Artykuł metodologiczny

Pełna, kontra subregionalna kwantyfikacja obciążenia beta-amyloidem w wycinkach mózgu myszy

DOI:

10.3791/63669

⸱

19 maja 2022

 ,  ,  ,  , 
1Henry E. Riggs School of Applied Life Sciences, Keck Graduate Institute, 2Crean College of Health and Behavioral Sciences, Chapman University, 3Keck Science Department, Claremont McKenna College, 4Department of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Chapman University, 5Department of Neurology, University of California, Irvine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje i porównuje procedurę przeprowadzania analizy całego regionu lub podregionu zainteresowania odcinków mózgu myszy strzałkowej w celu ilościowego określenia obciążenia beta-amyloidu w transgenicznym mysim modelu choroby Alzheimera APP/PS1.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zewnątrzkomórkowe nagromadzenie blaszek beta-amyloidu (Aβ) jest jedną z głównych patologicznych cech choroby Alzheimera (AD) i jest celem jedynej zatwierdzonej przez FDA terapii modyfikującej chorobę AD. W związku z tym, użycie transgenicznych modeli myszy, które nadmiernie eksprymują białko prekursorowe amyloidu i tym samym gromadzą płytki Aβ w mózgu, jest szeroko stosowane do modelowania ludzkiej choroby Alzheimera u myszy. Dlatego testy immunologiczne, w tym test immunoenzymatyczny (ELISA) i barwienie immunologiczne, zwykle mierzą obciążenie Aβ w tkankach mózgowych pochodzących od transgenicznych myszy z AD. Chociaż metody wykrywania i oznaczania ilościowego Aβ zostały dobrze ugruntowane i udokumentowane, nie zgłoszono wpływu wielkości obszaru zainteresowania wybranego w tkance mózgowej na pomiary obciążenia Aβ po barwieniu immunologicznym. W związku z tym obecny protokół miał na celu porównanie pomiarów obciążenia Aβ w pełnych i podobszarach zainteresowania za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Etapy związane z przygotowaniem tkanki mózgowej, swobodnym barwieniem immunologicznym sekcji mózgu, obrazowaniem i kwantyfikacją obciążenia Aβ w pełnych i podregionach zainteresowania opisano przy użyciu wycinków mózgu pochodzących od 13-miesięcznych podwójnie transgenicznych samców myszy APP / PS1. Obecny protokół i wyniki dostarczają cennych informacji na temat wpływu wielkości obszaru zainteresowania na kwantyfikację obszaru Aβ-dodatniego i wykazują silną korelację między obszarem Aβ-dodatnim uzyskanym przy użyciu analiz pełnych i podregionów zainteresowania dla odcinków mózgu pochodzących od 13-miesięcznych samców myszy APP/PS1, które wykazują rozległe odkładanie Aβ.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Alzheimera (AD), szósta najczęstsza przyczyna zgonów w Stanach Zjednoczonych, nadal stanowi zagrożenie dla zdrowia publicznego, z szacunkową liczbą 6,2 miliona Amerykanów żyjących z AD. Oczekuje się, że do 2060 roku liczba ta wzrośnie do 13,8 miliona1. Do tej pory leczenie objawowe za pomocą leków, takich jak inhibitory cholinoesterazy i memantyna, jest podstawowym sposobem leczenia2. AD charakteryzuje się objawami neuropatologicznymi, takimi jak zewnątrzkomórkowe odkładanie się blaszek beta-amyloidu (Aβ) i wewnątrzkomórkowa hiperfosforylowana akumulacja tau w postaci splątków neurofibrylarnych3,4. Utworzony przez endoproteolityczne rozszczepienie białka prekursorowego amyloidu (APP) za pośrednictwem beta- i gamma-sekretazy, Aβ agreguje się, tworząc oligomery i fibryle, prowadząc do skutków neurotoksycznych5. Przypuszcza się, że Aβ pełni główną rolę patologiczną od 1980 roku i jest celem terapeutycznym jedynej zatwierdzonej przez FDA terapii modyfikującej chorobę dla AD6. W rezultacie, transgeniczne modele myszy AD zawierające mutacje w genach skutkujące silną akumulacją Aβ w mózgu są szeroko stosowane w badaniach przedklinicznych nad AD od wczesnych lat 90. XX wieku7.

Wykrywanie gatunków Aβ w tych transgenicznych mózgach myszy AD odbywa się zazwyczaj za pomocą dwóch testów immunologicznych: testu immunoenzymatycznego (ELISA) i barwienia immunologicznego. Pierwszy test umożliwia ilościowe oznaczanie różnych gatunków Aβ i jest mniej czasochłonny w porównaniu z barwieniem immunologicznym, które wymaga kilku sekwencyjnych etapów przetwarzania i obrazowania tkanek, w tym sekcji tkanek, barwienia immunologicznego, obrazowania i kwantyfikacji8. Ponadto wyniki uzyskane po barwieniu immunologicznym są półilościowe8. Jednak zdolność do przestrzennej lokalizacji Aβ sprawia, że barwienie immunologiczne jest atrakcyjnym podejściem do wykrywania Aβ w tkankach mózgowych8.

Podczas korzystania z barwienia immunologicznego Aβ, różne grupy badawcze zastosowały kilka różnych paradygmatów kwantyfikacji. Na przykład niektóre grupy badawcze określają ilościowo obciążenie Aβ w całym obszarze zainteresowania (kora lub hipokamp), podczas gdy inne określają ilościowo obciążenie Aβ w określonym podregionie zainteresowania (część kory lub hipokampa)9,10,11. Chociaż metody wykrywania i oznaczania ilościowego Aβ zostały dobrze ugruntowane i udokumentowane, nie zgłoszono wpływu wielkości obszaru zainteresowania na pomiary obciążenia Aβ po barwieniu immunologicznym. W związku z tym obecny protokół miał na celu porównanie pomiarów obciążenia Aβ w pełnych i podobszarach zainteresowania za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, ImageJ.

