Ocena utleniania kwasów tłuszczowych w hodowanych komórkach kostnych

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje test do oceny zdolności do utleniania kwasów tłuszczowych w hodowlach pierwotnych komórek kostnych lub odpowiednich linii komórkowych.

Streszczenie

Tworzenie kości poprzez różnicowanie osteoblastów powinno wymagać znacznego wkładu energetycznego, ponieważ te wyspecjalizowane komórki muszą syntetyzować duże białka macierzy zewnątrzkomórkowej, które tworzą tkankę kostną, a następnie koncentrują jony niezbędne do jej mineralizacji. Szybko pojawiają się dane na temat wymagań metabolicznych związanych z tworzeniem kości. Chociaż wiele pozostaje do nauczenia się, oczekuje się, że zaburzenia w metabolizmie pośrednim przyczyniają się do chorób układu kostnego. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny zdolności komórek osteoblastycznych do utleniania ¹⁴znakowanych C kwasów tłuszczowych do ¹⁴CO₂ i metabolitów rozpuszczalnych w kwasach. Kwasy tłuszczowe stanowią bogaty rezerw energetyczny, który może być pobierany z krążenia po karmieniu lub po ich uwolnieniu z zapasów tkanki tłuszczowej. Test, wykonywany w kolbach do hodowli tkankowych T-25, jest pomocny w badaniu przyrostu lub utraty funkcji genów na wykorzystanie kwasów tłuszczowych oraz wpływ sygnałów anabolicznych w postaci czynników wzrostu lub morfogenów niezbędnych do utrzymania masy kostnej. Podano również szczegółowe informacje na temat możliwości dostosowania protokołu do oceny utleniania glukozy lub aminokwasów, takich jak glutamina.

Wprowadzenie

Osteoblast, pochodzący z komórek progenitorowych obecnych w szpiku kostnym i okostnej, jest odpowiedzialny za syntezę i wydzielanie zmineralizowanej, bogatej w kolagen matrycy, z której składa się tkanka kostna. Aby spełnić to kosztowne energetycznie przedsięwzięcie i przyczynić się do utrzymania integralności szkieletu przez całe życie, te wyspecjalizowane komórki utrzymują obfitą, szorstką retikulum endoplazmatyczne niezbędne do syntezy białek macierzy zewnątrzkomórkowej^1,2 oraz liczne mitochondria o wysokim potencjale błonowym do pozyskiwania wymaganej energii chemicznej z substratów paliwowych^3,4. O znaczeniu tej ostatniej funkcji świadczy zaprzestanie wzrostu kości i rozwój osteopenii^5,6 związane z deficytami energetycznymi, jak w przypadku ograniczenia kalorii. Wyłania się tożsamość preferowanego źródła paliwa osteoblastu oraz dane dotyczące wymagań metabolicznych osteoblastu podczas różnicowania lub w odpowiedzi na sygnalizację anaboliczną^7,8.

Długołańcuchowe kwasy tłuszczowe reprezentują bogate źródło energii chemicznej obecnej w surowicy i uwalnianej z tkanki tłuszczowej w odpowiedzi na zmniejszone spożycie kalorii lub zwiększony wydatek energetyczny. Po przejściu przez błonę komórkową i ligacji do koenzymu A w celu zwiększenia rozpuszczalności, tłuszczowe acylo-CoA są transportowane do macierzy mitochondrialnej przez podwójne enzymy palmitoilotransferazy karnityny na zewnętrznej i wewnętrznej błonie mitochondrialnej oraz translokazę karnityny-acylokarnityny⁷. W macierzy mitochondrialnej łańcuch maszynerii β-utleniania skraca acylo-CoA w 4-etapowym procesie, który generuje acetylo-CoA, który wchodzi w cykl TCA (cykl kwasu trikarboksylowego) i redukujące równoważniki. Katabolizm palmitynianu (C₁₆), najpowszechniejszego kwasu tłuszczowego u zwierząt, poprzez ten szlak daje ~131 ATP, znacznie więcej niż ~38 ATP generowane przez utlenianie glukozy⁷.

