Artykuł metodologiczny

Ablacja za pośrednictwem nitroreduktazy/metronidazolu oraz platforma MATLAB (RpEGEN) do badania regeneracji nabłonka barwnikowego siatkówki danio pręgowanego

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63658

⸱

2 marca 2022

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Louis J. Fox Center for Vision Restoration, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Earth Research Institute, University of California, Santa Barbara, 3Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodologię genetycznej ablacji nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) przy użyciu transgenicznego modelu danio pręgowanego. Dostosowanie protokołu w celu włączenia modulacji szlaku sygnałowego za pomocą związków farmakologicznych jest bardzo szczegółowe. Opracowano platformę MATLAB do ilościowego określania regeneracji RPE na podstawie pigmentacji, która została zaprezentowana i omówiona.

Streszczenie

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) znajduje się w tylnej części oka i pełni funkcje niezbędne do utrzymania zdrowia i integralności sąsiednich tkanek siatkówki i naczyń krwionośnych. Obecnie ograniczona zdolność naprawcza RPE ssaków, która ogranicza się do małych urazów, utrudnia postęp w zrozumieniu procesów regeneracyjnych RPE in vivo. W tym miejscu przedstawiono szczegółową metodologię ułatwiającą badanie naprawy RPE in vivo z wykorzystaniem danio pręgowanego, modelu kręgowców zdolnego do solidnej regeneracji tkanek. Protokół ten opisuje transgeniczny paradygmat uszkodzenia za pośrednictwem nitroreduktazy/metronidazolu (NTR/MTZ) (rpe65a:nfsB-eGFP), który powoduje ablację centralnych dwóch trzecich RPE po 24-godzinnym leczeniu MTZ, a następnie regenerację tkanek. Skoncentrowano się na ablacjach RPE u larw danio pręgowanego, a także przedstawiono metody badania wpływu związków farmakologicznych na regenerację RPE. Omówiono również generowanie i walidację RpEGEN, skryptu MATLAB stworzonego w celu automatyzacji kwantyfikacji regeneracji RPE na podstawie pigmentacji. Poza aktywnymi mechanizmami naprawy RPE, protokół ten można rozszerzyć o badania zwyrodnień RPE i reakcji na urazy, a także wpływu uszkodzenia RPE na sąsiednie tkanki siatkówki i naczyń krwionośnych, a także inne procesy komórkowe i molekularne. Ten system danio pręgowanego jest bardzo obiecujący w identyfikacji genów, sieci i procesów, które napędzają regenerację RPE i mechanizmy związane z chorobą RPE, z długoterminowym celem zastosowania tej wiedzy w systemach ssaków, a ostatecznie w kierunku rozwoju terapeutycznego.

Wprowadzenie

Metodologia opisana tutaj szczegółowo opisuje protokół genetycznej ablacji nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) przy użyciu larw danio pręgowanego. RPE rozciąga się nad tylną częścią oka i znajduje się między warstwowymi warstwami siatkówki nerwowej a warstwą naczyń krwionośnych stanowiącą naczyniówkę. Wsparcie troficzne, absorpcja światła fototoksycznego i utrzymanie białek cyklu wzrokowego to tylko niektóre z krytycznych funkcji, które wykonuje RPE, a które są niezbędne do utrzymania zdrowia i integralności tych sąsiednich tkanek1. Uszkodzenia RPE u ssaków są naprawialne, gdy zmiany są małe2; Jednak uszkodzenia odniesione w wyniku większych urazów lub postępującej choroby zwyrodnieniowej są nieodwracalne. U ludzi choroby zwyrodnieniowe RPE (np. zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) i choroba Stargardta) prowadzą do trwałej utraty wzroku i, przy niewielu dostępnych opcjach leczenia, do obniżenia jakości życia pacjenta. Ograniczona zdolność ssaków do samonaprawy stworzyła lukę w wiedzy w dziedzinie procesów regeneracyjnych RPE. Biorąc pod uwagę solidną zdolność regeneracyjną danio pręgowanego w wielu różnych typach tkanek, protokół ten został opracowany w celu ustanowienia systemu kręgowców in vivo, aby ułatwić badania nad wewnętrznie regenerującym się RPE i odkryć mechanizmy, które napędzają tę reakcję. Korzystając z opisanego tutaj paradygmatu ablacji, kanoniczny szlak sygnałowy Wnt class3, mTOR pathway4 i odpowiedzi związane z odpornością5 zostały zidentyfikowane jako krytyczne mediatory regeneracji RPE, prawdopodobnie z nakładającymi się funkcjami.

W tym paradygmacie ablacji genetycznej, Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 danio pręgowany wyraża gen nitroreduktazy pochodzenia bakteryjnego (NTR/nfsB) class6 połączony z eGFP pod kontrolą elementu wzmacniającego RPE, rpe65a7. Ablację uzyskuje się poprzez dodanie proleku, metronidazolu (MTZ), do wody systemu, w której znajduje się danio pręgowany. Wewnątrzkomórkowa aktywacja MTZ przez nitroreduktazę powoduje sieciowanie DNA i apoptozę w komórkach wykazujących ekspresję NTR/nfsB8,9. Technologia ta jest szeroko stosowana u danio pręgowanego do ablacji komórek siatkówki10,11,12,13 i innych tkanek8. Razem elementy te umożliwiają ukierunkowaną ekspresję (rpe65a) indukowalnej metodologii ablacji komórek (NTR/MTZ)8,9 oraz markera fluorescencyjnego (eGFP) do wizualizacji.

Istnieją również inne interesujące modele in vivo, które mogą być wykorzystane do badania potencjału regeneracyjnego RPE14. Są one szerokie i obejmują transdyferencjację RPE do siatkówki po retinektomii u, w której komórki RPE utracone w wyniku odrastania siatkówki są zastępowane15,16; Odbudowa RPE po urazie w "super gojącym" MRL/MpJ mouse17; oraz egzogenna stymulacja proliferacji RPE w szczurzym modelu spontanicznego RPE i zwyrodnienia siatkówki18, między innymi. Opracowano również modele in vitro, takie jak dorosłe ludzkie komórki macierzyste RPE (RPESCs)19. Wszystkie te modele są cennymi narzędziami pracującymi nad odkryciem procesów komórkowych związanych z regeneracją RPE (np. proliferacji, różnicowania itp.); jednak danio pręgowany jest wyjątkowy pod względem zdolności do wewnętrznej naprawy RPE po ablacji.

