Artykuł metodologiczny

Zastosowanie interferencji RNA w nicieni sosnowym, Bursaphelenchus xylophilus

DOI:

10.3791/63645

⸱

9 marca 2022

 ,  ,  ,  , 
1College of Forestry and Biotechnology, Zhejiang Agricultural & Forestry University

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodę moczenia interferencji RNA u Bursaphelenchus xylophilus , aby ułatwić badanie funkcji genów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nicienie sosnowe, Bursaphelenchus xylophilus, jest jednym z najbardziej niszczycielskich gatunków inwazyjnych na świecie, powodującym więdnięcie i ostateczną śmierć sosen. Pomimo uznania ich ekonomicznego i środowiskowego znaczenia, jak dotąd niemożliwe było szczegółowe badanie funkcji genów nicieni pasożytniczych roślinnych (PPN) przy użyciu konwencjonalnej genetyki wyprzedzonej i metod transgenicznych. Jednak jako technologia genetyki odwrotnej, interferencja RNA (RNAi) ułatwia badanie funkcjonalnych genów nicieni, w tym B. xylophilus.

Niniejszy artykuł przedstawia nowy protokół dotyczący RNAi genu ppm-1 u B. xylophilus, który według doniesień odgrywa kluczową rolę w rozwoju i rozmnażaniu innych nicieni patogennych. W przypadku RNAi promotor T7 był powiązany z 5′-końcem docelowego fragmentu za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), a podwójne RNA (dsRNA) było syntetyzowane poprzez transkrypcję in vitro . Następnie dostarczenie dsRNA przeprowadzono poprzez moczenie nicieni w roztworze dsRNA zmieszanym z syntetycznymi neurostymulantami. Zsynchronizowane młode osobniki B. xylophilus (około 20 000 osobników) były myte i moczone w dsRNA (0,8 μg/μL) w buforze moczeniowym przez 24 godziny w ciemności w temperaturze 25 °C.

Ta sama ilość nicieni została umieszczona w buforze moczenia bez dsRNA jako kontroli. Tymczasem kolejna identyczna ilość nicieni została umieszczona w buforze moczeniowym z genem dsRNA dsRNA z zielonego białka fluorescencyjnego (gfp) jako kontrolą. Po moczeniu poziom ekspresji docelowych transkrypcji został określony za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Efekty RNAi zostały następnie potwierdzone za pomocą mikroskopowej obserwacji fenotypów oraz porównania rozmiaru ciała dorosłych osobników w grupach. Obecny protokół może pomóc w dalszym rozwoju badań nad funkcjami genów B. xylophilus i innych pasożytniczych nicieni, w kierunku rozwoju strategii kontroli poprzez inżynierię genetyczną.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nicienie pasożytnicze roślinne (PPN) stanowią stałe zagrożenie dla bezpieczeństwa żywnościowego i ekosystemów leśnych. Powodują szacunkowo 100 miliardów USD strat ekonomicznychrocznie, z których najbardziej problematyczne są głównie nicienie węzłowe korzeniowe, nicienie torbielowe i nicienie sosnowe. Nicień sosnowy, Bursaphelenchus xylophilus, to migrujący, endopasożytniczy nicieni, będący patogenem przyczynowym choroby więdnięcia sosnytypu 2. Wyrządziło to ogromne szkody lasom sosnowym na całym świecie3. Używając terminologii Van Megena i in.4, B. xylophilus należy do Parasitaphelenchidae i należy do kladu 10, podczas gdy większość innych głównych pasożytów roślinnych należy do kladu 12.

Jako niezależny i niedawno wyewoluowany pasożyt roślinny, B. xylophilus jest atrakcyjnym modelem do badań porównawczych. Do tej pory przeprowadzono obszerne badania nad nicieniem węzłowym korzeniowym i torbielowymi należącymi do kladu 12, które są obligatoryjnymi, osiadłymi endopasożytami i należą do najbardziej intensywnie badanych nicieni. Jednak prowadzenie dalszych badań w tym ważnym obszarze wiąże się z poważnym wyzwaniem: funkcja genów pasożytniczych stanowi wąskie gardło badawcze. Badania funkcjonalne zazwyczaj obejmują eksperymenty ekspresji pozamacicznej oraz knockdown/out, ale opierają się na skutecznych protokołach transformacji genetycznych nicienia. W rezultacie genetyka odwrotna w PPN niemal wyłącznie opiera się na wyciszaniu genów przez RNAi.

