Artykuł metodologiczny

Mikrodysekcja laserowa do zastosowań jednotkankowych niezależnych od gatunku

DOI:

10.3791/63666

⸱

31 marca 2022

 ,  ,  ,  , 
1Center for Developmental Genetics, New York University, 2Sacred Heart University, 3Baylor School

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano protokół, który wykorzystuje laserową mikrodysekcję do izolowania pojedynczych tkanek nicieni do sekwencjonowania RNA. Protokół nie wymaga zestawów narzędzi genetycznych specyficznych dla danego gatunku, co pozwala na porównywanie profili ekspresji genów między różnymi gatunkami na poziomie próbek jednotkankowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metodologie jednokomórkowe zrewolucjonizowały analizę transkryptomów określonych typów komórek. Jednak często wymagają one specyficznych dla gatunku "zestawów narzędzi" genetycznych, takich jak promotory napędzające specyficzną tkankowo ekspresję białek fluorescencyjnych. Co więcej, protokoły, które zakłócają tkanki w celu wyizolowania pojedynczych komórek, usuwają komórki z ich natywnego środowiska (np. sygnalizacji od sąsiadów) i mogą powodować reakcje stresowe lub inne różnice w stosunku do natywnych stanów ekspresji genów. W obecnym protokole mikrodysekcja laserowa (LMD) jest zoptymalizowana pod kątem izolowania pojedynczych końcówek ogonów nicieni w celu zbadania ekspresji genów podczas morfogenezy końcówki ogona samca.

LMD pozwala na izolację części zwierzęcia bez potrzeby zakłócania działania komórek lub zestawów narzędzi specyficznych dla gatunku, a zatem ma zastosowanie do każdego gatunku. Następnie, protokoły przygotowania biblioteki sekwencyjnej RNA pojedynczej komórki, takie jak CEL-Seq2, można zastosować do pojedynczych tkanek izolowanych za pomocą LMD i przeanalizować przy użyciu standardowych potoków, biorąc pod uwagę, że dla gatunku dostępny jest dobrze opisany genom lub transkryptom. Takie dane można wykorzystać do ustalenia, jak konserwatywne lub różne są transkryptomy, które leżą u podstaw rozwoju tej tkanki u różnych gatunków.

Ograniczenia obejmują możliwość wycięcia interesującej tkanki oraz wielkość próbki. Analiza mocy pokazuje, że do uzyskania 80% mocy potrzeba zaledwie 70 końcówek ogonowych na warunek. Aby uzyskać taką liczbę zwierząt na tym samym etapie rozwoju, potrzebna jest ścisła synchronizacja rozwoju. W ten sposób opisano również metodę synchronizacji zwierząt w odstępach 1 godzin.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nicienie - szczególnie nicienie rasy Rhabditidae związane z systemem modelowym Caenorhabditis elegans - są wspaniałą grupą zwierząt dla ewolucyjnej biologii rozwojowej (EDB) z wielu powodów1,2. Do zalet należy niewielka liczba komórek, zdefiniowane i spójne linie komórkowe, przejrzystość oraz łatwość hodowli i hodowli. Dostępnych jest również wiele zasobów, w tym wysokiej jakości genomy dla wielu gatunków, a dla C. elegans, obszerne narzędzia genetyki molekularnej i wiedza na temat rozwoju, genetyki, anatomii i fizjologii3,4,5,6.

Podobnie jak w przypadku wielu innych organizmów, możliwość scharakteryzowania dynamiki transkryptomu w pojedynczych tkankach lub pojedynczych komórkach zrewolucjonizowała analizę rozwoju C. elegans7,8,9,10. Możliwość porównania transkryptomów pojedynczych komórek u nicieni w podobny sposób przekształciłaby EDB przy użyciu tych organizmów. Na przykład, takie porównania dostarczyłyby wglądu w to, jak ewoluowały sieci regulacji genów dla cech (cech), które zostały zachowane, dla cech, które się rozeszły, lub dla cech, które ewoluowały niezależnie.

Jednak izolowanie określonych tkanek lub komórek od nicieni jest jednym z największych wyzwań. W przypadku wielu organizmów pojedyncze komórki mogą być oddzielone od tkanek i zebrane w sposób bezstronny lub mogą być oznaczone specyficzną tkankowo ekspresją białka fluorescencyjnego i posortowane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)11. U C. elegans wysokoprzepustowa izolacja komórek (HTP) była ograniczona głównie do zarodków, ponieważ twardy zewnętrzny naskórek (i hydrostatyczny szkielet) utrudniał izolację komórek od larw i dorosłych. Aby obejść ten problem, w niektórych metodach zastosowano narzędzia genetyczne u całych robaków C. elegans, takie jak specyficzne tkankowo znakowanie mRNA12 oraz porównania różnicowych ekspresji między typem dzikim a mutantami wpływającymi na typ komórki13. Nowsze metody pozwoliły przezwyciężyć to wyzwanie, rozpuszczając naskórek w celu wyizolowania jąder14 lub całych komórek8,9,15. Izolacja komórek i hodowla komórkowa mają jednak oczywiste wady, że komórki są usuwane ze swojego naturalnego kontekstu rozwojowego lub anatomicznego - np. z dala od sygnalizacji komórka-komórka i kontaktu z macierzą zewnątrzkomórkową - co ma wpływać na profil ekspresji genów15. Co więcej, narzędzia genetyczne i markery specyficzne dla tkanek są specyficzne dla gatunku (tj. mogą być stosowane tylko u C. elegans).

