Artykuł metodologiczny

Model padaczki o etiologii zakaźnej z wykorzystaniem wirusa mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera

3.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63673

⸱

23 czerwca 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Utah, 2Interdepartmental Program in Neuroscience, University of Utah, 3Faculty of Veterinary Medicine, Institute of Pharmacology and Toxicology, Freie Universität Berlin

W tym artykule

Podsumowanie

Zakażenie śródmózgowe wirusem mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera (TMEV) u myszy C57BL/6 powiela wiele wczesnych i przewlekłych objawów klinicznych wirusowego zapalenia mózgu i późniejszej padaczki u ludzi. W artykule opisano zakażenie wirusem, objawy i histopatologię modelu TMEV.

Streszczenie

Jedną z głównych przyczyn epilepsji jest infekcja ośrodkowego układu nerwowego (OUN); około 8% pacjentów, którzy przeżyją taką infekcję, rozwija epilepsję w konsekwencji, przy czym wskaźniki te są znacznie wyższe w mniej rozwiniętych gospodarczo krajach. Praca ta zawiera przegląd modelowania padaczki o etiologii zakaźnej i wykorzystania jej jako platformy do testowania nowych związków przeciwpadaczkowych. Przedstawiono protokół indukcji padaczki przez niestereotaktyczne wstrzyknięcie domózgowe wirusa mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera (TMEV) u myszy C57BL / 6, który powiela wiele wczesnych i przewlekłych objawów klinicznych wirusowego zapalenia mózgu i późniejszej padaczki u ludzi. Opisano kliniczną ocenę myszy podczas zapalenia mózgu w celu monitorowania aktywności napadowej i wykrywania potencjalnych skutków przeciwpadaczkowych nowych związków. Ponadto przedstawiono histopatologiczne konsekwencje wirusowego zapalenia mózgu i napadów padaczkowych, takich jak uszkodzenie hipokampa i zapalenie nerwów, a także konsekwencje długoterminowe, takie jak spontaniczne napady padaczkowe. Model TMEV jest jedną z pierwszych translacyjnych, opartych na infekcjach, eksperymentalnych platform, która pozwala na badanie mechanizmów rozwoju padaczki w wyniku zakażenia OUN. W związku z tym służy również do identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych i związków dla pacjentów zagrożonych rozwojem padaczki po zakażeniu OUN.

Wprowadzenie

Jedną z częstych konsekwencji wirusowego zapalenia mózgu są napady padaczkowe. Wiele infekcji wirusowych wywołuje objawowe drgawki w ostrej fazie infekcji; Ryzyko takich napadów wzrasta o ponad 20% wśród ogółu społeczeństwa1,2,3. Pacjenci, którzy przeżyją zakażenie, mają również zwiększone ryzyko rozwoju przewlekłej padaczki o 4%-20% w ciągu miesięcy lub lat po zakażeniu1,4. Wirus mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera (TMEV) został zidentyfikowany jako odpowiedni wirus do badania ostrych i przewlekłych napadów padaczkowych w mysim modelu wirusowego zapalenia mózgu5,6,7. TMEV jest bezotoczkowym, jednoniciowym wirusem RNA o dodatnim znaczeniu z rodziny Picornaviridae i tradycyjnie był używany do badania demielinizacji rdzenia kręgowego myszy SJL, przed którą myszy C57BL / 6 (B6) są chronione, ponieważ mają zdolność do szybkiego usuwania wirusa po zakażeniu. Jednak TMEV wywołuje ostre napady u 50%-75% samców i samic myszy B6 w ciągu pierwszego tygodnia po zakażeniu (pi), podczas gdy około 25%-40% rozwija przewlekłą padaczkę od tygodni do miesięcy pi2,5,6,8,9. Oprócz napadów padaczkowych, myszy wykazują również wspólną histopatologię padaczkowego hipokampa z neurodegeneracją i glejozą5,6,8,10,11,12. Co więcej, myszy B6 zakażone TMEV osiągają znacznie gorsze wyniki w testach behawioralnych dotyczących uczenia się i pamięci oraz mają współistniejące choroby poznawcze, co obserwuje się również u pacjentów klinicznych z padaczką13,14,15.