W obecnym badaniu użyto 13-miesięcznych podwójnie transgenicznych samców myszy APP/PS1, które wykazują chimeryczną mysz/ludzką APP i zmutowaną presenilinę 1, do modelowania wczesnego początku AD12. Złogi Aβ zaczynają się rozwijać w wieku 6-7 miesięcy, a obfite nagromadzenie Aβ obserwuje się zarówno w korze, jak i hipokampie tych myszy w wieku 9-10 miesięcy12. Transgeniczne peptydy amyloidowe i holoproteina mogą być wykrywane przez 6E10-immunostaining13, co czyni go pożądanym modelem zwierzęcym dla obecnego protokołu. Procedura opisana w niniejszym dokumencie obejmuje preparację tkanki mózgowej, barwienie immunologiczne swobodnie pływających odcinków, obrazowanie i kwantację obciążenia Aβ w pełnych i podregionach będących przedmiotem zainteresowania. Analiza wykazuje silną korelację między kwantyfikacją pełno- i subregionalną, co wskazuje na solidną zgodność między tymi dwiema metodami w sekcjach tkanki mózgowej pochodzących od 13-miesięcznych samców myszy APP/PS1, które wykazują obfite złogi Aβ.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Uniwersyteckimi Zasobami Laboratoryjnymi Zwierząt zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Uniwersytet Kalifornijski w Irvine, Institutional Animal Care and Use Committee. Eksperymenty przeprowadzono na samcach myszy B6C3-Tg(APPswe, PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax (APP/PS1) (13-miesięcznych, n = 35). Myszy pozyskano ze źródeł komercyjnych (patrz tabela materiałów).

1. Przygotowanie tkanki mózgowej

  1. Znieczulić myszy za pomocą śmiertelnej dawki środka znieczulającego na bazie fenytoiny/pentobarbitalu (150 mg/kg) wstrzykiwanego dootrzewnowo (patrz tabela materiałów) zgodnie z zatwierdzonymi protokołami dla zwierząt. Wykonuj perfuzję serca lodowato zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (1x PBS) przez 5 minut z prędkością 5 ml / min, aby oczyścić naczynia krwionośne mózgu14.
  2. Zbierz tkankę mózgową zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem15, rozdziel na lewą i prawą półkulę mózgu i umieść prawą półmózg każdej myszy w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml świeżo przygotowanego 4% roztworu paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS przez 72 godziny w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Mózgi mogą być utrwalone w zanurzeniu od 24 do 72 godzin, w zależności od badanego antygenu. Lewa półmózgówka, bez móżdżku, może zostać zamrożona w ciekłym azocie, a następnie przechowywana w temperaturze -80 °C, a następnie przetworzona do testów biochemicznych, takich jak ELISA i biochemiczne wykrywanie Aβ16.
    UWAGA: PFA jest prawdopodobnym czynnikiem rakotwórczym, a kontakt skóry z PFA może prowadzić do objawów alergicznych skóry. Do obsługi używaj rękawiczek nitrylowych lub butylowych, masek i okularów ochronnych i przygotuj pod wyciągiem chemicznym.
  3. Po inkubacji w 4% PFA, inkubować półmózgi sekwencyjnie w 5 ml 10%, 20% i 30% roztworów sacharozy przygotowanych w 1x PBS przez 24 godziny, każdy w temperaturze 4 °C, aż tkanka mózgowa opadnie na dno stożkowej rurki.
  4. Po inkubacji w 30% roztworze sacharozy, usuń półmózg, delikatnie przetrzyj mózg na bibule filtracyjnej, aby usunąć nadmiar roztworu sacharozy, i zamroź utrwalony półmózg w sproszkowanym suchym lodzie na 30 minut. Przechowuj zamrożony półmózg w dobrze oznakowanych foliach aluminiowych w temperaturze -80 °C do kriosekcji.
    UWAGA: W obecnym protokole półmózgi były przechowywane w temperaturze -80 °C przez 6-8 miesięcy.
  5. Podziel zamrożony półmózg na skrawki o grubości 20 μm za pomocą kriostatu (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: W obecnym protokole półmózgowie zostały podzielone na sekcje strzałkowe, a w razie potrzeby można również przygotować przekroje koronalne17. Krok 2 służy do barwienia immunofluorescencyjnego Aβ na utrwalonych i kriochronionych próbkach tkanki mózgowej.

