Method Article

Zoptymalizowany test typu pull-down dla pojedynczych cząsteczek do ilościowego oznaczania fosforylacji białek

DOI:

10.3791/63665

⸱

June 6th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine, 2Department of Physics and Astronomy, University of New Mexico, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje przygotowanie próbki i analizę danych w celu ilościowego określenia fosforylacji białek za pomocą ulepszonego testu ściągania pojedynczych cząsteczek (SiMPull).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosforylacja jest konieczną modyfikacją potranslacyjną, która reguluje funkcję białka i kieruje wynikami sygnalizacji komórkowej. Obecne metody pomiaru fosforylacji białek nie są w stanie zachować niejednorodności fosforylacji poszczególnych białek. Test ściągania pojedynczej cząsteczki (SiMPull) został opracowany w celu zbadania składu kompleksów makromolekularnych poprzez immunoprecypitację białek na szklanym szkiełku nakrywkowym, a następnie obrazowanie pojedynczych cząsteczek. Obecna technika polega na adaptacji SiMpull, która zapewnia solidną ocenę ilościową stanu fosforylacji receptorów błonowych o pełnej długości na poziomie pojedynczej cząsteczki. Obrazowanie tysięcy pojedynczych receptorów w ten sposób pozwala na ilościowe określenie wzorców fosforylacji białek. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje zoptymalizowaną procedurę SiMputl, od przygotowania próbki po obrazowanie. Optymalizacja protokołów przygotowania szkła i utrwalania przeciwciał dodatkowo poprawia jakość danych. Obecny protokół zawiera kod do analizy danych pojedynczej cząsteczki, który oblicza frakcję receptorów fosforylowanych w próbce. Chociaż praca ta koncentruje się na fosforylacji receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), protokół można uogólnić na inne receptory błonowe i cytozolowe cząsteczki sygnałowe.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sygnalizacja związana z błoną jest dostrajana przez kombinację indukowanej ligandem aktywacji receptora błonowego i rekrutacji dalszych białek pomocniczych, które propagują sygnał. Fosforylacja kluczowych tyrozyn w ogonach cytoplazmatycznych receptorów ma kluczowe znaczenie dla zainicjowania tworzenia kompleksów sygnałowych lub signalosomów1,2. Dlatego ważnym pytaniem w biologii jest to, w jaki sposób tworzone i utrzymywane są wzorce fosforylacji w celu rekrutacji partnerów sygnalizacyjnych i dyktowania wyników komórkowych. Obejmuje to zrozumienie niejednorodności fosforylacji receptorów, zarówno pod względem ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych

UWAGA: Na tym etapie należy nosić środki ochrony osobistej (PPE), które obejmują podwójną warstwę rękawic nitrylowych, okulary ochronne lub osłonę twarzy oraz fartuch laboratoryjny.