Chociaż metodologia tutaj jest napisana tak, aby skupić się na zrozumieniu mechanizmów napędzających regenerację RPE, linia Tg(rpe65a:nfsB-eGFP) i ten protokół ablacji genetycznej mogą być wykorzystane do badania innych procesów komórkowych, takich jak apoptoza RPE, zwyrodnienie RPE i wpływ uszkodzenia RPE na sąsiednie tkanki siatkówki i naczyń. Protokół ablacji może być również zmodyfikowany w celu uwzględnienia manipulacji farmakologicznej, która jest wygodną wstępną strategią badania przesiewowego szlaków sygnałowych będących przedmiotem zainteresowania. Na przykład, wykazano, że blokowanie kanonicznego szlaku Wnt za pomocą inhibitora odpowiedzi Wnt-1 (IWR-1)20, upośledza regenerację RPE3. Zostało to powtórzone tutaj, aby przeprowadzić użytkowników przez eksperyment manipulacji farmakologicznej i posłużyć jako dowód koncepcji do walidacji skryptu MATLAB (RpEGEN) stworzonego do ilościowego określania regeneracji RPE w oparciu o odzyskiwanie pigmentacji. Podobnie jak linia transgeniczna i protokół ablacji, skrypty RpEGEN są adaptowalne i mogą być wykorzystywane do ilościowego określania innych markerów/procesów komórkowych w obrębie RPE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie metodologie opisane tutaj są zgodne z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu w Pittsburghu.

1. Przygotowanie przed pobraniem zarodków danio pręgowanego

  1. Ustawić inkubator zarodków na temperaturę 28,5°C.
  2. Przygotuj 25-krotny roztwór podstawowy inhibitora melanogenezy, N-fenylotiomocznika (PTU)21,22. Ten roztwór podstawowy jest skalowany na podstawie popularnej receptury22, a 1x jest równe 0,003% wagowo na objętość (% w/v) (np. 0,003 g proszku PTU na 100 ml ciekłego rozpuszczalnika).
    1. Aby przygotować duży 25-krotny roztwór podstawowy PTU, dodaj 0,75 g proszku PTU do 1 l oczyszczonej wody dejonizowanej (zwanej dalej dH2O) i dokładnie wymieszaj w temperaturze pokojowej (~25 °C) za pomocą mieszadła i płytki mieszającej. Przechowywać w temperaturze 4°C do 3 miesięcy, chronić przed światłem.
      UWAGA: Trudno jest skłonić PTU do przejścia do roztworu wodnego i może być konieczne dłuższe mieszanie przez noc.
      UWAGA: PTU jest niebezpieczny i należy zachować ostrożność, aby zapobiec połknięciu, wdychaniu i/lub kontaktowi ze skórą lub oczami. Proszek PTU i wszystkie płynne pochodne PTU opisane w niniejszym dokumencie mogą wymagać utylizacji jako odpady chemiczne w zależności od przepisów stanowych i instytucjonalnych. Przed użyciem zaleca się potwierdzenie prawidłowych metod utylizacji odpadów PTU, jeśli takie istnieją.
    2. Aby uzyskać 1,5-krotny roztwór roboczy PTU (zwany dalej 1,5-krotnym PTU), dodaj 60 ml 25-krotnego roztworu podstawowego PTU do 940 ml wody w pomieszczeniu dla danio pręgowanego (zwanej dalej wodą systemową). Opisano optymalne parametry jakości wody dla danio pręgowanego23, a obiekty wodne powinny mieć standardowe procedury monitorowania wody. Przechowywać 1,5 PTU w temperaturze 28,5°C przez 1-2 tygodnie w chronić przed światłem.
      UWAGA: Ten protokół jest rutynowo wykonywany przy użyciu stężeń PTU, rozpuszczalników i parametrów przechowywania opisanych w kroku 1.2. Ze względów ostrożności zarodki/larwy należy obserwować co 1-2 dni podczas pobytu w PTU, aby potwierdzić skuteczność i potwierdzić trwałą depigmentację. W przypadku podejrzenia zmniejszenia rozpuszczalności/skuteczności PTU należy zoptymalizować warunki rozpuszczania i/przechowywania.
  3. Przygotować roztwór podstawowy 0,05% w/v błękitu metylenowego, inhibitora wzrostu grzybów, dodając 0,05 g proszku błękitu metylenowego do 100 ml dH2O. Dokładnie wymieszać za pomocą mieszadła i płytki mieszającej. Przechowywać w temperaturze 4°C.
  4. Przygotowanie pipet do manipulacji zarodkami/larwami (np. przenoszenie zarodków/larw między szalkami Petriego, oddzielanie larw podczas badań przesiewowych fluorescencji, zbieranie uśpionych larw do probówek mikrowirówkowych w celu utrwalenia itp.) poprzez odcięcie zwężającego się końca szklanej pipety Pasteura za pomocą pisaka z diamentową końcówką. Wytrawić na obwodzie pipety pisakiem diamentowym i delikatnie pociągnąć lub odłamać koniec, aby uzyskać czystą przerwę.
    UWAGA: Otwór pipety powinien być na tyle gładki i szeroki, aby z łatwością wchłonąć zarodek znajdujący się jeszcze w kosmówce bez ścinania. Jako alternatywę należy użyć pipety do pobierania gruszki. Przygotowane pipety mogą być również używane do usuwania płynu podczas podmian wody (zamiast nalewania), aby zminimalizować utratę zarodków/larw.
  5. Przygotować 4% roztwór paraformaldehydu (PFA) w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) (np. dodać 10 ml 16% PFA do 4 ml 10x PBS i 26 ml dH2O). Przechowywać w temperaturze 4°C do 4 tygodni w chronić przed światłem.
    UWAGA: Paraformaldehyd jest niebezpieczną substancją chemiczną i należy z nim obchodzić się pod wyciągiem chemicznym i odpowiednio zutylizować. Należy zachować ostrożność i nosić środki ochrony osobistej (PPE), aby zapobiec połknięciu, wdychaniu i/lub kontaktowi ze skórą lub oczami.