RNAi, mechanizm szeroko obecny w komórkach eukariotycznych, tłumi ekspresję genów poprzez wprowadzenie podwójnego DNA (dsRNA)5. Do tej pory mechanizm wyciszania genów po transkrypcji indukowany przez dsRNA został odkryty u wszystkich badanych eukariontów, a technologia RNAi, jako narzędzie badań genomiki funkcjonalnej i innych zastosowań, szybko rozwijała się w wielu organizmach. Od czasu odkrycia mechanizmu RNAi u Caenorhabditis elegans w 1998roku, techniki RNAi stały się skutecznymi metodami identyfikacji funkcji genu nicieni i są proponowane jako nowy sposób skutecznej kontroli patogennych nicieni7.

RNAi technicznie ułatwia nasączenie młodych w dsRNA; jednak skuteczność i powtarzalność tego podejścia znacznie różnią się w zależności od gatunku nicieni i docelowego genu8. Badanie wyciszania 20 genów zaangażowanych w szlaki RNAi nicienia węzła korzeniowego, Meloidogyne incognita, z użyciem długich dsRNA jako czynników wyzwalających, co skutkowało różnorodnymi odpowiedziami, w tym wzrostem i brakiem zmian ekspresji niektórych genów9. Wyniki te pokazują, że geny docelowe mogą inaczej reagować na knockdown RNAi, co wymaga dokładnej oceny ich przydatności jako celów do zwalczania nicieni za pomocą RNAi. Jednak obecnie brakuje badań nad biologią rozwoju i rozrodczości B. xylophilus.

W kontynuacji wcześniejszych badań 10,11,12,13, opisujemy tutaj protokół zastosowania RNAi do badania funkcji genu ppm-1 B. xylophilus, w tym syntezę dsRNA, syntetyczne moczenie w neurostymulantach oraz ilościowe wykrywanie reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR). Wiedza zdobyta dzięki temu eksperymentalnemu podejściu prawdopodobnie znacząco przyczyni się do zrozumienia podstawowych systemów biologicznych i zapobiegania chorobie więdnięcia sosny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie zostało zatwierdzone przez radę ds. eksperymentów na zwierzętach Uniwersytetu Rolniczego i Leśnego Zhejiang. Izolat B. xylophilus NXY61 został pierwotnie wyodrębniony z chorego Pinus massoniana w rejonie Ningbo w prowincji Zhejiang, Chiny11.

1. Klonowanie genów

UWAGA: Szczegóły dotyczące podkładów używanych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów .

  1. Zbieraj nicienie.
    1. Hodować szczep B. xylophilus na grzybni Botrytis cinerea na płytkach Potato Dextrose Agar (PDA) w temperaturze 25 °C przez 3-5 dni.
    2. Zbierz nicienie metodą lejkaBellmana 14.
      1. Pod lejkiem umieść zaciskaną gumową rurkę i w otworze lejka umieść dwie warstwy papieru filtracyjnego. Przenieś kultury grzybowe do lejka i dodaj wodę, aby zanurzyć matę grzybową. Poczekaj 2 godziny, potem zbieraj nicienie.
  2. Wyodrębnić całkowite RNA z nicieni, używając odczynnika do ekstrakcji RNA (patrz Tabela Materiałów)11 zgodnie z następującymi krokami.
    1. Dodaj 500 μL odczynnika ekstrakcyjnego i 100 μL kulek magnetycznych do rurki wirówki o pojemności 2 mL. Aspiruj 20 μL nicieni i przelej próbkę do młynka do mielenia w 9 000 × g przez 30 sekund. Inkubuj przez 5 minut, a następnie wiruj przez 10 minut w temperaturze 12 000 × g i 4 °C.
    2. Przelej supernatant do nowej rurki wirówki. Dodaj 100 μL chloroformu, zakręć probówkę i wymieszaj, odwracając ją kilkakrotnie. Inkubuj przez 3 minuty, a następnie wiruj przez 10 minut w temperaturze 12 000 × g w 4 °C.
    3. Przelej supernatant do nowej rurki wirówki. Dodaj 250 μL alkoholu izopropylowego i intensywnie zawiruj. Wirówka z 12 000 × g przez 10 minut.
    4. Usuń nadmiar. Dodaj 500 μL etanolu 75% do przemytu RNA, a następnie przeprowadź próbkę w wir. Wiruj przez 5 minut w temperaturze 12 000 × g i 4 °C.
    5. Susz na powietrzu pellet RNA przez 5 minut.
    6. Ponownie zawiesić pellet w 30 μL wody wolnej od RNazy.
    7. Oblicz stężenie RNA według wzoru: A260 × rozcieńczenia × 40 = μg RNA/mL. Oblicz stosunek A260/A280.
      UWAGA: Stosunek ~2 jest uważany za czysty.
  3. Wykonaj odwrotną transkrypcję dobrej jakości RNA, aby uzyskać szablon cDNA.
    1. Zaprojektować i użyć pary specyficznych primerów, ppm-1-F/R (patrz Tabela materiałów), aby amplifikować częściową sekwencję kodującą genu Bx-ppm-1 w B. xylophilus (numer przystąpienia GenBank QTZ96795).
    2. Sklonuj sekwencje genu ppm-1 do wektora pGEM-Teasy zawierającego promotor T7, stosując standardowy protokół klonowania11.
      1. Ustaw reakcje PCR następująco: 2 μL cDNA, 25 μL 2x Ex Taq Polymerase Premix, 2 μL każdego podkładu (10 pmol/l) oraz sterylną wodę destylowaną do końcowej objętości 50 μL.
      2. Wykonaj zabieg wzmacniania w następujący sposób: 5 minut w 94 °C; następnie 35 cykli po 30 sekund przy 94 °C, 30 sekund przy 55 °C i 1 minutę w 72 °C; oraz ostatni krok przedłużania w temperaturze 72 °C przez 5 minut.
      3. Sklonuj amplifikowane produkty do wektora pGEM-T Easy do sekwencjonowania.

2. Synteza dsRNA

  1. Przygotuj szablon DNA do syntezy dsRNA za pomocą PCR z primerami zaprojektowanymi do dodawania miejsc promotorowych T7 na obu końcach. Dodaj sekwencję promotorów T7 do końca 5' spłonników.
  2. Użyj plazmidu zawierającego fragment genu ppm-1 (894 bp) jako szablonu do PCR i odzyskaj fragment zawierający promotor T711. Stosuj procedurę PCR i system opisany powyżej.
  3. Użyj zestawu transkrypcyjnego in vitro do syntezy dsRNA11.
    1. Rozmroź zamrożone odczynniki na lodzie.
    2. Dodaj 2 μL buforu reakcji 10x, 2 μL mieszanki enzymów oraz 1 μg DNA do probówki wirówki. Dodaj wodę wolną od nukleazy, aby uzyskać standardową reakcję 4 μL. Następnie wymieszaj równe objętości czterech roztworów rybonukleotydowych (ATP, CTP, GTP i UTP) i dodaj 8 μL mieszaniny do probówki. Dokładnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.
    3. Dodaj 1 μL DNazy, dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Zatrzymaj reakcję i dodaj 30 μL wody wolnej od nukleazy oraz 30 μL roztworu wydzielającego LiCl, aby wytrącić RNA. Wymieszaj dokładnie. Inkubować w temperaturze -20 °C przez noc.
    5. Wirówka przez 15 minut przy 12 000 × g i 4 °C. Usuń supernatant.
    6. Dodaj 1 ml 75% etanolu, aby przemyć RNA. Zrób próbkę w wirze i wiruj przez 10 minut w temperaturze 12 000 × g i 4 °C.
    7. Susz na powietrzu pellet RNA przez 3 minuty.
    8. Ponownie zawiesić pellet w 30 μL wody wolnej od RNazy.
    9. Przeanalizuj jakość dsRNA za pomocą spektrofotometru. Pipetą nałóż 1 μL próbki dsRNA na piedestał pomiarowy i ustaw długość fali na 340 nm. Wyobraź sobie produkty na żelu agarozowym o stężeniu 1,0%.