  1. Wykonaj trawienie piranii, aby usunąć zanieczyszczenia organiczne ze szkła.
    UWAGA: Roztwór piranii jest silnym utleniaczem, który jest i wysoce reaktywny w kontakcie z materiałami organicznymi. Reakcja ze szczątkami organicznymi jest egzotermiczna i potencjalnie wybuchowa. Dlatego zabieg należy wykonać w dygestorium chemicznym przy opuszczonym skrzydle. Do obsługi roztworu piranii wymagan....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek przedstawiający proces SiMPull jest pokazany w Rysunek 1A. Szkiełka nakrywkowe są funkcjonalizowane przy użyciu NeutrAwidyny jako kotwicy dla biotynylowanych przeciwciał anty-EGFR w celu wychwytywania EGFR-GFP z całkowitych lizatów białkowych. Po wypłukaniu niezwiązanego białka, fosforylowane receptory są znakowane przeciwciałem anty-fosfotyrozynowym (anty-PY)15. Rysunek 1B pokazuje obraz układu hydrofobowego, gdzie można przygoto.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół został zoptymalizowany, aby umożliwić ilościowe pomiary fosforylacji receptora na poziomie pojedynczego białka. Opracowano kilka prostych, ale ważnych modyfikacji protokołu SiMPull, które poprawiły wiarygodność pomiaru w celu wykrywania fosfo-tyrozyny, w tym zmniejszenie autofluorescencji za pomocą NaBH4 i postfiksowanie próbki w celu zapobieżenia dysocjacji przeciwciał. Użycie maski zielonego kanału do identyfikacji lokalizacji receptorów w celu obliczenia kolokalizacji z przeciwciałem .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health R35GM126934, R01AI153617 i R01CA248166 do DSL. EMB było wspierane przez program ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021), a JAR przez program UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). Z wdzięcznością dziękujemy za korzystanie ze wspólnych zasobów mikroskopii fluorescencyjnej University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, wspieranych przez NIH P30CA118100. Pragniemy podziękować doktorom Ankurowi Jainowi i Taekijipowi Ha, których oryginalny rozwój SiMPull zainspirował nas do tej pracy.
ES-C obecny adres: Grupa Immunodynamiczna, Laboratorium Integratywnej Immunologii Nowotworów, Centrum Badań nad Rakiem, National Cance....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 ml probówki do mikrowirówekMTC BioC2000
10 mM Tris-HCl pH 7,4
10 mM Tris-HCl pH 8,0/ 50 mM NaClT50 Bufor
Pojemnik na hodowle tkankoweCELLTREAT229620Przechowywanie szkła/tablic trawionych piranią
15 mL Probówka
16% Paraformaldehyd Wodny RozwiązanieMikroskopia elektronowa Sciences15710Niebezpieczna
rurkaFunkcjonalizowane przechowywanie szkła / ponowne użycie KOH
50 mM Tris-HCl pH 7,2 / 150 mM NaClSkładnik buforowy do lizy
do hodowli tkankowychCorning430166
8% Wodny roztwór aldehydu glutarowegoMikroskopia elektronowa Nauki16020Niebezpieczny
aceton (C3H6O)Millipore Sigma270725Niebezpieczny
Alexa Fluor 647 NHS EsterThermo Fisher ScientificA-20006
Wolny od zwierząt rekombinowany ludzki EGFPeprotechAF-100-15
Anti-Human EGFR (domena zewnętrzna) – BiotynaLeinco Technologies, IncE101
Przeciwciało anty-p-Tyr (PY99) Alexa Fluor 647Santa Cruz Biotechnologysc-7020 AF647
Sonikator do kąpieliBranson1200
Zestaw do oznaczania białek BCAPierce23227
Biotin-PEGLaysan BioBiotin-PEG-SVA, MW 5,000
Albuminasurowicy bydlęcejGold BiotechnologyA-420-1Składnik buforowy Tyrode'a Lejek
Buchnera
Bunsena
Chlorek wapnia (CaCl2)Millipore SigmaC4901Skrobak do komórek ze składnikiem buforowym Tyrode'a
Bioworld30900017-1
Stożkowa kolba filtrującaFisher ScientificS15464
Słoik z kopinyWHEATON900470
Hrabina II Automatyczny licznik komórekThermo Fisher ScientificAMQAX1000
Szkiełka nakrywkowe 24 x 60 #1.5Mikroskopia elektronowa Nauki63793
DipImagehttps://diplib.org/
DMEMCaisson LabsDML19-500
Kamera emCCDAndor iXon
Płodowa surowica bydlęca, OptimaBio-Techne S12450HOprogramowanie Heat
