Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowany test typu pull-down dla pojedynczych cząsteczek do ilościowego oznaczania fosforylacji białek

DOI:

10.3791/63665

⸱

6 czerwca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine, 2Department of Physics and Astronomy, University of New Mexico, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje przygotowanie próbki i analizę danych w celu ilościowego określenia fosforylacji białek za pomocą ulepszonego testu ściągania pojedynczych cząsteczek (SiMPull).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosforylacja jest konieczną modyfikacją potranslacyjną, która reguluje funkcję białka i kieruje wynikami sygnalizacji komórkowej. Obecne metody pomiaru fosforylacji białek nie są w stanie zachować niejednorodności fosforylacji poszczególnych białek. Test ściągania pojedynczej cząsteczki (SiMPull) został opracowany w celu zbadania składu kompleksów makromolekularnych poprzez immunoprecypitację białek na szklanym szkiełku nakrywkowym, a następnie obrazowanie pojedynczych cząsteczek. Obecna technika polega na adaptacji SiMpull, która zapewnia solidną ocenę ilościową stanu fosforylacji receptorów błonowych o pełnej długości na poziomie pojedynczej cząsteczki. Obrazowanie tysięcy pojedynczych receptorów w ten sposób pozwala na ilościowe określenie wzorców fosforylacji białek. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje zoptymalizowaną procedurę SiMputl, od przygotowania próbki po obrazowanie. Optymalizacja protokołów przygotowania szkła i utrwalania przeciwciał dodatkowo poprawia jakość danych. Obecny protokół zawiera kod do analizy danych pojedynczej cząsteczki, który oblicza frakcję receptorów fosforylowanych w próbce. Chociaż praca ta koncentruje się na fosforylacji receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), protokół można uogólnić na inne receptory błonowe i cytozolowe cząsteczki sygnałowe.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sygnalizacja związana z błoną jest dostrajana przez kombinację indukowanej ligandem aktywacji receptora błonowego i rekrutacji dalszych białek pomocniczych, które propagują sygnał. Fosforylacja kluczowych tyrozyn w ogonach cytoplazmatycznych receptorów ma kluczowe znaczenie dla zainicjowania tworzenia kompleksów sygnałowych lub signalosomów1,2. Dlatego ważnym pytaniem w biologii jest to, w jaki sposób tworzone i utrzymywane są wzorce fosforylacji w celu rekrutacji partnerów sygnalizacyjnych i dyktowania wyników komórkowych. Obejmuje to zrozumienie niejednorodności fosforylacji receptorów, zarówno pod względem obfitości, jak i specyficznych wzorców fosfotyrozyny, które mogą zapewnić sposób manipulowania wyjściami sygnałowymi poprzez dyktowanie składu signalosomu3,4,5,6,7. Istnieją jednak ograniczenia w obecnych metodach badania fosforylacji białek. Analiza Western blot jest doskonała do opisywania trendów fosforylacji białek, ale jest półilościowa8 i nie dostarcza informacji na temat heterogeniczności systemu, ponieważ tysiące do milionów receptorów są uśredniane razem. Podczas gdy western blot pozwala na sondowanie próbki przy użyciu specyficznych dla fosfo przeciwciał przeciwko specyficznym tyrozynom, nie może dostarczyć informacji na temat wielomiejscowych wzorców fosforylacji w tym samym białku. Ilościowa fosfoproteomika donosi o obfitości fosfotyrozyny, ale istnieją ograniczenia w wykrywaniu fosforylacji wielomiejscowej, ponieważ interesujące reszty muszą znajdować się w tym samym peptydzie (zwykle 7-35 aminokwasów), który jest generowany przez trawienie enzymatyczne9,10,11.

Aby przezwyciężyć powyższe ograniczenia, test pojedynczej cząsteczki (SiMPull) został dostosowany do ilościowego określania stanów fosforylacji nienaruszonych receptorów na poziomie pojedynczej cząsteczki. SiMPull został po raz pierwszy zademonstrowany jako potężne narzędzie do badania kompleksów makromolekularnych przez Jaina i wsp.12,13. W SiMputl kompleksy makromolekularne poddano immunoprecypitacji (IP) na szklanych szkiełkach nakrywkowych funkcjonalizowanych przeciwciałami, a następnie przeanalizowano za pomocą mikroskopii jednocząsteczkowej pod kątem liczby podjednostek białka i współIP ze złożonymi składnikami12. Modyfikacja autorstwa Kima i wsp.14, oznaczona jako SiMBlot, była pierwszą, w której zastosowano odmianę SiMpull do analizy fosforylacji zdenaturowanych białek. Protokół SiMBlot opiera się na wychwytywaniu biotynylowanych białek powierzchniowych komórek za pomocą szkiełek nakrywkowych pokrytych NeutrAvidin, które są następnie badane pod kątem fosforylacji za pomocą znakowania przeciwciałami specyficznymi dla fosfo14. Pomimo tych postępów konieczne były ulepszenia, aby kwantyfikacja modyfikacji potranslacyjnej była bardziej niezawodna i miała zastosowanie do szerszego zakresu białek.

Obecny protokół opisuje zoptymalizowane podejście SiMputl, które zostało użyte do ilościowego określenia wzorców fosforylacji nienaruszonego receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) w odpowiedzi na szereg warunków ligandowych i mutacji onkogennych15. Chociaż prace te koncentrują się na EGFR, podejście to można zastosować do dowolnego receptora błonowego i białek cytozolowych (POI), dla których dostępne są wysokiej jakości przeciwciała. Protokół obejmuje kroki mające na celu zmniejszenie autofluorescencji próbek, projekt matrycy próbek, który wymaga minimalnej objętości próbki przy jednoczesnym przygotowaniu do 20 próbek, oraz optymalizację warunków znakowania i utrwalania przeciwciał. Opracowano algorytmy analizy danych do wykrywania pojedynczych cząsteczek i kwantyfikacji fosforylowanych białek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych

UWAGA: Na tym etapie należy nosić środki ochrony osobistej (PPE), które obejmują podwójną warstwę rękawic nitrylowych, okulary ochronne lub osłonę twarzy oraz fartuch laboratoryjny.