Tradycyjnie, modele epilepsji i napadów wykorzystują albo zastosowanie substancji chemokonvulsantowych, albo stymulacji elektrycznej do wywołania napadów; jednak modele te nie mają poprawności konstrukcyjnej i często wykazują poważniejsze napady i uszkodzenia mózgu niż są obserwowane u pacjentów klinicznych16. Nie ma modelu, który byłby odpowiedni dla każdego pytania badawczego17. Wykorzystanie modelu TMEV jest szczególnie interesujące, jeśli bada się czynniki predysponujące do rozwoju napadów po zakażeniu OUN lub jeśli związki są badane pod kątem ich skuteczności przeciwpadaczkowej.

Ponieważ model TMEV został stworzony i używany w kilku różnych laboratoriach na całym świecie, autorzy zidentyfikowali wiele szczegółów, które pozwalają na udaną implementację modelu, np. specyfikę różnych szczepów wirusa i myszy. Najbardziej wiarygodną indukcję napadów padaczkowych uzyskano przy użyciu szczepu Daniela myszy TMEV i B6J2,5,6,8,9. Model jest obecnie używany przez National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) jako platforma do identyfikacji nowych leków przeciwko padaczce i napadom padaczkowym18,19. Niniejszy artykuł zawiera szczegółowy protokół indukcji wirusa i monitorowania klinicznego, aby umożliwić innym badaczom wykorzystanie tego modelu wirusowego zapalenia mózgu do dalszego zrozumienia mechanizmów choroby, a także do testowania leków.

Poniższy protokół odzwierciedla badanie przeznaczone do testowania związków w tym modelu, chociaż można przeprowadzić wiele innych rodzajów badań. Myszy są znieczulane na krótko przed wstrzyknięciem szczepem TMEV Daniela w obszar skroniowy prawej półkuli (tylna i przyśrodkowa do prawego oka). W zależności od pytania badawczego, jeśli wymagane są niezakażone zwierzęta kontrolne, myszy otrzymują sterylną sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, pH 7,4, w tym KH2PO4 [1,06 mM], NaCl [155,17 mM] i Na2HPO4·7H2O [2,97 mM]) zamiast TMEV. Wcześniejsze doświadczenia na myszach zakażonych TMEV wykazały, że napady wywołane obchodzeniem się z dzieckiem występują między 3. a 7. dniem po zakażeniu. Częstotliwość wstrzykiwania, droga i czas testowania związków doświadczalnych różnią się w zależności od ich właściwości. Zaleca się szczepienie wirusa w piątek, co pozwala na monitorowanie napadów w dniach 3-7 w następnym tygodniu, od poniedziałku do piątku. Podczas tygodnia monitorowania napadów można podawać eksperymentalne związki (i.p.) dwa razy dziennie (w odstępie co najmniej 4 godzin), chyba że kinetyka lub mechanizm działania związku sugerują inaczej. Monitorowanie napadów padaczkowych podczas leczenia można przeprowadzić we wcześniej ustalonym punkcie czasowym. Czas wstrzykiwania i obserwacji różni się w zależności od poszczególnych związków. Zwierzętom wstrzykuje się badany związek lub nośnik zamiast związku narkotykowego. Te dwie grupy mogą być traktowane i obserwowane analogicznie do grupy eksperymentalnej. Podczas eksperymentu jedna osoba zajmująca się myszami i oceniająca napady powinna być ślepa na leczenie.