Inactivated Fusion 360Autodesk
Geneticin G418 DisulfateCaisson LabsG030-5GM
Lodowaty kwas octowy (CH3COOH)JT BakerJTB-9526-01Niebezpieczny
Szklane pipety
Szklany pręt
Glukoza (D-(+)-glukoza)Millipore SigmaD9434Składnik buforowy Tyrode'a
Halt Koktajl inhibitorów fosfotazy i proteazy (100X)Thermo Fisher Scientific78446Składnik buforowy do lizy
HEPESMillipore SigmaH3375TyrodeSkładnik buforowy
Kwas solny (HCl)VWRBDH7204-1Niebezpieczny
nadtlenek wodoru (H2O2) (3%)HX0645
Nadtlenek wodoru (H2O2) (30%)EMD MilliporeHX0635-2
Lód
IGEPAL CA-630 ( NP-40)Sigma AldrichI8896Składnik bufora do lizy
ImmEdge Hydrofobowy długopis barierowy VectorLaboratoriesH-4000
Olejek immersyjny Immersol 518FZeiss444960-0000-000
własna linia
L-glutaminaThermo Fisher Scientific25030-164
Sześciowodny chlorek magnezu (MgCl2-6H2O)MPBio2191421Komponent buforowy Tyrode'a
MatlabMathworksCurve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox oraz Zestaw narzędzi do statystyk i uczenia maszynowego
Metanol (CH3OH)IBIS ScientificMX0486-1Niebezpieczna
wodaMilli-Q
Mix-n-Stain CF Barwnik Zestawy do znakowania przeciwciałBiotium92245Sugerowany zestaw do koniugacji
mPEGLaysan Biowalerianian mPEG-sukcynimidylu, MW 5,000
N-(2-aminoetylo)-3-aminopropylotrimetoksysilanUCT UnitedChemical A0700Niebezpieczna
nanosiatkaMiraloma Tech
NeutrAvidin Biotyna Białko wiążąceThermo Fisher Scientific31000
Azot (sprężony gaz)
Procesor graficzny NVIDIA z CUDAPoszukaj kompatybilności na https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Mikroskop Olympus iX71Folia
Parafilm MLab DepotHS234526C
PBS pH 7,4Keson LabsPBL06
PC-200 Analogowa płyta grzejnaCorning6795-200
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U / ml)Thermo Fisher Scientific15140-163
Receptor fosfo-EGF (Tyr1068) (1H12) Mysiasygnalizacji komórkowej2236BF
Chlorek potasu (KCl)Millipore Sigma529552Składnik buforowy Tyrode
Wodorotlenek potasu (KOH)Millipore Sigma1050330500Niebezpieczny
filament PLA premium, średnica 1,75 mmPodnieś 3DPMS:2035U/RAL:3028Zakres temperatur drukowania: 205-235 °
Drukarka 3D C Pro2Raise 3D
Pyrex 1 L zlewka
PYREX 100 ml butelki do przechowywaniaCorning1395-100CH3OH/C3H6O ponowne wykorzystanie
zlewek
Zlewka
Widok poczwórny Obraz SplitterPhotometricsModel QV2
Wirówka z chłodzeniemEppendorfEP-5415R
RevCount Liczniki komórek, prowadnice do liczenia komórek EVEVWR10027-446
Filtry emisji Semrock: niebieskie (445/45 nm), zielone (525/45 nm), czerwone (600/37 nm), dalekie czerwone (685/40 nm)SemrockLF405/488/561/635-4X4M-B-000
Serologiczny kontroler pipet
Pipety
Zestaw do analizyhttps://github.com/LidkeLab/smite.git
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Sigma AldrichS6014Niebezpieczny
borowodorek sodu (NaBH4)Millipore Sigma452874Tyrode' s Składnik buforowy
Chlorek sodu (NaCl)Millipore SigmaS9625Aktywuj przez kolejne cykle ciepła i pH
Wodorotlenek soduVWRBDH3247-1
Ortowanan sodu (Na3VO4)MilliporeSigma S6508Niebezpieczny
kwas siarkowy (H2SO4)Millipore Sigma258105Niebezpieczne
mikrosfery TetraSpeckKoraliki wielofluorescencyjneThermo Fisher ScientificT7279
Baza Tris (Trizma)Millipore SigmaT1503
Niebieska plama trypanowa, 0,4%Thermo Fisher Scientific15250061
Trypsin-EDTA 0,05%Thermo Fisher Scientific25300120
100 mm NaCl Na50 stożkowa stożkowa 50 ml 60 mm Naczynie Palnik serologicznemieszającypróżniowa uszczelniająca Olympus technologia mAb Pyrex 250 mLPyrex 4 Lserologiczne pojedynczych cząsteczek

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  2. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule Pull DownProtein PhosphorylationPhosphorylation QuantificationEGFR PhosphorylationImmunoprecipitation AssayAntibody LabelingGlass PreparationSingle Molecule ImagingColocalization AnalysisGaussian Localization

Related Articles