Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Sondowanie mechaniki zespołu miozyny w wiązkach filamentów aktynowych za pomocą pęsety optycznej

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63672

⸱

4 maja 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of Mississippi, 2Department of Biomedical Engineering, University of Mississippi

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono i omówiono tworzenie wiązek aktomiozyny in vitro oraz pomiar siły generowania zespołu miozyny za pomocą pęsety optycznej.

Streszczenie

Miozyny to białka motoryczne, które hydrolizują ATP, aby podążać wzdłuż ścieżek filamentu aktynowego (AF) i są niezbędne w procesach komórkowych, takich jak ruchliwość i skurcze mięśni. Aby zrozumieć mechanizmy generowania siły, miozyna II została przebadana zarówno na poziomie pojedynczej cząsteczki (SM), jak i jako zespoły silników in vitro przy użyciu metod biofizycznych, takich jak pułapkowanie optyczne.

Te badania wykazały, że zachowanie generujące siłę miozyny może się znacznie różnić, gdy przechodzi się z poziomu pojedynczej cząsteczki w układzie trzech koralików do grup silników współpracujących ze sobą na sztywnej powierzchni koralików lub szkiełek nakrywkowych w układzie ślizgowym. Jednak te konstrukcje testowe nie pozwalają na ocenę dynamiki grupowej miozyny w lepkosprężystej hierarchii strukturalnej, tak jak w komórce. Opracowaliśmy metodę wykorzystującą pęsetę optyczną do zbadania mechaniki generowania siły przez zespoły miozyny oddziałujące z wieloma włóknami aktyny.

Te pakiety aktomiozyny ułatwiają badanie w hierarchicznym i zgodnym środowisku, które rejestruje komunikację motoryczną i moc wyjściową zespołu. Konfigurowalny charakter testu pozwala na zmianę warunków eksperymentalnych w celu zrozumienia, w jaki sposób modyfikacje zespołu miozyny, wiązki włókien aktynowych lub otaczającego środowiska skutkują różnymi mocami wyjściowymi.

Wprowadzenie

Białka motoryczne są niezbędne do życia, przekształcając energię chemiczną w pracę mechaniczną1,2,3. Silniki miozyny oddziałują z filamentami aktyny, podejmując kroki wzdłuż włókien podobnych do toru, a dynamika sieci aktyna-miozyna przeprowadza skurcz mięśni, ruchliwość komórek, pierścień kurczliwy podczas cytokinezy i ruch ładunku wewnątrz komórki, wśród innych istotnych zadań3,4,5,6,7,8. Ponieważ miozyny odgrywają tak wiele istotnych ról, awaria funkcjonalności sieci miozyna-aktyna może prowadzić do rozwoju choroby, takiej jak mutacje w łańcuchu ciężkim miozyny, które powodują nadkurczliwość serca w kardiomiopatii przerostowej (HCM)9,10,11,12,13,14. W skurczu mięśni poszczególne silniki miozyny współpracują ze sobą, pracując jako zespół, aby zapewnić wymaganą energię mechaniczną, która przeprowadza względne przesuwanie AFs4,15,16,17,18. Silniki miozyny tworzą mostki krzyżowe między AF i wykorzystują zmiany konformacyjne wynikające z cyklu mechanochemicznego, aby wspólnie poruszać się w kierunku kolczastego końca wyrównanych włókien17,18,19,20,21.

Rozwój ilościowych testów ruchliwości in vitro na poziomie SM przy użyciu technik takich jak pułapkowanie optyczne ułatwił zebranie bezprecedensowych szczegółów na temat funkcjonowania poszczególnych silników miozynowych, w tym pomiar generowania siły SM i wielkości kroków22,23,24,25,26,27,28,29,30. Finer i in. opracowali optyczny test pułapkowania "z trzema koralikami" lub "hantlami", aby zbadać mechanikę generowania siły w pojedynczych silnikach miozyny II23,31. Ponieważ miozyna mięśniowa II działa w zespołach w celu zarażenia migotania przedsionków, ale nie jest procesowa na poziomie SM, orientacja testu pułapkowania optycznego musiała zostać zmieniona z klasycznego podejścia kulkowego związanego z silnikiem32. Aby utworzyć test hantli, użyto dwóch pułapek optycznych do utrzymania AF nad silnikiem miozyny związanym z koralikiem przymocowanym do szkiełka nakrywkowego, a siłę wyjściową przez pojedynczy silnik mierzono poprzez ruchy AF w obrębie trap23.

Jednak siły SM i użycie orientacji testu pojedynczego silnika/pojedynczego włókna nie dają pełnego obrazu generowania siły na poziomie systemu, ponieważ wiele białek motorycznych, w tym miozyna II, nie działa w izolacji i często nie funkcjonuje jako suma swoich części15,16,17,32,33,34,35,36. Bardziej złożone struktury, które zawierają więcej niż jeden silnik oddziałujący z więcej niż jednym włóknem, są niezbędne do lepszego zrozumienia synergii sieci włókien miozyny i aktyny15,32. Orientacja testu hantli została wykorzystana do zbadania generowania siły małego zespołu poprzez przymocowanie wielu miozyn do koralika lub użycie włókna o grubości miozyny przymocowanego do powierzchni i umożliwienie silnikom interakcji z zawieszonym AF4,23,34,37,38,39,Lokal mieszkalny 40.