Badania śledzące z użyciem radioznakowanych lipidów wykazały, że kość zajmuje znaczną część krążących lipidów^9,10, podczas gdy genetyczna ablacja enzymów krytycznych dla katabolizmu lipidów prowadzi do zmniejszenia aktywności osteoblastów i utraty masy kostnej^9,11. Przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje kwas tłuszczowy znakowany ¹⁴C do oceny zdolności hodowanych osteoblastów do pełnego metabolizowania kwasów tłuszczowych do CO₂ lub metabolitów rozpuszczalnych w kwasach, które reprezentują pośrednie etapy procesu utleniania. Chociaż wymagane jest zastosowanie radioaktywności, metoda jest prosta, wymaga ograniczonych inwestycji i można ją dostosować z korzyścią dla innych znakowanych radioaktywnie metabolitów i typów komórek.

Protokół

Ten protokół wykorzystuje konwersję kwasu [^1-14C]-oleinowego do ¹⁴CO₂ jako wskaźnika zdolności utleniania kwasów tłuszczowych. Lokalne Biuro Bezpieczeństwa Radiacyjnego zatwierdziło protokół użycia materiałów radioaktywnych przed rozpoczęciem eksperymentów. Wszystkie zabiegi radiologiczne wykonywano za osłoną z pleksi przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej. Lokalna Komisja ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt zatwierdziła protokół przed użyciem komórek pierwotnych.