Protokół

Wszystkie opisane procedury zostały zatwierdzone przez odpowiednie władze. Zwierzęta są utrzymywane zgodnie z zaleceniami zawartymi w "Przewodniku opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych" (Krajowa Rada ds. Badań Naukowych) oraz zgodnie z polityką Publicznej Służby Zdrowia i Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki i Wykorzystywania Zwierząt na Uniwersytecie Utah, protokół dla zwierząt (numer: 21-11009, Wydział Farmakologii i Toksykologii) oraz na Freie Universität Berlin (protokół: G0015/21, LAGeSo Berlin, Instytut Farmakologii i Toksykologii). Wyniki przedstawione w Rysunek 3 i Rysunek 5 zostały zatwierdzone pod numerami 33.9-42502-04-11/0516 i 33.9-42502-04-15/1892 (LAVES Oldenburg, Wydział Farmakologii, Toksykologii i Farmacji, Uniwersytet Medycyny Weterynaryjnej w Hanowerze).

1. Rozważania i przygotowania do projektowania badania

  1. wirus
    1. Szczep TMEV Daniela został dostarczony dzięki uprzejmości Roberta Fujinami z University of Utah. Pierwotnie został wyizolowany od myszy w kolonii Harvarda20. Przed przystąpieniem do TMEV należy zapoznać się ze szczegółową klasyfikacją i przepisami dotyczącymi czynników biologicznych w poszczególnych krajach i przedyskutować z personelem instytucji ds. bezpieczeństwa biologicznego, aby zapewnić zgodność z przepisami. Zazwyczaj TMEV jest klasyfikowany jako BSL 2, w zależności od szczepu i modyfikacji genetycznych. Standardowa dawka niezbędna do wywołania napadów padaczkowych u większości zwierząt wynosi 3 x 105 jednostek tworzących blaszkę miażdżycową (PFU).
      UWAGA: Może być konieczne dostosowanie dawki, na przykład, jeśli używane są myszy transgeniczne. Ogólnie rzecz biorąc, miana między 2 x 104 PFU a 2,44 x 107 PFU były stosowane do skutecznego wywoływania napadów. Zwierzęta kontrolne otrzymują sterylny PBS i nie doświadczają napadów padaczkowych. Wirus nie zakaża ludzi; jednak środki ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawice, okulary ochronne) powinny być noszone przez eksperymentatorów przez cały czas, a tusze myszy i ściółka powinny być sterylizowane w autoklawie przed usunięciem.
  2. zwierzęta
    1. Do wywoływania i badania napadów należy używać myszy B6J, ponieważ inne szczepy myszy niekoniecznie wykazują napady, np. SJL/J, FVB/N lub Balb/c mice5. Nie ma różnicy między samicami i samcami myszy pod względem częstości występowania ostrych napadów5. Przeprowadź eksperymenty na młodocianych i dorosłych myszach (począwszy od 5-6 tygodnia życia).
  3. dieta
    1. Dieta została uznana za jedno ze źródeł zmienności nasilenia choroby między laboratoriami, dlatego należy rozważyć dietę jako potencjalny czynnik zmienności22.
  4. Wielkość grupy
    1. Ponieważ nie u wszystkich zwierząt rozwijają się ostre lub przewlekłe napady padaczkowe w tym modelu, do testów złożonych należy użyć około 20 myszy / grupę.
  5. Dobrostanu
    1. Jeśli jakakolwiek mysz wykaże znaczące działania niepożądane wynikające z zakażenia lub podania badanego związku (np. letarg, zła pielęgnacja, nadmierne zaczerwienienie i ropna wydzielina z rany) po czasie obserwacji określonym przez lokalne wytyczne IACUC (np. 48 godzin), należy poddać mysz eutanazji w sposób humanitarny.
    2. Humanitarną eutanazję każdej myszy wykazującej ekstremalną utratę masy ciała (>20%) w okresie infekcji.
    3. Jeśli zwierzęta nie jedzą prawidłowo, zapewnij im dostęp do dodatkowych granulek zwilżonych pediatrycznym roztworem elektrolitu lub podobnym roztworem.