Inne testy małych zespołów obejmują test ślizgania włókien in vitro, w którym silniki miozyny są powlekane na powierzchni szkiełka nakrywkowego, a koralik związany z AF jest używany do sondowania siły generowanej przez zespół silników4,35,36,38,39,40,41,42,43. W obu tych przypadkach miozyny są związane ze sztywną powierzchnią – koralikiem lub szkiełkiem nakrywkowym – i wykorzystują jeden AF. W takich przypadkach silniki nie są w stanie swobodnie się poruszać ani komunikować ze sobą, a sztywno związane miozyny nie odzwierciedlają zgodnego, hierarchicznego środowiska, w którym silniki współpracowałyby ze sobą w sarcomere32. Wcześniejsze badania sugerowały, że miozyna II może wyczuwać swoje otoczenie i odpowiednio dostosowywać się do zmieniających się warunków lepkosprężystych lub koncentracji motorycznej poprzez zmianę cech, takich jak generowanie siły i współczynnik obciążenia41,44,45. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania testu pułapkowania optycznego, który wspiera i rejestruje komunikację motoryczną i zgodność systemu, aby namalować bardziej realistyczny obraz mechanistycznych podstaw generowania siły zespołu miozyny II.

Tutaj opracowaliśmy metodę łączenia hierarchicznej struktury in vitro z pułapką optyczną poprzez tworzenie wiązek lub kanapek składających się z wielu silników miozyny oddziałujących między dwoma filamentami aktyny. Ta modułowa geometria testu ma możliwość bezpośredniego badania, w jaki sposób czynniki molekularne i środowiskowe wpływają na wytwarzanie siły miozyny zespołowej. Co więcej, badanie mechanizmów generowania siły za pomocą tych zespołów aktyna-miozyna może potencjalnie pomóc w modelowaniu i zrozumieniu, w jaki sposób zadania komórkowe na dużą skalę, takie jak skurcz mięśni, rozprzestrzeniają się z poziomu molekularnego9,10,13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Trawienie szkiełek nakrywkowych

  1. Rozpuść 100 g KOH w 300 ml 100% etanolu w zlewce o pojemności 1 000 ml. Mieszać mieszadłem, aż większość KOH się rozpuści.
    UWAGA: Skoncentrowany roztwór KOH może spowodować oparzenia i uszkodzenia odzieży. Nosić rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny.
  2. Szkiełka nakrywkowe należy umieszczać pojedynczo w stojakach do czyszczenia szkiełek nakrywkowych.
    UWAGA: Stojaki są zaprojektowane ze szczelinami, które utrzymują pojedyncze szkiełka nakrywkowe w odstępach od siebie, aby umożliwić trawienie i płukanie na każdej powierzchni szkiełka nakrywkowego, otwory odpływowe w dnie i wykonane z materiału, który może wytrzymać trudne warunki trawienia. Mogą być wykonane na zamówienie lub zakupione komercyjnie.
  3. Przygotuj i oznacz trzy zlewki o pojemności 1 000 ml: jedną z 300 ml etanolu i dwie zlewki z 300 ml wody z odwróconej osmozy (RO).
    UWAGA: W tym przypadku woda RO pochodziła z laboratoryjnego oczyszczacza wody, ale można ją również kupić komercyjnie, jeśli lokalny oczyszczacz nie jest dostępny.
  4. Umieść każdą z czterech zlewek w sonografie do kąpieli, aby odgazować przez 5 minut.
  5. Zanurzyć stojak z szkiełkami nakrywkowymi w zlewce z KOH i etanolem i poddać sonikacji przez 5 minut.
  6. Przenieść stojak szkiełek nakrywkowych ze zlewki KOH/etanolu do zlewki zawierającej tylko etanol. Zanurzaj ruszt w górę i w dół w zlewce, aż nie będzie ściegu.
    UWAGA: Uważaj, aby nie naruszyć szkiełek nakrywkowych ani nie wrzucić rusztu na siłę do zlewki. Spowoduje to wysunięcie szkiełek nakrywkowych ze stojaka lub rozpryskiwanie chemikaliów.
  7. Ostrożnie przenieś stojak szkiełek nakrywkowych ze zlewki etanolu do zlewki z wodą, zanurzając w górę iw dół, aż nie będzie perliorów.
  8. Zanurz stojak z szkiełkami nakrywkowymi w zlewce z wodą, która nie została jeszcze użyta i ponownie poddaj sonikacji przez 5 minut.
  9. Użyj butelki, aby spryskać stojak na szkiełka nakrywkowe wodą, aż płynnie spłynie z szkiełek nakrywkowych. Powtórz z etanolem.
  10. Umieść ruszty do wyschnięcia w piekarniku w temperaturze 90 °C na 20 minut. Stojaki z wytrawionymi szkiełkami nakrywkowymi należy przechowywać w temperaturze pokojowej w zamkniętych pojemnikach, aby zapobiec zanieczyszczeniu.