3. RNAi przez moczenie

  1. Wymieszaj 4 μL 5x buforu moczenia (0,05% żelatyny, 5,5 mM KH2PO4, 2,1 mM NaCl, 4,7 mM NH4Cl, 3 mM spermydyny) z dsRNA i ddH2O, aby uzyskać całkowitą objętość 20 μL i końcowe stężenie RNA 0,8 μg/μL.
  2. Zdobyć larwy J2.
    1. Zbierz nicienie z kultur grzybowych i przenieś je do szklanej miski Petriego o średnicy 6 cm. Dodaj 10 ml wody do naczynia, aby nicienie mogły swobodnie pływać. Zostawiaj nicienie w misce przez 30 minut i czekaj, aż jajka przyczepią się do dna.
    2. Ostrożnie usuwaj wodę i nicienie, uważając, by nie ruszyć jaj. Powtarzaj te kroki, aż wszystkie larwy i dorosłe zostaną usunięte, pozostawiając w misce tylko jaja.
    3. Wykluwaj zebrane jaja przez 24 godziny w ciemności w temperaturze 25 °C, aby uzyskać larwy J2. Zbierz larwy J2, umieść je w probówce i przemyj trzykrotnie ddH2O dla eksperymentu RNAi15.
    4. Przełóż larwy J2 do probówki 2 mL zawierającej roztwór dsRNA i dodaj roztwór resorcynolu (owinięty folią aluminiową i rozpuszczony w wodzie), aby uzyskać końcowe stężenie 1,0%. Inkubuj larwy w wirowaniu w 15 × g na stole do potrząsania przez 24 godziny w 25 °C, aby larwy skutecznie wchłaniały dsRNA.
    5. Mocz tę samą ilość nicieni w buforze mokającym bez sondy dsRNA lub z sondą dsRNA GFP jako kontrolą. Wykorzystaj gen GFP (gfp, M62653.1) jako nieendogenną kontrolę i syntetyzuj dsRNA gfp za pomocą genetycznie specyficznych primerów T7-GFP-F/R.

4. wykrywanie qPCR

  1. Oczyść larwy J2 ddH2 O, w tym tez interferencją genów docelowych, interferencją genów GFP oraz niezakłóconą grupę kontrolną. Wyodrębnij całkowite RNA z każdej grupy za pomocą opisanej powyżej metody.
  2. Rozpocznij qPCR.
    1. Zaprojektuj zapalniki q-ppm-1-F/R przy użyciu wybranego oprogramowania (patrz Tabela materiałów).
    2. Ustawił reakcję qPCR w 12 μL zawierającej 1 μL cDNA, 6 μL fluorescencyjnego premixu, 0,4 μL każdego primeru (10 pmol/l) oraz sterylną wodę destylowaną.
    3. Wykonaj qPCR w następujący sposób: 2 minuty w 95 °C; następnie 40 cykli po 10 sekund przy 95 °C, 30 sekund przy 55 °C i 1 minutę w 72 °C.
    4. Użyj genu actb (numer przystąpienia GenBank EU100952) i genu tbb-2 (numer przystąpienia GenBank MT769316) lub innych genów jako wewnętrznych genów referencyjnych do oceny zmian poziomu ekspresji genów po RNAi15.
  3. Zgodnie z wartością progu cyklu (Ct) i krzywej rozpuszczania zastosowano metodę 2-ΔΔCt do oszacowania względnego poziomu ekspresji docelowego genu i weryfikacji efektywności interferencyjnej.
    1. Aby uzyskać wartość ΔCt, odejmij wartość Ct wewnętrznego genu referencyjnego każdej próbki od wartości Ct genu docelowego. Następnie odejmij wartość ΔCt grupy interferencyjnej od wartości ΔCt grupy kontrolnej, aby uzyskać wartość ΔΔCt.
      UWAGA: Wartość ΔΔCt większa niż 0 wskazuje, że zakłócenie jest skuteczne.