  1. Wykonaj trawienie piranii, aby usunąć zanieczyszczenia organiczne ze szkła.
    UWAGA: Roztwór piranii jest silnym utleniaczem, który jest i wysoce reaktywny w kontakcie z materiałami organicznymi. Reakcja ze szczątkami organicznymi jest egzotermiczna i potencjalnie wybuchowa. Dlatego zabieg należy wykonać w dygestorium chemicznym przy opuszczonym skrzydle. Do obsługi roztworu piranii wymagane jest szkło Pyrex.
    1. Przygotuj miejsce pracy wewnątrz dygestoria chemicznego. Ułożyć szkiełka nakrywkowe bez zachodzenia na siebie na dnie zlewki szklanej o pojemności 4 l, zlewki "reakcyjnej" i umieścić zlewkę reakcyjną na płycie grzejnej z delikatnym ciepłem. Pozwól szklanym naczyniom się rozgrzać przez 10 minut. Umieścić "odpadową" szklaną zlewkę o pojemności 1 l z 500 ml ddH2O proksymalnie do zlewki reakcyjnej.
    2. Powoli dodać 49 ml 12 N kwasu siarkowego (H2SO4)do zlewki reakcyjnej za pomocą szklanej pipety serologicznej. Przed wyrzuceniem wypłukać pipetę w zlewce na odpady.
    3. Dodać kroplami 21 ml 30% nadtlenku wodoru (H2O2) za pomocą szklanej pipety serologicznej do zlewki reakcyjnej. Powoli rozprowadzić kropleH2O2równomiernie na dnie kolby reakcyjnej, aby zapobiec miejscowemu wygaszaniu reakcji trawienia piranii. Przed wyrzuceniem wypłukać pipetę w zlewce na odpady.
      UWAGA: Zawsze dodawajH2O2do H 2SO4 i nigdy odwrotnie.
    4. Szkiełka nakrywkowe należy wytrawiać przez 30 minut. Delikatnie mieszać zawartość zlewki reakcyjnej co 5 minut.
    5. Roztwór piranii ugasić przez wlanie zawartości zlewki na odpady do zlewki reakcyjnej. Powoli przesuwaj ciecz w dół ścianki zlewki reakcyjnej, aby zminimalizować rozpryskiwanie. Wyjąć zlewkę reakcyjną z płyty grzejnej.
    6. Gdy reakcja zostanie stłumiona i schłodzona, wlać roztwór piranii z powrotem do zlewki na odpady w celu neutralizacji bez usuwania wytrawionych szkiełek nakrywkowych ze zlewki reakcyjnej.
    7. Zneutralizuj roztwór piranii poprzez stopniowe dodawanie słabej zasady. Na przykład użyj nadmiernej masy 20 g wodorowęglanu sodu (NaHCO3)/100 ml roztworu piranii.
      UWAGA: Nie przechowywać roztworów piranii w szczelnych pojemnikach na odpady. Roztwór należy zawsze zneutralizować przed utylizacją. Reakcja neutralizacji wytwarza energiczne pęcherzyki i może być wybuchowa, jeśli nie jest kontrolowana przez stopniowe dodawanie słabej zasady.
    8. Wymieszaj zobojętniony roztwór szklanym prętem mieszadłem i pozwól mu reagować przez 2 godziny. Podnieś pH do >4 i wyrzuć roztwór.
    9. Pomiędzy dodatkami słabej zasady do roztworu piranii, przenieść wytrawione szkiełka nakrywkowe ze zlewki reakcyjnej do lejka Buchnera za pomocą szklanego pręta mieszającego i płukać przez 5 minut w stanie ddH2O.
      UWAGA: Przejdź natychmiast do następnego kroku lub przechowuj szkiełka nakrywkowe z wytrawionymi piranią przez okres do 2 tygodni w ddH2O w szczelnie zamkniętym szklanym słoiku lub na szalce Petriego (owinąć folią uszczelniającą, patrz Tabela materiałów).
  2. Sonikować szkiełka nakrywkowe w kąpieli w rozpuszczalnikach organicznych, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Umieść szkiełka nakrywkowe w szklanym słoiku Coplin (patrz Tabela materiałów) i przykryj metanolem (CH3OH). Uszczelnij pokrywkę słoika folią uszczelniającą i sonikuj w kąpieli przez 10 minut. Ostrożnie przelej metanol ze słoika Coplin do szklanej butelki do przechowywania.
    2. Napełnij słoik Coplin acetonem (C3H6O), zamknij pokrywkę i zanurz się w sonikacji przez 10 minut. Ostrożnie wylej aceton ze słoika Coplin do szklanej butelki do przechowywania.
      UWAGA: Metanol jest łatwopalny i bardzo toksyczny. Stosować w dygestorium chemicznym. Aceton jest łatwopalny i drażniący. Dlatego należy obchodzić się z nim i przechowywać go w szkle i używać w okapie chemicznym. Utylizować jako odpady niebezpieczne zgodnie z lokalnymi przepisami i wytycznymi.
      UWAGA: Metanol i aceton mogą być ponownie użyte do pięciu razy.
  3. Aktywuj powierzchnię szkiełka nakrywkowego w celu funkcjonalizacji silanów.
    1. Kąpiel sonikować 1 M wodorotlenkiem potasu (KOH) przez 20 min. Ostrożnie wylać KOH ze słoika Coplin do stożkowej probówki o pojemności 50 ml w celu ponownego użycia.
      UWAGA: KOH jest i drażniący. Stosować w dygestorium chemicznym i nie przechowywać w szkle. Przechowuj go w tubkach polipropylenowych. Utylizować jako odpady niebezpieczne zgodnie z lokalnymi przepisami i wytycznymi.