2. Polimeryzacja filamentów aktynowych

  1. Zrób rozwiązanie T
    1. Do stożkowej probówki o pojemności 50 ml dodać 3,94 g Tris-HCl i 0,147 g CaCl2. Dodaj wodę RO, aby uzyskać całkowitą objętość 50 ml i dobrze wymieszaj.
      UWAGA: Końcowe stężenia roztworu T wynoszą odpowiednio 500 mM Tris-HCl i 20 mM CaCl2.
    2. Oznaczyć probówkę Roztwór T i przechowywać ją w temperaturze 4 °C.
  2. Utwórz bufor TC
    1. Wymieszaj 40 ml wody RO i 1,5 ml roztworu T w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Zmień pH na 8,0, dodając niewielkie ilości skoncentrowanego KOH. Dodaj wodę, aby uzyskać 50 ml roztworu i sprawdź pH. W razie potrzeby dostosuj pH.
      UWAGA: Końcowy bufor TC zawiera 5 mM Tris-HCl i 0,2 mM CaCl2 przy pH 8.
    2. Oznacz probówkę TC i przechowuj ją w temperaturze 4 °C.
  3. Utwórz bufor FC
    1. Dodać 85 ml wody RO, 10 ml roztworu T, 3,73 g KCl i 0,041 g MgCl2 do 100 ml butelki buforowej. Zmodyfikuj pH do 7,5, dodając małe objętości stężonego KOH. Dodaj wodę, aby uzyskać końcową objętość 100 ml i sprawdź pH.
      UWAGA: Końcowy bufor FC zawiera 500 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2 i 2 mM CaCl2 przy pH 7,5.
    2. Oznaczyć probówkę FC i przechowywać ją w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotuj ogólny bufor aktynowy (GAB).
    1. Wymieszaj 485 μl buforu TC, 10 μl 10 mM ATP i 5 μl 50 mM DTT w probówce mikrowirówkowej.
      UWAGA: Końcowe warunki bufora to 5 mM Tris-HCl, 0,2 mM CaCl2, 0,5 mM DTT i 0,2 mM ATP.
    2. Oznaczyć go jako GAB i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  5. Przygotować bufor do polimeryzacji aktyny (APB).
    1. Wymieszać 455 μl buforu FC, 25 μl 100 mM ATP i 20 μl 50 mM DTT w probówce do mikrowirówki.
      UWAGA: Końcowe warunki buforowe to 50 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 2 mM DTT i 5 mM ATP.
    2. Oznaczyć probówkę jako APB i przechowywać ją w temperaturze 4 °C.
  6. Rozpuść aktynę
    1. Rozpuść aktynę mięśni szkieletowych królika, dodając 100 μl wody dejonizowanej do fiolki 1 mg liofilizowanej aktyny. Dobrze wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół. Podwielokrotność podzielić na 5 μl próbek, zamknąć i przechowywać podwielokrotności aktyny o stężeniu 10 mg/ml w temperaturze -80 °C.
    2. Rozpuść biotynylowaną aktynę mięśni szkieletowych królika, dodając 20 μl wody RO. Podwielokrotność porcji rozdzielić na 5 μl próbek, zamrozić błyskawicznie i przechowywać 1 mg/ml biotynylowanych podwielokrotności aktyny w temperaturze -80 °C.
  7. Nieznakowana polimeryzacja aktyny ze stabilizacją falloidyny rodaminy
    1. Rozmrozić jedną fiolkę z aktyną 10 mg/ml i trzymać ją na lodzie.
    2. Przygotować świeży bufor GAB, dodać 100 μl GAB do podwielokrotności aktyny i wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół. Inkubować roztwór na lodzie przez 1 godzinę.
    3. Przygotuj świeży APB podczas inkubacji. Po inkubacji spolimeryzować aktynę we włókna, dodając 11 μl APB do roztworu aktyny. Dobrze wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół. Umieść na lodzie na 20 min.
    4. Dodać 5 μl falloidyny znakowanej rodaminą do świeżo spolimeryzowanego roztworu filamentu aktynowego. Pozostaw na lodzie w ciemności na 1 godzinę.
    5. Przechowywać fiolkę z aktyną rodaminy zawinięta w folię aluminiową w ciemności w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Sugeruje się używanie tych filamentów przez maksymalny okres 1 tygodnia. Jakość AF można potwierdzić każdego dnia dzięki szybkiemu obrazowaniu komórki przepływowej zawierającej tylko AF i wyświetlaniu spójnych włókien dzień po dniu.
  8. Biotynylowana polimeryzacja aktyny ze stabilizacją falloidyny Alexa Fluor 488
    1. Rozmrozić jedną fiolkę z aktyną 10 mg/ml i 1 fiolkę z 1 mg/ml biotynylowaną aktyną i przechowywać je na lodzie.
    2. Zrób świeży bufor GAB.
    3. Połączyć dwie fiolki (krok 2.8.1) w stosunku 10:1 aktyna do biotynylowanej aktyny. Dodaj 100 μl GAB do mieszaniny aktyny i dobrze wymieszaj, delikatnie pipetując w górę iw dół. Inkubować na lodzie przez 1 godzinę.
    4. Zrób świeży APB podczas inkubacji.
    5. Po etapie inkubacji spolimeryzować aktynę, dodając 11 μl APB do roztworu aktyny. Dobrze wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół. Inkubować na lodzie przez 20 minut.
    6. Dodaj 5 μl falloidyny znakowanej Alexa Fluor 488 i inkubuj na lodzie w ciemności przez 1 godzinę.
    7. Przechowywać fiolkę z biotynylowaną aktyną zawinięta w folię aluminiową w ciemności w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Te filamenty mogą być używane maksymalnie przez okres 1 tygodnia.

3. Przygotowanie miozyny i koralików

  1. Rozpuść miozynę II
    1. Krótko odwirować (~5 s) liofilizowaną miozynę szkieletową II, aby zebrać ją na dnie probówki za pomocą standardowej miniwirówki.
    2. Rozpuść miozynę do 10 mg/ml, dodając 100 μl 1 mM DTT przygotowanego w wodzie RO.
    3. Rozcieńczyć podstawowy roztwór miozyny 10x, dodając 10 μl 10 mg/ml miozyny do 90 μl 1 mM DTT w wodzie RO. Przygotować porcje o małej objętości (1-5 μl), zamknąć i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Aktywność miozyny można potwierdzić, wykonując standardowy test włókien ślizgowych, jak opublikowano wcześniej46,47. Zobacz dyskusję, aby uzyskać krótki opis.
  2. Czyszczenie kulek pokrytych streptawidyną
    1. Rozcieńczyć 20 μl kulek streptawidyny o wielkości 1 μm w 80 μl wody RO. Przemyć cztery razy, odkręcając do 9 600 × g i rozpuszczając w 100 μl wody RO.
    2. Sonikować przez 2 minuty przy amplitudzie 40% i przechowywać umyte kulki na rotatorze w temperaturze 4 °C.