2. Immunofluorescencja

  1. Umieść strzałkowe skrawki tkanki mózgowej (krok 1.5) na 24-dołkowej płytce (do sześciu skrawków mózgu myszy na 300 μl na studzienkę). Myć przez 5 minut z 1x PBS trzy razy w temperaturze pokojowej (23 °C), umieszczając płytkę na shakerze z delikatnym obracaniem.
  2. Inkubować skrawki tkanki mózgowej z 70% kwasem mrówkowym w dH20 w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    UWAGA: Kwas mrówkowy jest, dlatego należy unikać kontaktu ze skórą i oczami.
  3. Myj skrawki tkanki mózgowej przez 5 minut dH20 trzy razy w temperaturze pokojowej.
  4. Zablokuj niespecyficzne wiązanie z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 0,3% TritonX 100 (patrz tabela materiałów) w 1x PBS w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  5. Inkubować skrawki tkanki mózgowej z pierwszorzędowym przeciwciałem znakowanym fluoroforem (6E10, patrz tabela materiałów) rozcieńczonym (1:1000) w 1x PBS zawierającym 0,3% TritonX 100 w temperaturze 4 °C przez 24 h.
    UWAGA: Ponieważ przeciwciało pierwszorzędowe jest sprzężone z fluoroforem, płytka musi być pokryta od tego etapu lub wszystkie prace muszą być wykonywane w ciemnym pomieszczeniu, aby utrzymać skuteczność fluoroforu.
  6. Myj skrawki tkanki mózgowej przez 10 minut 1x PBS trzy razy w temperaturze pokojowej.
  7. Zamontuj skrawki tkanki mózgowej na dodatnio naładowanych szkiełkach szklanych (patrz Tabela materiałów), które są dobrze oznakowane (informacje na etykiecie na szkiełku są oparte na preferencjach), po krótkim przemyciu dH20 w celu usunięcia pozostałych soli. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu w ciemności.
    UWAGA: Sekcje mózgu muszą być zamontowane ostrożnie, aby uniknąć fałd i rozdarć, wpływających na kwantyfikację danych. W przypadku rozdarć i/lub fałd, które leżą w obszarze zainteresowania i mogą zakłócać kwantyfikację danych, zaleca się ponowne barwienie i ponowne zamontowanie.
  8. Zamontuj skrawki tkanki mózgowej za pomocą wodnego podłoża montażowego (patrz Tabela materiałów) i umieść szklane szkiełko nakrywkowe na tkance. Uszczelnić końce szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci i przechowywać szkiełka w pudełku na szkiełka w temperaturze 4 °C do czasu wykonania obrazowania.
    UWAGA: W obecnym protokole preparaty zostały zobrazowane w ciągu 1 miesiąca po barwieniu.

3. Obrazowanie

  1. Zobrazuj wycinki mózgu wybarwione 6E10 za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (epifluorescencyjnego lub konfokalnego) (patrz Tabela materiałów), który ma 2-krotny obiektyw do uchwycenia całego wycinka tkanki mózgowej na jednym obrazie i jest wyposażony w odpowiedni filtr (GFP w tej pracy).
    UWAGA: Ustawienia obrazowania muszą być spójne na różnych slajdach.
  2. Zapisz przechwycone obrazy jako plik TIFF lub zgodnie z wymaganiami i otwórz je w oprogramowaniu do analizy obrazów (patrz tabela materiałów) zgodnie z opisem w kroku 4.2 poniżej dla kwantyfikacji 6E10.
    UWAGA: Przed przechwyceniem obrazu należy dołączyć podziałkę liniową w celu ilościowego określenia w oprogramowaniu do analizy obrazu, ImageJ.

4. Analiza całego regionu zainteresowania

UWAGA: Dwa obszary zainteresowania niniejszej pracy to hipokamp i izokora mózgowa. Analiza całego obszaru zainteresowania reprezentuje analizę całej kory izo-korowej (określanej jako kora w przyszłości) lub hipokampa w obrazowanym wycinku tkanki mózgowej.

  1. Pobierz oprogramowanie do analizy obrazu (patrz tabela materiałów) i uruchom oprogramowanie po zainstalowaniu.
  2. Po uruchomieniu oprogramowania kliknij Plik | Otwórz | Wybierz obraz, który ma zostać poddany analizie.
  3. Kliknij Analizuj | Ustawianie skali| Kliknij, aby usunąć skalę. Wybierz narzędzie Prosto z paska narzędzi oprogramowania i narysuj linię prostą wzdłuż paska podziałki. Kliknij Analizuj | Miara. Zwróć uwagę na długość lub odległość podziałki liniowej w pikselach. Kliknij Analizuj | Ustaw skalę.
    1. W wyskakującym okienku wprowadź odległość w pikselach, znaną odległość podziałki liniowej (w tym przypadku w μm) oraz jednostkę długości jako μm. Zaznacz opcję Globalne, aby zastosować nowe ustawienie skali do wszystkich kolejnych obrazów, jeśli przetwarzanych jest wiele obrazów. Kliknij przycisk OK, aby zastosować plik settings.
      UWAGA: Przed dalszą analizą zawsze zaleca się sprawdzenie, czy do obrazu została zastosowana dokładna skala.
  4. Aby ustawić żądany pomiar dla obszaru przekroju, przejdź do Analiza | Ustawianie pomiarów | Zaznacz pola Obszar i Etykieta wyświetlania. Sprawdź, czy analizowany obraz jest zaznaczony w obszarze Przekieruj do.
  5. Aby ułatwić wizualizację hipokampa lub kory mózgowej, przejdź do Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast. Przeciągnij suwak Maksimum stopniowo w lewo, aby zwiększyć przejrzystość tkanek, aż do momentu, gdy będzie można zidentyfikować interesujące obszary mózgu.
    UWAGA: Nie stosuj tego ustawienia, aby uniknąć fałszywych pomiarów podczas analizy, zamiast tego przejdź do następnego kroku.
  6. Użyj narzędzia Zaznaczanie wielokątów lub Zaznaczanie odręczne, aby obrysować obszar hipokampa. Kliknij opcję Resetuj w ustawieniach jasności/kontrastu, gdy hipokamp zostanie zarysowany, aby powrócić do pierwotnej jasności.
    UWAGA: Kroki należy powtórzyć osobno dla obszaru korowego.
  7. Aby zmierzyć całkowitą powierzchnię tkanki wybranego obszaru, kliknij Edytuj | Czysty na zewnątrz. Gdy wybrany region stanie się jedynym obrazem na ekranie, kliknij Analizuj | Zmierz, aby uzyskać całkowitą powierzchnię tkanki analizowanej w wyskakującym okienku. Zapisz dane w pliku Excel do późniejszego wykorzystania.
  8. Aby zmierzyć obszar dodatni 6E10, przejdź do Obraz | Dostosuj | Próg koloru. Gotowy filtr w metodzie Thresholding zwykle zapewnia pożądane wyniki, podkreślając najsilniejsze sygnały na czerwono.
    UWAGA: Optymalny wybór progu będzie zależał od tła obrazu i intensywności barwienia. Wybierz ustawienie progu, które wychwyci plamę, a nie tło.
  9. Po wybraniu odpowiedniego progu zaznacz opcję Ciemne tło. Spowoduje to podświetlenie plam Aβ (plama zainteresowania) na czarnym tle. Kliknij Wybierz | Oryginalny | Wybierz, dając ciemne sygnały (osady Aβ) na białym tle. Kliknij Analizuj | Przeanalizuj cząstki i kliknij OK, gdy wygeneruje się wyskakujące okienko.
  10. Skopiuj wynik podsumowania wygenerowany przez oprogramowanie, klikając Edytuj | Kopia. Wklej do wcześniej uruchomionego pliku Excel z odpowiednimi etykietami. Jest to obszar 6E10-dodatni w wybranych regionach zainteresowania (hipokamp lub kora mózgowa).
    UWAGA: W programie Excel pojawi się kolumna dla całkowitego obszaru 6E10-dodatniego (krok 4.10) i całkowitego obszaru tkanki (krok 4.7).
  11. Oblicz obszar 6E10-dodatni (%) w następujący sposób16: (Całkowita powierzchnia 6E10-dodatnia/Całkowita analizowana powierzchnia tkanki) x 100.