2. Inokulacja wirusa

  1. Sterylizacja strzykawki iniekcyjnej
    1. Zdjąć nakrętkę strzykawki insulinowej. Dodać rurkę polietylenową jako kołnierz wokół igły, aby zapewnić odpowiednią głębokość wstrzyknięcia 2,5 mm. Zanurzyć strzykawkę w etanolu na 30 minut. Umieścić strzykawkę w świetle UV na 30 minut.
    2. Założyć nasadkę z powrotem na igłę. Zawinąć strzykawkę w woreczek sterylizacyjny i zakleić taśmą klejącą. Etykieta z datą przygotowania.
  2. Wstrzyknięcie wirusa
    1. Pobierz porcje szczepu TMEV Daniela z zamrażarki w temperaturze -80 °C. Rozmrozić wirusa i trzymać go na lodzie. Unikaj rozmrażania i ponownego zamrażania wirusa. Umieścić w strzykawce zawiesinę wirusa (3 x 105 PFU rozcieńczoną w 20 μl pożywki hodowlanej PBS lub DMEM).
      UWAGA: Wirus jest zakaźny dla myszy, ale nie dla ludzi.
    2. Wyczyść ławkę środkiem dezynfekującym i pracuj pod pochłaniaczem oparów. Inokulacja wirusa nie jest sterylna, ale jest tak czysta, jak to tylko możliwe.
    3. Przenieś mysz do komory indukcyjnej znieczulenia i użyj 2% izofluranu w tlenie, aby wywołać znieczulenie. Osiągnięcie tolerancji chirurgicznej zajmuje kilka minut; Dostosuj stężenie w zależności od oddechu zwierzęcia i głębokości znieczulenia.
    4. Przenieś znieczuloną mysz z pudełka anestezjologicznego pod maskę. Sprawdź tolerancję chirurgiczną, np. poprzez uszczypnięcie palca u nogi. Cała procedura wykonywana jest w czasie krótszym niż 30 sekund, dzięki czemu zwierzę nie musi wdychać izofluranu podczas iniekcji. Dodaj maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
    5. Oczyść głowę zwierzęcia wacikiem nasączonym alkoholem. Lekko przechylić głowę myszy w lewo, tak aby miejsce wstrzyknięcia było skierowane do góry.
    6. Pociągnąć skórę nieco do tyłu, wprowadzić igłę do głowy i wstrzyknąć 20 μl śródkorowo na głębokość 2,5 mm w okolicę skroniową prawej półkuli (z tyłu i przyśrodkowo do prawego oka).
    7. Wstrzyknięcie należy wykonać jednostronnie w tę samą półkulę u wszystkich zwierząt. Użyj oka i ucha jako punktów orientacyjnych dla lokalizacji kory ciemieniowej. Umiejscowienie zostało wcześniej zweryfikowane histologicznie; zobacz Rysunek 1. Współrzędne iniekcji zgodnie z iniekcją stereotaktyczną w stosunku do bregmy wynoszą −2,0 (AP); +3,0 (ML); −1,5 (DV).
    8. Pozostawić strzykawkę na miejscu na 5-15 sekund. Zanotować, czy nie ma wycieku z wstrzyknięcia lub czy widoczne są pęcherzyki powietrza - w takim przypadku należy przygotować nową strzykawkę. Ostrożnie wyciągając strzykawkę, należy ją lekko obrócić. Nałóż maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu pod narkozą.
    9. OPCJONALNIE: Zakoduj zwierzę na ogonie lub uchu w zależności od lokalnych procedur (opcjonalnie, ale łatwo, ponieważ zwierzę jest nieprzytomne).
    10. Przenieść zwierzę do nowej klatki, która jest umieszczana w połowie na poduszce grzewczej (35-40 °C) podczas rekonwalescencji po znieczuleniu. Nie pozostawiaj zwierząt bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.
      UWAGA: Zwierzęta mogą być ponownie trzymane w grupach po wyzdrowieniu (zakażone zwierzęta nie są mieszane ze zwierzętami pozorowanymi zarażonymi). Zakażone myszy nie powinny być trzymane w tym samym pomieszczeniu co myszy niezakażone.
    11. Śledź wagę myszy przez pierwsze 7 dni pi ponieważ tracą na wadze po infekcji i mogą wymagać dodatkowego karmienia.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat procedury wstrzykiwania TMEV. Od lewej do prawej: W przypadku wstrzyknięcia prawej kory ciemieniowej igłę wstrzykuje się nieco z boku wyimaginowanej linii między okiem a uchem przeciwległym. Kołnierz do kontroli głębokości jest oznaczony kolorem żółtym. Droga iniekcyjna jest widoczna w koronalnym odcinku mózgu, oznaczonym strzałką. Miejsce wstrzyknięcia odpowiada współrzędnym podanym nad strzałką. Prawy obraz przedstawia rozmieszczenie wirusa Theilera (fioletowy) w CA1 formacji hipokampa. Figura została przygotowana przy użyciu biorender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Testowanie związków