      UWAGA: KOH może być ponownie użyty do pięciu razy.
    2. Spłucz dwukrotnie ddH2O. Odcedź ddH2O z szkiełek nakrywkowych, a następnie podgrzej każde szkiełko nakrywkowe, machając przez płomień palnika Bunsena, aby usunąć całą wilgoć z powierzchni. Umieść szkiełka nakrywkowe w suchym słoiku Coplin.
  4. Wykonaj aminozylanizację szkiełka nakrywkowego.
    1. Przygotować roztwór aminozelanu, mieszając 69,4 ml metanolu z 3,6 ml kwasu octowego (CH3COOH) w kolbie stożkowej. Dodać 720 μl N-(2-aminoetylo)-3-aminopropylotrimetoksysilanu (aminozilanu) i dobrze wymieszać (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Kwas octowy jest łatwopalny i. Trzymaj szklanymi pipetami i przechowuj w szkle. Pracuj z kwasem octowym w dygestoriach chemicznych. Aminozlan stanowi bardzo toksyczne zagrożenie wziewne, działa uczulająco i drażniąco. Jest szkodliwy dla organizmów wodnych. Stosować w dygestorium chemicznym. Chemikalia należy utylizować jako odpady niebezpieczne zgodnie z lokalnymi przepisami i wytycznymi.
      UWAGA: Aminosilan jest światłoczuły i szybko hydrolizuje w wodzie. Wszystkie czynności z tym odczynnikiem muszą być wykonywane w minimalnych warunkach oświetleniowych, aby zachować aktywność. Przedmuchnąć butelkę azotem gazowym i nałożyć folię uszczelniającą przed przechowywaniem w ciemnym eksykatorze. Wymieniaj co 6-9 miesięcy.
    2. Natychmiast dodaj roztwór aminosilanu do słoika Coplin. Przykryj i nałóż folię uszczelniającą, kontynuując ochronę przed światłem.
    3. Szkiełka nakrywkowe inkubować w roztworze aminozelanu przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej (RT). Kąpiel sonikować przez 1 minutę, a następnie inkubować przez kolejne 10 minut. Ostrożnie wlać roztwór aminozelanu do pojemnika na odpady przeznaczonego dla CH3OH ze śladowymi ilościami aminozlanu i CH3COOH.
    4. Przepłukać szkiełka nakrywkowe metanolem i wlać roztwór do pojemnika na odpady przeznaczonego na metanol.
    5. Opłucz szkiełka nakrywkowe trzy razy po 2 minuty za pomocą ddH2O. Odcedź szkiełka nakrywkowe, zetrzyj nadmiar wilgoci i całkowicie wysusz na powietrzu przez 10 minut.
  5. Przeprowadzić przygotowanie matrycy/funkcjonalizację biotyny-PEG szkiełek nakrywkowych.
    1. Przygotować 1 M NaHCO3 (pH 8,5) zapasu roboczego, rozpuszczając 84,5 mg NaHCO3 w 1 ml ddH2O. W celu uzyskania końcowego stężenia 10 mM NaHCO3 rozcieńczyć 1 M NaHCO3 do ddH2O (1:100).
    2. Narysuj siatkę na suchych aminozylanizowanych szkiełkach nakrywkowych za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego (patrz Tabela materiałów) i poczekaj, aż tusz wyschnie. Napisz identyfikator na szkiełku nakrywkowym, aby zaznaczyć właściwą orientację. Umieść szkiełka nakrywkowe w wilgotnej komorze.
      UWAGA: Tablica powinna składać się z 16-20 kwadratów o wymiarach około 4 mm x 4 mm.
    3. Aby przygotować roztwór walerianianu sukcynimidylu biotyny-PEG (biotyna-PEG)/mPEG walerianian sukcynimidylu (mPEG), najpierw usuń mPEG i biotynę-PEG (patrz tabela materiałów) z zamrażarki i zrównoważ do RT. Dodać 153 mg mPEG i 3,9 mg biotyny-PEG (~1:39 biotyna-PEG:mPEG) do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i ponownie zawieś w 609 μl 10 mM NaHCO3 przez delikatne pipetowanie. Wirować przy 10 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pęcherzyków.
      UWAGA: Okres półtrwania hydrolizy walerianianu sukcynimidylu w buforze o pH 8,5 wynosi ~30 min. Po dodaniu buforu do mPEG należy jak najszybciej wykonać następujące czynności. Ten krok ma kluczowe znaczenie.
    4. Zastosuj roztwór biotyny-PEG/mPEG, aby całkowicie pokryć każdy kwadrat w układzie szkiełek nakrywkowych, zwykle 10-15 μl na kwadrat. Nie pozwól, aby płyn przelał się przez wyznaczoną przestrzeń. Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w komorze wilgotnościowej w ciemności przez 3-4 godziny w temperaturze pokojowej.
    5. Umyj szkiełka nakrywkowe dużą ilością wody, zanurzając je kolejno w 3 szklanych zlewkach o pojemności 250 ml wypełnionych ddH2O na 10 s każda.
    6. Usuń całą wilgoć ze szkiełek nakrywkowych za pomocą gazowego azotu. Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać tyłem do siebie w wypełnionej azotem stożkowej tubie o pojemności 50 ml owiniętej folią uszczelniającą w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Przejdź natychmiast do kroku 2 lub przechowuj szkiełka nakrywkowe w temperaturze -20 °C do 1 tygodnia przed użyciem.