2. Pobieranie i utrzymanie zarodków danio pręgowanego przed ablacją genetyczną (0-5 dni po zapłodnieniu)

  1. Utrzymuj dorosłego danio pręgowanego zgodnie z wcześniejszym opisem3,4,5. Po południu/wieczorem przed pobraniem zarodków należy oddzielić dorosłe rybo danio pręgowane do zbiorników hodowlanych na tarło.
  2. Następnego ranka (0 dni po zapłodnieniu (dpf)) zbierz zarodki na szalki Petriego o średnicy 10 cm w wodzie systemowej i usuń wszystkie niezdolne do życia lub niezapłodnione jaja, które będą wydawać się nieprzezroczyste i/lub będą miały nieregularną cytoplazmę i nieudane rozszczepienie24.
    UWAGA: Normalne rozszczepienie i etap rozwoju będą widoczne u zdrowych zarodków, jak opisano25. Szalki Petriego powinny być wypełnione w trzech czwartych (~30 ml dla szalki o średnicy 10 cm) przez cały czas trwania protokołu.
    1. Dodaj dwie krople błękitu metylenowego o sile 0,05% w/v do każdej szalki Petriego, delikatnie wymieszaj i przechowuj zarodki w temperaturze 28,5°C do końca protokołu.
  3. Około 6 godzin po zapłodnieniu (hpf)4,5,26, zastąp wodę systemową na zarodkach Petriego 1,5x PTU (roztwór roboczy sporządzony w kroku 1.2.2) i uzupełnij błękit metylenowy.
    UWAGA: PTU musi być dodany do zarodków przed rozpoczęciem pigmentacji (tj. przed 24 hpf)25, ponieważ już pigmentowane tkanki nie ulegną depigmentacji po dodaniu PTU21. Należy jednak zauważyć, że u danio pręgowanego leczonego PTU odnotowano zmniejszenie rozmiaru oczu, deficyty oczu i twarzoczaszki oraz zakłócenie niektórych szlaków sygnałowych (np. sygnalizacji tarczycy) leczonych PTU27,28,29. Toksyczność rozwojowa PTU wydaje się być zależna od stężenia i czasu dodawania PTU27,29. Jak wspomniano powyżej w celu walidacji skuteczności PTU (krok 1.2), objawy toksyczności PTU powinny być również dokładnie monitorowane, a w przypadku podejrzenia, stężenie robocze i/lub czas dodawania PTU powinny być zoptymalizowane.
  4. Na 2-3 dpf dekorionate zarodki za pomocą świeżo przygotowanego roztworu pronazy.
    1. Rozpuścić pronazę w 1,5x PTU w stężeniu 2 mg/ml przez wirowanie.
      UWAGA: Pronase jest pakowany w bardzo drobny proszek i działa drażniąco. Podejmij środki w celu uniknięcia wdychania i/lub kontaktu ze skórą, oczami itp.
    2. Oddziel zarodki wyklute od zarodków niewyklutych i traktuj pronazą tylko zarodki, które nie wykluły się.
    3. Zastąp 1,5x PTU roztworem pronazy o stężeniu 2 mg/ml przygotowanym w kroku 2.4.1 i pozostaw na niewyklutych zarodkach na 4-5 minut z delikatnym mieszaniem (np. na rotatorze/wytrząsarce stołowej lub przez ręczne wirowanie).
    4. Wylej roztwór pronazy i natychmiast spłucz świeżym 1,5x PTU. Delikatnie rozetrzeć 1,5x PTU płukać zarodki za pomocą pipety transferowej z gruszką.
    5. Powtórz drugie płukanie 1.5x PTU, aby wyrzucić wszystkie zanieczyszczenia kosmówki, a następnie uzupełnij 1.5x PTU w celu konserwacji.
      UWAGA: Zarodki można również dekorionować ręcznie za pomocą kleszczy z cienką końcówką. W takim przypadku należy usunąć zanieczyszczenia kosmówkowe i uzupełnić 1,5x PTU po ręcznej dekorionacji.
  5. Monitoruj stan zdrowia zarodków/larw i uzupełniaj 1,5 PTU co 1-2 dni. Zarodki/larwy są przechowywane w 1,5 x PTU do czasu ablacji w 5 dpf.
    UWAGA: Znaczenie kroków 2.3 i 2.4 omówiono bardziej szczegółowo w sekcji Dyskusja.

3. Badania przesiewowe larw danio pręgowanego pod kątem rpe65a:nfsB-eGFP i genetycznej ablacji nabłonka barwnikowego siatkówki (5-6 dni po zapłodnieniu)

  1. Przygotować świeży roztwór 10 mM metronidazolu (MTZ) na 5 dpf (dzień ablacji). Ten proces trwa 2 godziny.
    1. Dodać proszek MTZ do wody systemowej bez PTU i dokładnie wymieszać przez energiczne wytrząsanie (np. 250 obrotów na minutę) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    2. Schłodzić 10 mM roztwór MTZ przez dodatkowy 1 godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze/wytrząsarce stołowej i zapewnić całkowite rozpuszczenie przed dodaniem do szalek Petriego z larwami.
      UWAGA: Badanie przesiewowe fluorescencji i separację larw eGFP+ (krok 3.2) można przeprowadzić podczas inkubacji w temperaturze 37 °C i pokojowej.
      UWAGA: MTZ jest niebezpieczny i należy zachować ostrożność, aby zapobiec połknięciu, wdychaniu i/lub kontaktowi ze skórą lub oczami. Proszek MTZ i wszystkie jego pochodne płynne mogą wymagać utylizacji jako odpady chemiczne w zależności od przepisów stanowych i instytucjonalnych. Przed użyciem zaleca się potwierdzenie prawidłowych metod utylizacji odpadów MTZ, jeśli takie istnieją.
  2. Badanie przesiewowe larw danio pręgowanego pod kątem transgenu rpe65a:nfsB-eGFP.
    1. Znieczulić larwy 0,168 g/L trikainy (MS-222) i oddzielić transgeniczne (eGFP+) larwy (Ryc. 1) od larw nietransgenicznych (eGFP-) za pomocą stereoskopowego mikroskopu fluorescencyjnego z laserem/filtrem wzbudzającym 488 nm.
      UWAGA: Trikainę należy dodać do 1,5 x PTU i/lub roztworów związków farmakologicznych, ponieważ larwy powinny pozostać zanurzone w leczeniu podczas badań przesiewowych na obecność eGFP. Inkubować larwy w tricainie tylko na czas badania przesiewowego (np. ≤10 minut dla pojedynczej 10-centymetrowej szalki Petriego zawierającej 50 larw).
    2. Przesiane larwy należy natychmiast obudzić, pipetując bezpośrednio na szalkę Petriego ze świeżym 1,5x PTU bez tricainy.
    3. Po zakończeniu badań przesiewowych należy następnie rozdzielić larwy eGFP+ na dwie grupy szalek Petriego: jedną grupę, która ma otrzymać leczenie MTZ (ablowana/MTZ+) i jedną grupę kontrolną bez ablacji (MTZ-).
  3. Wykonać ablację nabłonka barwnikowego siatkówki.
    1. Usuń 1.5x PTU z nieablowanych (MTZ-) naczyń kontrolnych i dodaj świeżą wodę systemową bez PTU.
    2. Usunąć 1,5 x PTU z naczyń zabiegowych poddanych ablacji (MTZ+) i dodać świeżo przygotowany roztwór 10 mM MTZ (krok 3.1.).
    3. Usunąć roztwór 10 mM MTZ dokładnie po 24 godzinach (oznaczonych jako 1 dzień po urazie (dpi)) i dodać świeżą wodę z układu bez PTU. Wymień świeżą wodę systemową bez PTU na miskę (talerze) MTZ. Larwy nie będą ponownie narażone na PTU do końca trwania protokołu.
      UWAGA: Pipetowanie lub wylewanie wszystkich 1,5x PTU (kroki 3.3.1 i 3.3.2) lub 10 mM MTZ (kroki 3.3.3) między wymianami roztworu bez utraty larw może być trudne, ponieważ zwierzęta aktywnie pływają w pobliżu. W takim przypadku można dodać płukanie wodą systemową bez PTU, aby zapewnić pomyślną wymianę roztworu.