LMD zapewnia alternatywną metodę izolowania tkanek bez zakłócania naturalnego kontekstu komórek. Co istotne w przypadku EDB, LMD umożliwia również porównywanie transkryptomów z homologicznych tkanek różnych gatunków bez konieczności stosowania specyficznych dla gatunku zestawów narzędzi genetycznych, jeśli dostępne są sekwencje genomu lub całego transkryptomu tych gatunków. LMD polega na celowaniu w tkanki poprzez bezpośrednią obserwację mikroskopową i użycie mikrowiązki laserowej - zintegrowanej z optyką mikroskopu - w celu wycięcia i zebrania (przechwycenia) interesującej nas tkanki16. Ograniczenia LMD polegają na tym, że nie sprzyja on bardzo metodom HTP (chociaż profile transkrypcji dla końcówek ogonowych, jak opisano w tym protokole, były solidne przy ~ 70 próbkach), niektóre próbki mogą być trudne do wypreparowania, a cięcia są ograniczone do precyzji lasera i tego, co można zobrazować w mikroskopie.

Celem obecnego protokołu jest opisanie w jaki sposób LMD, a następnie sekwencja RNA pojedynczej tkanki, może być wykorzystana do uzyskania danych transkryptomu specyficznych dla etapu i tkanki od nicieni. W szczególności demonstruje LMD do izolowania końcówek ogonów od larw czwartego stadium (L4) C. elegans. Jednak tę metodę można dostosować do innych tkanek i oczywiście różnych gatunków.

U C. elegans istnieją 4 komórki, które tworzą końcówkę ogona zarówno u samców, jak i hermafrodytów. Podczas stadium L4 u samców - ale nie u hermafrodytów - komórki końca ogona zmieniają swój kształt i migrują do przodu i do wewnątrz. Proces ten zachodzi również u niektórych, ale nie wszystkich innych gatunków nicieni rabditydów. Dlatego końcówka ogona jest dobrym modelem dla ewolucji dymorfezy płciowej. Ze względu na swoje położenie, końcówka ogona jest również łatwa do odizolowania za pomocą LMD.

Aby uzyskać profile transkryptomu z końcówek ogona, obecny protokół wykorzystuje CEL-Seq2, metodę sekwencyjną RNA opracowaną dla pojedynczych komórek17,18. Metoda ta ma kilka zalet w przypadku tkanek pochodzących z LMD. CEL-Seq2 jest bardzo czuły i wydajny, wykorzystuje unikalne identyfikatory molekularne (UMI), aby umożliwić prostą kwantyfikację odczytów mRNA, transkrypcję in vitro w celu zapewnienia liniowej amplifikacji oraz kodowanie kreskowe, które umożliwia multipleksowanie pojedynczych próbek tkanek. Jedynym ograniczeniem CEL-Seq2 jest to, że odzyskane odczyty są stronnicze do końca 3' mRNA, a zatem nie można rozróżnić większości izoform.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synchronizacja robaków

UWAGA: Poniżej opisano dwie metody synchronizacji rozwoju C. elegans i innych gatunków rhabditidae.