5. Analiza podregionu zainteresowania

UWAGA: Analiza podregionu zainteresowania reprezentuje analizę części kory mózgowej lub hipokampa w obrazowanym przekroju tkanki mózgowej.

  1. Pobierz oprogramowanie do analizy obrazu i uruchom je po zainstalowaniu.
  2. Po uruchomieniu oprogramowania kliknij Plik | Otwórz | Wybierz obraz, który ma zostać poddany analizie.
  3. Kliknij Analizuj | Ustawianie skali| Kliknij, aby usunąć skalę. Wybierz narzędzie Proste z paska narzędzi oprogramowania i narysuj linię prostą wzdłuż paska podziałki. Kliknij Analizuj | Miara. Zwróć uwagę na długość lub odległość podziałki liniowej w pikselach. Kliknij Analizuj | Ustaw skalę.
    1. W wyskakującym okienku wprowadź odległość w pikselach, znaną odległość podziałki liniowej (w tym przypadku w μm) i wprowadź jednostkę długości jako μm. Zaznacz opcję Globalne, aby zastosować nowe ustawienie skali do wszystkich kolejnych obrazów, jeśli przetwarzanych jest wiele obrazów. Kliknij przycisk OK, aby zastosować plik settings.
      UWAGA: Przed dalszą analizą zawsze zaleca się sprawdzenie, czy do obrazu została zastosowana dokładna skala.
  4. Aby ustawić żądany pomiar dla obszaru przekroju, przejdź do Analiza | Ustawianie pomiarów | zaznacz pola Obszar i Etykieta wyświetlania. Sprawdź, czy analizowany obraz jest zaznaczony w obszarze Przekieruj do.
  5. Dostosuj jasność i kontrast, jeśli obraz jest zbyt ciemny, a obszary mózgu (np. hipokamp lub kora mózgowa w tym przypadku) nie mogą być łatwo zidentyfikowane. Użyj paska narzędzi oprogramowania i kliknij Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast i w razie potrzeby przeciągnij suwaki Maksimum w lewo, aby zwiększyć widoczność tkanki.
    UWAGA: Nie stosuj tego ustawienia, aby uniknąć fałszywych pomiarów podczas analizy, zamiast tego przejdź do następnego kroku.
  6. Za pomocą narzędzia Prostokąt wybierz interesujący Cię obszar w korze lub hipokampie. Użyj paska narzędzi i kliknij Edytuj | Selekcja | Określ, zmieniając wysokość i szerokość na wstępnie zdefiniowaną wartość. Wyreguluj pudełko tak, aby było całkowicie pokryte chusteczką. Zresetuj jasność/kontrast, aby powrócić do oryginalnej jasności.
    UWAGA: Rozmiar pola używanego do zaznaczania obszarów zainteresowania musi być spójny dla wszystkich obrazów. Na potrzeby niniejszej analizy rozmiar pudełka wynosił albo 300 pikseli x 300 pikseli (co odpowiada 1177 μm x 1177 μm), albo 400 pikseli x 200 pikseli (co odpowiada 1569 μm x 784 μm).
  7. Zduplikuj wybrany obszar zainteresowania, klikając pole prawym przyciskiem myszy i klikając Duplikuj. Otworzy się nowe okno z wybranym regionem. Zmień nazwę zduplikowanego obrazu, aby wyświetlić region, w którym się znajduje (np. kora mózgowa lub hipokamp).
  8. Dostosuj zduplikowany typ obrazu, korzystając z paska narzędzi i klikając Obraz | Rodzaj | 8-bitowy, aby przekonwertować zduplikowany obraz RGB na 8-bitowy, aby jak najlepiej przeanalizować płytki. Odwróć obraz, klikając Edytuj | Odwrócić.
  9. Aby zmierzyć obszar dodatni 6E10, przejdź do Obraz | Dostosuj | Próg. Wstępnie zdefiniowany filtr w metodzie progowania zwykle zapewnia pożądane wyniki, podświetlając najsilniejsze sygnały na czerwono.
    UWAGA: Optymalny wybór progu będzie zależał od tła obrazu i intensywności barwienia. Wybierz ustawienie progu, które wychwyci plamę, a nie tło.
  10. Po wybraniu odpowiedniego progu wybierz pozycję Zastosuj.
  11. Aby przeanalizować obszar 6E10-dodatni, użyj paska narzędzi i kliknij Analizuj | Analizuj cząstki, upewniając się, że zaznaczona jest opcja "Podsumuj wyniki".
  12. Skopiuj dane wyjściowe podsumowania z %Area wygenerowanym przez oprogramowanie, klikając Edytuj | Kopia. Wklej do wcześniej uruchomionego pliku Excel z odpowiednimi etykietami.
  13. Powtórz kroki 5.3-5.12 dla różnych obszarów tkanki. Upewnij się, że rozmieszczenie każdego pola w celu wyznaczenia obszaru zainteresowania jest spójne między każdym obrazem.
    UWAGA: Narzędzie do obracania może być używane, jeśli wymiary przybornika Prostokąt nie mieszczą się w określonym obszarze ze względu na krzywiznę tkanki.
  14. Aby obrócić prostokąt, użyj paska narzędzi i kliknij Edytuj | Selekcja | W razie potrzeby obróć i dostosuj stopień obrotu. Zduplikuj obraz, jak wspomniano w kroku 5.7, i wyczyść go na zewnątrz, używając paska narzędzi i klikając Edytuj | Wyczyść na zewnątrz, co usuwa plamy 6E10 poza określonym prostokątem. Przejdź do kroku 5.8 opisanego powyżej.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj porównuje się dwie różne metody ilościowego określania obszaru 6E10-dodatniego w hipokampie i kory tkanek mózgowych myszy. Dwie metody to analizy całego regionu i podregionu zainteresowania (Rysunek 1). Analiza całego obszaru zainteresowania, jak sama nazwa wskazuje, polega na nakreśleniu całego obszaru zainteresowania (w tym przypadku kory mózgowej lub hipokampa) w celu określenia obszaru 6E10-dodatniego (Rysunek 1A,B). Analiza podregionu zainteresowania polega na wybraniu wstępnie zdefiniowanego regionu w regionie zainteresowania w celu określenia obszaru 6E10-dodatniego (Rysunek 1C,D). Krok po kroku protokół ImageJ dla tych dwóch metod jest pokazany w Rysunek 2, Rysunek 3 i Rysunek 4.