2. Przygotowanie lizatu SiMPull

UWAGA: Wymagane środki ochrony osobistej dla pozostałych etapów protokołu to rękawice nitrylowe, okulary ochronne i fartuchy laboratoryjne.

UWAGA: Lizaty zostały przygotowane z przylegających komórek CHO wykazujących ekspresję EGFR-GFP. Komórki zostały posiane w naczyniu do hodowli tkankowej 60 mm (TC60) przez noc12,13. Komórki CHO hodowano w DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% L-glutaminą, 1% penicyliną-streptomycyną i 500 ng/ml genetycyny (patrz tabela materiałów). Można również stosować inne przylegające linie komórkowe lub komórki zawiesinowe.

  1. Umieść komórki na płytce, wykonując poniższe czynności.
    1. Umyj naczynie hodowlane (zawierające komórki) 1 ml 1x PBS. Dodać 1 ml 1x trypsyny i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C, aby odłączyć komórki. Za pomocą pipety przenieś oderwane komórki z naczynia do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    2. Weź 10 μl błękitu trypanowego i wymieszaj z 10 μl zawiesiny komórek w oddzielnej probówce wirówkowej. Policz komórki za pomocą 10 μl mieszaniny komórek w automatycznym liczniku komórek, zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
    3. Płytka 8 x 105 komórek przez noc na szalce Petriego TC60. Talerz jedno danie na warunek.
      UWAGA: W niniejszym badaniu komórki nie były leczone lub były leczone perwanadatem i EGF, jak opisano w kroku 2.4.1.
  2. Przygotuj następujące roztwory do przygotowania lizatu komórkowego.
    1. Przygotuj lodowato zimny 1x PBS (pH 7,4).
    2. Przygotować bufor do lizy, roztwór 1% niejonowego, niedegenerującego się detergentu (patrz tabela materiałów) w 50 mM Tris-HCl (pH 7,2) i 150 mM NaCl uzupełniony inhibitorem proteazy/fosfatazy (PPI) (1:100 z magazynu). Umieścić probówkę na nutatorze i pozostawić bufor do wymieszania przez 15 minut. Przygotowany roztwór należy przechowywać na lodzie.
    3. Przygotować bufor Tyrode do końcowego stężenia 135 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,2), 20 mM glukozy i 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (patrz tabela materiałów). Podgrzać roztwór do temperatury 37 °C.
  3. Przygotować kontrolę pozytywną do fosforylacji - 1 mM zabieg perwanadanowy.
    UWAGA: Ten krok jest opcjonalny. Pervandate jest peroksydowaną formą wanadanu - inhibitora białkowych fosfataz tyrozynowych16. Zapobieganie defosforylacji białek poprzez hamowanie aktywności fosfatazy powoduje, że próbka jest silnie ufosforylowana.
    1. Przygotować zapas 200 mM aktywowanego ortowanadanu sodu (Na3VO4).
      1. Aby przygotować 100 ml roztworu, dodać 3,89 g Na3VO4 (patrz tabela materiałów) do 90 ml ddH2O i rozpuścić, mieszając. Dostosuj pH do 10, dodając kroplami HCl lub NaOH. Dodanie HCl zmieni kolor roztworu na żółty.
      2. Doprowadzić objętość do 100 ml za pomocą ddH2O. Zagotuj roztwór, podgrzewając go w kuchence mikrofalowej. Po ugotowaniu roztwór będzie bezbarwny.
      3. Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej i ponownie dostosować pH do 10. Powtórz gotowanie, chłodzenie i regulację pH jeszcze dwa do czterech razy, aż pH ustabilizuje się na poziomie 10. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Przygotować zapas 30 mM perwanadatu (PV), mieszając 20,4 μl 3% H2O2 z 100 μl 200 mM Na3VO4 i 546,8 μL ddH2O (równomolowe stężenia H2O2 i aktywowane Na3VO4). Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    3. Przygotuj 1 mM PV w buforze Tyrode. Aby uzyskać 10 ml roztworu, dodać 0,33 ml 30 mM zapasu PV do 9,67 ml buforu Tyrode'a o temperaturze 37 °C. Natychmiast leczyć komórki.
    4. Umyj komórki raz 3 ml buforu Tyrode. Dodać 3 ml 1 mM pv do buforu Tyrode'a do komórek i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Wykonaj stymulację liganda.
    1. Stymuluj komórki za pomocą interesującego Cię liganda, używając odpowiedniego stężenia, czasu i temperatury. W celu maksymalnej stymulacji EGFR inkubować z 1 ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) o stężeniu 50 nM + 1 mM PV w buforze Tyrode'a przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  5. Wykonaj lizę komórek.
    1. Po pożądanym leczeniu komórkowym umieść naczynie na lodzie i umyj lodowatym 1x PBS. Całkowicie usunąć całą objętość PBS za pomocą pipety.
    2. Dodać 180 μl buforu do lizy (krok 2.2.2) do płytki. Użyj skrobaka do komórek, aby naciągnąć bufor wokół płytki, aby całkowicie zakryć komórki. Zastosuj mocny, równomierny nacisk skrobakiem do komórek na całej powierzchni hodowli, aby w pełni zmodyfikować komórki.
      UWAGA: Objętość buforu do lizy musi być utrzymywana na minimalnym poziomie, aby zapewnić wysokie stężenie białka.
    3. Odpipetować zlizowane komórki i przenieść je do probówki o pojemności 1,5 ml. Trzymaj probówkę na lodzie przez 30 minut. Wirować lizaty co 5 minut.
      UWAGA: Jeśli punkt POI składa się z wielu podjednostek lub jest wrażliwy na dysocjację, nie należy wirować lizatów.
    4. Odwirować zlizowane komórki przy 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety. Zawiera on całkowity lizat białka.
    5. Zarezerwować 10 μl lizatu i rozcieńczyć go do 90 μl buforu do lizy do analizy w teście kolorymetrycznym bicynchoninowym (BCA)17. Pozostały całkowity lizat białkowy należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
    6. Oznaczyć całkowite stężenie białka w lizacie za pomocą analizy BCA (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Całkowite lizaty białkowe można przygotować w dniu doświadczenia i stosować w postaci świeżej lub przechowywać jako jednorazowe podwielokrotności w temperaturze -80 °C przez okres do 12 tygodni. Nie zamrażać/nie rozmrażać.

