UWAGA: Do obrazowania użyto obiektywu zanurzonego w wodzie NA 1.2.

6. Montaż próbki w stoliku mikroskopu

  1. Przygotuj próbki komórek do obrazowania w następujący sposób.
    1. Hodowla komórek raka sutka myszy 4T1 w RPMI-1640 uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Zmieniaj pożywkę co 2 dni i przechodź komórki w tempie 70%–80% konfluencji.
      UWAGA: Pasaże 8-10 były używane przez cały czas trwania opisanych tutaj eksperymentów.
    2. W przypadku eksperymentów obrazowych inkubować 1 x 105 komórek na kwadratowych szkiełkach nakrywkowych przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Następnie przemyć komórki wstępnie podgrzanym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i inkubować z nanocząstkami złota (rozcieńczenie 1:100 w pożywce do hodowli komórkowych, stężenie podstawowe: 2,3 x10 10 cząstek/ml, średnica: 60 nm) przez 4 godziny.
    3. Przed obrazowaniem umyj komórki lodowatym PBS i utrwal je 4% paraformaldehydem w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT). Umyj komórki PBS 3x, a następnie zamontuj między dwoma szkiełkami nakrywkowymi w celu obrazowania.
  2. Umieść kroplę wody destylowanej na obiektywie zanurzenia w wodzie, który skupia wiązki laserowe na próbce między obiektywem a próbką. Następnie umieść próbkę na stoliku mikroskopu.
  3. Kondensator z NA 1.4 zbiera światło rozchodzące się do przodu. Umieścić kroplę wody między skraplaczem a próbką do obrazowania. Ustawić wysokość kondensatora na około 1 mm nad próbką, aby zebrać maksymalną ilość światła.
  4. Detektor SRS znajduje się na ruchomym uchwycie, co pozwala na jego wsunięcie i wysunięcie z toru optycznego odbioru. W celu skupienia ostrości na próbce za pomocą światła białego, należy przesunąć detektor SRS poza tor wiązki.
  5. Umieść detektor z powrotem na ścieżce wiązki, gotowy do obrazowania SRS.

7. Zmiana przesunięcia Ramana i zbieranie danych hiperspektralnych

UWAGA: Przesunięcie Ramana, przy którym odbywa się obrazowanie, zależy od pozycji stopnia opóźniającego w skrzynce SF-TRU i długości fali wiązki pompy z systemu laserowego.