  1. Przygotowanie mieszanki
    1. Zapoznaj się z instrukcjami dotyczącymi formułowania. Przygotuj rozwiązanie pojazdu zgodnie z zaleceniami lub dostarczonymi instrukcjami. Jako przykład przedstawiono procedurę leczenia lekiem przeciwpadaczkowym lewetyracetamem (LEV). LEV zmniejsza obciążenie napadami do 30%-40% poziomu nośnika przy dawce 350 mg/kg. Nośnikiem użytym w tym badaniu jest 0,5% metylocelulozy.
    2. Oblicz dawki w zależności od związku. Zważ lek zgodnie z obliczeniami. W leczeniu 1 kg myszy należy odważyć 350 mg LEV.
    3. Przygotować roztwór podstawowy z odpowiednią objętością roztworu nośnika, zgodnie z zaleceniami dotyczącymi formułowania (np. sonikacja, substancje pomocnicze w podłożu itp.). Biorąc pod uwagę objętość wstrzyknięcia wynoszącą 0,01 ml/g myszy, objętość wstrzyknięcia na 1 kg wynosiłaby 10 ml z 350 mg LEV, co daje roztwór 35 mg/ml19. Należy podać obliczenie i dawkę w mg/kg mc. oraz objętość w ml.
      UWAGA: Przykładowy protokół można znaleźć na stronie 2 Materiałów Uzupełniających 1.
  2. Podawanie związków
    1. Losowo dobieraj klatki do nośnika lub grupy złożonej. Używaj pozorowanych zakażonych myszy do badań nad mechanizmami rozwoju padaczki lub do celów walidacyjnych, ale nie do rutynowych badań przesiewowych leków.
    2. Raportuj warunki otoczenia, takie jak temperatura, wilgotność, pora dnia itp.
    3. Zmieszać roztwór ze związkiem, a także roztworem nośnika. Odessać nośnik lub związek do strzykawki i oznaczyć je kolorem, aby zapobiec pomieszaniu.
    4. Zważ zwierzęta. Upewnij się, że myszy B6J ważą >18 g w dniu 3 pi (nie zaokrąglone). Podaj wagę.
    5. Związek należy podawać (np. we wstrzyknięciu dootrzewnowym lub innymi odpowiednimi drogami). Napisz czas i drogę podania.
    6. Należy monitorować zwierzęta pod kątem wszelkich zmian w zachowaniu po podaniu związku, zwłaszcza po pierwszych wstrzyknięciach. Jeśli wystąpią drgawki, należy zgłosić intensywność napadów zgodnie z skalą Racine'a23; Patrz krok 3.2.
      UWAGA: Przykładowy protokół podawania leku złożonego można znaleźć w Materiałach Uzupełniających 1, strona 3, natomiast napady zaobserwowane podczas podawania zostaną odnotowane w Materiałach Uzupełniających 1, strony 4-5.
  3. Monitorowanie napadów padaczkowych wywołanych postępowaniem z użyciem polecenia
    1. Wykonaj tę procedurę przez eksperymentatora ślepego na leczenie. Przynieś wszystkie klatki na ławkę. Obserwuj zwierzęta pod kątem napadów padaczkowych 2 razy dziennie w fazie światła.