1. Utlenianie kwasów tłuszczowych w hodowanych osteoblastach

1. Posiewaj pierwotne osteoblasty kalwaryczne¹² lub linię komórek osteoblastycznych, taką jak Mc3t3-E1, i płytkę w kolbach T-25 (5 x 10⁵ komórek/kolbę) w α-MEM zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/ml penicyliny i 0,1 μg/ml streptomycyny.
   1. Wysiew: 3-4 kolby nasienne dla każdej grupy poddanej działaniu substancji (tj. kontrola i nokaut genów lub nośnik i leczenie farmakologiczne) do wykorzystania w doświadczeniu. Wysiewać dodatkowe 1-2 kolby dla każdej grupy poddawanej działaniu substancji, aby znormalizować liczbę komórek lub stężenie białka. Inkubować kolby hodowlane w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ .
2. Hoduj komórki przez 2-3 dni, aż kolby zaczną się zlewać. Skłonić zbiegające się kultury do różnicowania poprzez dodanie 50 μg/ml kwasu askorbinowego i 10 mM fosforanu β-glicerolu (patrz tabela materiałów) do pożywki hodowlanej i kontynuować hodowlę przez okres do 14 dodatkowych dni.
   UWAGA: Głód surowicy (dodanie 0,5%-1% FBS) przez noc jest konieczny, jeśli planowane jest leczenie czynnikiem wzrostu. Obniżenie odsetka FBS ogranicza ilość nieznakowanych radioaktywnie lipidów w hodowli i pozwala na maksymalne działanie egzogennych czynników wzrostu. Jeśli ma być badane działanie hormonów, stosuje się FBS pozbawiony węgla drzewnego.
3. Przygotuj bibułę filtracyjną, gumowe korki do tulei o wymiarach 15 mm x 30 mm i polipropylenowe studzienki środkowe (patrz Tabela Materiałów) na dzień przed eksperymentem.
   1. Złóż pasek bibuły filtracyjnej o wymiarach 1 cm x 10 cm w kształcie wentylatora i umieść go w wiadrze z polipropylenową studnią środkową. Dobrze wciśnij ramię środka polipropylenowego przez środek gumowego korka tulei i opuść środek polipropylenowy do kolby T-25. Następnie uszczelnić kolbę korkiem tulei (Rysunek 1).
      UWAGA: Może być konieczne dokładne dostosowanie umieszczenia środka polipropylenowego, aby nie stykał się z podłożem hodowlanym. Podczas eksperymentu środek polipropylenowy dobrze zapobiega dotykaniu bibuły filtracyjnej z medium etykietującym i pozwala na zebranie ¹⁴_CO2
   .
4. W dniu doświadczenia sprzężyć [^1-14C]-kwas oleinowy z albuminą surowicy bydlęcej (BSA) przez zmieszanie 20% albuminy surowicy bydlęcej w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (5 μl na kolbę) z 0,1 μCi/ml kwasu oleinowego [^1-14C] (0,6 μl/kolbę) w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
   1. Następnie umieścić probówkę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, delikatnie wstrząsając. Przygotować 1-2 dodatkowe kolby na koniugaty kwasu oleinowego i BSA, aby uwzględnić błąd pipetowania.
5. Usunąć pożywkę hodowlaną z kolby do hodowli tkankowej i zastąpić ją 1,5 ml świeżej pożywki do głodzenia surowicy (krok 1.2).
6. Dla każdej kolby połączyć 5,6 μl roztworu kwasu oleinowego-BSA (krok 1.4) z 2 μl 100 mM roztworu karnityny i 1 ml pożywki hodowlanej, aby uzyskać roztwór do znakowania. Dodać roztwór do etykietowania do kolb hodowlanych. Zachowaj nadmiar roztworu, aby odczytać całkowitą liczbę aktywności dodanej do testu.
   UWAGA: Roztworu do znakowania nie dodaje się do dodatkowych kolb przeznaczonych do ilościowego określania liczby komórkowej lub stężenia białka.
7. Opuścić środkowe studzienki z polipropylenu zawierające bibułę filtracyjną w kolbie, a następnie przykryć je gumowym korkiem.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby środek polipropylenowy nie stykał się z podłożem hodowlanym. Doprowadzi to do zanieczyszczenia krzyżowego bibuły filtracyjnej znakowanym radioizotopowo kwasem tłuszczowym zamiast CO₂ .
8. Inkubować kultury komórkowe przez 3 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
9. Aby zebrać ¹⁴CO₂ należy wstrzyknąć 150 μl 1 N NaOH do studzienki polipropylenowej w celu zwilżenia bibuły filtracyjnej i 200 μl 1 M kwasu nadchlorowego do pożywki hodowlanej. Wstrzyknąć NaOH i kwas nadchlorowy, przepychając igłę przez gumowy korek.
   UWAGA: Nie należy wyjmować gumowego korka z kolby. Może to spowodować ucieczkę ¹⁴CO_{2 .} Aby ułatwić wstrzyknięcie, należy utrzymać kolbę w pozycji pionowej, a następnie powrócić do pozycji hodowlanej po zakończeniu wstrzyknięć.
10. Inkubować kolby w temperaturze 55 °C przez 1 godzinę.
11. Otworzyć kolby po schłodzeniu ich w kapturze do hodowli komórkowych. Usuń bibuły filtracyjne z polipropylenowych studzienek środkowych za pomocą pęsety i umieść je w 3-4 ml cieczy scyntylacyjnej (patrz Tabela materiałów) w fiolce scyntylacyjnej.
    UWAGA: 100 μl nadmiaru roztworu do znakowania dodaje się do 3-4 ml cieczy scyntylacyjnej w celu zmierzenia całkowitej liczby aktywności. 100 μl podstawowej pożywki hodowlanej (bez [^1-14C]-kwasu oleinowego) dodaje się do 3-4 ml cieczy scyntylacyjnej w celu pomiaru aktywności tła.
12. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub przez noc, zmierzyć radioaktywność w liczbach na minutę (cpm) za pomocą licznika scyntylacyjnego (patrz tabela materiałów).
13. Aby znormalizować wyniki cpm, należy wyizolować ekstrakty białkowe z nieznakowanych kolb T-25 dla każdego warunku hodowli. Przemyć 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, dodać 1 ml buforu do lizy komórek RIPA do każdej kolby i zeskrobać powierzchnię komórek za pomocą skrobaka do komórek.
    1. Przenieść bufor RIPA do probówki mikrowirówkowej z pipetą i odwirowywać przy 19 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant za pomocą pipety do świeżej probówki do mikrowirówki i oznaczyć stężenie białka zgodnie z protokołem oznaczania BCA (patrz tabela materiałów).
    2. Podzielić surowe odczyty cpm z licznika scyntylacyjnego przez stężenie białka, aby uzyskać znormalizowany cpm wytworzonych ¹⁴CO₂ (Tabela 1).
14. Postępuj zgodnie z lokalnymi wymaganiami, aby pozbyć się fiolek scyntylacyjnych, materiałów do hodowli komórkowych, pożywki, strzykawek itp. Odkazić powierzchnie robocze i przeprowadzić testy wycierania radioaktywności zgodnie z lokalnymi wymaganiami.

2. Zbiór metabolitów rozpuszczalnych w kwasach

UWAGA: 3-godzinny okres inkubacji użyty w kroku 1.8 powyżej może nie być wystarczającym czasem na utlenienie całego [^1-14C] w pełni oleinowego kwasu pobranego przez komórki do CO₂. Strumień na szlaku utleniania kwasów tłuszczowych można również ocenić, mierząc promieniotwórczość we frakcji rozpuszczalnej w kwasie.