3. Funkcjonalizacja tablicy za pomocą biotynylowanego przeciwciała

  1. Przygotuj następujące rozwiązania.
    1. Bufor T50, roztwór 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) i 50 mM NaCl. Roztwór jest stabilny przez 1 miesiąc w RT.
    2. T50-BSA poprzez uzupełnienie buforu T50 o 0,1 mg/ml BSA. Przygotowany roztwór należy przechowywać na lodzie.
    3. 10 mg/ml borowodorku sodu (NaBH4) w 1x PBS. Przygotuj to bezpośrednio przed użyciem.
    4. 0,2 mg/ml NeutrAwidyny (patrz Tabela Materiałów) w buforze T50.
      UWAGA: NaBH4 jest środkiem redukującym i jest łatwopalny. Po użyciu należy zawsze przepłukać pojemnik azotem gazowym i przechowywać go w eksykatorze.
  2. Funkcjonalizować macierz za pomocą biotynylowanego przeciwciała.
    1. Wyjmij z zamrażarki matryce funkcjonalizowane PEG-biotyną i zrównoważ stożkową rurkę z RT przed otwarciem. Umieścić szkiełko nakrywkowe z matrycą skierowaną do góry na naczyniu do hodowli tkankowych (TC100) wyłożonym folią uszczelniającą.
      UWAGA: Zminimalizuj oświetlenie górne. Wszystkie roztwory powinny "perplać się" na kwadratach zdefiniowanych przez układ hydrofobowy. Dodaj odpowiednią objętość roztworu, aby całkowicie pokryć każdy kwadrat (zwykle 10-15 μl) i nie pozwól, aby płyn przelał się przez wyznaczoną przestrzeń. Aby szybko usunąć płyny, użyj wewnętrznego przewodu próżniowego podłączonego do kolby próżniowej w celu wychwytywania odpadów. Pozwól NaBH4 odgazować się przez 1 godzinę przed usunięciem, pozostawiając rurkę otwartą w okapie oparów chemicznych. Leczenie NaBH4 jest konieczne w celu zmniejszenia autofluorescencji tła, zmniejszając w ten sposób liczbę fałszywie dodatnich wykryć pojedynczych cząsteczek.
    2. Potraktuj każdy kwadrat tablicy 10 mg/ml NaBH4 w 1x PBS przez 4 minuty w temperaturze pokojowej. Przemyć trzykrotnie PBS.
    3. Inkubować każdy kwadrat przez 5 minut z 0,2 mg/ml NeutrAwidyny w T50. Umyć trzykrotnie T50-BSA.
      UWAGA: NeutrAwidyna wiąże się z PEG-biotyną i zapewnia miejsce wiązania dla biotynylowanych przeciwciał12,13,15.
    4. Inkubować każdy kwadrat przez 10 minut z 2 μg/ml biotynylowanego przeciwciała specyficznego dla POI w T50-BSA; przemyć trzykrotnie T50-BSA.
      UWAGA: Niniejszy protokół wykorzystuje biotynylowane przeciwciała anty-EGFR IgG (patrz tabela materiałów) do wychwytywania EGFR-GFP.

4. SiMPull POI z lizatów całokomórkowych

UWAGA: Umieść na lodzie naczynie TC100 z funkcjonalnymi tablicami SiMPull na resztę przygotowania SiMPull. Ten krok polega na pobraniu POI z całkowitego lizatu białkowego. Lizat nie może być ponownie użyty po rozmrożeniu.

  1. Przygotuj następujące rozwiązania.
    1. Przygotować 4% paraformaldehydu (PFA)/0,1% aldehydu glutarowego (GA) w 1x PBS.
      UWAGA: PFA i GA są toksycznymi utrwalaczami chemicznymi i potencjalnymi czynnikami rakotwórczymi. Nosić środki ochrony osobistej. Chemikalia należy utylizować jako odpady niebezpieczne zgodnie z lokalnymi przepisami i wytycznymi.
    2. Przygotuj 10 mM Tris-HCl, pH 7,4.
  2. Rozmrozić i wymieszać lizat, delikatnie pipetując w górę iw dół. Trzymaj na lodzie.
  3. Rozcieńczyć 1 μl lizatu w 100 μl lodowatego T50-BSA/PPI.
    UWAGA: W razie potrzeby należy określić odpowiedni współczynnik rozcieńczenia całkowitego lizatu białkowego, stosując szereg rozcieńczeń do matrycy. Optymalna gęstość receptorów SiMPull na powierzchnię matrycy wynosi 0,04-0,08/μm2. Rozcieńczenia lizatu można ocenić w kroku 6 (Analiza danych).
  4. Inkubować lizat na matrycy przez 10 minut, a następnie przemyć czterokrotnie lodowatym roztworem T50-BSA/PPI.
  5. Rozcieńczyć przeciwciało antyfosfotyrozynowe sprzężone z AF647 (patrz tabela materiałów) w lodowatym T50-BSA/PPI i inkubować na matrycy przez 1 h.
    UWAGA: W niniejszym protokole do identyfikacji fosforylowanej populacji EGFR-GFP stosuje się pan-anty-pTyr (PY99)-AF647 IgG. Zastosowanie przeciwciał znakowanych bezpośrednio eliminuje potrzebę stosowania przeciwciał drugorzędowych, zwiększając możliwości znakowania i poprawiając spójność wyników. Przeciwciała znakowane fluorescencyjnie można uzyskać ze źródeł komercyjnych. Jeśli nie są dostępne na rynku, przeciwciała mogą być znakowane na zamówienie przy użyciu standardowych technik biokoniugacji, a dostępne są komercyjne zestawy do biokoniugacji. Każda partia przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie musi zostać przetestowana pod kątem optymalnych warunków znakowania poprzez wykonanie SiMPull w celu zmierzenia krzywej dawki i znalezienia punktu nasycenia.
  6. Umyj sześć razy lodowatym T50-BSA, w sumie przez 6-8 minut.
  7. Umyć dwukrotnie lodowatym środkiem 1x PBS.
  8. Inkubować macierz z 4% roztworem PFA/0,1% GA przez 10 minut, aby zapobiec dysocjacji przeciwciał.
  9. Przemyć dwukrotnie przez 5 minut za pomocą 10 mM Tris-HCl, pH 7,4/PBS w celu dezaktywacji utrwalaczy.
    UWAGA: W przypadku eksperymentów z użyciem więcej niż jednego przeciwciała (np. wykrywanie wielu miejsc fosfotyrozyny) powtórz kroki 4.5-4.9. Patrz krok 6.2.9 w celu uzyskania informacji na temat określania przeszkody sterycznej między dwoma przeciwciałami.

5. Akwizycja obrazu

UWAGA: Akwizycja obrazów pojedynczych molekuł odbywa się za pomocą obiektywu TIRF 150x i rozdzielacza obrazu, który przechwytuje każdy kanał widmowy w określonym kwadrancie kamery emCCD (patrz Tabela materiałów). Obrazy kalibracyjne są najpierw pozyskiwane, aby umożliwić rejestrację kanałów i kalibrację wzmocnienia kamery za pomocą siatki wyrównania kanałów z nanowzorcem (nanogrid), która zawiera 20 x 20 tablic otworów o długości fali 200 ± 50 nm w odległości od 3 ± 1 μm (całkowity rozmiar ~60 μm × 60 μm).