4. Przygotowanie komory przepływowej

  1. Przygotuj roztwór poli-l-lizyny (PLL), dodając 30 ml 100% etanolu do probówki o pojemności 50 ml i dodając 200 μl 0,1% w/v poli-l-lizyny do wody i dobrze wymieszaj.
  2. Dodaj wytrawione szkiełko nakrywkowe do roztworu PLL i pozwól mu moczyć się przez 15 minut. Usuń szkiełko nakrywkowe pęsetą, uważając, aby dotykać tylko krawędzi szkiełka nakrywkowego, gdy jest ono wyciągane z probówki (patrz Rysunek 1A-C). Chwyć szkiełka nakrywkowe za krawędzie ręką w rękawiczce.
  3. Wysuszyć szkiełko nakrywkowe przefiltrowanym przewodem powietrznym, aż nie pozostanie etanol ani żadne pozostałości na szkiełku nakrywkowym.
  4. Nałóż dwa kawałki dwustronnej taśmy klejącej na środek szkiełka mikroskopowego w odległości 3-4 mm od siebie. Oderwij lub odetnij nadmiar taśmy, która zwisa z krawędzi zjeżdżalni.
  5. Dodaj szkiełko nakrywkowe pokryte PLL na wierzchu taśmy prostopadłej do długiej osi szkiełka mikroskopowego (tworząc literę T), aby utworzyć kanał.
  6. Za pomocą małej rurki ściśnij szkiełko nakrywkowe na taśmie i dokładnie na szkiełku mikroskopowym, aż taśma stanie się przezroczysta (Rysunek 1A). Upewnij się, że na taśmie nie ma pęcherzyków powietrza, ponieważ może to spowodować wyciek z kanału przepływowego.
    UWAGA: Komora przepływowa może pomieścić objętość 10-15 μl.

5. Przygotowanie pakietu Actomyosin

  1. W oddzielnych probówkach rozcieńczyć każdy rodzaj filamentu aktynowego (znakowanego rodaminą i biotynylem 488) 600x, mieszając 0,5 μl odpowiedniej, znakowanej aktyny z 300 μl APB. Dodać dodatkowe 5 μl odpowiednio oznakowanej falloidyny do każdej probówki i inkubować na lodzie w ciemności przez 15 minut.
  2. Do biotynylowanego roztworu aktyny dodać system oczyszczania tlenu składający się z 1 μl beta-D-glukozy w stężeniu 500 mg/ml, 1 μl oksydazy glukozowej w stężeniu 25 mg/ml i 1 μl katalazy w stężeniu 500 jednostek/ml. Dodać 1 μl 100 mM ATP i 1 μl 100x rozcieńczonych, oczyszczonych kulek streptawidyny. Delikatnie wymieszaj końcówką pipety. Umieścić zawiesinę na rotatorze w temperaturze 4 °C, podczas gdy reszta wiązki aktomiozyny jest montowana.
  3. Dodać 15 μl rozcieńczonej aktyny rodaminy do komory przepływowej PLL (rysunek 1D). Przetrzyj nadmiar roztworu przez komorę przepływową, ale nie pozwól, aby kanał przepływowy wysechł. Inkubować przez 10 minut w komorze wilgotnościowej.
    UWAGA: Komory wilgotnościowe mogą być wykonane z pustych pudełek po końcówkach do pipet z wodą dodaną na dno i pokrywą pokrytą folią aluminiową, aby zablokować światło.
  4. Przygotować roztwór kazeiny o stężeniu 1 mg/ml w APB.
  5. Dodać 15 μl kazeiny o stężeniu 1 mg/ml, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu kolejnych składników (Rysunek 1E). Inkubować przez 5 minut w komorze wilgotnościowej.
  6. Dodaj żądane stężenie miozyny do biotynylowanej aktyny i zawiesiny perełek z kroku 5.2. Delikatnie wymieszać końcówką pipety, a następnie natychmiast dodać 15 μl zawiesiny kroku 5.2 + pożądane stężenie miozyny do komory przepływowej (Rysunek 1F, G). Inkubować przez 20 minut. Uszczelnij otwarte końce komory przepływowej lakierem do paznokci, aby zapobiec parowaniu podczas eksperymentów z obrazowaniem i pułapką optyczną.
    UWAGA: Stężenie roztworu miozyny wynoszące 1 μM daje solidne wiązanie i może być wykorzystane jako punkt wyjścia do pożądanego dostosowania testu (patrz Rysunek 2).

6. Pomiary siły za pomocą pułapki optycznej (NT2 Nanotracker2)

UWAGA: Chociaż poniższy protokół jest przeznaczony specjalnie dla systemu NT2, ten test może być używany z innymi systemami pułapkowania optycznego, w tym z tymi, które są zbudowane na zamówienie, które również mają możliwości fluorescencji. Ogólny przepływ pracy pozostaje taki sam, polegający na ustawianiu ostrości na powierzchni szkiełka, wykonywaniu kalibracji kulek i pozyskiwaniu danych poprzez znajdowanie fluorescencyjnych wiązek aktyny. Dla systemu NT2 rysunek uzupełniający S1, rysunek uzupełniający S2, rysunek uzupełniający S3, rysunek uzupełniający S4, rysunek uzupełniający S5, rysunek uzupełniający S6 i rysunek uzupełniający S7 zawierają szczegółowe informacje na temat systemu pułapkowania optycznego i interfejsu oprogramowania.