  1. W przypadku dużych zmian w przesunięciu Ramana należy zmienić długość fali lasera. Na przykład, aby obrazować drgania CO w zakresie 2,800–3,100 cm-1, wybierz 802 nm, natomiast w przypadku obrazowania około 1,600 cm-1 dla piku amidu I, wybierz wiązkę pompy przy 898 nm. Dostosuj to za pomocą oprogramowania.
  2. Aby uzyskać niewielkie korekty w przesunięciu Ramana, zeskanuj stopień opóźniający w jednostce SF-TRU.
  3. SF-TRU podaje pozycje stopnia opóźniającego w milimetrach (mm). Aby przeliczyć pozycję stopnia opóźniającego z mm na cm-1, wykonaj kalibrację skanowania hiperspektralnego przy użyciu próbki kulek polistyrenowych i porównaj pozycje pików znalezione w skanie kalibracyjnym z tymi wykonanymi w spontanicznym układzie Ramana. W ten sposób otrzymamy równanie liniowe, które przeliczy pozycję stopnia opóźniającego w mm na przesunięcie Ramana w cm-1.
  4. Aby wygenerować skan hiperspektralny, należy wykonać serię zdjęć w różnych pozycjach etapu opóźnienia.
  5. Aby zsynchronizować akwizycję obrazu i ruch stopnia opóźniającego, użyj jednostki analogowej do wysyłania i odbierania sygnałów TTL do iz systemu SF-TRU.
    UWAGA: Aby to zrobić, skrzynka analogowa ma następujące połączenia: (i) TRIG OUT VD1 - jest podłączony do SF-TRU za pomocą BNC i wysyła sygnał TTL, aby powiedzieć opóźnieniu stage, aby przesunął się o krok +1. (ii) TRIG In 1 - w tym przypadku sygnał jest odbierany przez BNC, gdy stopień opóźniający zakończy swój ruch, i jest on używany do wyzwolenia następnego obrazu w szeregu czasowym.
  6. Dla zestawu danych hiperspektralnych wybierz następujące ustawienia w oprogramowaniu mikroskopu konfokalnego:
    1. Na karcie Trigger (Wyzwalacz) wybierz opcję Start by TTL trigger (ON) i Trigger (every frame).
    2. Na karcie Serie ustaw szeregi czasowe WŁĄCZONE i szeregi z WYŁĄCZONE.
    3. Ustaw liczbę klatek w szeregach czasowych tak, aby odpowiadała liczbie kroków w oprogramowaniu ATM (w tym miejscu jest używana liczba 101 kroków).
  7. W oprogramowaniu bankomatu przejdź do zakładki Uruchom.
    1. Ustaw pozycje stopnia opóźnienia w milimetrach dla rozpoczęcia i zakończenia skanowania hiperspektralnego. W przypadku obszaru o wysokiej liczbie falowej CH użyj pozycji początkowej = 90.25 mm i pozycji końcowej = 92.25 mm.
    2. Upewnij się, że liczba kroków odpowiada liczbie ramek w oprogramowaniu mikroskopu konfokalnego.
  8. Po sprawdzeniu prawidłowych ustawień należy najpierw uruchomić stos hiperspektralny w oprogramowaniu mikroskopu konfokalnego. Przejdź do Acquire i kliknij Rozpocznij skanowanie. Następnie w oprogramowaniu bankomatu kliknij Start. Inicjuje to zbieranie serii obrazów, z przyrostowym wzrostem pozycji stopnia opóźnienia między wybranymi pozycjami początkowymi i końcowymi
  9. Wyeksportuj serię obrazów hiperspektralnych jako plik .tif wieloklatkowy i użyj odpowiedniego pakietu oprogramowania do przeprowadzenia kalibracji.
  10. Po zakończeniu kalibracji użyj równania kalibracji liniowej, aby przekonwertować pozycję stopnia opóźnienia na przesunięcia Ramana.
  11. Aby przełączać się między obrazowaniem w obszarze wibracyjnym CH (2,800–3,100 cm-1) a obszarem wibracyjnym amidu I 1,500–1,700 cm-1), wykonaj następujące czynności.
    1. Zmień długość fali pompy w oprogramowaniu lasera z 802 nm na 898 nm.
    2. Zmień ustawienie dyspersji Stokesa w oprogramowaniu ATM z 30 mm na 5 mm.
    3. Dokonaj niewielkiej regulacji lustra w ścieżce dyspersji wiązki pompy wewnątrz skrzynki SF-TRU. Odbywa się to poprzez regulację dolnego pokrętła na uchwycie lusterka, które zmienia kąt lustra o wartość przyrostową.
    4. Wykonując skan hiperspektralny nad regionem amidu I, ustaw pozycje start i stop w oprogramowaniu ATM odpowiednio na 89 i 91 mm
      UWAGA: Na tym etapie należy nosić okulary ochronne do lasera, ponieważ wiązka lasera będzie odsłonięta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Moduł Spectral Focus Timing and Recombination Unit (SF-TRU) został wprowadzony pomiędzy dwuwyjściowy laser femtosekundowy a zmodyfikowany laserowy mikroskop skaningowy. Przestrajalny ultraszybki system laserowy zastosowany w tym badaniu ma dwa porty wyjściowe dostarczające jedną wiązkę o stałej długości fali 1045 nm, a drugą wiązkę przestrajalną w zakresie 680–1300 nm. Szczegółowy schemat modułu SF-TRU i multimodalnej platformy obrazowania przedstawiono na rysunku Rysunek 1. SF-TRU służy do ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W pracy zaprezentowano połączenie modułu SF-TRU z ultraszybkim systemem laserowym o podwójnym wyjściu, demonstrując swoje zastosowania w mikrospektroskopii multimodalnej. Dzięki możliwości badania wychwytu nanocząstek złota (AuNPs) przez komórki nowotworowe, multimodalna platforma obrazowania może wizualizować reakcje komórkowe na leczenie raka w hipertermii, gdy wiązki laserowe są pochłaniane przez AuNPs.