  1. Dokonaj rejestracji kanału, wykonując poniższe czynności.
    UWAGA: Dokładna rejestracja kanałów jest potrzebna do prawidłowego obliczenia kolokalizacji emiterów. Ten krok ma kluczowe znaczenie.
    1. Wyczyść tarczę olejową i nałóż na nią kroplę oleju. Umieść nanosiatkę na stoliku w celu obrazowania. Korzystając z przechodzącego białego światła, skoncentruj się na wzorze siatki.
      UWAGA: Obrazy za pomocą nanosiatki są pozyskiwane za pomocą światła przechodzącego, które przechodzi przez nanosiatkę i jest wykrywane we wszystkich kanałach spektralnych. Alternatywnie można użyć kulek multifluorescencyjnych, które emitują fluorescencję wykrytą w każdym kanale. Akwizycja obrazu będzie musiała być zoptymalizowana zgodnie z każdą konfiguracją mikroskopu.
    2. Zrób serię 20 obrazów siatki. Upewnij się, że piksele nie są nasycone. Zapisz serię obrazów jako "Wierny".
    3. Rozogniskuj nanosiatkę, aby utworzyć wzór Airy18. Wykonaj serię 20 obrazów w celu kalibracji wzmocnienia. Zapisz obraz jako "Wzmocnienie".
    4. Uzyskaj serię 20 obrazów do przesunięcia kamery, blokując całe światło przed dotarciem do aparatu. Zapisz obraz jako "Tło".
  2. Pobierz SiMPull images.
    UWAGA: Przed obrazowaniem matrycy szkiełek nakrywkowych należy wymienić roztwór Tris na T50-BSA i zrównoważyć matrycę z RT.
    1. Wyczyść obiektyw olejowy i nałóż na niego dodatkową ilość oleju. Zamocuj matrycę szkiełek nakrywkowych na stoliku mikroskopu.
    2. Zoptymalizuj moc wzbudzenia każdego fluoroforu, kąt TIRF i czas integracji kamery. Celem jest osiągnięcie najwyższego stosunku sygnału do szumu przy jednoczesnej minimalizacji fotowybielania próbki. Zapisz moc lasera, aby zachować spójność w przyszłych pomiarach.
      UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano czas ekspozycji 300 ms dla kanału dalekiej czerwieni i 1 s dla kanału zielonego. Zastosowano laser o długości fali 642 nm o mocy około 500 μW, natomiast laser o długości fali 488 nm o mocy 860 μW, mierzonej przed soczewką tuby.
    3. Uzyskaj obrazy dla każdej próbki. Najpierw zobrazuj kanał dalekiej czerwieni, a następnie każdy fluorofor o niższej długości fali, aby zmniejszyć fotowybielanie. Ze względu na małą objętość używaną do każdej próbki, sprawdzaj poziom buforu co 30-45 minut i uzupełniaj w razie potrzeby.