  1. Włącz skrzynkę sterowniczą i laser (rysunek uzupełniający S1).
  2. Uruchom oprogramowanie komputerowe pułapki optycznej, klikając ikonę JPK Nanotracker na pulpicie.
  3. Obudź pilota, klikając przycisk Logitech pośrodku (rysunek uzupełniający S2).
  4. Włącz moduł fluorescencyjny, przełączając włącznik/wyłącznik (rysunek uzupełniający S3).
  5. Obróć wieżyczkę kostki filtra do obrazowania w jasnym polu (rysunek uzupełniający S4).
  6. Gdy system będzie gotowy, włącz laser za pomocą przycisku zasilania lasera w lewym dolnym rogu ekranu na 50 mW i pozwól mu ustabilizować się na 30 minut (rysunek uzupełniający S5).
  7. Kolejno klikaj przyciski Oświetlenie, Kamera, Cel i Ruch sceny w oprogramowaniu, aby wyświetlić te okna do przeglądania i manipulowania podczas eksperymentu. Włącz oświetlenie mikroskopu, klikając przycisk włączania/wyłączania i ustawiając je na maksymalną moc, klikając i przeciągając pasek maksymalnie w prawo (rysunek uzupełniający S5).
  8. Otwórz obszar próbki i wyjmij uchwyt próbki ze stolika mikroskopu. Dodaj celę przepływową, zabezpiecz ją metalowymi uchwytami na próbki i upewnij się, że szkiełko z szkiełkiem nakrywkowym znajduje się na dnie.
  9. Dodaj 30 μl wody RO do środka dolnego obiektywu. Nie pozwól, aby końcówka pipety dotykała soczewki. Włóż ponownie stolik na próbkę.
    UWAGA: Ponieważ system NT2 wykorzystuje obiektyw do zanurzenia w wodzie jako obiektyw do zalewania, media zanurzeniowe mogą się różnić w zależności od celu pułapkowania w konfiguracji użytkownika.
  10. Podnieś dolny obiektyw za pomocą strzałek sterujących na ekranie lub L2 na pilocie zdalnego sterowania, aż kropla wody dotknie szkiełka nakrywkowego (rysunek uzupełniający S5).
  11. Opuść górny obiektyw, aż zostanie osiągnięta około połowa odległości do komory przepływowej, korzystając ze strzałek na ekranie lub R2 na pilocie zdalnego sterowania. Dodaj 170 μl wody RO do górnej części komory przepływowej bezpośrednio pod górnym obiektywem. Opuść górną soczewkę, aż przerwie napięcie powierzchniowe wody i utworzy menisk.
  12. Przesuwaj stolik mikroskopu za pomocą strzałek na pilocie zdalnego sterowania, aż dojdziesz do krawędzi taśmy przylegającej do kanału przepływowego. Zamknij drzwiczki próbki.
    UWAGA: "Kliknięcie" po zamknięciu drzwiczek próbki oznacza, że migawka lasera jest teraz otwarta. Jest to funkcja bezpieczeństwa, która umożliwia otwarcie rolety tylko wtedy, gdy drzwi są zamknięte.
  13. Korzystając z okna Cel na ekranie, ustaw ostrość na krawędzi taśmy, podnosząc dolny obiektyw o nazwie Laser Objective, klikając górną strzałkę za pomocą elementów sterujących na ekranie. Zrób to samo dla górnego celu, klikając strzałkę w dół (Rysunek uzupełniający S5).
    UWAGA: Podwójne strzałki przesuwają cel lub etap szybciej. Krawędź taśmy służy do ustawiania ostrości, ponieważ jest to duży, łatwy do znalezienia obiekt, który znajduje się blisko powierzchni szkiełka nakrywkowego. Inną opcją są pęcherzyki powietrza w taśmie. Nie jest to jednak wymagane, jeśli użytkownik ma zautomatyzowaną procedurę wyszukiwania ostrości powierzchni lub preferowaną metodę wewnętrzną.
  14. Gdy taśma jest już ostra, częściowo zamknij przysłonę w górnej części pułapki optycznej. Opuść górny obiektyw w dół, aż wielokątny kształt tęczówki będzie widoczny. Ustaw ostrość na tych krawędziach, ponownie otwórz przysłonę, a następnie połącz obiektywy za pomocą, klikając ikonę kłódki (rysunek uzupełniający S5).
  15. Znajdź pływający koralik i zapułap go, klikając przycisk Trap Shutter, który otworzy migawkę i pozwoli laserowi pułapkującemu uderzyć w próbkę. Kliknij kursor Pułapka na ekranie i przeciągnij go, aby przesunąć położenie lasera zalewkowego. Po uwięzieniu skalibruj koralik, aby skorelować pomiary napięcia z siłą i przemieszczeniem.
  16. Kliknij przycisk Kalibracja. Dostosuj procedurę kalibracji w oparciu o analizę widm mocy i dopasuj częstotliwość narożnika w oprogramowaniu dla kierunków X, Y i Z (rysunek uzupełniający S6).
  17. Kliknij Ustawienia. Wpisz średnicę koralika (1 000 nm) i wpisz temperaturę stolika znajdującego się w lewym dolnym rogu okna oprogramowania. (patrz rysunek uzupełniający S6).
  18. Kliknij Pułapka 1. Kliknij X Signal. Kliknij Uruchom, aby wykonać dopasowanie częstotliwości narożnika. Kliknij i przeciągnij w oknie, aby zoptymalizować dopasowanie funkcji. Kliknij Użyj tego, aby wyświetlić wartości czułości i sztywności. Kliknij Zaakceptuj wartości. Powtórz te czynności dla sygnałów Y i Z. Zamknij okno. (patrz rysunek uzupełniający S6).
    UWAGA: Dopuszczalne są również procedury kalibracji ściegu w innych systemach pułapkowania optycznego lub systemach zbudowanych na zamówienie, które zostały solidnie przetestowane przez użytkownika, takie jak metoda ekwipartycji lub metoda siły oporu57,58.
  19. Znajdź wiązkę aktomiozyny, wyszukując na powierzchni szkiełka nakrywkowego kulki związane z AF.
  20. Po wykryciu koralika niezatłoczonego przez inne pływające koraliki, obserwuj AF wokół niego za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, aby zweryfikować obecność wiązki.
  21. Sprawdź, czy pakiet jest obecny, szukając obu fluorescencyjnych AF zlokalizowanych jednocześnie. Włącz źródło światła białego i użyj odpowiedniej kostki filtra, aby zobrazować każdy żarnik aktynowy, obracając wieżyczkę (kostki filtra wzbudzenia 488 nm i 532 nm odpowiednio dla wzbudzenia Alexa Fluor 488 i rodaminy). Patrz rysunek uzupełniający S4.
    UWAGA: Eksperyment kontrolny mający na celu weryfikację intensywności fluorescencji pojedynczych AF może być przydatny w identyfikacji wiązek, które składają się z pojedynczych włókien znakowanych 488 i pojedynczymi rodaminami, lub mających zastosowanie do dowolnego zestawu fluoroforów, który użytkownik zdecyduje się użyć.
  22. Po weryfikacji złap koralik przymocowany do górnego filamentu wiązki, klikając przycisk Trap Shutter.
  23. Użyj elementów sterujących na ekranie, aby zapisać dane, klikając przycisk Oscyloskop (rysunek uzupełniający S7). Aby wyświetlić pomiary bez rejestrowania danych, kliknij przycisk Start. Aby zapisać wszystkie dane, kliknij Autozapis. Aby zarejestrować pomiary, kliknij Rozpocznij nagrywanie. Wybierz, które dane mają być wizualizowane w czasie rzeczywistym (pozycja, siła, kierunek x, kierunek y), wybierając z rozwijanego menu sygnał X lub sygnał Y. Pamiętaj, że kierunek osi jest wyświetlany od lewej do prawej, a kierunek y to ruch w górę i w dół na ekranie. Patrz rysunek uzupełniający S7.
    UWAGA: Dane zostaną zapisane jako pliki .out i obejmują czas, napięcie, przemieszczenie i siłę dla każdego kierunku. Pliki te można wyeksportować do innego oprogramowania w celu wizualizacji i analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Komory przepływowe zawierające systemy pęczków akto-miozynowych mają standardową konstrukcję, składającą się z szkiełka przedmiotowego i trawionej lamelki, rozdzielonych kanałem wykonanym z dwustronnej taśmy klejącej (Rycina 1). Układ analityczny jest następnie budowany od lamelki w górę poprzez etapowe wprowadzanie składników, zgodnie z opisem w protokole. Końcowy układ składa się z matrycowych filamentów aktyny znakowanych rodaminą; pożądanego stężenia miozyny (dla reprezentatywnych wynikó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przeprowadzono badanie in vitro z użyciem pęsety optycznej w połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym w celu zbadania dynamiki zespołów miozyny oddziałujących z filamentami aktyny. Wiązki aktyna-miozyna-aktyna zostały złożone przy użyciu miozyny mięśniowej II, aktyny rodaminy na dole wiązki i na powierzchni szkiełka nakrywkowego oraz znakowanych 488, biotynylowanych włókien aktyny na górze wiązki. Białko aktynowe z mięśnia królika polimeryzowano i stabilizowano przy użyciu ogólnych aktynowych (GAB) i polimeryz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca jest częściowo wspierana przez University of Mississippi Graduate Student Council Research Fellowship (OA), University of Mississippi Sally McDonnell-Barksdale Honors College (JCW, JER), Mississippi Space Grant Consortium w ramach grantu numer NNX15AH78H (JCW, DNR) oraz American Heart Association w ramach grantu numer 848586 (DNR).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Białko aktyny (biotyna): mięśnie szkieletoweCytoszkieletAB07-ABiotynylowane białko aktynowe
Białko aktynowe, mięśnie szkieletowe królikaCytoszkieletAKL99-ABiałko aktynowe
Alexa Fluor 488 PhalloidinInvitrogenA12379Stabilizator aktyny i barwnik Alexa Fluor 488
ATPFisher scientificBP413-25Wymagane dla aktyny montaż i ruchliwość miozyny
Beta-D-glukozaFisherMP218069110naukowy Część systemu oczyszczania tlenu stosowany w celu zmniejszenia fotowybielania podczas obrazowania fluorescencyjnego
Blotting Grade Blocker (kazeina)Biorad1706404Służy do blokowania powierzchni przed niespecyficznym wiązaniem
CaCl2Fisher scientificC79500Chlorek wapnia, zapewnia niezbędną kontrolę nad dynamiką sieci miozyny aktynowej
KatalazaFisherICN10040280naukowy Część systemu oczyszczania tlenu stosowana w celu zmniejszenia fotowybielania podczas obrazowania fluorescencyjnego
Szkiełka nakrywkoweFisher scientific12544CSłuży do produkcji komórek przepływowych
DTTFisher scientificAC327190010Służy do przygotowania
buforuEtanolFisher scientificA4094Regent używany do czyszczenia szkiełek nakrywkowych
Oksydaza glukozowaFisher scientific34-538-610KUCzęść systemu oczyszczania tlenu stosowana w celu zmniejszenia fotowybielania podczas obrazowania fluorescencyjnego
KClFisher scientificP217-500Służy do przygotowania buforu
KOHFisher scientificP250-1Służy do wytrawiania szkiełek nakrywkowych i regulacji bufor pH
MgCl2Fisher scientificM33-500Służy do przygotowania buforu
Szkiełka mikroskopoweFisher scientific12-544-2Służy do wytwarzania komórek przepływowych
Białko miozyny II: mięśnie szkieletowe królikaCytoszkieletMY02Białko motoryczne miozyny o pełnej długości wyizolowane z mięśni szkieletowych królika
Nanotracker2Bruker/JPKNT2Przyrząd do pułapkowania optycznego
Poly-l-lizynaSigma-AldrichP8920Urządzenia do adhezji włókien aktynowych do szklanej powierzchni szkiełka nakrywkowego
Rodamina FalloidynaCytoszkieletPHDR1Stabilizator aktyny i barwienie fluorescencyjne rodaminy
Koraliki streptawidyny, 1 i mu; mSpherotechSVP-10-5Uchwyt optyczny
Tris-HClFisher scientificPR H5121Służy do przygotowania bufora