5. Ocena długości ciała dorosłych nicieni według RNAi

  1. Po RNAi hodować larwy J2 do dorosłości na trawnikach B. cinerea w płytkach PDA przez 60 godzin w temperaturze 25 °C15.
  2. Zbierz dorosłe osobniki metodą lejka Bellmana (patrz krok 1.1.2.1)14.
  3. Zrób zdjęcia dorosłych nicieni pod mikroskopem i użyj oprogramowania ImageJ (lub innego oprogramowania pomiarowego) do pomiaru długości ciała.
    1. Zmierz długość za pomocą ImageJ, wybierając Analizuj | Ustaw skalę. Jeśli odległość jest znana, wpisz wartość długości narysowanej prostej. Wprowadzamy jednostkę długości.
    2. Zaznacz pole Global (użyj tego standardu dla wszystkich zdjęć) i kliknij OK , aby wybrać długość do pomiaru z linią prostą na obrazie, który ma być mierzony.
    3. Użyj polecenia Ctrl+M (pomiar), aby wyświetlić wyniki i zarejestrować je w oknie wyników .
  4. Zmierzyć 50 samców i 50 samic nicieni do analizy statystycznej12.
  5. Analizuj dane, obliczając średnią i odchylenie standardowe dla każdej próbki. Porównaj średnie próbek z różnych grup za pomocą testu Student t-test.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza ekspresji ppm-1 u B. xylophilus po RNAi
Względny poziom ekspresji genu ppm-1 B. xylophilus nasączonego gfp dsRNA oraz tego nasączonego docelowym genem dsRNA wynosił odpowiednio 0,92 i 0,52 (poziom ekspresji genu ppm-1 w grupie kontrolnej leczonejddH2O został ustawiony na 1) (Rysunek 1). W związku z tym egzogenne dsRNA nie wpływa na ekspresj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż cykl życia i środowisko pasożytnicze B. xylophilus różnią się od innych nicieni, badania nad molekularną patogenezą tego patogenu roślinnego są ograniczone. Pomimo znacznych postępów w zastosowaniu technologii edycji genomu CRISPR/Cas9 u C. elegans i innych nicieni,do tej pory opublikowano jedynie technologię RNAi zastosowaną na B. xylophilus. RNAi jest jednym z najpotężniejszych narzędzi dostępnych do badania funkcji genów nicieni i jest szeroko wykorzystywane w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania te zostały sfinansowane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31870637 31200487) i wspólnie sfinansowane przez Zhejiang Key Research Plan (2019C02024, LGN22C160004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Lejek BaermannaNie maNie mado izolacji nicieni
Beacon Designer 7.9Shanghai Kangyusheng Information Technology Co.Nie mado projektowania zapalników qPCR
Botrytis cinereaNie maNie majako pożywienie dla nicieni
Bursaphelenchus xylophilusNie maNie majego numer to NXY61 i pierwotnie został wyekstrahowany z chorego
Pinus massoniana w Ningbo, prowincja Zhejiang, Chiny.
Inkubator o stałej temperaturzeShanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.H1703544do hodowli nicieni
Aparat elektroforezyLaboratoria Bio-Rad1704466Aby uzyskać analizę elektroforetyczną
Etanol, 75%Sinopharm Chemical Reagent Co.80176961do wyodrębniania RNA
Ex Taq Polymerase PremixTakara Bio Inc.RR030Adla PCR
Ex Taq Polymerase PremixTakara Bio Inc.RR390Adla PCR
Obrazownik żelowyLongGene Scientific Instruments Co.LG2020aby uczynić pasmami kwasów nukleinowych widocznymi
GraphPad Prism 8GraphPad PrismNie maanalizować dane i tworzyć liczby
Wirówka o dużych prędkościachHangzhou Allsheng Instruments Co.AS0813000Wirówka
Młynek do tkanek o wysokim strumieniuBertindo wyodrębniania RNA
Oprogramowanie ImageJNarodowe Instytuty ZdrowiaNie mado pomiaru długości korpusu
Alkohol izopropylowyShanghai Aladdin Biochemical Technology Co.L1909022do wyodrębniania RNA
Mikroskop Leica DM4BLeica Microsystems Inc.obserwować nicienie
Magnetyczne koralikiAoran Science & Technology Co.150010Cdo wyodrębniania RNA
Zestaw transkrypcji MEGAscript T7 High YieldThermo Fisher Scientific Inc.AM1333syntezować dsRNA in vitro
Spektrofotometr NanoDrop ND-2000Thermo Fisher Scientific Inc.NanoDrop 2000/2000Canalizować jakość dsRNA
Wzmacniacz PCRBio-Rad Life Medical Products Co.1851148do amplifikacji sekwencji kwasów nukleinowych