    2. Oceń aktywność napadową za pomocą zmodyfikowanej skali Racine'a23: 0 = brak zmian w zachowaniu, 1 = ruchy ust i twarzy, 2 = głową, 3 = jednostronne klonus kończyn przednich, 4 = obustronny klonus kończyn przednich z odchodem, 5 = uogólniona aktywność toniczno-kloniczna z utratą tonu posturalnego, czasami skakanie, 6 = długotrwałe i nadmierne skakanie i nadpobudliwość. Zgłaszaj liczbę i intensywność napadów.
    3. Przesuń długopis po klatce, aby narobić trochę hałasu.
    4. Przenieś każde zwierzę do innego pudełka i z powrotem.
    5. Delikatnie potrząśnij klatką ruchem w przód iw tył, uważając, aby nie potrząsnąć klatką tak energicznie, że zwierzęta uderzą w boki lub górę klatki i będą narażone na obrażenia fizyczne.
    6. Monitoruj wszystkie zwierzęta w klatce pod kątem napadów. W dowolnym momencie, jeśli mysz ma napad, przenieś ją z powrotem do klatki domowej i zapisz poziom napadu bez dalszej stymulacji napadu poprzez hałas lub obchodzenie się.
    7. W przypadku zwierząt, które nie chwyciły się samoistnie lub po delikatnym potrząśnięciu klatką, wywołaj drgawki poprzez bardziej intensywne obchodzenie się: Ostrożnie odwróć mysz, obracając ją za ogon od lewej do prawej.
      UWAGA: Zwierzęta z napadami padaczkowymi są nadpobudliwe i mogą być nerwowe.
    8. Ponownie obserwuj każde zwierzę pod kątem napadów. Powtórz ten proces dla kolejnych klatek.
      UWAGA: Przykładowy protokół monitorowania napadów można znaleźć w Materiałach Uzupełniających 1, strony 6-7.
  4. Raport danych na temat skutków złożonych
    1. Analizuj dzienną masę ciała za pomocą powtarzanych pomiarów (RM) ANOVA.
    2. Użyj dziennych skumulowanych wartości obciążenia konfiskatą, aby uzyskać graficzne przedstawienie danych. Należy przedstawić dane dotyczące skuteczności (liczba zwierząt, u których nie wystąpiły napady Racine'a w stadium 3-5) jako liczbę zwierząt objętych ochroną/liczbę badanych w każdej odpowiedniej grupie (zwykle N = 20). W związku z tym należy porównać dane między grupami leczonymi podłożem i narkotykami pod kątem odpowiedzi (napad padaczkowy lub brak napadu) za pomocą dokładnego testu Fishera.
      UWAGA: Zwierzę jest uważane za "chronione" przed napadami, jeśli ma napad w stadium 2 lub krótszym, a zwierzęta niechronione mają napady w stadium 3-5.
    3. Przeanalizuj dane dotyczące tolerancji w podobny sposób, jak liczba zwierząt z zaburzeniami behawioralnymi lub skutkami toksycznymi/liczba badanych w każdej grupie. Zwróć uwagę na wszelkie działania niepożądane, w tym zgony.
    4. Jeśli mniej niż 50% myszy, którym wstrzyknięto pojazd, dojdzie do ostrego zatarcia, nie należy brać pod uwagę danych.