Bibliografia

  1. Goldstein, L. S. Kinesin molecular motors: transport pathways, receptors, and human disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 6999-7003 (2001).
  2. Lee Sweeney, H., Holzbaur, E. L. F. Motor proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (5), 021931(2018).
  3. O'Connell, C. B., Tyska, M. J., Mooseker, M. S. Myosin at work: Motor adaptations for a variety of cellular functions. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1773 (5), 615-630 (2007).
  4. Kaya, M., Tani, Y., Washio, T., Hisada, T., Higuchi, H. Coordinated force generation of skeletal myosins in myofilaments through motor coupling. Nature Communications. 8, 1-13 (2017).
  5. Akhshi, T. K., Wernike, D., Piekny, A. Microtubules and actin crosstalk in cell migration and division. Cytoskeleton. 71 (1), 1-23 (2014).
  6. Brawley, C. M., Rock, R. S. Unconventional myosin traffic in cells reveals a selective actin cytoskeleton. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9685-9690 (2009).
  7. Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125 (7), 1627-1632 (2012).
  8. Spudich, J. A., et al. Myosin structure and function. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 60, 783-791 (1995).
  9. Sommese, R. F., et al. Molecular consequences of the R453C hypertrophic cardiomyopathy mutation on human β-cardiac myosin motor function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12607-12612 (2013).
  10. Nag, S., et al. The myosin mesa and the basis of hypercontractility caused by hypertrophic cardiomyopathy mutations. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (6), 525-533 (2017).
  11. Kawana, M., Sarkar, S. S., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Biophysical properties of human b-cardiac myosin with converter mutations that cause hypertrophic cardiomyopathy. Science Advances. 3 (2), 1-11 (2017).
  12. Girolami, F., et al. Novel α-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: A massively parallel sequencing study. Circulation: Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).
  13. Debold, E. P., et al. Hypertrophic and dilated cardiomyopathy mutations differentially affect the molecular force generation of mouse α-cardiac myosin in the laser trap assay. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 293 (1), 284-291 (2007).
  14. Barron, J. T. Hypertrophic cardiomyopathy. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 1 (3), 277-282 (1999).
  15. Duke, T. A. J. Molecular model of muscle contraction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (6), 2770-2775 (1999).
  16. Vilfan, A., Duke, T. Instabilities in the transient response of muscle. Biophysical Journal. 85 (2), 818-827 (2003).
  17. Huxley, A. F. Muscle structure and theories of contraction. Progress in Biophysics and Biophysical Chemistry. 7, 255-318 (1957).
  18. Huxley, H. E. Fifty years of muscle and the sliding filament hypothesis. European Journal of Biochemistry. 271 (8), 1403-1415 (2004).
  19. Kad, N. M., Kim, S., Warshaw, D. M., VanBuren, P., Baker, J. E. Single-myosin crossbridge interactions with actin filaments regulated by troponin-tropomyosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (47), 16990-16995 (2005).
  20. Veigel, C., Molloy, J. E., Schmitz, S., Kendrick-Jones, J. Load-dependent kinetics of force production by smooth muscle myosin measured with optical tweezers. Nature Cell Biology. 5 (11), 980-986 (2003).
  21. Spudich, J. A. The myosin swinging cross-bridge model. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 2, 387-392 (2001).
  22. Simmons, R. M., Finer, J. T., Chu, S., Spudich, J. A. Quantitative measurements of force and displacement using an optical trap. Biophysical Journal. 70 (4), 1813-1822 (1996).
  23. Finer, J. T., Simmons, R. M., Spudich, J. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps. Nature. 368 (6467), 113-119 (1994).
  24. Kron, S. J., Uyeda, T. Q. P., Warrick, H. M., Spudich, J. A. An approach to reconstituting motility of single myosin molecules. Journal of Cell Science. 98, 129-133 (1991).
  25. Molloy, J. E., Burns, J. E., Kendrick-Jones, B., Tregear, R. T., White, D. C. S. Movement and force produced by a single myosin head. Nature. 378 (6553), 209-212 (1995).
  26. Ruegg, C., et al. Molecular motors: Force and movement generated by single Myosin II molecules. Physiology. 17 (5), 213-218 (2002).
  27. Nayak, A., et al. Single-molecule analysis reveals that regulatory light chains fine-tune skeletal myosin II function. Journal of Biological Chemistry. 295 (20), 7046-7059 (2020).
  28. Dupuis, D. E., Guilford, W. H., Wu, J., Warshaw, D. M. Actin filament mechanics in the laser trap. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 18 (1), 17-30 (1997).
  29. Tyska, M. J., et al. Two heads of myosin are better than one for generating force and motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4402-4407 (1999).
  30. Tyska, M. J., Warshaw, D. M. The myosin power stroke. Cell Motility and the Cytoskeleton. 51 (1), 1-15 (2002).
  31. Finer, J. T., et al. Characterization of single actin-myosin interactions. Biophysical Journal. 68, 291-296 (1995).
  32. Al Azzam, O., Trussell, C. L., Reinemann, D. N. Measuring force generation within reconstituted microtubule bundle assemblies using optical tweezers. Cytoskeleton. 78 (3), 111-125 (2021).
  33. Wagoner, J. A., Dill, K. A. Evolution of mechanical cooperativity among myosin II motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (20), 2101871118(2021).
  34. Walcott, S., Warshaw, D. M., Debold, E. P. Mechanical coupling between myosin molecules causes differences between ensemble and single-molecule measurements. Biophysical Journal. 103 (3), 501-510 (2012).
  35. Stewart, T. J., Murthy, V., Dugan, S. P., Baker, J. E. Velocity of myosin-based actin sliding depends on attachment and detachment kinetics and reaches a maximum when myosin-binding sites on actin saturate. Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101178(2021).