4. Utrzymanie larw po ablacji genetycznej (6+ dni po zapłodnieniu)

  1. Sprawdzaj larwy i uzupełniaj wodę w systemie bez PTU codziennie, aż do eutanazji (krok 5.6) lub powrotu do pomieszczenia dla danio pręgowanego.
  2. Monitoruj powodzenie i zakres ablacji in vivo na 2 dpi (7 dpf) przy użyciu oświetlenia światłem przechodzącym w mikroskopie stereoskopowym (Rysunek 2).

5. Włączenie leczenia farmakologicznego do protokołu ablacji nabłonka barwnikowego siatkówki danio pręgowanego

UWAGA: Jak wykonano wcześniej3, traktowanie kontrolą nośnika 15 μM IWR-1 lub dopasowanego objętościowo sulfotlenku dimetylu (DMSO) rozpoczynającego się od 4 dpf jest tutaj przedstawione jako przykładowy eksperyment do testowania RpEGEN. Stężenia i ramy czasowe mogą się różnić w zależności od różnych związków farmakologicznych, a zalecenia dotyczące walidacji dawka-odpowiedź, czasu trwania leczenia, badań przesiewowych i innych aspektów projektu eksperymentalnego dla badań manipulacji farmakologicznej są omówione w sekcji Dyskusja. Wykonaj kroki 6 i 7, jeśli wymagana jest analiza obrazu.

  1. Pobieraj i utrzymuj zarodki zgodnie z opisem w kroku 2. Dechorionate zarodki na 2 dpf.
  2. Przebadaj larwy eGFP+ na 4 dpf, jak opisano w kroku 3.2. Zamiast szalek Petriego, umieść larwy eGFP+ na płytkach 6-dołkowych o gęstości n ≤ 10 larw na 6-dołkowe w celu leczenia farmakologicznego. Wyznaczyć oddzielne płytki 6-dołkowe dla larw, które nie zostaną poddane ablacji (MTZ-) i larw, które zostaną poddane ablacji (MTZ+).
    UWAGA: Sygnał eGFP jest widoczny na 4 dpf, ale wydaje się ciemniejszy niż intensywność sygnału na 5 dpf.
  3. Wstępnie potraktuj 4 larwy eGFP+ dpf 15 μM IWR-1 lub kontrolą nośnika DMSO o dopasowanej objętości dokładnie przez 24 godziny przed ablacją genetyczną roztworem 10 mM MTZ.
    UWAGA: Często do eksperymentów z leczeniem farmakologicznym potrzeba bardzo mało związku. Aby uniknąć ważenia małych ilości proszku IWR-1, ten związek farmakologiczny jest kupowany już w roztworze DMSO, w stężeniu 25 mM, i podawany na mniejsze objętości po przybyciu, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
    1. Określić objętość potrzebnych zabiegów farmakologicznych i kontroli nośnika i odpowiednio poddzielić 1,5 x PTU do stożkowych probówek. Zalecana jest objętość 5 ml/dołek płytki 6-dołkowej.
    2. Dodaj zapas IWR-1 do 1,5x PTU, aby uzyskać końcowe stężenie 15 μM IWR-1 (np. 3 μL z 25 mM IWR-1 na 5 ml 1,5x PTU). Dodaj dopasowaną objętość materiału DMSO do 1,5 x PTU (np. 3 μL ≥ 99,7% DMSO na 5 ml 1,5 x PTU). W tym przypadku uzyska to końcowe stężenie 0,06% objętości/objętości (% v/v) DMSO. Dobrze wymieszaj przez wirowanie i wizualnie potwierdź rozpuszczenie związków.
      UWAGA: DMSO, IWR-1 i inne związki farmakologiczne i rozpuszczalniki mogą wymagać utylizacji jako odpady chemiczne w zależności od przepisów stanowych i instytucjonalnych. Przed użyciem zaleca się potwierdzenie poziomu zagrożenia i właściwych metod usuwania odpadów z tych związków, jeśli takie istnieją.
    3. Usunąć 1,5 x PTU z larw eGFP+ na płytkach 6-dołkowych i dodać 5 ml / studzienkę świeżo przygotowanych zabiegów 0,06% v/v DMSO lub 15 μM IWR-1 z kroku 5.3.2.
  4. Na 5 dpf należy przeprowadzić ablację RPE. Oprócz 24-godzinnego leczenia wstępnego (krok 5.3), larwy pozostaną zanurzone w zabiegach farmakologicznych i kontrolnych nośnika podczas 24 godzin ablacji genetycznej za pomocą 10 mM MTZ oraz podczas rekonwalescencji po ablacji, aż do utrwalenia (np. od 4-9 dpf).
    1. Przygotować 10 mM roztworu MTZ na 2 godziny przed wykonaniem ablacji genetycznej (krok 3.1).
    2. Określić objętość zabiegów farmakologicznych i kontrolnych nośnika potrzebnych zarówno dla 6-dołkowych płytek bez ablacji (MTZ-), jak i ablowanych (MTZ+) oraz podawać odpowiednie objętości świeżej wody systemowej bez PTU (MTZ-) lub 10 mM roztworu MTZ (MTZ+) do stożkowych probówek. Daje to cztery warunki leczenia: 1) 0,06% v/v DMSO, MTZ-; 2) 15 μM IWR-1, MTZ-; 3) 0,06% v/v DMSO, MTZ+; oraz 4) 15 μM IWR-1, MTZ+.
    3. Dodaj roztwory podstawowe IWR-1 i DMSO do odpowiednich rurek stożkowych, jak wykonano w kroku 5.3.2. Dobrze wymieszaj przez wirowanie i wizualnie potwierdź rozpuszczenie związków.
    4. Usunąć 0,06% v/v DMSO i 15 μM IWR-1 w 1,5x PTU (krok 5.3.2) z wyznaczonych 6-dołkowych płytek nieablowanych (MTZ-) i ablowanych (MTZ+) i uzupełnić odpowiednimi zabiegami wykonanymi w kroku 5.4.3.
    5. Usunąć zabiegi DMSO 0,06% v/v i 15 μM IWR-1 w roztworze MTZ 10 mM dokładnie po 24 godzinach i uzupełnić zabiegami w świeżej wodzie systemowej bez PTU. Uzupełnij zabiegi DMSO 0,06% v/v i 15 μM IWR-1 w słodkiej wodzie systemowej bez PTU na nieablowanej (MTZ-) 6-dołkowej płytce (płytkach).
  5. Postępuj zgodnie z utrzymaniem larw po ablacji, jak opisano w kroku 4 i uzupełniaj 0,06% v/v DMSO lub 15 μM IWR-1 dziennie w wodzie systemowej bez PTU.
  6. Poddaj eutanazji larwy na 9 dpf (4 dpi dla rodzeństwa leczonego MTZ w tym samym wieku) poprzez zanurzenie zwierząt w roztworze trikainy o stężeniu 0,3 g/l (śmiertelne przedawkowanie) w połączeniu z szybkim schładzaniem (np. umieścić szalki Petriego na lodzie) przez co najmniej 20 minut30. Sprawdź, czy larwy nie reagują na dotyk i utrwal się w 4% PFA (krok 1.5) przez 3 godziny w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez noc.
  7. Przetwarzaj tkankę larwalną po utrwaleniu w celu uzyskania obrazu z-stack pod mikroskopem konfokalnym, jak opisano wcześniej5,31 i tutaj w sekcji Reprezentatywne wyniki. Analiza w krokach 6 i 7 będzie wymagała co najmniej pozyskania markerów jądrowych (np. DAPI) i obrazów stosu z jasnego pola.