Wyniki

Wpływ na ostre napady padaczkowe
Napady behawioralne są rejestrowane, jeśli wystąpią podczas wstrzykiwania leku (DI) lub podczas kolejnych sesji obsługi/monitorowania napadów AM/PM. Napady zaobserwowane podczas obchodzenia się z napadami można przedstawić w postaci mapy cieplnej, która jest pokazana na rycinie 2 dla LEV (350 mg/kg). Do celów analizy obciążenia napadami przyjmuje się średnią końcowych (dzień 7) skumulowanych wartości obciążenia napadami dla grupy leczonej nośnikiem i porównuje się ją za pomocą testu U Manna-Whitneya z grupą leczoną związkiem (wartości obciążenia napadami obejmują wartości zebrane podczas obserwacji po wstrzyknięciu). W przypadku skuteczności złożonej, dokładny test Fishera określa, czy istnieje statystyczna różnica w skuteczności między grupami leczonymi nośnikiem i lekiem. Podobnie, dane dotyczące tolerancji są analizowane za pomocą dokładnego testu Fishera. Analiza masy ciała jest przeprowadzana za pomocą ANOVA z powtarzanymi pomiarami w celu określenia zmian w trakcie eksperymentu, a także różnic między myszami leczonymi związkiem i nośnikiem.

figure-results-1
Rysunek 2: Mapa termiczna napadów behawioralnych po testach z użyciem nośnika (0,5% metylocelulozy) lub LEV (350 mg/kg). Wstrzyknięcia dwa razy na dobę wykonywano na 1 godzinę przed rozpoczęciem leczenia i obserwacją napadów. Napady behawioralne rejestrowano, jeśli wystąpiły podczas wstrzykiwania leku (DI) lub podczas kolejnych sesji obsługi/monitorowania napadów AM/PM. LEV (350 mg/kg) znacznie zmniejsza napady padaczkowe obserwowane podczas sesji manipulacyjnych (35,9% obciążenia związanego z napadami padaczkowymi pojazdu) w ciągu 5-dniowego okresu obserwacji. Mapa cieplna jest tworzona poprzez zobrazowanie etapu napadów 1-3 na zielono, 4 na żółto i 5 na pomarańczowo. Ten nowy rysunek został utworzony na podstawie opublikowanego zestawu danych19. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Padaczka przewlekła
Oprócz zgłoszonego obciążenia napadami w pierwszym tygodniu liczby pi, istnieje kilka odczytów, które mogą być przydatne w zależności od badania i hipotezy. Jeśli zwierzęta są trzymane przez długi czas, w podgrupie zakażonych zwierząt rozwiną się spontaniczne napady padaczkowe po kilku tygodniach liczby pi, które występują rzadziej niż ostre napady, a zatem wymagają zapisu EEG. Aby zarejestrować EEG od myszy, elektrody muszą być wszczepione do stereotaktycznego zabiegu chirurgicznego24. Rysunek 3 pokazuje różne zdarzenia padaczkowe w fazie przewlekłej poprzez zapis EEG u myszy zakażonych TMEV8.