  1. Zsynchronizować przez zatrzymanie pierwszego stadium larwalnego (L1) po leczeniu alkalicznym podchlorynem (wybielaczem).
    UWAGA: Ta metoda została wcześniej szczegółowo opisana19. Metoda ta opiera się na dwóch cechach C. elegans, które są również prawdziwe dla kilku innych gatunków rabditidae: (1) Skorupka jaja jest odporna na wybielanie, podczas gdy naskórek otaczający dorosłe i larwalne robaki nie jest. (2) Pierwsze stadium rozwoju larw hamuje rozwój, gdy są trzymane bez jedzenia20.
    1. Traktuj gravidy hermafrodyty (lub samice) rozcieńczonym roztworem wybielacza, aby rozbić ich naskórek i uwolnić zarodki.
    2. Usuń zarodki z wybielacza i trzymaj je bez jedzenia, aż wyklują się wszystkie L1.
    3. Umieść zatrzymany L1 na jedzeniu, gdzie wszystkie wznawiają rozwój mniej więcej w tym samym czasie.
      UWAGA: Wyjście z aresztu L1 może nastąpić w ciągu jednej godziny.
  2. Synchronizacja z metodą "hatch-off" (używaną tutaj; Rysunek 1 góra):
    UWAGA: Metoda hatch-off pozwala na ścisłą synchronizację bez zakłócania rozwoju (zatrzymanie L1 wpływa na rozwój nawet późniejszych etapów21). Protokół został zaadaptowany z Pepper et al.22. Celem tej metody jest pobranie L1, które wykluły się w określonym czasie, z płytki zawierającej tylko zarodki.
    1. Wybierz matki: Wieczorem przed wykonaniem wylęgu zbierz ~30 grawitacyjnych hermafrodytów na talerz wysiany E. coli OP50.
    2. Inkubować w temperaturze 25 °C w celu złożenia jaj przez noc.
      UWAGA: Wybierz płytę bez pęknięć i pęcherzyków, w których mogłyby utknąć robaki. Unikaj talerzy z bardzo grubym trawnikiem bakteryjnym, ponieważ później trudno będzie usunąć wszystkie robaki. Jeśli pracujesz ze szczepem wrażliwym na temperaturę, dostosuj czas składania jaj, aby uwzględnić dłuższą embriogenezę. Wybieraj matki na maksymalnym etapie składania jaj.
    3. Usuń matki i larwy: następnego ranka, pod mikroskopem preparacyjnym (20-krotne powiększenie), delikatnie nanieś pipetą 1-2 ml buforu M9 na ściankę płytki bez spryskiwania; zakręć płytką, aby usunąć robaki.
    4. Usuń i wyrzuć wszystkie płyny i robaki, przykładając końcówkę pipety do ścianki płytki na krawędzi agaru, aby uniknąć wybijania. Sprawdź, czy na talerzu nie pozostały żadne robaki (a jedynie jaja/zarodki), zwłaszcza L1; W przeciwnym razie powtórz pranie.
    5. Umieścić płytkę w temperaturze 25 °C na 1 godzinę i poczekać, aż wyklują się niektóre L1.
    6. Zebrać nowo wyklute L1: ostrożnie upuść 1 ml buforu M9 na agar. Zakręć płytką, aby usunąć L1, ale nie zarodki. Delikatnie odpipetować bufor i robaki do probówki wirówkowej o pojemności 1 ml.
    7. Odwirować probówkę przez 1 minutę przy ~18 000 × g. Usunąć supernatant.
    8. Pipetę L1 należy nanieść bezpośrednio na trawnik bakteryjny na talerzu z nasionami. Sprawdź pod mikroskopem preparacyjnym, czy nie ma dorosłych robaków lub zarodków.
    9. Przechowywać robaki w temperaturze 25 °C, aż osiągną pożądany etap.
      UWAGA: Jeśli warunki są optymalne, można pobrać dwie dodatkowe partie L1 z tej samej płytki. Sprawdź płytkę początkową, aby upewnić się, że nie ma L1. W razie potrzeby umyj ponownie. Powtórz kroki 1.2.5-1.2.9.
    10. Sprawdź czas rozwoju. Przed przystąpieniem do dalszej aplikacji sprawdź niektóre robaki pod mikroskopem złożonym przy 400-krotnym powiększeniu, aby potwierdzić, że osiągnęły pożądany etap rozwoju, tutaj L3.
      UWAGA: Odległość migracji dystalnych komórek wierzchołkowych lub komórek łącznikowych może być wykorzystana jako wskazówka, oprócz rozwoju sromu. Jeśli chodzi o rozwój sromu, Mock et al.23 dostarczają użytecznego przewodnika, chociaż czas w tym badaniu został określony na 20 °C. W temperaturze 25 °C C. elegans typu dzikiego przechodzą linienie L3-L4 24 godziny po wykluciu.

2. Zbieranie samców L4 i hermafrodytów oraz fiksacja

  1. Przygotować wolny od RNAzy, zimny (-20 °C), 70% metanol przed utrwaleniem.
  2. Pod mikroskopem preparacyjnym przy 30-50-krotnym powiększeniu zacznij wybierać samce i hermafrodyty z płytek synchronizacyjnych na oddzielne płytki bez nasion, gdy tylko będzie można rozróżnić płcie (~21 godzin po wykluciu, Ryc. 2) i kontynuuj zbieranie przez 1-2 godziny lub do momentu zebrania 200 zwierząt.
  3. Utrzymuj robaki w temperaturze 25 °C, aż osiągną pożądany etap eksperymentu.
  4. Zmyj robaki z płytki 1-2 ml buforu M9 za pomocą końcówki pipety wstępnie umytej buforem M9 zawierającym 0,01% detergentu (aby zapobiec przywieraniu robaków do końcówki).
  5. Przenieś robaki do probówki wirówkowej o pojemności 1 ml.
  6. Wiruj przez 1 minutę z prędkością 21 000 × g, aby ogranulować robaki. Usunąć supernatant.
  7. Dodaj 1 ml buforu M9 i wymieszaj, aby rozbić osad.
  8. Wiruj przez 1 minutę z prędkością 21 000 × g, aby ogranulować robaki. Usunąć supernatant.
  9. Powtórz pranie.
  10. Dodaj 1 ml lodowatego 70% metanolu i dobrze wymieszaj.
  11. Wiruj przez 1 minutę z prędkością 21 000 × g, aby ogranulować robaki. Usunąć supernatant.
  12. Powtórz kroki 2.10 i 2.11.
  13. Dodać 500 μl 70% metanolu, wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę do nocy.

3. Mikrodysekcja laserowa

UWAGA: Od teraz używaj odczynników i materiałów eksploatacyjnych wolnych od RNaz; używaj końcówek filtrujących.