Szalki PetriegoNie maNie mado hodowli nicieni
wektor pGEM-T EasyPromega CorporationA1360Do klonowania
Agar z dekstrozą ziemniaczaną (średni)Nie maNie maaby cultur Botrytis cinerea
Zestaw reagentów Prime Script RT z gDNA EraserTakara Bio Inc.RR047Bdo syntetycznego cDNA
Primer Premier 5.0PREMIER BiosoftNie mado projektowania zapalników PCR
Primery: ppm-1-F/RTsingke Biotechnology Co.Nie maN: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACC
q-ppm-1-F/RTsingke Biotechnology Co.Nie maN: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3'
Cykler termiczny w czasie rzeczywistym & nbsp; qTOWER 2.2Analytique Jena Instruments (Pekin) Co.dla qPCR
Stoł trzęsącyShanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co.Do moczenia nicieni
Mikroskop stereoskopowyChongqing Optec Instrument Co.1814120obserwować nicienie
T7-GFP-F/RTsingke Biotechnology Co.Nie maN: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA
GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG
TTACAAACTCAAGAAGG-3'
  Promotor T7Tsingke Biotechnology Co.Nie maTAATACGACTCACTATAGGG
Zestaw do ekstrakcji DNA żelu agarozowego Takara MiniBESTTakara Bio Inc.9762aby odzyskać DNA
TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)Takara Bio Inc.RR820Adla qPCR
TrichloroetanShanghai LingFeng Chemical Reagent Co.do wyodrębniania RNA
Odczynnik TRIzolThermo Fisher Scientific Inc.15596026Całkowity odczynnik do ekstrakcji RNA, aby wyodrębnić RNA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nicol, J. M., et al. Current nematode threats to world agriculture. Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions. Jones, J., Gheysen, G., Fenoll, C. , Springer. Dordrecht. 21-43 (2011).
  2. Jones, J. T., et al. Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 14 (9), 946-961 (2013).
  3. Kikuchi, T., et al. Genomic insights into the origin of parasitism in the emerging plant pathogen Bursaphelenchus xylophilus. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002219(2011).
  4. Megen, H. V., et al. A phylogenetic tree of nematodes based on about 1200 full-length small subunit ribosomal DNA sequences. Nematology. 11 (6), 927-950 (2009).
  5. Niu, J. H., Jian, H., Xu, J. M., Guo, Y. D., Liu, Q. RNAi technology extends its reach: Engineering plant resistance against harmful eukaryotes. African Journal of Biotechnology. 9 (45), 7573-7582 (2010).
  6. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 91 (6669), 806-811 (1998).
  7. Shahid, M., Imran, A., Mazhar, H., Yusuf, Z., Rob, W. B. Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends in Plant Science. 11 (11), 559-565 (2006).
  8. Marmonier, A., et al. In vitro acquisition of specific small interfering RNAs inhibits the expression of some target genes in the plant ectoparasite Xiphinema index. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3266(2019).
  9. Iqbal, S., Fosu-Nyarko, J., Jones, M. G. K. Attempt to silence genes of the RNAi pathways of the root-knot nematode, Meloidogyne incognita results in diverse responses including increase and no change in expression of some genes. Frontiers in Plant Science. 11, 328(2020).
  10. Zhou, L. F., et al. Molecular characterization and functional analysis of akt-1 in pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Forest Pathology. 51 (1), 12647(2021).
  11. Zhou, L. F., et al. The role of mab-3 in spermatogenesis and ontogenesis of pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Pest Management Science. 77 (1), 138-147 (2021).
  12. Tang, J., et al. Bxy-fuca encoding α-L-fucosidase plays crucial roles in development and reproduction of the pathogenic pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Pest Management Science. 76 (1), 205-214 (2020).
  13. Wang, J. H., et al. Molecular characterization and functional analysis of daf-8 in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Journal of Forestry Research. , (2021).