6. Analiza danych

  1. Pobierz demo codes.
    UWAGA: Dostarczony kod demonstracyjny i przykładowe zestawy danych demonstrują pełny przepływ pracy analizy danych (Dodatkowe pliki kodowania 1-4). Wymagania systemowe wymienione w SiMPullMain.m znajdują się w dodatkowym pliku kodowania 1.
    1. Rozpakuj i zapisz w osobistym katalogu Dokumenty/MATLAB (MacOS/Linux) lub Dokumenty\MATLAB (Windows).
      UWAGA: Spowoduje to wygenerowanie czterech nowych folderów: SiMPull_class, smite, Sample Data, Sample Analysis Outputs.
    2. Otwórz plik "ReadMe_Setup.txt" znajdujący się w folderze SiMPull_class.
    3. Zainstaluj przyborniki MATLAB i MATLAB: Przybornik do dopasowywania krzywych, Przybornik do obliczeń równoległych oraz Przybornik do statystyk i uczenia maszynowego.
    4. Zainstaluj DipImage19 zgodnie z instrukcjami pobierania.
    5. Zainstaluj pakiet do analizy pojedynczych cząsteczek "smite" zgodnie z opisem w ReadMe_setup.txt.
      UWAGA: "smite" jest dostępne w repozytorium GitHub (patrz Spis materiałów).
    6. Otwórz plik SiMPullMain.m znajdujący się w folderze SiMPull_class, przeciągając go do okna programu MATLAB.
    7. Zmień katalog na ...\MATLAB\Sample Data\, klikając ikonę Przeglądaj w poszukiwaniu folderu i wybierając folder.
  2. Przegląd etapów przetwarzania danych
    1. Uruchom SiMPullMain.m — postępując zgodnie z instrukcjami dla każdej sekcji. Wykonaj każdą sekcję indywidualnie, umieszczając kursor w tej sekcji i klikając ikonę Uruchom sekcję.
      UWAGA: Ogólne kroki analizy danych są opisane w tej sekcji. Szczegółowe instrukcje znajdują się w dołączonym kodzie SiMPullMain.m.
    2. Uruchom sekcję "Inicjalizacja", aby ustawić ścieżkę do zdefiniowania kanałów spektralnych i rozmiaru obrazu.
    3. Uruchom sekcję "Znajdź wzmocnienie i przesunięcie kamery", aby przekonwertować wzmocnienie kamery na fotony przy użyciu zestawów danych wzmocnienia i tła.
    4. Uruchom sekcję "Rejestracja kanału", aby obliczyć lokalną transformację średniej ważonej używaną do rejestracji obrazu.
    5. Formatowanie i selekcjonowanie danych. Uruchom sekcję "Połącz sekwencyjne kanały w obraz poczwórny". Uruchom polecenie "Usuń uszkodzone ramki".
    6. Uruchom sekcję "Dopasuj pojedyncze cząsteczki i znajdź nakładające się cząsteczki".
      UWAGA: Ta sekcja wykonuje wiele funkcji w celu lokalizacji pojedynczych cząsteczek w każdym kanale i określenia zdarzeń kolokalizacji między kanałami spektralnymi.
    7. Aby określić minimalną liczbę fotonów na rzeczywiste dopasowanie GFP, uruchom polecenie "Optymalizuj minimalny próg fotonów". Jest to proces iteracyjny.
      1. Najpierw ustaw smf. Thresholding_MinPhotons = [0, 0, 0] i uruchom sekcję. Wybierz "Puste dane" files, gdy zostaniesz o to poproszony. Powtórz te czynności z plikami "CHO-EGFR-GFP".
      2. Wybierz odpowiednią minimalną wartość progową, porównując dwa histogramy. Ustaw smf. Thresholding_MinPhotons = [475, 0, 0] i ponownie uruchom sekcję.
    8. Uruchom sekcję "Oblicz procent dopasowań GFP dodatnich dla sygnału FR", aby poprawić lokalizacje tła i obliczyć wartości końcowe.
    9. Wykonać opcję 1 (krok 6.2.10) lub opcję 2 (krok 6.2.11) zgodnie z potrzebą eksperymentalną.
    10. Opcja 1: Popraw liczbę receptorów dostępnych w błonie plazmatycznej do wiązania ligandów, zgodnie z opisem w Reference15.
      1. Po pierwsze, oznacz receptory powierzchniowe nasyconymi poziomami fluorescencyjnego barwnika estrowego NHS (NHS-AF647, patrz tabela materiałów). Następnie wykonaj eksperyment SiMPull, aby określić procent lokalizacji GFP, która kolokalizuje się z AF647.
        UWAGA: Zapewnia to oszacowanie frakcji receptorów dostępnych do znakowania NHS oraz stosunku receptorów na powierzchni (SR).
      2. Zastosuj poprawkę SR w obliczeniach końcowych: NGFP = (NLOC - NBG)*SR, gdzie NGFP to skorygowana liczba lokalizacji GFP, NBG to numer lokalizacji tła, a NLOC to łączne lokalizacje.
        UWAGA: W niniejszym przykładzie ta poprawka nie jest stosowana, ponieważ Perwanadat jest przepuszczalny przez błonę16, a zatem działanie hamowania fosfatazy nie jest ograniczone do receptorów powierzchniowych.
    11. Opcja 2: W przypadku pomiarów fosforylacji wielomiejscowej należy wziąć pod uwagę możliwość wystąpienia przeszkody sterycznej w przypadku stosowania dwóch przeciwciał.
      UWAGA: Przeszkoda steryczna może powodować zmniejszenie obserwowanego odsetka fosforylowanych receptorów dla przeciwciała 1 w obecności przeciwciała 2 (P12), w porównaniu z samym przeciwciałem 1 (P1).
      1. Użyj SiMPull, aby wyznaczyć P1 i P12 i obliczyć współczynnik korekcyjny dla przeszkody sterycznej, postępując zgodnie z wcześniej opublikowaną klasą Reference15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek przedstawiający proces SiMPull jest pokazany w Rysunek 1A. Szkiełka nakrywkowe są funkcjonalizowane przy użyciu NeutrAwidyny jako kotwicy dla biotynylowanych przeciwciał anty-EGFR w celu wychwytywania EGFR-GFP z całkowitych lizatów białkowych. Po wypłukaniu niezwiązanego białka, fosforylowane receptory są znakowane przeciwciałem anty-fosfotyrozynowym (anty-PY)15. Rysunek 1B pokazuje obraz układu hydrofobowego, gdzie można przygoto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół został zoptymalizowany, aby umożliwić ilościowe pomiary fosforylacji receptora na poziomie pojedynczego białka. Opracowano kilka prostych, ale ważnych modyfikacji protokołu SiMPull, które poprawiły wiarygodność pomiaru w celu wykrywania fosfo-tyrozyny, w tym zmniejszenie autofluorescencji za pomocą NaBH4 i postfiksowanie próbki w celu zapobieżenia dysocjacji przeciwciał. Użycie maski zielonego kanału do identyfikacji lokalizacji receptorów w celu obliczenia kolokalizacji z przeciwciałem ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health R35GM126934, R01AI153617 i R01CA248166 do DSL. EMB było wspierane przez program ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021), a JAR przez program UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). Z wdzięcznością dziękujemy za korzystanie ze wspólnych zasobów mikroskopii fluorescencyjnej University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, wspieranych przez NIH P30CA118100. Pragniemy podziękować doktorom Ankurowi Jainowi i Taekijipowi Ha, których oryginalny rozwój SiMPull zainspirował nas do tej pracy.
ES-C obecny adres: Grupa Immunodynamiczna, Laboratorium Integratywnej Immunologii Nowotworów, Centrum Badań nad Rakiem, National Cancer Institute, Bethesda