To badanie wykorzystało trzech czytelników; dwóch niezależnych czytelników przeprowadziło analizę subregionu zainteresowania, a trzeci czytelnik przeprowadził analizę całego regionu zainteresowania. Jak widać w Rysunek 5A,B, istniała silna istotna dodatnia korelacja (p < 0,0001) między obszarem 6E10-dodatnim zgłoszonym przez dwóch czytelników przeprowadzających analizę podregionu zainteresowania (współczynnik korelacji Pearsona r = 0,97 dla kory i r = 0,96 dla hipokampa). Obszary 6E10-dodatnie zgłoszone przez dwóch czytelników dla analizy podregionu zainteresowania zostały uśrednione, a uśredniony podregion zainteresowania obszar 6E10-dodatni miał silną istotną dodatnią korelację (p < 0,0001) z obszarem 6E10-dodatnim uzyskanym przy użyciu analizy całego regionu zainteresowania dla obu kory (współczynnik korelacji Pearsona r = 0,96; Rysunek 5C) i hipokamp (współczynnik korelacji Pearsona r = 0,95; Rysunek 5D). Średni obszar dodatni w korze mózgowej i hipokampie-6E10 uzyskany w analizach całego regionu i podregionu będącego przedmiotem zainteresowania był porównywalny bez istotnej różnicy, potwierdzając zgodność między obiema metodami (Rysunek 5E). Co więcej, nierozpuszczalny Aβ1-42 mierzono w homogenatach całego mózgu w podgrupie myszy, a obszar korowy (Figura 5F) i hipokampa (Figura 5G) 6E10-dodatni obszar określony przez analizę całego obszaru zainteresowania był istotnie (p < 0,01) skorelowany z nierozpuszczalnym ładunkiem Aβ1-42 za pomocą testu ELISA (patrz tabela materiałów).