6. Wstępne przetwarzanie obrazu z użyciem mikroskopu konfokalnego na FIDŻI (ImageJ)

  1. Importuj i formatuj obrazy ze stosu mikroskopu konfokalnego za pomocą FIJI32.
    1. Otwieranie obrazów mikroskopowych przy użyciu opcji importu formatów biologicznych ustawionych na Widok stosu z: Hyperstack i Tryb koloru: Skala szarości.
    2. Wygeneruj projekcję o maksymalnej intensywności importowanego obrazu mikroskopowego, wybierając Obraz | Stosy | Projekt Z. W oknie ZProjection ustaw opcje Start Slice i Stop Slice tak, aby uwzględniały wszystkie plasterki dla tego obrazu. Na przykład ustaw Wycinek początkowy: 1 i Plasterek końcowy: 18 dla stosu z, który ma łącznie 18 wycinków. Wybierz Typ projekcji: Maksymalna intensywność i kliknij OK.
    3. Przekonwertuj plik projekcji o maksymalnej intensywności na obraz 8-bitowy (jeśli jeszcze tego nie zrobiono), wybierając Obraz | Rodzaj | 8-bitowy.
    4. Zmień orientację obrazu tak, aby strona grzbietowa była skierowana do góry, a dystalna (tj. soczewka) pozostała po lewej stronie, wybierając Obraz | Przekształcanie | Odwróć w poziomie (dla ostatniego polecenia wybierz opcję, która najlepiej odpowiada kierunkowości potrzebnej dla tego obrazu). Aby uzyskać obraz wielokanałowy, kliknij Tak w stosie procesów? , aby zmienić orientację wszystkich kanałów.
      UWAGA: Ten krok jest krytyczny, ale nie jest potrzebny, jeśli obraz jest już w grzbietowej górnej, dystalnej orientacji lewej. Zobacz Rysunek 3A-D i Rysunek 4 dla obrazów z oczami ustawionymi we właściwym kierunku do przetworzenia.
    5. Zapisz 8-bitową projekcję o maksymalnej intensywności jako plik w formacie TIF (Tagged Image File Format), wybierając polecenie Plik | Zapisz jako | Niechyb....
  2. Generuj obszar zainteresowania RPE (ROI) za pomocą FIJI.
    1. Otwórz 8-bitowy obraz TIF wygenerowany zgodnie z opisem w kroku 6.1. Uruchom Menedżera zwrotu z inwestycji, wybierając pozycję Analizuj | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji.
    2. Użyj obrazu | Powiększaj i przełączaj się między kanałami DAPI i jasnego pola, aby zidentyfikować punkt (punkty), w których wierzchołkowa strona RPE przylega do końcówki zewnętrznej membrany ograniczającej (OLM) (Rysunek 3B', B", D', D"; niebieskie groty strzałek). Użyj tego anatomicznego punktu orientacyjnego jako punktu wyjścia do zwrotu z inwestycji.
    3. Utwórz zwrot z inwestycji RPE za pomocą narzędzia Polygon Selections (na pasku narzędzi FIJI), korzystając zarówno z kanałów obrazu DAPI, jak i jasnego pola oraz funkcji powiększania (Obraz | Powiększenie), aby określić wierzchołkowe i podstawowe granice RPE. Doprowadź grzbietowe i brzuszne końce ROI (tj. Tam, gdzie ROI przechodzi od wierzchołkowej do podstawowej strony RPE) do ostrego punktu, zamiast stępiać się lub zaokrąglać (Rysunek 3B', B", D', D"; purpurowe linie).
      UWAGA: Utworzenie wskazanego końca ROI jest krytycznym krokiem w celu optymalizacji wykrywania punktów końcowych za pomocą RpEGEN i jest omówione w sekcji Dyskusja.
    4. Dodaj ROI, klikając Dodaj w Menedżerze ROI. Dostosuj zwrot z inwestycji zgodnie z potrzebami i kliknij Aktualizuj w Menedżerze zwrotów z inwestycji.
    5. Zapisz plik ROI, wybierając opcję Więcej>> | Zapisać... w ramach Menedżera ROI. Używaj identycznych nazw dla dopasowanych plików obrazów ROI i TIF (np. [nazwa pliku].tif i [nazwa pliku].roi).
  3. Połącz 8-bitowe pliki TIF i ROI dla każdego warunku w jednym folderze. Na przykład folder DMSO_9dpf będzie zawierał wszystkie dopasowane pliki TIF i ROI dla grupy larwalnej 9 dpf bez ablacji (MTZ-) 0,06% v/v DMSO.