  14. Viglierchio, D. R., Schmitt, R. V. On the methodology of nematode extraction from field samples: Baermann funnel modifications. Journal of Nematology. 15 (3), 438-444 (1983).
  15. Zhu, N., et al. Observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54842(2016).
  16. Zhou, L. F., Chen, F. M., Ye, J. R., Pan, H. Y. Selection of reliable reference genes for RT-qPCR analysis of Bursaphelenchus mucronatus gene expression from different habitats and developmental stages. Frontiers in Genetics. 9, 269-279 (2018).
  17. Wang, M., et al. Double-stranded RNA-mediated interference of dumpy genes in Bursaphelenchus xylophilus by feeding on filamentous fungal transformants. International Journal for Parasitology. 46 (5-6), 351-360 (2016).
  18. Ma, H. B., Lu, Q., Liang, J., Zhang, X. Y. Functional analysis of the cellulose gene of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, using RNA interference. Genetics and Molecular Research: GMR. 10 (3), 1931-1941 (2011).
  19. Cheng, X. Y., Dai, S. M., Xiao, L., Xie, B. Y. Influence of cellulase gene knock down by dsRNA interference on the development and reproduction of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Nematology. 12 (12), 225-233 (2010).
  20. Xue, Q., Wu, X. Q., Zhang, W. J., Deng, L. N., Wu, M. M. Cathepsin L-like cysteine proteinase genes are associated with the development and pathogenicity of pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), 215(2019).
  21. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: Soaking in the genome sequence. Science. 282 (5388), 430-431 (1998).
  22. Urwin, P. E., Lilley, C. J., Atkinson, H. J. Ingestion of double-stranded RNA by pre parasitic juvenile cyst nematodes leads to RNA interference. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 15 (8), 747-752 (2002).
  23. Bakhetia, M., Charlton, W., Atkinson, H. J., McPherson, M. J. RNA interference of dual oxidase in the plant nematode Meloidogyne incognita. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (10), 1099-1106 (2005).
  24. Rosso, M. N., Dubrana, M. P., Cimbolini, N., Jaubert, S., Abad, P. Application of RNA interference to root-knot nematode genes encoding esophageal gland proteins. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 615-620 (2005).
  25. Chen, Q., Rehman, S., Smant, G., Jones, J. T. Functional analysis of pathogenicity proteins of the potato cyst nematode Globodera rostochiensis using RNAi. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 621-625 (2005).
  26. Wang, D. D., Li, Y., Li, J., Xie, B. Y., Chen, G. H. Molecular clone and its RNAi interference effect analysis of mapk gene in Bursaphelenchus xylophilus ( in Chinese). Acta Phytopathologica Sinica. 46 (5), 662-669 (2016).
  27. Qiu, X., Wu, X., Huang, L., Ye, J. R. Influence of Bxpel1 gene silencing by dsRNA interference on the development and pathogenicity of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 125(2016).
  28. Dulovic, A., Streit, A. RNAi-mediated knockdown of daf-12 in the model parasitic nematode Strongyloides ratti. PLoS Pathogens. 15 (3), 1007705(2019).
  29. Li, L., Zhao, H., Cui, Y., Wei, H., Li, M. Research progress of gene editing technology. Life Science Research. 21 (3), 268-274 (2017).
  30. Bindhya, C. Y., Karuppannan, V., Kuppuswamy, S. Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection. Molecular and Biochemical Parasitology. 148 (2), 219-222 (2006).
  31. Jiang, Z., Sher, A. K., David, G. H., Ralph, B. Next-generation insect-resistant plants: RNAi-mediated crop protection. Trends in Biotechnology. 35 (9), 871-882 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus
Posted by JoVE Editors on 4/16/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/63645-v

Tagi

Analiza funkcji genudwuniciowy RNAlej Baermannatranskrypcja in vitroilo ciowe PCRfenotyp wielko ci cia aanaliza ekspresji gen w

Powiązane artykuły