figure-results-1
Rysunek 1: Wybór pełnych i podregionów zainteresowania. Reprezentatywne obrazy przedstawiające pełną korę izo-korową (korę) i hipokamp zarysowane dla analizy całego obszaru zainteresowania odpowiednio w (A) i (B). Reprezentatywne obrazy pokazują wybór podregionu (regionów) kory mózgowej i hipokampa dla analizy podregionu będącego przedmiotem zainteresowania odpowiednio w (C) i (D). Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Protokół dla pełnego obszaru zainteresowania 6E10-dodatniego obszaru kwantyfikacji. Kroki analizy obrazu pokazujące oryginalny obraz (A), obraz po regulacji jasności/kontrastu (B), wybór obszaru zainteresowania (C), oczyszczenie (D), regulację progu (E) i końcowy obraz gotowy do analizy (F). Liczby na rysunku oznaczają numery kroków w protokole. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Protokół dla podregionu zainteresowania 6E10-dodatnia kwantyfikacja obszaru. Kroki analizy obrazu pokazujące oryginalny obraz (A), obraz po regulacji jasności/kontrastu (B), wybór obszaru zainteresowania (C), powielenie obrazu obszaru zainteresowania (D), zmiana obrazu na 8-bitowy i odwrócenie obrazu (E), regulacja progu (F) i ostateczny obraz gotowy do analizy (G). Liczby na rysunku oznaczają numery kroków w protokole. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Protokół dla rotacji obszaru zainteresowania. Kroki analizy obrazu przedstawiające wybór obszaru zainteresowania i obrót pola wyboru w celu dopasowania do krzywizny tkanki (A), obraz obszaru zainteresowania po duplikacji (B) oraz obraz po oczyszczeniu obszaru zewnętrznego (niebędącego obszarem zainteresowania) (C). Liczby na rysunku oznaczają numer kroku w protokole. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Korelacja między pełnymi i podregionami analiz zainteresowania. Wykresy punktowe pokazują korelację między obszarem 6E10-dodatnim przez dwóch niezależnych czytelników przeprowadzających analizę podregionu zainteresowania dla kory mózgowej (A) i hipokampa (B). Obserwuje się silną dodatnią korelację między obszarem 6E10-dodatnim wynikającym z analizy subregionu zainteresowania a analizą całego regionu zainteresowania zarówno dla kory (C), jak i hipokampa (D). Nie ma statystycznie istotnej różnicy w średnim obszarze 6E10-dodatnim przez analizy całego obszaru zainteresowania i podregionu zainteresowania w korze mózgowej i hipokampie (E). Obserwuje się istotną korelację między pomiarami homogenatu nierozpuszczalnego Aβ1-42 w całym mózgu za pomocą testu ELISA a analizą całego obszaru zainteresowania zarówno dla kory mózgowej (F), jak i hipokampa (G). Dane analizowano przy użyciu współczynnika korelacji Pearsona, r, w (A-D) i (F-G) oraz przy użyciu dwukierunkowych pomiarów powtarzanych ANOVA w (E) przy użyciu oprogramowania do tworzenia wykresów i statystyki. Dane przedstawiono jako średni błąd standardowy ± średniej (SEM) wynoszącej n = 35 myszy w (E), a dwustronny p < 0,05 uznano za statystycznie istotny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany w niniejszym dokumencie protokół przedstawia procedurę przygotowania półkrwi i mózgu do przekroju strzałkowego, barwienie immunofluorescencyjne złogów Aβ przy użyciu przeciwciała 6E10 na swobodnie pływających odcinkach, obrazowanie wycinków mózgu barwionych Aβ, a następnie ilościowe oznaczanie złogów Aβ w korze i hipokampie tkanki mózgowej myszy za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Chociaż istnieją opublikowane protokoły do ilościowego określania obciążenia Aβ w sekcjach tkanki mózgowej 8,10, protokół ten opisuje etapy związane z ilościowym określaniem obciążenia Aβ w całej korze izo-korowej (określanej jako kora) i hipokampie w porównaniu z obciążeniem Aβ w podregionie zainteresowania w korze i hipokampie, kiedy może to być pożądane. Przedstawiono również korelację między pełnymi i podregionami zainteresowania analizami.

W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, opisany protokół dotyczy skrawków tkanki mózgowej o grubości 20 μm poddanych swobodnemu barwieniu immunologicznemu, co skutkuje optymalną penetracją przeciwciał w obrębie odcinka tkanki18. Technika swobodnego pływania może wymagać ręcznego przenoszenia skrawków tkanek między różnymi roztworami podczas barwienia immunofluorescencyjnego oraz ostrożnego obchodzenia się z sekcjami tkanek przez cały czas trwania zabiegu. Jest to szczególnie ważne, gdy skrawki tkanek są zanurzone w 70% roztworze kwasu mrówkowego w celu pobrania antygenu w obecnym protokole, co zwiększa kruchość tkanek w przypadku cienkich odcinków. Alternatywne podejścia do opisanego protokołu obejmują użycie grubszych odcinków tkanek (np. 30-40 μm) lub użycie odcinków tkanki, które są bezpośrednio montowane na dodatnio naładowanych szkiełkach przed barwieniem immunofluorescencyjnym. Po drugie, opisany w niniejszym dokumencie protokół wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie przeciwciało 6E10. Oprócz stosowania znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała 6E10, niefluorescencyjne przeciwciała 6E10 (np. przeciwciało 6E10 sprzężone z peroksydazą chrzanową) mogą być również stosowane do wykrywania obciążenia Aβ w skrawkach tkanki mózgowej, a obecny protokół można dostosować do ilościowego oznaczania Aβ-dodatnich barwników immunochemicznych w skrawkach tkanki mózgowej, jak opisano wcześniej8. Po trzecie, dokładność wyników kwantyfikacji obciążenia Aβ będzie zależeć od odpowiedniego wyboru progu w oprogramowaniu analitycznym, który zależy od tła tkankowego i intensywności sygnału. Wybór progu musi być dokonany przez użytkownika końcowego w taki sposób, aby do oznaczania ilościowego wybierane były tylko barwienia Aβ-dodatnie. Interwencja użytkownika końcowego jest wymagana w celu zoptymalizowania określonego progu, który można zastosować do wszystkich obrazów, aby zapewnić dokładność ustawienia progu. Po czwarte, ponieważ analiza podregionu zainteresowania wymaga wybrania małego obszaru zainteresowania w przekroju tkanki, do tej analizy wykorzystano dwa niezależne czytniki. Aby zachować niezależność i zaślepienie podczas zbierania danych, wszystkie obrazy zostały zakodowane numerycznie; Sekwencja analizy obrazu została losowo podzielona między czytelników w taki sposób, że różni czytelnicy analizowali różne obrazy w dowolnym momencie, a dane były przesyłane pod koniec każdego tygodnia. Ze względu na zwiększone prawdopodobieństwo zmienności między czytnikami w regionie wyboru zainteresowań w analizie podregionu zainteresowania, czytelnicy zostali przeszkoleni przy użyciu kilku przykładowych obrazów, aby zoptymalizować wybór regionów w korze i hipokampie przed rozpoczęciem zbierania danych. Trening ten ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia zmienności między czytnikami, a jak widać (Rysunek 5A,B), obszar 6E10-dodatni zgłoszony przez obu czytelników wykazuje silną względną zgodność w obecnym badaniu.