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml probówki do mikrowirówekMTC BioC2000
10 mM Tris-HCl pH 7,4
10 mM Tris-HCl pH 8,0/ 50 mM NaClT50 Bufor
Pojemnik na hodowle tkankoweCELLTREAT229620Przechowywanie szkła/tablic trawionych piranią
15 mL Probówka
16% Paraformaldehyd Wodny RozwiązanieMikroskopia elektronowa Sciences15710Niebezpieczna
rurkaFunkcjonalizowane przechowywanie szkła / ponowne użycie KOH
50 mM Tris-HCl pH 7,2 / 150 mM NaClSkładnik buforowy do lizy
do hodowli tkankowychCorning430166
8% Wodny roztwór aldehydu glutarowegoMikroskopia elektronowa Nauki16020Niebezpieczny
aceton (C3H6O)Millipore Sigma270725Niebezpieczny
Alexa Fluor 647 NHS EsterThermo Fisher ScientificA-20006
Wolny od zwierząt rekombinowany ludzki EGFPeprotechAF-100-15
Anti-Human EGFR (domena zewnętrzna) – BiotynaLeinco Technologies, IncE101
Przeciwciało anty-p-Tyr (PY99) Alexa Fluor 647Santa Cruz Biotechnologysc-7020 AF647
Sonikator do kąpieliBranson1200
Zestaw do oznaczania białek BCAPierce23227
Biotin-PEGLaysan BioBiotin-PEG-SVA, MW 5,000
Albuminasurowicy bydlęcejGold BiotechnologyA-420-1Składnik buforowy Tyrode'a Lejek
Buchnera
Bunsena
Chlorek wapnia (CaCl2)Millipore SigmaC4901Skrobak do komórek ze składnikiem buforowym Tyrode'a
Bioworld30900017-1
Stożkowa kolba filtrującaFisher ScientificS15464
Słoik z kopinyWHEATON900470
Hrabina II Automatyczny licznik komórekThermo Fisher ScientificAMQAX1000
Szkiełka nakrywkowe 24 x 60 #1.5Mikroskopia elektronowa Nauki63793
DipImagehttps://diplib.org/
DMEMCaisson LabsDML19-500
Kamera emCCDAndor iXon
Płodowa surowica bydlęca, OptimaBio-Techne S12450HOprogramowanie Heat
Inactivated Fusion 360Autodesk
Geneticin G418 DisulfateCaisson LabsG030-5GM
Lodowaty kwas octowy (CH3COOH)JT BakerJTB-9526-01Niebezpieczny
Szklane pipety
Szklany pręt
Glukoza (D-(+)-glukoza)Millipore SigmaD9434Składnik buforowy Tyrode'a
Halt Koktajl inhibitorów fosfotazy i proteazy (100X)Thermo Fisher Scientific78446Składnik buforowy do lizy
HEPESMillipore SigmaH3375TyrodeSkładnik buforowy
Kwas solny (HCl)VWRBDH7204-1Niebezpieczny
nadtlenek wodoru (H2O2) (3%)HX0645
Nadtlenek wodoru (H2O2) (30%)EMD MilliporeHX0635-2
Lód
IGEPAL CA-630 ( NP-40)Sigma AldrichI8896Składnik bufora do lizy
ImmEdge Hydrofobowy długopis barierowy VectorLaboratoriesH-4000
Olejek immersyjny Immersol 518FZeiss444960-0000-000
własna linia
L-glutaminaThermo Fisher Scientific25030-164
Sześciowodny chlorek magnezu (MgCl2-6H2O)MPBio2191421Komponent buforowy Tyrode'a
MatlabMathworksCurve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox oraz Zestaw narzędzi do statystyk i uczenia maszynowego
Metanol (CH3OH)IBIS ScientificMX0486-1Niebezpieczna
wodaMilli-Q
Mix-n-Stain CF Barwnik Zestawy do znakowania przeciwciałBiotium92245Sugerowany zestaw do koniugacji
mPEGLaysan Biowalerianian mPEG-sukcynimidylu, MW 5,000
N-(2-aminoetylo)-3-aminopropylotrimetoksysilanUCT UnitedChemical A0700Niebezpieczna
nanosiatkaMiraloma Tech
NeutrAvidin Biotyna Białko wiążąceThermo Fisher Scientific31000
Azot (sprężony gaz)
Procesor graficzny NVIDIA z CUDAPoszukaj kompatybilności na https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Mikroskop Olympus iX71Folia
Parafilm MLab DepotHS234526C
PBS pH 7,4Keson LabsPBL06
PC-200 Analogowa płyta grzejnaCorning6795-200
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U / ml)Thermo Fisher Scientific15140-163
Receptor fosfo-EGF (Tyr1068) (1H12) Mysiasygnalizacji komórkowej2236BF
Chlorek potasu (KCl)Millipore Sigma529552Składnik buforowy Tyrode
Wodorotlenek potasu (KOH)Millipore Sigma1050330500Niebezpieczny
filament PLA premium, średnica 1,75 mmPodnieś 3DPMS:2035U/RAL:3028Zakres temperatur drukowania: 205-235 °
Drukarka 3D C Pro2Raise 3D
Pyrex 1 L zlewka
PYREX 100 ml butelki do przechowywaniaCorning1395-100CH3OH/C3H6O ponowne wykorzystanie
zlewek
Zlewka
Widok poczwórny Obraz SplitterPhotometricsModel QV2
Wirówka z chłodzeniemEppendorfEP-5415R
RevCount Liczniki komórek, prowadnice do liczenia komórek EVEVWR10027-446
Filtry emisji Semrock: niebieskie (445/45 nm), zielone (525/45 nm), czerwone (600/37 nm), dalekie czerwone (685/40 nm)SemrockLF405/488/561/635-4X4M-B-000
Serologiczny kontroler pipet
Pipety
Zestaw do analizyhttps://github.com/LidkeLab/smite.git
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Sigma AldrichS6014Niebezpieczny
borowodorek sodu (NaBH4)Millipore Sigma452874Tyrode' s Składnik buforowy
Chlorek sodu (NaCl)Millipore SigmaS9625Aktywuj przez kolejne cykle ciepła i pH
Wodorotlenek soduVWRBDH3247-1
Ortowanan sodu (Na3VO4)MilliporeSigma S6508Niebezpieczny
kwas siarkowy (H2SO4)Millipore Sigma258105Niebezpieczne
mikrosfery TetraSpeckKoraliki wielofluorescencyjneThermo Fisher ScientificT7279
Baza Tris (Trizma)Millipore SigmaT1503
Niebieska plama trypanowa, 0,4%Thermo Fisher Scientific15250061
Trypsin-EDTA 0,05%Thermo Fisher Scientific25300120
100 mm NaCl Na50 stożkowa stożkowa 50 ml 60 mm Naczynie Palnik serologicznemieszającypróżniowa uszczelniająca Olympus technologia mAb Pyrex 250 mLPyrex 4 Lserologiczne pojedynczych cząsteczek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  2. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).
  3. Coba, M. P., et al. Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks. Science Signaling. 2 (68), (2009).
  4. Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin. Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).
  5. Stites, E. C., et al. Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets. Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).
  6. Hause, R. J., et al. Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors. PLOS ONE. 7 (9), 44471(2012).
  7. Lau, E. K., et al. Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection. Science Signaling. 4 (185), (2011).
  8. Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
  9. Brunner, A. M., et al. Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization. Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).
  10. Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
  11. Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications. Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).
  12. Jain, A., et al. Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down. Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).
  13. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  14. Kim, K. L., et al. Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
  15. Salazar-Cavazos, E., et al. Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes. Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695(2020).
  16. Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
  17. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  18. Keller, H. E. Objective lenses for confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).
  19. Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB. , (1999).
  20. fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc. , Available from: https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html (2013).
  21. Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride. Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).
  22. Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. Toward single-cell single-molecule pull-down. Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).
  23. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Single Molecule Pull DownProtein PhosphorylationPhosphorylation QuantificationEGFR PhosphorylationImmunoprecipitation AssayAntibody LabelingGlass PreparationSingle Molecule ImagingColocalization AnalysisGaussian Localization

Powiązane artykuły