Co więcej, szybkie obrazowanie specyficzne chemicznie i wysoka rozdzielczość spektralna ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez granty EPSRC: Raman Nanotheranostics (EP/R020965/1) i CONTRAST facility (EP/S009957/1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Jednostka detekcyjna APE SRS APE(Angewandte Physik & Elektronik GmbH)APE Lock-in ModulePołączony system zawierający fotodiodę Si o dużej powierzchni do wykrywania wiązki pompy wraz ze wzmacniaczem Lock-In do wykrywania modulacji wiązki
Konfokalna jednostka skanującaOlympusFV 3000Konfokalna jednostka skanująca służąca do obrazowania
kulek lateksowych CML, 4% w/v, 1,0 i mikro; mInvitrogenC37483Mikrosfery polistyrenowe
Szkiełka nakrywkoweThorlabsCG15CH2Szkiełka nakrywkowe 22 mm x 22 mm do komórek wysiewających
FBSGibco10500-064Surowica bydlęca płodu (inaktywowana termicznie)
FlouviewOlympusFV31S-SWOprogramowanie sterujące laserowym mikroskopem skaningowym
Generator funkcyjnyBX precyzyjny40543Służy do generowania funkcji fali prostokątnej, która jest podawana do EOM w SF-TRU w celu wytworzenia modulacji w wiązce stokesa
Nanocząstki złotaNanopartzA11-60Sferyczne nanocząstki złota, średnica 60 nm
Interfejs wejściowo-wyjściowyOlympusFV30 ANALOGTo urządzenie umożliwia wprowadzanie odczytów napięcia z PMT i LockIn do oprogramowania skanowania konfokalnego i umożliwia przesyłanie impulsów czasowych między mikroskopem Olympus a SF-TRU jednostka.
InSight X3NewportSpectra-PhysicsFemtosekundowy laser impulsowy o podwójnym wyjściu. Przestrajany (680– 1300 nm) i stałe (1045 nm) wyjścia laserowe z częstotliwością powtarzania 80 MHz.
Rama mikroskopuOlympusIX83Mikroskop odwrócony
Mysz 4T1 komórkiATCC CRL-2539Mysie komórki raka piersi
NA 1.2 Cel zanurzenia w wodzieOlympusUPLSAPO60XW/IRWielofotonowy obiektyw 60x ma odległość roboczą 0,28 mm. Można zastosować inne podobne cele.
Kondensator NA 1.4NikonCSC1003Można również stosować inne kondensatory z NA wyższym niż obiektyw wzbudzenia.
PMTHamamatsuR3896PMT służy do wykrywania zdjęć anty-stokes dla CARS micrsocopy
PMT ConnectorHamamatsuC13654-01-Y002Connector for PMT
Power SupplyRSRSPD-3303 CProgramowalny zasilacz, który służy do dostarczania prawidłowego napięcia do PMT
RPMI-1640GibcoA10491-01Od tego czasu stwierdzono, że pożywka 1640 z Roswell Park Memorial Institute (RPMI) jest odpowiednia dla różnych komórek ssaków.
SF-TRUNewport Spectra PhysicsSystem SF-TRUprzeznaczony do kontrolowania opóźnienia czasowego i dyspersji 2 wyjść laserowych oraz do wykonywania modulacji wiązki wymaganych dla SRS