7. Kwantyfikacja i wizualizacja regeneracji RPE za pomocą skryptów RpEGEN

  1. Zainstaluj i przygotuj skrypty RpEGEN.
    1. Pobierz najnowsze skrypty RpEGEN z repozytorium GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN), klikając Kod | Pobierz plik ZIP.
    2. Rozpakuj folder i umieść go w żądanej lokalizacji obszaru roboczego (np. Pulpit).
    3. Otwórz program MATLAB.
    4. Przejdź do folderu RpEGEN w okienku Bieżący folder (zwykle po lewej stronie).
    5. Kliknij prawym przyciskiem myszy folder RpEGEN i wybierz Dodaj do ścieżki | Wybrane foldery i podfoldery. Spowoduje to dodanie folderu do ścieżki programu MATLAB, dzięki czemu może on automatycznie znajdować i uruchamiać dowolne skrypty w folderze.
    6. Kliknij dwukrotnie folder RpEGEN w okienku Bieżący folder, aby wyświetlić wszystkie podfoldery i pliki M.
    7. Kliknij dwukrotnie plik RpEGEN.m, aby otworzyć go w okienku Edytora.
    8. W sekcji ZMIENNE ZDEFINIOWANE PRZEZ UŻYTKOWNIKA pliku RpEGEN.m wprowadź lokalizacje katalogów dla folderów zawierających pliki ROI (.roi), pliki obrazów (.tif) oraz miejsca, w których mają zostać zapisane pliki wyjściowe. Wprowadź nazwę grupy dla pliku .mat, który ma zostać wyeksportowany (np. DMSO_9dpf, DMSO_4dpi itp.) oraz położenie kanału jasnego pola w stosie obrazów TIF (np. 3, jeśli jasne pole jest trzecim kanałem w stosie obrazów). Jeśli plik obrazu zawiera tylko obraz w jasnym polu, wartość ta powinna być równa 1.
  2. Uruchom skrypt RpEGEN.m i zweryfikuj wyniki.
    UWAGA: RpEGEN wymaga aktywacji Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox oraz Statistics and Machine Learning Toolbox na licencji użytkownika MATLAB w celu uruchomienia. Ponadto do importowania zwrotów z inwestycji FIJI do MATLABa wymagany jest bezpłatnie zestaw narzędzi ReadImageJROI33; jednak jest on dostarczany w folderze RpEGEN wraz z innymi plikami funkcji M, które nie wymagają żadnej aktywacji.
    1. Uruchom skrypt, klikając przycisk Uruchom w menu Edytor w górnej części MATLAB.
      UWAGA: Po zainicjowaniu okno polecenia wyświetli pełne dane wyjściowe wskazujące postęp skryptu. Po zapisaniu pliku MAT zawierającego wyodrębnione dane, pojawi się rysunek z trzema panelami, który zostanie zapisany jako plik PDF w katalogu wyjściowym dla każdego uruchomienia obrazu. Są to dane dotyczące kontroli jakości (QC), aby upewnić się, że wszystko działa prawidłowo i obejmują: 1) obraz w jasnym polu nałożony przez ROI (Rysunek 4A); 2) zwrot z inwestycji wraz z linią środkową i związaną z nią odległością kątową (stopnie) (Rysunek 4G); oraz 3) ROI z wartościami mediany intensywności linii środkowej (0-255, 8-bitowa skala kolorów) (Rysunek 4H). Poczekaj, aż pliki PDF QC zostaną zapisane w folderze wyjściowym, a ostatnia figura zniknie, zanim przejdziesz do następnego kroku.
    2. Otwórz poszczególne pliki PDF wyeksportowane do folderu wyjściowego w dowolnej przeglądarce plików PDF i sprawdź, czy wszystkie ROI pasują do obrazów w jasnym polu, czy wartości linii środkowych są rozsądnymi przybliżeniami środka ROI oraz czy mediany wartości intensywności są odpowiednio wypełnione danymi (tj. nie wszystkie te same wartości na całej linii środkowej).
      UWAGA: Szczegółowy opis i strukturę każdej zmiennej zapisanej w pliku MAT przez RpEGEN.m znajduje się w Tabeli 1.
  3. Uruchom skrypt RpEGEN_PermPlot.m.
    UWAGA: Skrypt RpEGEN_PermPlot.m wykorzystuje dane wyjściowe RpEGEN.m do przeprowadzania porównań statystycznych przy użyciu symulacji permutacji median dwóch grup, a także udostępnia kod do odtwarzania wykresów w tym artykule przy użyciu swobodnie dostępnego zestawu narzędzi GRAMM34, który również został dołączony do folderu RpEGEN.
    1. Kliknij dwukrotnie plik RpEGEN_PermPlot.m, aby otworzyć go w nowej karcie Edytora.
    2. W sekcji SEKCJA 1 - ZMIENNE ZDEFINIOWANE PRZEZ UŻYTKOWNIKA w pliku RpEGEN_PermPlot.m wprowadź lokalizację katalogu folderu wyjściowego zawierającego pliki MAT z uruchomionego RpEGEN.m i wprowadź nazwę każdego pliku MAT, który ma zostać załadowany (np. DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat).
    3. Uruchom tę sekcję skryptu, klikając przycisk Uruchom sekcję w menu Edytor w górnej części programu MATLAB.
    4. W sekcji 2 wprowadź nazwy dwóch grup do porównania statystycznego w zmiennych data_A i data_B (są to grupy, z których zostaną wyprowadzone mediany za pomocą symulacji permutacji). W zmiennej bin_sz wprowadź liczbę stopni, po upływie której mają zostać zintegrowane wartości mediany intensywności dla zestawów danych (domyślnie są to przedziały 1 stopnia).
      UWAGA: Zmienna reps wskazuje liczbę permutacji, które mają zostać użyte do zbudowania rozkładu prawdopodobieństwa i może być ustawiona na dowolną liczbę (wartość domyślna to 20 000). Ogólnie rzecz biorąc, większa liczba powtórzeń będzie bardziej solidna statystycznie, ale wydłuży czas przetwarzania.
    5. Uruchom tę sekcję skryptu, klikając przycisk Uruchom sekcję w menu Edytor w górnej części programu MATLAB. Wykonanie tej sekcji może zająć trochę czasu w zależności od określonej liczby powtórzeń, ale zapewnia ciągłą aktualizację stanu w oknie polecenia.
    6. Uruchom sekcje HEATMAP FIGURE i GROUP RESULTS AND P-VALUES niezależnie za pomocą przycisku Uruchom sekcję. Edytuj zmienne danych we wszystkich sekcjach oznaczonych kodem "WPROWADŹ DANE TUTAJ". Pliki PDF z tymi rysunkami są automatycznie zapisywane dla każdego z nich i mogą być łatwo modyfikowane w dowolnym oprogramowaniu do obróbki końcowej w oprogramowaniu wektorowym.
      UWAGA: Wykresy wygenerowane w pliku RpEGEN_PermPlot.m są ad hoc i prawdopodobnie będą wymagały modyfikacji w oparciu o specyficzne dane i potrzeby wizualne każdego użytkownika. Liczby te stanowią jednak solidną podstawę, którą można łatwo zindywidualizować za pomocą stron internetowych MATLAB i GRAMM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wiadomo, że hamowanie kanonicznej ścieżki sygnałowej Wnt znacząco upośledza regenerację RPE u rybek zebrafish, przy zastosowaniu paradygmatu ablacji genetycznej (rpe65a:nfsB-eGFP) oraz metodologii manipulacji farmakologicznej (IWR-1) opisanych w protokole3. Niniejszy eksperyment został powtórzony w celu walidacji zautomatyzowanej metody ilościowego określania regeneracji RPE u rybek zebrafish w oparciu o pigmentację. Poniższe podsumowanie wyników obejmuje wszystkie etapy protokołu, od dni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje metodologię genetycznej ablacji RPE oraz badania mechanizmów degeneracji i regeneracji u danio pręgowanego w wieku larwalnym. Protokół ten został również z powodzeniem przeprowadzony u dorosłych zebry3, ale z mniej obszerną charakterystyką, dlatego w centrum uwagi znajdują się tutaj larwy. Krytyczne aspekty tej części protokołu (kroki 1-4) obejmują: 1) dodanie 1,5 x PTU do zarodków przed rozpoczęciem melanogenezy, 2) dechorionację zarodków leczonych PTU przy 2-3 dpf, 3) staran...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