  36. Hilbert, L., Cumarasamy, S., Zitouni, N. B., Mackey, M. C., Lauzon, A. M. The kinetics of mechanically coupled myosins exhibit group size-dependent regimes. Biophysical Journal. 105 (6), 1466-1474 (2013).
  37. Debold, E. P., Walcott, S., Woodward, M., Turner, M. A. Direct observation of phosphate inhibiting the Force-generating capacity of a miniensemble of myosin molecules. Biophysical Journal. 105 (10), 2374-2384 (2013).
  38. Kaya, M., Higuchi, H. Nonlinear elasticity and an 8-nm working stroke of single myosin molecules in myofilaments. Science. 329 (5992), 686-689 (2010).
  39. Pertici, I., et al. A myosin II nanomachine mimicking the striated muscle. Nature Communications. 9 (1), 1-10 (2018).
  40. Cheng, Y. S., De Souza Leite, F., Rassier, D. E. The load dependence and the force-velocity relation in intact myosin filaments from skeletal and smooth muscles. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 318 (1), 103-110 (2020).
  41. Stam, S., Alberts, J., Gardel, M. L., Munro, E. Isoforms confer characteristic force generation and mechanosensation by myosin II filaments. Biophysical Journal. 108 (8), 1997-2006 (2015).
  42. Rastogi, K., Puliyakodan, M. S., Pandey, V., Nath, S., Elangovan, R. Maximum limit to the number of myosin II motors participating in processive sliding of actin. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  43. Debold, E. P., Patlak, J. B., Warshaw, D. M. Slip sliding away: Load-dependence of velocity generated by skeletal muscle myosin molecules in the laser trap. Biophysical Journal. 89 (5), 34-36 (2005).
  44. Albert, P. J., Erdmann, T., Schwarz, U. S. Stochastic dynamics and mechanosensitivity of myosin II minifilaments. New Journal of Physics. 16, (2014).
  45. Erdmann, T., Schwarz, U. S. Stochastic force generation by small ensembles of myosin II motors. Physical Review Letters. 108 (18), 1-5 (2012).
  46. Guo, B., Guilford, W. H. The tail of myosin reduces actin filament velocity in the in vitro motility assay. Cell Motility and the Cytoskeleton. 59 (4), 264-272 (2004).
  47. Miller-Jaster, K. N., Petrie Aronin, C. E., Guilford, W. H. A quantitative comparison of blocking agents in the in vitro motility assay. Cellular and Molecular Bioengineering. 5 (1), 44-51 (2012).
  48. Mansoon, A., Balaz, M., Albet-Torres, N., Rosengren, K. J. In vitro assays of molecular motors -- impact of motor-surface interactions. Frontiers in Bioscience. 13, 5732-5754 (2008).
  49. Persson, M., et al. Heavy meromyosin molecules extending more than 50 nm above adsorbing electronegative surfaces. Langmuir. 26 (12), 9927-9936 (2010).
  50. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  51. Yanagida, T., Nakase, M., Nishiyama, K., Oosawa, F. Direct observation of motion of single F-actin filaments in the presence of myosin. Nature. 307 (5946), 58-60 (1984).
  52. Tsuda, Y., Yasutake, H., Ishijima, A., Yanagida, T. Torsional rigidity of single actin filaments and actin-actin bond breaking force under torsion measured directly by in vitro micromanipulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (23), 12937-12942 (1996).
  53. Stewart, T. J., et al. Actin sliding velocities are influenced by the driving forces of actin-myosin binding. Cellular and Molecular Bioengineering. 6 (1), 26-37 (2013).
  54. Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).
  55. Fordyce, P. M., Valentine, M. T., Block, S. M. Advances in surface-based assays for single molecules. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , 431-460 (2008).
  56. Ozeki, T., et al. Surface-bound casein modulates the adsorption and activity of kinesin on SiO2 surfaces. Biophysical Journal. 96 (8), 3305-3318 (2009).
  57. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  58. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Review of Scientific Instruments. 75 (9), 2787-2809 (2004).
  59. Thoresen, T., Lenz, M., Gardel, M. L. Thick filament length and isoform composition determine self-organized contractile units in actomyosin bundles. Biophysical Journal. 104 (3), 655-665 (2013).
  60. Matusovsky, O. S., et al. Millisecond conformational dynamics of skeletal Myosin II power stroke studied by high-speed atomic force microscopy. ACS Nano. 15 (2), 2229-2239 (2021).
  61. Reinemann, D. N., et al. Collective force regulation in anti-parallel microtubule gliding by dimeric Kif15 kinesin motors. Current Biology. 27 (18), 2810-2820 (2017).
  62. Cordova, J. C., et al. Bioconjugated core-shell microparticles for high-force optical trapping. Particle and Particle Systems Characterization. 35 (3), 1-8 (2018).
  63. Reinemann, D. N., Norris, S. R., Ohi, R., Lang, M. J. Processive Kinesin-14 HSET exhibits directional flexibility depending on motor traffic. Current Biology. 28 (14), 2356-2362 (2018).
  64. Forth, S., Hsia, K. C., Shimamoto, Y., Kapoor, T. M. Asymmetric friction of nonmotor MAPs can lead to their directional motion in active microtubule networks. Cell. 157 (2), 420-432 (2014).
  65. Shimamoto, Y., Kapoor, T. M. Analyzing the micromechanics of the cell division apparatus. Methods in Cell Biology. 145, 173-190 (2018).
  66. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  67. Thoresen, T., Lenz, M., Gardel, M. L. Reconstitution of contractile actomyosin bundles. Biophysical Journal. 100 (11), 2698-2705 (2011).
  68. Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. Reconstitution of contractile actomyosin arrays. Methods in Enzymology. 540 (11), 265-282 (2014).
  69. Weirich, K. L., Stam, S., Munro, E., Gardel, M. L. Actin bundle architecture and mechanics regulate myosin II force generation. Biophysical Journal. 120 (10), 1957-1970 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dynamika bia ek motorycznychp czki aktyno miozynowegenerowanie si ypu apkowanie optycznetesty cytoszkieletowekalibracja kulekfluorescencyjne filamenty aktynowe
Sondowanie mechaniki zespołu miozyny w wiązkach filamentów aktynowych za pomocą pęsety optycznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.