Obecny protokół opisuje test do oceny zdolności do utleniania kwasów tłuszczowych w hodowlach pierwotnych komórek kostnych lub odpowiednich linii komórkowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obecny protokół opisuje test do oceny zdolności do utleniania kwasów tłuszczowych w hodowlach pierwotnych komórek kostnych lub odpowiednich linii komórkowych.
Tworzenie kości poprzez różnicowanie osteoblastów powinno wymagać znacznego wkładu energetycznego, ponieważ te wyspecjalizowane komórki muszą syntetyzować duże białka macierzy zewnątrzkomórkowej, które tworzą tkankę kostną, a następnie koncentrują jony niezbędne do jej mineralizacji. Szybko pojawiają się dane na temat wymagań metabolicznych związanych z tworzeniem kości. Chociaż wiele pozostaje do nauczenia się, oczekuje się, że zaburzenia w metabolizmie pośrednim przyczyniają się do chorób układu kostnego. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny zdolności komórek osteoblastycznych do utleniania 14znakowanych C kwasów tłuszczowych do 14CO2 i metabolitów rozpuszczalnych w kwasach. Kwasy tłuszczowe stanowią bogaty rezerw energetyczny, który może być pobierany z krążenia po karmieniu lub po ich uwolnieniu z zapasów tkanki tłuszczowej. Test, wykonywany w kolbach do hodowli tkankowych T-25, jest pomocny w badaniu przyrostu lub utraty funkcji genów na wykorzystanie kwasów tłuszczowych oraz wpływ sygnałów anabolicznych w postaci czynników wzrostu lub morfogenów niezbędnych do utrzymania masy kostnej. Podano również szczegółowe informacje na temat możliwości dostosowania protokołu do oceny utleniania glukozy lub aminokwasów, takich jak glutamina.
Osteoblast, pochodzący z komórek progenitorowych obecnych w szpiku kostnym i okostnej, jest odpowiedzialny za syntezę i wydzielanie zmineralizowanej, bogatej w kolagen matrycy, z której składa się tkanka kostna. Aby spełnić to kosztowne energetycznie przedsięwzięcie i przyczynić się do utrzymania integralności szkieletu przez całe życie, te wyspecjalizowane komórki utrzymują obfitą, szorstką retikulum endoplazmatyczne niezbędne do syntezy białek macierzy zewnątrzkomórkowej1,2 oraz liczne mitochondria o wysokim potencjale błonowym do pozyskiwania wymaganej energii chemicznej z substratów paliwowych
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Ten protokół wykorzystuje konwersję kwasu [1-14C]-oleinowego do 14CO2 jako wskaźnika zdolności utleniania kwasów tłuszczowych. Lokalne Biuro Bezpieczeństwa Radiacyjnego zatwierdziło protokół użycia materiałów radioaktywnych przed rozpoczęciem eksperymentów. Wszystkie zabiegi radiologiczne wykonywano za osłoną z pleksi przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej. Lokalna Komisja ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt zatwierdziła protokół przed użyciem komórek pierwotnych.
1. Utlenianie kwasów tłuszczowych w hodowanych osteoblastach
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Aktywność enzymatyczna zarówno karnitynowej palmitoilotransferazy 1 (Cpt1), jak i karnitynowej palmitoilotransferazy 2 (Cpt2) jest niezbędna do mitochondrialnego utleniania długołańcuchowych kwasów tłuszczowych. Cpt1 jest enzymem ograniczającym szybkość w tej ścieżce metabolicznej, jednak w genomach ssaków zakodowane są trzy izoformy (Cpt-1a, Cpt-1b i Cpt-1c), a genetyczna dysfunkcja jednej izoformy może prowadzić do kompensacyjnej nadekspresji innej izoformy.13Z kolei Cpt2 jest kodowane przez poj.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Opisana powyżej procedura pozwala na bezpośrednią ocenę utleniania kwasów tłuszczowych, ponieważ zmierzone wyniki to 14CO2 zebrane na bibule filtracyjnej nasączonej NaOH oraz metabolity rozpuszczalne w kwasach zebrane po zakwaszeniu kultury kwasem nadchlorowym. Dostępne na rynku zestawy testowe, które wykorzystują znakowane fluorescencyjnie cząsteczki lipidów lub analogi lipidów, mogą mierzyć wychwyt lipidów, ale nie określają katabolizmu do wytwarzania energii. Inne miary katabolizmu, takie jak
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Ta praca została wsparta przez Nagrodę za Przegląd Zasług od Służby Badań i Rozwoju Laboratorium Biomedycznego Biura Badań i Rozwoju Weteranów (BX003724) oraz grant od Narodowego Instytutu Cukrzycy i Chorób Trawiennych i Nerek (DK099134).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| [1-14C]-Kwas oleinowy | Perkin Elmer | NEC317050UC | |
| 15 x 30 mm gumowe korki do rękawów | VWR | 89097-542 | |
| ml Igła | precyzyjna 309628 | ||
| 25 G (25 G x 1 1/2 cala) | BD Precyzyjna | 305127 | |
| Kwas askorbinowy | Sigma Aldrich | A4403 | |
| BCA Zestaw do oznaczania białek | Thermo Fisher | 23225 | Inne zestawy są również odpowiednie Licznik |
| scyntylacyjny | Beckman lub odpowiednik Beckman Coulter | LS6000SC | |
| Fosforan beta-glicerolu | Sigma Aldrich | G6626 | |
| Surowica bydlęca Albumina | Sigma Aldrich | 126609 | |
| Karnityna | Sigma Aldrich | C0283 | |
| Komórkowy bufor | Protokół jest podatny na typowe do lizy (tj. RIPA) | ||
| Kleszcze | Dostępne z wielu źródeł | ||
| Zestaw | Dostępne z wielu źródeł | ||
| Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Corning | 20-030-CV | |
| Płodowa surowica | Dostępne z wielu źródeł | ||
| Probówki do mikrowirówek, 1,5 ml | Dostępne z wielu źródeł | ||
| Minimalna pożywka essensjalna, modyfikacja alfa | Corning | 10-022-CV | |
| Penicylina-Streptomycyna | Gibco | 15140122 | |
| Kwas nadchlorowy | Sigma Aldrich | 50439 | |
| Studnie środkowe z polipropylenu | VWR | 72760-048 | |
| Wodorotlenek sodu | Sigma Aldrich | S5881 | |
| T-25 skośna kolba do hodowli tkanek szyi | Corning | 430639 | |
| Inkubator | |||
| Trypsyna (0,25%)-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| Ultima Gold (roztwór scyntylacyjny) | PerkinElmer | 6013329 | |
| Whatman Bibuła chromatograficzna | Sigma Aldrich | WHA3030917 |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny