Przedstawiono i omówiono tworzenie wiązek aktomiozyny in vitro oraz pomiar siły generowania zespołu miozyny za pomocą pęsety optycznej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Sondowanie mechaniki zespołu miozyny w wiązkach filamentów aktynowych za pomocą pęsety optycznej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Miozyny to białka motoryczne, które hydrolizują ATP, aby podążać wzdłuż ścieżek filamentu aktynowego (AF) i są niezbędne w procesach komórkowych, takich jak ruchliwość i skurcze mięśni. Aby zrozumieć mechanizmy generowania siły, miozyna II została przebadana zarówno na poziomie pojedynczej cząsteczki (SM), jak i jako zespoły silników in vitro przy użyciu metod biofizycznych, takich jak pułapkowanie optyczne.
Te badania wykazały, że zachowanie generujące siłę miozyny może się znacznie różnić, gdy przechodzi się z poziomu pojedynczej cząsteczki w układzie trzech koralików do grup silników współpracujących ze sobą na sztywnej powierzchni koralików lub szkiełek nakrywkowych w układzie ślizgowym. Jednak te konstrukcje testowe nie pozwalają na ocenę dynamiki grupowej miozyny w lepkosprężystej hierarchii strukturalnej, tak jak w komórce. Opracowaliśmy metodę wykorzystującą pęsetę optyczną do zbadania mechaniki generowania siły przez zespoły miozyny oddziałujące z wieloma włóknami aktyny.
Te pakiety aktomiozyny ułatwiają badanie w hierarchicznym i zgodnym środowisku, które rejestruje komunikację motoryczną i moc wyjściową zespołu. Konfigurowalny charakter testu pozwala na zmianę warunków eksperymentalnych w celu zrozumienia, w jaki sposób modyfikacje zespołu miozyny, wiązki włókien aktynowych lub otaczającego środowiska skutkują różnymi mocami wyjściowymi.
Wprowadzenie
Białka motoryczne są niezbędne do życia, przekształcając energię chemiczną w pracę mechaniczną1,2,3. Silniki miozyny oddziałują z filamentami aktyny, podejmując kroki wzdłuż włókien podobnych do toru, a dynamika sieci aktyna-miozyna przeprowadza skurcz mięśni, ruchliwość komórek, pierścień kurczliwy podczas cytokinezy i ruch ładunku wewnątrz komórki, wśród innych istotnych zadań3,4,5,6,7,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Trawienie szkiełek nakrywkowych
- Rozpuść 100 g KOH w 300 ml 100% etanolu w zlewce o pojemności 1 000 ml. Mieszać mieszadłem, aż większość KOH się rozpuści.
UWAGA: Skoncentrowany roztwór KOH może spowodować oparzenia i uszkodzenia odzieży. Nosić rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny. - Szkiełka nakrywkowe należy umieszczać pojedynczo w stojakach do czyszczenia szkiełek nakrywkowych.