  1. Jeżeli do przetwarzania próbek stosuje się metodę CEL-Seq2, należy przygotować mieszankę wzorcową dla każdego startera CEL-Seq2 (tabela uzupełniająca S1): odpipetować 2 μl startera CEL-Seq2, 1 μl 10 mM dNTP i 9 μl 1% β-merkaptoetanolu (w wodzie wolnej od RNazy) do oznakowanej probówki o pojemności 200 μl.
  2. Montaż na suwaku
    1. Pod mikroskopem preparacyjnym odpipetować 20 μl nieruchomych ślimaków (20-40 robaków z kroku 2.13) na matową stronę szkiełka podstawowego z membraną z naftalanu etylenu (PEN) (w miejscu, gdzie znajduje się membrana).
    2. Poczekaj, aż metanol wyparuje. Użyj podgrzewacza do slajdów, aby przyspieszyć parowanie.
      UWAGA: Można nałożyć dodatkowe krople metanolu i użyć końcówki pipety do rozprowadzenia robaków, jeśli zaczną się zbrylać podczas wysychania. Kiedy robaki są w kępach, mogą być trudne do wycięcia.
  3. Ustawianie mikroskopu
    UWAGA: Poniższy protokół jest specyficzny dla instrumentu wymienionego w Tabeli materiałów. Należy go wyregulować, jeśli używany jest inny mikroskop LMD.
    1. Umieść nawilżacz biurkowy za stage z boku mikroskopu LMD. Upewnij się, że para wydmuchuje się bezpośrednio na scenę.
      UWAGA: Nawilżacz jest pomocny w zmniejszaniu elektryczności statycznej, która w przeciwnym razie może zapobiec wpadnięciu małej części membrany do nasadki rurki.
    2. Przekręć kluczyk zasilania lasera.
    3. Włącz zasilanie sterowania stage.
    4. Włącz skrzynkę kontrolną mikroskopu.
    5. Otwórz oprogramowanie do mikrodysekcji laserowej.
    6. Zdejmij plastikową osłonę ze stolika.
    7. Kliknij przycisk rozładunku ze strzałką w górę, aby załadować szkiełka membranowe.
    8. Upewnij się, że szkiełko jest całkowicie suche, odwróć tak, aby membrana była skierowana w dół.
    9. Wstaw slajd i kliknij przycisk Kontynuuj w oknie zmiany próbki.
    10. Wymień plastikową osłonę.
    11. U dołu ekranu wybierz uchwyt slajdu, w którym znajduje się slajd.
    12. Aby załadować rury, kliknij przycisk rozładowywania ze strzałką w dół.
    13. Wyciągnij tackę i wyjmij blok probówki.
      UWAGA: Blok probówki używany w tym eksperymencie jest przeznaczony do probówek PCR o pojemności 500 μl.
    14. Włóż nakrętki probówek z probówkami PCR o pojemności 500 μl do uchwytu i złóż probówkę pod spodem.
    15. Umieść blok z powrotem na tacy i wsuń tacę z powrotem do stolika mikroskopu.
    16. W wyskakującym oknie urządzenia kolektora zmian wybierz probówki PCR i kliknij ok.
    17. Kliknij pustą rurkę w lewym dolnym rogu ekranu pod zaślepkami rurki urządzenia kolektora.
    18. Na panelu sterowania mikroskopu wybierz TL-BF dla oświetlenia jasnego pola światła przechodzącego.
  4. Cięcie
    UWAGA: Ten protokół jest specyficzny dla przyrządu wymienionego w Tabeli materiałów.
    1. Używając obiektywu 2.5x, dostosuj ostrość, aż robaki i struktura membrany będą widoczne.
    2. Przełącz się na obiektyw 20x.
    3. Przenieś scenę do regionu, w którym nie ma robaków. Dostosuj ostrość tak, aby struktury przypominające pęcherzyki w membranie miały żółtawy kolor ( Rysunek 3A, B), aby ustawić ostrość lasera na właściwej płaszczyźnie ogniskowej.
    4. Ustaw parametry lasera; dla końcówek ogonowych zacznij od mocy 45, przysłony 30 i prędkości 20.
    5. W panelu sterowania lasera wybierz opcję kalibracji. Postępuj zgodnie z instrukcjami.
      UWAGA: Przyrząd wykona ten krok automatycznie. Zapewni to, że kształt narysowany myszką na ekranie będzie identyczny z kształtem wyciętym przez laser.
    6. U dołu ekranu przy zaślepkach rurki urządzenia kolektora kliknij pozycję A.
    7. Po prawej stronie ekranu wybierz pojedynczy kształt | Rysowanie + Cięcie. Po lewej stronie ekranu wybierz opcję PtoP.
    8. Narysuj linię.
    9. Kliknij przycisk Start Cut, aby laser przeciął membranę.
      UWAGA: Może również wytrawić linię w szkle.
    10. Jeśli to próbne cięcie wygląda dobrze (membrana jest przecięta, krawędzie cięcia wyglądają na gładkie), przejdź do następnego kroku. W przeciwnym razie dostosuj ostrość i wytnij kolejną linię.
    11. Znajdź robaka. Przełącz się na Move + Cut i użyj myszy, aby przeciąć ogon.
      UWAGA: Jeśli laser nie przecina ogona, wyreguluj ostrość i zwiększ moc lasera. W przypadku grubszych tkanek może być konieczne ustawienie mocy lasera na 60.
    12. Zapisz parametry: zakładka Plik | Zapisz konfigurację aplikacji; w celu późniejszego odzyskania przywróć konfigurację aplikacji.
    13. Aby pobrać próbkę, przełącz się na ustawienie Rysuj + Wytnij z funkcją PtoP i narysuj kształt, aby zakończyć cięcie sekcji membrany (Rysunek 3C).
      UWAGA: Większe sekcje membrany i sekcje w kształcie prostokątów lub trójkątów, a nie okręgów lub owali, są łatwiejsze do zlokalizowania w nasadce rurki kolektora.
    14. Wybierz następną rurkę w nasadce rurki urządzenia zbierającego u dołu ekranu i odetnij następną końcówkę ogona.
    15. Po wycięciu czterech ogonów rozładuj stojak na probówki (kliknij Rozładuj strzałką w dół) i znajdź sekcje membrany pod mikroskopem preparacyjnym (Rysunek 3D).
      UWAGA: Sekcje mogą znajdować się na środku nasadki rurki lub przyklejone z boku nasadki.
    16. Kontynuuj pracę z aplikacją podrzędną. W przypadku CEL-Seq2 odpipetować 1,2 μl głównej mieszanki startera CEL-Seq2 (od kroku 3.1) bezpośrednio na próbkę.
    17. Zamknij probówkę, oznacz etykietą numer startera i natychmiast umieść nakrętkę probówki bezpośrednio na kawałku suchego lodu, aby błyskawicznie zamrozić próbkę i zapobiec degradacji RNA.
    18. Załaduj więcej probówek, przywróć blok probówki na stolik i wytnij więcej próbek. Dodaj inną mieszankę podkładów CEL-Seq2 do każdej końcówki ogona.
    19. Przechowywać wszystkie probówki w temperaturze -70 °C.

4. Sekwencjonowanie RNA z pojedynczym ogonem za pomocą CEL-Seq2

UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat protokołu CEL-Seq2, zobacz Yanai i Hashimshony18.

  1. Oczyść obszar stołu laboratoryjnego roztworem do odkażania RNazy, aby zapobiec degradacji RNA.
  2. Przygotuj mieszanki wzorcowe i trzymaj je na lodzie.
    1. Przygotować główną mieszaninę odwrotnej transkrypcji: 0,4 μl buforu pierwszej nici, 0,1 μl 0,1 M DTT, 0,1 μl inhibitora RNazy i 0,1 μl odwrotnej transkryptazy na próbkę.
    2. Przygotować główną mieszankę reakcji drugiej nici: 7 μl wody, 2,31 μl buforu drugiej nici, 0,23 μl dNTP, 0,08 μl ligazy E. coli, 0,3 μl polimerazy DNA E. coli, 0,08 μl RNaseH na próbkę.
  3. Rozbijanie otwartych komórek i wyżarzanie za pomocą starterów (pełna lista starterów znajduje się w tabeli uzupełniającej S1):
    1. Zaprogramować termocykler i jego pokrywę na 65 °C.
    2. Pobrać próbki o temperaturze od -70 °C i inkubować je w termocyklerze przez 2,5 minuty.
    3. Wiruj z prędkością 21 000 × g przez 30-40 s.
    4. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 2,5 min.
    5. Przenieś je natychmiast do lodu.
    6. Wiruj z prędkością 21 000 × g przez 30-40 s i włóż je z powrotem do lodu.
  4. Przekształcanie RNA w cDNA:
    1. Dodaj 0,8 μl mieszanki do odwrotnej transkrypcji do każdej końcówki ogona.
    2. Inkubować w temperaturze 42 °C przez 1 godzinę.
    3. Inaktywacja termiczna w temperaturze 70 °C przez 10 min.
    4. Natychmiast przenieś go na lód.
    5. Dodaj 10 μl mieszanki drugiej nici do każdej końcówki ogona.
    6. Przesuń próbki.
    7. Wiruj z prędkością 21 000 × g przez 30-40 s.
    8. Inkubować w temperaturze 16 °C przez 2 godziny.
  5. Oczyszczanie cDNA:
    1. Podgrzej kulki do oczyszczania DNA do temperatury pokojowej.
    2. Zebrać do 40 próbek w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml (do 480 μl).
    3. Wymieszać kulki do momentu, aż będą dobrze rozproszone i dodać 20 μl kulek i 100 μl buforu do wiązania kulek na każde 100 μl próbki zbiorczej (na 480 μl próbki dodać 480 μl buforu perełkowego i 96 μl kulek do końcowej objętości do 1,056 μl). Dobrze wymieszać przez pipetowanie.
    4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    5. Umieść na stojaku magnetycznym na co najmniej 5 minut, aż płyn stanie się klarowny.
    6. Usunąć i wyrzucić wszystkie substancje sklarowane nad osadem z wyjątkiem 20 μl.
    7. Dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu.
    8. Inkubować przez co najmniej 30 s, usunąć supernatant przez pipetowanie go bez naruszania kulek. Odrzucić supernatant.
    9. Powtórz kroki 4.5.7 i 4.5.8 jeden raz.
    10. Suszyć koraliki na powietrzu przez 15 minut lub do całkowitego wyschnięcia.
    11. Ponownie zawiesić kulki (~6,4 μL) w 6,4 μL wody. Dokładnie wymieszać, pipetując całą objętość w górę i w dół dziesięć razy.
    12. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
    13. Przejdź bezpośrednio do transkrypcji in vitro (IVT).
  6. Transkrypcja i fragmentacja in vitro:
    1. Do probówki zawierającej 6,4 μl próbki i kulek dodać następującą mieszaninę (łącznie 9,6 μl): 1,6 μl 10x buforu T7, 1,6 μl ATP, 1,6 μl UTP, 1,6 μl CTP i 1,6 μl GTP (każdy dNTP przy stężeniu 75 mM) 1,6 μl enzymu T7.
    2. Inkubować przez 13 godzin w temperaturze 37 °C w uchwycie w temperaturze 4 °C.
    3. Dodać 6 μl roztworu egzonukleazy (końcowa objętość powinna wynosić 22 μl).
    4. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
    5. Umieścić probówkę z powrotem na lodzie i dodać 5,5 μl buforu do rozdrobnienia (0,25 × objętości reakcji).
    6. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze 94 °C.
    7. Natychmiast umieścić probówkę na lodzie i dodać 2,75 μl buforu zatrzymującego rozdrobnienie (0,5 × objętości dodanego buforu do fragmentacji).
    8. Usuń koraliki, umieszczając rurkę na stojaku magnetycznym na co najmniej 5 minut, aż płyn stanie się przezroczysty.
    9. Przenieść supernatant do nowej probówki.
  7. Oczyszczanie amplifikowanego RNA (aRNA):
    1. Rozgrzej kulki czyszczące RNA do temperatury pokojowej.
    2. Mieszaj koraliki, aż będą dobrze rozproszone.
    3. Odpipetować 55 μl kulek (1,8 × objętości reakcyjnej).
    4. Inkubuj je w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    5. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na co najmniej 5 minut, aż płyn stanie się klarowny.
    6. Usunąć i wyrzucić 80 μl supernatantu.
    7. Dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 70% etanolu.
    8. Inkubować przez co najmniej 30 s, usunąć supernatant przez pipetowanie, nie naruszając kulek. Odrzucić supernatant.
    9. Powtórz mycie etanolem jeszcze dwa razy.
    10. Suszyć koraliki na powietrzu przez 15 minut lub do całkowitego wyschnięcia.
    11. Ponownie zawiesić kulki w 7 μl wody. Odpipetuj całą objętość w górę i w dół 10 razy, aby dokładnie wymieszać.
    12. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
    13. Umieść rurkę z koralikami na stojaku magnetycznym na 5 minut, aż płyn stanie się klarowny.
    14. Przenieść supernatant do nowej probówki.
      UWAGA: Punkt zatrzymania: próbki można przechowywać w temperaturze -70 °C.
  8. Opcjonalnie: Sprawdź ilość i jakość aRNA za pomocą automatycznego systemu elektroforezy zgodnie z protokołem producenta.
  9. Przygotowanie biblioteki:
    1. Do 5 μl RNA dodać 1 μl 100 μM losowego startera heksamerowego RT (patrz tabela materiałów) i 0,5 μl 10 mM dNTP.
    2. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut.
    3. Dodać 4 μl następującej mieszanki w temperaturze pokojowej: 2 μl buforu pierwszej nici, 1 μl 0,1 M DDT, 0,5 μl inhibitora RNazy, 0,5 μl odwrotnej transkryptazy.
    4. Inkubować w temperaturze 25 °C przez 10 minut.
    5. Inkubować w temperaturze 42 °C przez 1 godzinę (w piecu do hybrydyzacji lub nagrzanym termocyklerze z pokrywką ustawioną na 50 °C).
    6. Inkubować w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
    7. Przenieść 5 μl do nowej probówki (resztę reakcji utrzymać w temperaturze -20 °C). Dodaj 5,5 μl ultraczystej wody, 1 μl RNA PCR Primer (RP1), 1 μl indeksowanego RNA PCR Primer (RPIX) i 12,5 μl mieszanki PCR.
    8. Użyj następującego programu w termocyklerze: 30 s w 98 °C, 11 cykli: (10 s w 98 °C, 30 s w 60 °C, 30 s w 72 °C), 10 min w 72 °C, przytrzymaj w 4 °C.
      UWAGA: Punkt zatrzymania: próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C.
  10. Czyszczenie biblioteki:
    1. Podgrzej kulki do oczyszczania DNA do temperatury pokojowej.
    2. Mieszaj koraliki, aż będą dobrze rozproszone.
    3. Dodać 25 μl kulek do reakcji PCR. Dobrze wymieszać przez pipetowanie.
    4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    5. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na co najmniej 5 minut, aż płyn stanie się klarowny.
    6. Usunąć i wyrzucić 45 μl supernatantu.
    7. Dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu.
    8. Inkubować przez co najmniej 30 s, usunąć i wyrzucić supernatant bez naruszania kulek.
    9. Powtórz płukanie etanolem raz.
    10. Kulki suszyć na powietrzu przez 15 minut lub do całkowitego wyschnięcia.
    11. Zawiesić je ponownie w 25 μl wody. Dobrze wymieszać przez pipetowanie.
    12. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
    13. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 5 minut, aż płyn stanie się klarowny.
    14. Przenieść 25 μl supernatantu do nowej probówki.
    15. Powtórz kroki 4.10.2-4.10.10 raz.
    16. Zawiesić ponownie z 10,5 μl wody. Dobrze wymieszać przez pipetowanie.
    17. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
    18. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 5 minut, aż płyn stanie się klarowny.
    19. Przenieść 10 μl supernatantu do nowej probówki i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  11. Oceń jakość i ilość biblioteki zgodnie z wymaganiami urządzenia do sekwencjonowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po mikrodysekcji laserowej, indywidualne końcówki ogonów samców i hermafrodytów w 4 punktach czasowych (L3 22 h po wykluciu; L4 24, 26 i 28 h after hatch) przygotowano do sekwencjonowania RNA z wykorzystaniem protokołu CEL-Seq2. Startery CEL-Seq2 zawierają unikalne kody kreskowe, które umożliwiają sekwencjonowanie odczytów z określonej próbki (w tym przypadku pojedynczej końcówki ogona) w celu bioinformatycznej identyfikacji. Tą metodą wygenerowano dane sekwencjonowania dla łącznie 557 końcówek ogonów (266 hermafrodytów ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krytyczne etapy metody
Jeśli zostanie wykonana prawidłowo, opisana tutaj metoda pozwoli uzyskać solidne profile RNA przy stosunkowo niewielkiej liczbie próbek wypreparowanych laserowo (w tym przykładzie 70 końcówek ogona). Jednak w przypadku próbek pochodzących od rozwijających się zwierząt ścisła synchronizacja ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia zmienności między próbkami. Z tego powodu protokół zaleca metodę hatch-off do synchronizacji robaków. Tutaj badacz może określić i precyzyjnie kontrolo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez granty NIH (R01GM141395) i NSF (1656736) dla DF oraz stypendium NIH (F32GM136170) dla AW. Rysunek 1 został stworzony przy pomocy BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  0,5 &mikro; Szkiełka szklane z membraną M PEN bez RNazLeica11600288do LMD
500 i micro; L Probówki PCR (bez nukleaz)Axygen732-0675do cięcia końcówek ogona w
Mikroskop złożony z obiektywem 40x i DICdowolnydo sprawdzania wieku robaków
Nawilżacz biurkowydowolny
mikroskop preparacyjny z podstawą światła przechodzącegodowolnydo wszystkich prac ślimakowych
szklane pipety Pasteuradowolnyuchwyt kilofa ślimakowego
szkiełka podstawowe i nakrywkowedosprawdzania wieku robaków
System mikrodysekcji LMD6Leicawielokrotnośćdo cięcia końcówek ogonowych
Probówki LoBind 0,5 mlReceptura
M9w WormBook
Biologicznei sole N1000należy dodać: Przepis w WormBook
P10 płynna objętość pipety, np. Gilson
P1000 pipeta o zmiennej objętościnp. Gilson
P2 pipeta o zmiennej objętościnp. Gilson
Końcówki do pipet 1,000 i mikro; Ldowolna
końcówka do pipet 1-10 i mikro; L przefiltrowałdowolny
drut platynowo-irydowyTritechPT-9010aby wytrychy ślimakowe
sterylne i wolne od nukleaz 1 ml probówki wirówkowedowolne
Tween 20SigmaP9416Dodaj bardzo małą ilość do bufora M9, aby zapobiec przywieraniu robaków do końcówek pipet
wentylowane plastikowe szalki Petriego o średnicy 6 mmdowolne
Do systemu CEL-Seq2
4200 TapeStation z odczynnikami do bardzo czułej detekcji RNA i DNAAutomatyczny system elektroforezyAligent
Kulki AMPure XPoczyszczające DNABeckman CoulterA63880
Bufor wiążący koraliki  20% PEG8000, 2,5 M
CEL-Seq2 (patrz tabela S1)Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf6335000020Termocykler z programowalną pokrywą i blokiem dla 200 &mikro; l rury.
Polimeraza DNA I (E. coli)Invitrogen18052-025
dNTP mix 10 mMany
E. coli Ligaza DNAInvitrogen18052-019
Etanol
ExoSAP-IT do oczyszczania produktu PCRAffymetrix78200roztwór egzonukleazy
MEGAscript T7 Zestaw do transkrypcjiAmbionAM1334Dla kroku 4.6.1
Woda wolna od nukleazdowolna
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix z buforem HFNEBM0531PCR mix krok 4.9.7
losowy starter hexamer RT GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
NNNNNN		IDTstarter z 6 nukleotydami, które są losowe
Bufor fragmentacji RNANEBE6150S
Bufor zatrzymujący fragmentację RNANEBE6150S
RNA PCR Index Primers (RPI1– RPI48)Illumina, NEB lub IDTRPIX w kroku 4.9.7 protokołu, sekwencje dostępne w koralikach Illumina
RNAClean XPBeckman CoulterA63987
RNase AWAY Surface DeminazinantThermo Scientific7000TS1lub inny podobny produkt
RNaseH (E. coli)Invitrogen18021-071
RNaseOUT Rekombinant Inhibitor rybonukleazyInvitrogen10777-019
Bufor drugiej niciInvitrogen10812-014
Superscripit IIInvitrogen18064-014odwrotna transkryptaza
bufora Eppendorf 22431005 Metanol 99,8% Sigma 322415 do naprawy robaków Podłoże wzrostowe NGM US , , , były Kulki Startery NaCl

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haag, E. S., Fitch, D. H. A., Delattre, M. From "the worm" to "the worms" and back again: the evolutionary developmental biology of nematodes. Genetics. 210 (2), 397-433 (2018).
  2. Sommer, R. J., Bumbarger, D. J. Nematode model systems in evolution and development. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (3), 389-400 (2012).
  3. WormBase. , Available from: https://wormbase.org/#012-3-6 (2022).
  4. WormAtlas. , Available from: https://wormatlas.org (2022).
  5. WormBook. , Available from: http://wormbook.org (2022).
  6. WormBook in Genetics. , Available from: https://academic.oup.com/genetics/pages/wormbook (2022).
  7. Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  8. Kaletsky, R., Murphy, C. T. Transcriptional profiling of C. elegans adult cells and tissues with age. Methods in Molecular Biology. 2144, 177-186 (2020).
  9. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), 1007559(2018).
  10. Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single-cell resolution. Science. 365 (6459), 1971(2019).
  11. Kulkarni, A., Anderson, A. G., Merullo, D. P., Konopka, G. Beyond bulk: a review of single cell transcriptomics methodologies and applications. Current Opinion in Biotechnology. 58, 129-136 (2019).
  12. Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome Biology. 8 (7), 135(2007).
  13. Baugh, L. R., et al. The homeodomain protein PAL-1 specifies a lineage-specific regulatory network in the C. elegans embryo. Development. 132 (8), 1843-1854 (2005).
  14. Haenni, S., et al. Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3'-end-seq. Nucleic Acids Research. 40 (13), 6304-6318 (2012).
  15. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS One. 6 (4), 19505(2011).
  16. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  17. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77(2016).
  18. Yanai, I., Hashimshony, T. CEL-Seq2-single-cell RNA sequencing by multiplexed linear amplification. Methods in Molecular Biology. 1979, 45-56 (2019).
  19. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e4019(2012).
  20. Baugh, L. R. To grow or not to grow: nutritional control of development during Caenorhabditis elegans L1 arrest. Genetics. 194 (3), 539-555 (2013).
  21. Baugh, L. R., Hu, P. J. Starvation responses throughout the Caenorhabditis elegans life cycle. Genetics. 216 (4), 837-878 (2020).
  22. Pepper, A. S., Killian, D. J., Hubbard, E. J. Genetic analysis of Caenorhabditis elegans glp-1 mutants suggests receptor interaction or competition. Genetics. 163 (1), 115-132 (2003).
  23. Mok, D. Z., Sternberg, P. W., Inoue, T. Morphologically defined sub-stages of C. elegans vulval development in the fourth larval stage. BMC Developmental Biology. 15, 26(2015).
  24. Lytal, N., Ran, D., An, L. Normalization methods on single-cell RNA-seq data: an empirical survey. Frontiers in Genetics. 11, 41(2020).
  25. Vieth, B., Ziegenhain, C., Parekh, S., Enard, W., Hellmann, I. powsimR: power analysis for bulk and single cell RNA-seq experiments. Bioinformatics. 33 (21), 3486-3488 (2017).
  26. Bolkova, J., Lanctot, C. Quantitative gene expression analysis in Caenorhabditis elegans using single molecule RNA FISH. Methods. 98, 42-49 (2016).
  27. Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. , 1-16 (2012).
  28. Lee, C., et al. Single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 7 (12), 2357(2017).
  29. Baird, S. E., Chamberlin, H. M. Caenorhabditis briggsae methods. WormBook. , 1-9 (2006).
  30. Felix, M. A. Oscheius tipulae. WormBook. , 1-8 (2006).
  31. Han, Z., et al. Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes. Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).
  32. Fernandes Povoa, E. E., Ebbing, A. L. P., Betist, M. C., vander Veen, C., Korswagen, H. C. An optimized dissociation protocol for FACS-based isolation of rare cell types from Caenorhabditis elegans L1 larvae. MethodsX. 7, 100922(2020).
  33. Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression. BMC Genomics. 20 (1), 500(2019).
  34. Steiner, F. A., Henikoff, S. Cell type-specific affinity purification of nuclei for chromatin profiling in whole animals. Methods in Molecular Biology. 1228, 3-14 (2015).
  35. Ebbing, A. Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns. Developmental Cell. 47 (6), 801-813 (2018).
  36. Rödelsperger, C., et al. Spatial transcriptomics of nematodes identifies sperm cells as a source of genomic novelty and rapid evolution. Molecular Biology and Evolution. 38 (1), 229-243 (2021).
  37. Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

RNA pojedynczych kom rekprotok niezale ny od gatunkuizolacja tkankiko c wki ogon w nicieniCEL Seq2analiza ekspresji gen wmikroskop sekcyjnyszkie ko z membran PENsynchronizacja pr bek

Powiązane artykuły