Obecny protokół i wyniki dostarczają cennych informacji na temat wpływu wielkości obszaru zainteresowania na kwantyfikację obszaru Aβ-dodatniego. Oczekuje się, że większy obszar zainteresowania będzie reprezentował tkankę bardziej niż mniejszy obszar zainteresowania. Dlatego pożądane jest pobieranie próbek z większej tkanki w celu dokładnego ilościowego określenia obciążenia Aβ w tkankach. Jednak w przypadku jednorodnego rozkładu obciążenia Aβ w tkance, mniejszy obszar pobierania próbek jest ogólnie uważany za dobrą reprezentację większej tkanki poddawanej analizie. Potwierdzają to obecne wyniki badań, a obciążenie Aβ w całej korze i hipokampie było silnym korelatem obciążenia Aβ w wybranym podregionie kory i hipokampa (ryc. 5C,D). Aby dodatkowo potwierdzić zgodność między pełnymi i podregionami analiz zainteresowania, porównano średni obszar 6E10-dodatni w korze i hipokampie i nie stwierdzono różnicy między tymi dwiema metodami (ryc. 5E). Potwierdza to, że każda z tych metod (analiza całego lub podregionu) daje porównywalne pomiary obciążenia Aβ.

Obecny protokół ma pewne ograniczenia. Te dwie metody (analiza całego regionu i podregionu) nie zawsze mogą być używane zamiennie. Wybór zastosowania analizy pełnej lub podregionu będzie zależał od regionalnego rozmieszczenia Aβ w tkance, na który wpływ ma wiek, płeć i szczep mysiego modelu AD. W wieku 13 miesięcy obciążenie Aβ jest rozprowadzane w korze i hipokampie myszy APP / PS1. Jednak po 6 miesiącach złogi Aβ są ograniczone do kory, a minimalne złogi obserwuje się w hipokampie12. W takich warunkach analiza całego obszaru zainteresowania może być pożądanym podejściem do zwiększenia obszaru pobierania próbek tkanek, a tym samym sygnału Aβ. Z drugiej strony, analiza podregionów może być metodą z wyboru, gdy interesujące jest obciążenie Aβ w określonym regionie mózgu (np. Korze somatosensorycznej). Dodatkowo, w wieku 13 miesięcy, samce myszy APP/PS1 wykazują intensywne barwienie 6E10-dodatnie, a barwienie immunofluorescencyjne daje doskonały sygnał o bardzo niskim tle, co sprawia, że obecny protokół jest bardzo odpowiedni do kwantyfikacji w danych warunkach. Nie jest jasne, czy ta metoda kwantyfikacji może być z powodzeniem zastosowana do mniej intensywnego barwienia, a odpowiedzi na to pytanie będą wymagały przyszłe prace. Przedstawiona w niniejszym dokumencie metoda immunofluorescencji i kwantyfikacji obrazu wykrywa wszystkie formy Aβ, w tym formę prekursora13. W rezultacie, jeśli istnieje zainteresowanie wykryciem określonego gatunku Aβ (np. Aβ1-40 lub Aβ1-42), można zastosować przeciwciała specyficzne dla tych izoform Aβ. Dlatego, chociaż metoda barwienia i wykrywania immunofluorescencyjnego 6E10 korelowała z pomiarami pomiarów Aβ1-42 w homogenatach całego mózgu przy użyciu ELISA (Figura 5F, G), korelacja była tylko niewielka. Można to przypisać pomiarowi tylko Aβ1-42 za pomocą testu ELISA i wykrywaniu wszystkich gatunków Aβ za pomocą barwienia immunologicznego 6E10. W niniejszym badaniu wykorzystano trzy czytniki w celu oceny zgodności i korelacji między analizami pełnymi i subregionalnymi. Posiadanie dodatkowych czytelników może poprawić solidność badania i może jeszcze bardziej potwierdzić zgodność między dwiema przedstawionymi tutaj metodami. Ponadto używamy korelacji Pearsona jako miary zgodności, która jest szeroko stosowana wśród innych metod do opisu zgodności między zmiennymi ciągłymi19. Jednak jednym z ograniczeń stosowania korelacji Pearsona do określenia zgodności jest to, że dwie metody użyte w niniejszym dokumencie mogą dawać podobne wyniki, ale jedna metoda może skutkować ogólnie wyższymi wartościami niż druga z powodu systematycznego odchylenia. Dlatego korelacja Pearsona jest dobrą miarą względnej zgodności19. Aby zwiększyć niezawodność protokołu, można zastosować dodatkowe metody potwierdzania bezwzględnej zgodności, takie jak porównanie średniej powierzchni dodatniej 6E10 za pomocą dwóch metod (rysunek 5E)19. Podsumowując, obecny protokół porównuje obciążenie Aβ wykryte przez barwienie immunofluorescencyjne i analizuje pełne i podregiony zainteresowania w skrawkach tkanki mózgowej. Wyniki wskazują na silną korelację między tymi dwiema metodami dla wycinków tkanki mózgowej pochodzących od 13-miesięcznych samców myszy APP/PS1, które wykazują obfite złogi Aβ.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Institute of Aging of the National Institutes of Health pod numerami nagród R01AG062840 (dla RKS) i R01AG072896 (dla RKS). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Institutes of Health. Około 200 tys. dolarów (100%) z funduszy federalnych wsparło ten projekt. Chcielibyśmy również podziękować dr Joshua Yangowi za pomoc w redagowaniu manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki stożkowe 15 mlThermoFisher Scientific, MA, USA339650