UWAGA: Stojaki są zaprojektowane ze szczelinami, które utrzymują pojedyncze szkiełka nakrywkowe w odstępach od siebie, aby umożliwić trawienie i płukanie na każdej powierzchni szkiełka nakrywkowego, otwory odpływowe w dnie i ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Komory przepływowe zawierające systemy pęczków akto-miozynowych mają standardową konstrukcję, składającą się z szkiełka przedmiotowego i trawionej lamelki, rozdzielonych kanałem wykonanym z dwustronnej taśmy klejącej (Rycina 1). Układ analityczny jest następnie budowany od lamelki w górę poprzez etapowe wprowadzanie składników, zgodnie z opisem w protokole. Końcowy układ składa się z matrycowych filamentów aktyny znakowanych rodaminą; pożądanego stężenia miozyny (dla reprezentatywnych wynikó.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przeprowadzono badanie in vitro z użyciem pęsety optycznej w połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym w celu zbadania dynamiki zespołów miozyny oddziałujących z filamentami aktyny. Wiązki aktyna-miozyna-aktyna zostały złożone przy użyciu miozyny mięśniowej II, aktyny rodaminy na dole wiązki i na powierzchni szkiełka nakrywkowego oraz znakowanych 488, biotynylowanych włókien aktyny na górze wiązki. Białko aktynowe z mięśnia królika polimeryzowano i stabilizowano przy użyciu ogólnych aktynowych (GAB) i polimeryz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca jest częściowo wspierana przez University of Mississippi Graduate Student Council Research Fellowship (OA), University of Mississippi Sally McDonnell-Barksdale Honors College (JCW, JER), Mississippi Space Grant Consortium w ramach grantu numer NNX15AH78H (JCW, DNR) oraz American Heart Association w ramach grantu numer 848586 (DNR).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Białko aktyny (biotyna): mięśnie szkieletowe | Cytoszkielet | AB07-A | Biotynylowane białko aktynowe |
| Białko aktynowe, mięśnie szkieletowe królika | Cytoszkielet | AKL99-A | Białko aktynowe |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Stabilizator aktyny i barwnik Alexa Fluor 488 |
| ATP | Fisher scientific | BP413-25 | Wymagane dla aktyny montaż i ruchliwość miozyny |
| Beta-D-glukoza | Fisher | MP218069110 | naukowy Część systemu oczyszczania tlenu stosowany w celu zmniejszenia fotowybielania podczas obrazowania fluorescencyjnego |
| Blotting Grade Blocker (kazeina) | Biorad | 1706404 | Służy do blokowania powierzchni przed niespecyficznym wiązaniem |
| CaCl2 | Fisher scientific | C79500 | Chlorek wapnia, zapewnia niezbędną kontrolę nad dynamiką sieci miozyny aktynowej |
| Katalaza | Fisher | ICN10040280 | naukowy Część systemu oczyszczania tlenu stosowana w celu zmniejszenia fotowybielania podczas obrazowania fluorescencyjnego |
| Szkiełka nakrywkowe | Fisher scientific | 12544C | Służy do produkcji komórek przepływowych |
| DTT | Fisher scientific | AC327190010 | Służy do przygotowania |
| buforuEtanol | Fisher scientific | A4094 | Regent używany do czyszczenia szkiełek nakrywkowych |
| Oksydaza glukozowa | Fisher scientific | 34-538-610KU | Część systemu oczyszczania tlenu stosowana w celu zmniejszenia fotowybielania podczas obrazowania fluorescencyjnego |
| KCl | Fisher scientific | P217-500 | Służy do przygotowania buforu |
| KOH | Fisher scientific | P250-1 | Służy do wytrawiania szkiełek nakrywkowych i regulacji bufor pH |
| MgCl2 | Fisher scientific | M33-500 | Służy do przygotowania buforu |
| Szkiełka mikroskopowe | Fisher scientific | 12-544-2 | Służy do wytwarzania komórek przepływowych |
| Białko miozyny II: mięśnie szkieletowe królika | Cytoszkielet | MY02 | Białko motoryczne miozyny o pełnej długości wyizolowane z mięśni szkieletowych królika |
| Nanotracker2 | Bruker/JPK | NT2 | Przyrząd do pułapkowania optycznego |
| Poly-l-lizyna | Sigma-Aldrich | P8920 | Urządzenia do adhezji włókien aktynowych do szklanej powierzchni szkiełka nakrywkowego |
| Rodamina Falloidyna | Cytoszkielet | PHDR1 | Stabilizator aktyny i barwienie fluorescencyjne rodaminy |
| Koraliki streptawidyny, 1 i mu; m | Spherotech | SVP-10-5 | Uchwyt optyczny |
| Tris-HCl | Fisher scientific | PR H5121 | Służy do przygotowania bufora |
Bibliografia
- Goldstein, L. S. Kinesin molecular motors: transport pathways, receptors, and human disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 6999-7003 (2001).
- Lee Sweeney, H., Holzbaur, E. L. F.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