L.L.L. jest współtwórcą amerykańskiego patentu #9,458,428, który opisuje przyspieszoną metodę pozyskiwania nabłonka barwnikowego siatkówki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych; Nie ma to związku z treścią niniejszego dokumentu. J.M.G. i G.B.F. nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Praca opisana tutaj była wspierana przez National Institutes of Health (RO1-EY29410 dla J.M.G. i NIH CORE Grant P30-EY08098 dla Wydziału Okulistyki); Centrum Transplantacji i Terapii Immunologicznej UPMC (do L.L.L. i J.M.G.); oraz E. Ronald Salvitti Chair in Ophthalmology Research (do J.M.G.). Dodatkowe wsparcie otrzymano od Wiegand Fellowship in Ophthalmology (dla L.L.L), Eye & Ear Foundation z Pittsburgha oraz nieograniczonego grantu od Research to Prevent Blindness, Nowy Jork, NY. Autorzy pragną również podziękować Amandzie Platt za pomoc techniczną oraz dr Hugh Hammerowi i personelowi wodnemu za doskonałe wsparcie w opiece nad zwierzętami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Lab Materiał/Sprzęt
2-(4-amidinofenylo)-6-indolokarbamidyny dichlorowodorek (DAPI)Millipore SigmaD9542
6-dołkowe płytkiFisher Scientific07-200-83
Stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenuFisher Scientific05-539-13Numer katalogowy dotyczy probówek 50 ml
Pisak do pisania z diamentową końcówkąFisher Scientific50-254-51Wyprodukowany przez Electron Microscopy Sciences, elementy podobne do tego numeru części są odpowiednie
Dimetylosulfotlenek (DMSO) ≥ 99.7 %Fisher ScientificBP231Sprawdź wymagania dotyczące utylizacji odpadów chemicznych
Inkubator zarodków (duży)Fisher Scientific3720A
Inkubator zarodków (mini/blat)LabnetI5110A
Stereoskopowy mikroskop fluorescencyjnyZeissAxio Zoom.V16Lub podobny, z laserem/filtrem wzbudzającym 488 nm
Szklana pipeta PasteuraFisher Scientific13-678-4Wyprodukowany przez Corning, niesterylny
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endoMillipore Sigma5.04462Wyprodukowany przez Calbiochem; 25 mM w DMSO; sprawdź wymagania dotyczące utylizacji odpadów chemicznych
Błękit metylenowy (proszek)Fisher ScientificBP117-100Dostępny również jako gotowy roztwór wodny
Metronidazol (MTZ)Millipore SigmaM3761Sprawdź wymagania dotyczące utylizacji odpadów chemicznych
N-fenylotiomocznik (PTU)Millipore SigmaP7629Sprawdź wymagania dotyczące utylizacji odpadów chemicznych
Paraformaldehyd (16 % w/v) bez metanoluFisher ScientificAA433689MOdpady chemiczne, wymagana odpowiednia utylizacja
Szalki PetriegoFisher ScientificFB0875712Średnica 10 cm
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (saszetki z proszkiem)Millipore SigmaP3813Służy do produkcji 10 X PBS stock
PronaseMillipore SigmaPRON-RO
Inkubator z wytrząsaniemBenchmarkH2010Służy do inkubacji MTZ przez 1 godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza
Mikroskop stereoskopowyLeicaS9iLub podobny, ze światłem przechodzącym iluminacja
Kleszcze Student Dumont #5Fine Science Tools91150-20Kleszczyki z cienką końcówką do ręcznej dechorionacji
Rotator/wytrząsarka stołowaScilogexSK-D1807-E
Pipeta transferowaMillipore SigmaZ1350033,2 mL do pobierania bańki, niesterylna
Metanosulfonian trikainy (MS-222)PentairTRS1, TRS2, TRS5Dostępne również w Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium z DAPIVector LaboratoriesH-1200
Software Material
FIJI (Fiji to tylko ImageJ)FIJI (Fidżi to tylkoImageJ)https://imagej.net/software/fiji/Wersja: 2.0.0-rc-69/1.52p; Kompilacja: 269a0ad53f; Potrzebna wtyczka: Przykłady Bio-Formats
GRAMM i instrukcjeMathWorkshttps://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/get-matlab.htmlZestawy narzędzi potrzebne do uruchomienia RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
Obsługa MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/support.html