Płytki 24-dołkoweFisher Scientific, NH, Stany ZjednoczoneFB012929
Zestaw ELISA dla ludzi z amyloidem beta 42ThermoFisher Scientific, MA, StanyZjednoczone KHB3441
Wodne podłoża montażoweVector laboratories, CA, USAH-5501-60
Albuminasurowicy bydlęcejSigmaaldrich, MO, Stany ZjednoczoneA2153-50G
BZ-X710 Uniwersalny mikroskop fluorescencyjny KeyenceKeyence, IL, USABZ-X710
Przezroczysta folia do paznokciPreferencje użytkownikaNA
KriostatLeica Biosystems, IL, StanyZjednoczone Kriostat Leica CM1860 Kwas
VWR, PA, USA48393-081
GraphPad PrismGraphPad Software, CA, USAWersja 8
ImageJ 1.51kNational Institutes of Health, MD, USAWersja 1.53e
MyszyJackson Laboratories, ME, USA034829-JAX
ParaformaldehydSigmaaldrich, MO, USAP6148-500G
Fenytoina/ Znieczulenie na bazie pentobarbitalu (Euthasol)Patterson Veterinary, MA, USA07-805-9296
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiFisher Scientific,  NH, USABP661-50
Plus (+) szkiełka mikroskopoweTed Pella, Inc., CA, USA260100
Przeciwciało pierwszorzędowe (6E10)Biolegend, CA, USA803013
SacharozaSigmaaldrich, MO, USA47289
Triton X 100Sigmaaldrich, MO, USAT8787-100ML
mrówkowy Sigmaaldrich, MO, USA F0507-500ML Szkiełka nakrywkowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alzheimer's Association. 2021 Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimer's & Dementia. 17 (3), 327-406 (2021).
  2. Langa, K. M., Foster, N. L., Larson, E. B. Mixed dementia: emerging concepts and therapeutic implications. Journal of the American Medical Association. 292 (23), 2901-2908 (2004).
  3. Gandy, S., DeKosky, S. T. Toward the treatment and prevention of Alzheimer's disease: rational strategies and recent progress. Annual Review of Medicine. 64, 367-383 (2013).
  4. Bloom, G. S. Amyloid-beta and tau: the trigger and bullet in Alzheimer disease pathogenesis. JAMA Neurology. 71 (4), 505-508 (2014).
  5. Gremer, L., et al. Fibril structure of amyloid-beta(1-42) by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6359), 116-119 (2017).
  6. Ferrero, J., et al. First-in-human, double-blind, placebo-controlled, single-dose escalation study of aducanumab (BIIB037) in mild-to-moderate Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia Translational Research & Clinical Interventions. 2 (3), 169-176 (2016).
  7. Poon, C. H., Wang, Y., Fung, M. L., Zhang, C., Lim, L. W. Rodent models of amyloid-beta feature of Alzheimer's disease: development and potential treatment implications. Aging and Disease. 11 (5), 1235-1259 (2020).
  8. Christensen, A., Pike, C. J. Staining and quantification of beta-amyloid pathology in transgenic mouse models of Alzheimer's disease. Methods in Molecular Biology. 2144, 221(2020).
  9. Thakker, D. R., et al. Intracerebroventricular amyloid-beta antibodies reduce cerebral amyloid angiopathy and associated micro-hemorrhages in aged Tg2576 mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (11), 4501-4506 (2009).
  10. Song, Z., et al. Detecting amyloid-beta accumulation via immunofluorescent staining in a mouse model of Alzheimer's disease. Journal of Visualized Experiments. (170), e62254(2021).
  11. Sun, J., et al. Hematologic safety of chronic brain-penetrating erythropoietin dosing in APP/PS1 mice. Alzheimer's & DementiaTranslational Research & Clinical Interventions. 5, 627-636 (2019).
  12. Jankowsky, J. L., et al. Mutant presenilins specifically elevate the levels of the 42 residue beta-amyloid peptide in vivo: evidence for augmentation of a 42-specific gamma secretase. Human Molecular Genetics. 13 (2), 159-170 (2004).
  13. Grant, M. K. O., et al. Human cerebrospinal fluid 6E10-immunoreactive protein species contain amyloid precursor protein fragments. PloS One. 14 (2), 0212815(2019).
  14. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  15. Eichenbaum, K. D., et al. Minimally invasive method for murine brain fixation. Biotechniques. 39 (4), 487-490 (2005).
  16. Chang, R., et al. Blood-brain barrier penetrating biologic tnf-alpha inhibitor for Alzheimer's disease. Molecular Pharmaceutics. 14 (7), 2340-2349 (2017).
  17. Pinskiy, V., et al. High-throughput method of whole-brain sectioning, using the tape-transfer technique. PloS One. 10 (7), 0102363(2015).
  18. Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments. (162), e61622(2020).
  19. van Stralen, K. J., Dekker, F. W., Zoccali, C., Jager, K. J. Measuring agreement, more complicated than it seems. Nephron Clinical Practice. 120 (3), 162-167 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Amyloid Beta QuantificationBrain Section ImagingSub Regional AnalysisFull Region AnalysisAPP PS1 MiceImmunostaining ProtocolImage Analysis SoftwareHippocampus QuantificationCortex Quantification6E10 Staining

Powiązane artykuły