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tabish, T. A., et al. Smart gold nanostructures for light mediated cancer theranostics: Combining optical diagnostics with photothermal therapy. Advanced Science. 7 (15), Weinheim, Baden-Württemberg, Germany. 1903441(2020).
  2. Tian, F., et al. Gold nanostars for efficient in vitro and in vivo real-time SERS detection and drug delivery via plasmonic-tunable Raman/FTIR imaging. Biomaterials. 106, 87-97 (2016).
  3. Jenkins, S. V., et al. Enhanced photothermal treatment efficacy and normal tissue protection via vascular targeted gold nanocages. Nanotheranostics. 3 (2), 145-155 (2019).
  4. Huang, J., et al. Rational design and synthesis of gammaFe2 O3 @Au magnetic gold nanoflowers for efficient cancer theranostics. Advanced Materials. 27 (34), Deerfield Beach, Fla. 5049-5056 (2015).
  5. Dilipkumar, A., et al. Label-free multiphoton endomicroscopy for minimally invasive in vivo imaging. Advanced science. 6 (8), Weinheim, Baden-Württemberg, Germany. 1801735(2019).
  6. Wang, C. -C., et al. Differentiation of normal and cancerous lung tissues by multiphoton imaging. Journal of Biomedical Optics. 14 (4), 044034(2009).
  7. Chrabaszcz, K., et al. Comparison of standard and HD FT-IR with multimodal CARS/TPEF/SHG/FLIMS imaging in the detection of the early stage of pulmonary metastasis of murine breast cancer. The Analyst. 145 (14), 4982-4990 (2020).
  8. Tsai, T. H., et al. Visualizing radiofrequency-skin interaction using multiphoton microscopy in vivo. Journal of Dermatological Science. 65 (2), 95-101 (2012).
  9. Wang, C. -C., et al. Early development of cutaneous cancer revealed by intravital nonlinear optical microscopy. Applied Physics Letters. 97 (11), 113702(2010).
  10. Li, F. -C., et al. Dorsal skin fold chamber for high resolution multiphoton imaging. Optical and Quantum Electronics. 37 (13), 1439-1445 (2005).
  11. Tong, L., et al. Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy. Nature Nanotechnology. 7 (1), 56-61 (2011).
  12. Chong, S., Min, W., Xie, X. S. Ground-state depletion microscopy: Detection sensitivity of single-molecule optical absorption at room temperature. The Journal of Physical Chemistry Letters. 1 (23), 3316-3322 (2010).
  13. Chen, T., et al. Transient absorption microscopy of gold nanorods as spectrally orthogonal labels in live cells. Nanoscale. 6 (18), 10536-10539 (2014).
  14. Liu, J., Irudayaraj, J. M. Non-fluorescent quantification of single mRNA with transient absorption microscopy. Nanoscale. 8 (46), 19242-19248 (2016).
  15. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  16. Wang, C. -C., et al. In situ chemically specific mapping of agrochemical seed coatings using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Biophotonics. 11 (11), 201800108(2018).
  17. Wang, C. -C., Yoong, F. -Y., Penfield, S., Moger, J. Visualization of active ingredients uptake in seed coats with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings SPIE 10069, Multiphoton Microscopy the Biomedical Sciences XVII. , 1006928(2017).
  18. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  19. Zeytunyan, A., Baldacchini, T., Zadoyan, R. Module for multiphoton high-resolution hyperspectral imaging and spectroscopy. Proceedings SPIE 10498, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XVIII. , 104980(2018).
  20. Wang, C. -C., Wu, R. -J., Lin, S. -J., Chen, Y. -F., Dong, C. -Y. Label-free discrimination of normal and pulmonary cancer tissues using multiphoton fluorescence ratiometric microscopy. Applied Physics Letters. 97 (4), 043706(2010).
  21. Wang, C. -C., Chandrappa, D., Smirnoff, N., Moger, J. Monitoring lipid accumulation in the green microalga botryococcus braunii with frequency-modulated stimulated Raman scattering. Proceedings SPIE 9329, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XV. , 9329(2015).
  22. Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
  23. Cui, L., et al. In situ plasmon-enhanced CARS and TPEF for Gram staining identification of non-fluorescent bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 264, 120283(2022).
  24. Ma, J., Sun, M. Nonlinear optical microscopies (NOMs) and plasmon-enhanced NOMs for biology and 2D materials. Nanophotonics. 9 (6), 1341-1358 (2020).
  25. Sun, L., Chen, Y., Sun, M. Exploring nonemissive excited-state intramolecular proton transfer by plasmon-enhanced hyper-Raman scattering and two-photon excitation fluorescence. The Journal of Physical Chemistry C. 126 (1), 487-492 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Gold NanoparticlesNonlinear Optical MicroscopyStimulated Raman ScatteringTwo Photon FluorescenceTransient AbsorptionMultimodal ImagingCancer CellsCellular UptakeHyperspectral ImagingMolecular Imaging

Powiązane artykuły