1. Zebrać 1 ml zakwaszonej pożywki z każdej poddanej działaniu T-25 kolby i przenieść ją do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
2. Dodać 60 μl 20% BSA i 100 μl 16 M kwasu nadchlorowego.
3. Wirować i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
4. Następnie wirować i odwirowywać przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
5. Dodać 200 μl supernatantu do cieczy scyntylacyjnej i zmierzyć aktywność (krok 1.12).
6. Znormalizuj odczyty do stężenia białka lub pomiarów DNA (krok 1.13.1).

3. Pomiar utleniania glukozy lub utleniania aminokwasów

1. Zastąp ¹⁴znakowanych C kwasem oleinowym ¹⁴znakowanymi C glukozami lub ¹⁴aminokwasami znakowanymi C, aby zmierzyć utlenianie tych cząsteczek paliwa.
2. Przygotuj kultury osteoblastów zgodnie z krokami 1.1-1.2.
3. Aby rozpocząć eksperyment, należy usunąć pożywkę hodowlaną z kolby do hodowli tkankowych i zastąpić ją 1,5 ml świeżej pożywki do głodzenia surowicy.
4. Przygotować roztwór do znakowania składający się z 0,6 μCi ¹⁴glukozy znakowanej C lub ¹⁴aminokwasów znakowanych C w 1 ml pożywki głodowej i dodać do kolb.
5. Wykonaj kroki 1.6-1.13.

Wyniki

Aktywność enzymatyczna zarówno karnitynowej palmitoilotransferazy 1 (Cpt1), jak i karnitynowej palmitoilotransferazy 2 (Cpt2) jest niezbędna do mitochondrialnego utleniania długołańcuchowych kwasów tłuszczowych. Cpt1 jest enzymem ograniczającym szybkość w tej ścieżce metabolicznej, jednak w genomach ssaków zakodowane są trzy izoformy (Cpt-1a, Cpt-1b i Cpt-1c), a genetyczna dysfunkcja jednej izoformy może prowadzić do kompensacyjnej nadekspresji innej izoformy.¹³Z kolei Cpt2 jest kodowane przez poj...

Dyskusja

Opisana powyżej procedura pozwala na bezpośrednią ocenę utleniania kwasów tłuszczowych, ponieważ zmierzone wyniki to ¹⁴CO₂ zebrane na bibule filtracyjnej nasączonej NaOH oraz metabolity rozpuszczalne w kwasach zebrane po zakwaszeniu kultury kwasem nadchlorowym. Dostępne na rynku zestawy testowe, które wykorzystują znakowane fluorescencyjnie cząsteczki lipidów lub analogi lipidów, mogą mierzyć wychwyt lipidów, ale nie określają katabolizmu do wytwarzania energii. Inne miary katabolizmu, takie jak

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
[1-14C]-Kwas oleinowy	Perkin Elmer	NEC317050UC
15 x 30 mm gumowe korki do rękawów	VWR	89097-542
ml Igła	precyzyjna 309628
25 G (25 G x 1 1/2 cala)	BD Precyzyjna	305127
Kwas askorbinowy	Sigma Aldrich	A4403
BCA Zestaw do oznaczania białek	Thermo Fisher	23225	Inne zestawy są również odpowiednie Licznik
scyntylacyjny	Beckman lub odpowiednik Beckman Coulter	LS6000SC
Fosforan beta-glicerolu	Sigma Aldrich	G6626
Surowica bydlęca Albumina	Sigma Aldrich	126609
Karnityna	Sigma Aldrich	C0283
Komórkowy bufor			Protokół jest podatny na typowe do lizy (tj. RIPA)
Kleszcze			Dostępne z wielu źródeł
Zestaw			Dostępne z wielu źródeł
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Corning	20-030-CV
Płodowa surowica			Dostępne z wielu źródeł
Probówki do mikrowirówek, 1,5 ml			Dostępne z wielu źródeł
Minimalna pożywka essensjalna, modyfikacja alfa	Corning	10-022-CV
Penicylina-Streptomycyna	Gibco	15140122
Kwas nadchlorowy	Sigma Aldrich	50439
Studnie środkowe z polipropylenu	VWR	72760-048
Wodorotlenek sodu	Sigma Aldrich	S5881
T-25 skośna kolba do hodowli tkanek szyi	Corning	430639
Inkubator
Trypsyna (0,25%)-EDTA	Gibco	25200056
Ultima Gold (roztwór scyntylacyjny)	PerkinElmer	6013329
Whatman Bibuła chromatograficzna	Sigma Aldrich	WHA3030917

1 do lizy preparacyjne do kwantyfikacji DNA bydlęca kultur tkankowych