Bibliografia

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Grierson, I., et al. repair and regeneration of the retinal pigment epithelium. Eye. 8 (2), 255-262 (1994).
  3. Hanovice, N. J., et al. Regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium after widespread genetic ablation. PLoS Genetics. 15 (1), 1007939(2019).
  4. Lu, F., Leach, L. L., Gross, J. M. mTOR activity is essential for retinal pigment epithelium regeneration in zebrafish. bioRxiv. , (2021).
  5. Leach, L. L., Hanovice, N. J., George, S. M., Gabriel, A. E., Gross, J. M. The immune response is a critical regulator of zebrafish retinal pigment epithelium regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (21), (2021).
  6. Zenno, S., Koike, H., Tanokura, M., Saigo, K. Gene cloning, purification, and characterization of nfsb, a minor oxygen-insensitive nitroreductase from escherichia coli, similar in biochemical properties to frase I, the major flavin reductase in vibrio fischeri. The Journal of Biochemistry. 120 (4), 736-744 (1996).
  7. Hamel, C. P., et al. Molecular cloning and expression of rpe65, a novel retinal pigment epithelium-specific microsomal protein that is post-transcriptionally regulated in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15751-15757 (1993).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
  10. White, D. T., et al. Immunomodulation-accelerated neuronal regeneration following selective rod photoreceptor cell ablation in the zebrafish retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 3719-3728 (2017).
  11. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590(2016).
  12. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. The Journal of Comparative Neurology. 518 (6), 800-814 (2010).
  13. Hagerman, G. F., et al. Rapid recovery of visual function associated with blue cone ablation in zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0166932(2016).
  14. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969(2021).
  15. Chiba, C., et al. Visual cycle protein rpe65 persists in new retinal cells during retinal regeneration of adult newt. The Journal of Comparative Neurology. 495 (4), 391-407 (2006).
  16. Yoshii, C., Ueda, Y., Okamoto, M., Araki, M. Neural retinal regeneration in the anuran amphibian xenopus laevis post-metamorphosis: Transdifferentiation of retinal pigmented epithelium regenerates the neural retina. Developmental Biology. 303 (1), 45-56 (2007).
  17. Xia, H., Krebs, M. P., Kaushal, S., Scott, E. W. Enhanced retinal pigment epithelium regeneration after injury in mrl/mpj mice. Experimental Eye Research. 93 (6), 862-872 (2011).
  18. McGill, T. J., et al. Subretinal transplantation of human central nervous system stem cells stimulates controlled proliferation of endogenous retinal pigment epithelium. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 43(2019).
  19. Salero, E., et al. Adult human rpe can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
  20. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nature Chemical Biology. 5 (2), 100-107 (2009).
  21. Whittaker, J. R. An analysis of melanogenesis in differentiating pigment cells of ascidian embryos. Developmental Biology. 14 (1), 1-39 (1966).
  22. Westerfield, M. Zebrafish Book, 5th Edition; A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregon, USA. (2007).
  23. Hammer, H. S. Water quality for zebrafish culture in The Zebrafish in Biomedical Research. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. 321-335 (2020).
  24. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196(2012).
  25. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  26. Camp, E., Lardelli, M. Tyrosinase gene expression in zebrafish embryos. Development Genes and Evolution. 211 (3), 150-153 (2001).
  27. Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
  28. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PloS One. 7 (6), 40132(2012).
  29. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and igf signaling. PLoS One. 6 (8), 22991(2011).
  30. Leary, S., et al. Avma Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , American veterinary medical association. Schaumburg, Illinois, USA. (2020).
  31. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on cryosections from embryonic and adult zebrafish eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, 4779(2007).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Muir, D. GitHub - ReadImageJROI. , Available from: https://github.com/DylanMuir/ReadImageJROI (2021).
  34. Morel, P. Gramm: Grammar of graphics plotting in matlab. Journal of Open Source Software. 3 (23), 568(2018).
  35. Reinhardt, R., et al. Sox2, tlx, gli3, and her9 converge on rx2 to define retinal stem cells in vivo. The EMBO Journal. 34 (11), 1572-1588 (2015).
  36. Schonthaler, H. B., et al. Evidence for rpe65-independent vision in the cone-dominated zebrafish retina. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1940-1949 (2007).
  37. Yazulla, S., Studholme, K. M. Neurochemical anatomy of the zebrafish retina as determined by immunocytochemistry. Journal of Neurocytology. 30 (7), 551-592 (2001).
  38. Larison, K. D., Bremiller, R. Early onset of phenotype and cell patterning in the embryonic zebrafish retina. Development. 109 (3), 567-576 (1990).
  39. Dwass, M. Modified randomization tests for nonparametric hypotheses. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (1), 181-187 (1957).
  40. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: A refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  41. Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
  42. Meyers, J. R., et al. Β-catenin/wnt signaling controls progenitor fate in the developing and regenerating zebrafish retina. Neural Development. 7, 30(2012).
  43. Tappeiner, C., et al. Inhibition of the tgfβ pathway enhances retinal regeneration in adult zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0167073(2016).
  44. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, o-phospho-l-serine, suppresses müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Experimental Eye Research. 91 (5), 601-612 (2010).
  45. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (38), 15858-15863 (2011).
  46. Lemmens, K., et al. Matrix metalloproteinases as promising regulators of axonal regrowth in the injured adult zebrafish retinotectal system. The Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1472-1493 (2016).
  47. Elsaeidi, F., Bemben, M. A., Zhao, X. F., Goldman, D. Jak/stat signaling stimulates zebrafish optic nerve regeneration and overcomes the inhibitory actions of socs3 and sfpq. The Journal of Neuroscience. 34 (7), 2632-2644 (2014).
  48. Van Dyck, A., et al. Müller glia-myeloid cell crosstalk accelerates optic nerve regeneration in the adult zebrafish. Glia. 69 (6), 1444-1463 (2021).
  49. Conedera, F. M., Pousa, A. M. Q., Mercader, N., Tschopp, M., Enzmann, V. Retinal microglia signaling affects müller cell behavior in the zebrafish following laser injury induction. Glia. 67 (6), 1150-1166 (2019).
  50. Chen, S., Lathrop, K. L., Kuwajima, T., Gross, J. M. Retinal ganglion cell survival after severe optic nerve injury is modulated by crosstalk between jak/stat signaling and innate immune responses in the zebrafish retina. Development. 149 (8), (2022).
  51. de Preux Charles, A. S., Bise, T., Baier, F., Marro, J., Jaźwińska, A. Distinct effects of inflammation on preconditioning and regeneration of the adult zebrafish heart. Open Biology. 6 (7), 160102(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Regeneracja RPE u danio pr gowanegoablacja nitroreduktaz i metronidazolemplatforma RpEGEN MATLABmodel uszkodzenia RPEtransgeniczne danio pr gowaneprzesiew farmakologicznykwantyfikacja pigmentacji RPEfluorescencyjna stereomikroskopiaszlak sygna owy Wnt

Powiązane artykuły