figure-results-2
Rysunek 3: Typowe ślady EEG w fazie przewlekłej (14 tygodni pi) po zakażeniu wirusem DA u myszy. (A-C) Reprezentatywne zdarzenia EEG, w których nie zaobserwowano behawioralnej korelacji motorycznej, tj. (A) pojedyncze skoki, (B) skupiska kolców, (C) jak również napad elektrograficzny, przypuszczalnie ogniskowy. (D-F) Reprezentatywne zdarzenia EEG z korelacjami behawioralnymi. Mysz zilustrowana w D miała zdarzenia podobne do napadów z drganiami mioklonicznymi (oznaczone przez "M", którym towarzyszyły artefakty ruchowe), stereotypowymi ruchami (wskazywanymi przez "naciśnięcie głowy", gdy mysz płasko naciskała głowę na ziemię) lub zatrzymaniem behawioralnym; "Scr" opisuje artefakt ruchowy drapania, (E) i (F) wykazują typowe zmiany EEG podczas uogólnionych napadów konwulsyjnych: (E) napad Racine'a w stadium 3 o czasie trwania 22 s i 1 Hz oraz (F) napad w stadium 5 o czasie trwania 34 s i 5,4 Hz. Ten rysunek został opublikowany przed8 i jest przedrukowany za zgodą Elsevier. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Histologia
Ponieważ padaczce i drgawkom zwykle towarzyszy patologia hipokampa u pacjentów, która jest rekapitulowana w modelach eksperymentalnych, większość laboratoriów analizuje również zmiany w hipokampie lub wpływ potencjalnego leczenia przeciwpadaczkowego na patologię. Często analizowane parametry obejmują neurodegenerację i kurczenie się hipokampa, a także stan zapalny poprzez znakowanie określonych populacji komórek odpornościowych. W przypadku takich analiz, pod koniec eksperymentu, myszy są głęboko znieczulane, dopóki nie nastąpi zatrzymanie oddechu, a tętno znacznie zwolni lub wykaże arytmię. Krew jest usuwana przez wewnątrzsercową perfuzję PBS, a następnie 4% paraformaldehyd (PFA)25 w celu utrwalenia tkanki. Tkanka jest następnie przetwarzana przez kriosekcję i barwienie (immuno)26, a następnie analizy mikroskopowe.

figure-results-3
Rysunek 4: Zwyrodnienie hipokampa u myszy zakażonych padaczką TMEV. (A,B) Skrawki koronalne zabarwione fioletem krezynowym wykazują normalną cytoarchitekturę u myszy (A) kontrolnej (PBS) i zwyrodnienie hipokampa u myszy (B) TMEV po 2 miesiącach liczby pi. Uwaga: Powiększone komory boczne, zapadnięcie się zębodołu i ścieńczenie warstwy komórek piramidowych. (C) Kwantyfikacja tego uszkodzenia wykazuje znaczne zmniejszenie powierzchni hipokampa i odpowiadający mu wzrost obszaru komorowego myszy TMEV (N = 7) w porównaniu z myszami PBS (N = 6; dane są średnie ± SEM; p < 0,001; Test t-Studenta). (D,E) Znakowanie NeuN dodatkowo ilustruje wielkość utraty komórek neuronalnych w odcinkach pobranych w wieku 6 miesięcy liczby pi. Strzałki wskazują obszary z całkowitą utratą komórek piramidalnych. (E) Zakręt zębaty wydaje się być stosunkowo nienaruszony nawet u myszy z padaczką. Podziałka = (A,B) 2 mm; (D,E) 0,5 mm. Ten rysunek został już wcześniej opublikowany6 i jest przedrukowany za zgodą Oxford University Press. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 5: Reprezentatywne mikrofotografie o różnym nasileniu infiltracji limfocytów T z powodu ostrego zapalenia mózgu po 7 dniach od infekcji. Odcinki seryjne zawierające hipokamp grzbietowy ipsilateralny wybarwiono przeciwciałami przeciwko CD3 w celu znakowania limfocytów T. (A,D) Normalny hipokamp bez infiltracji limfocytów T, jak to wyglądało u zwierząt zakażonych pozorami. (B, E) Umiarkowana infiltracja limfocytów T, jak obserwuje się u większości myszy zakażonych TMEV. (C, F) Ciężki naciek limfocytów T, który zaobserwowano tylko u niektórych zakażonych myszy. Ten rysunek został opublikowany przed8 i jest przedrukowany za zgodą Elsevier. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Plik uzupełniający składa się z formularza używanego do testowania związków w modelu TMEV. Strona 1 zawiera przegląd konfiguracji eksperymentalnej. Informacje na temat przygotowania związku, nośnika i roztworu związku są podane na stronach 1-2. Aplikacja złożona jest zarejestrowana na stronie 3. Arkusze punktacji na stronach 4-5 służą do rejestrowania napadów zaobserwowanych i określonych ilościowo przez eksperymentatora wykonującego wstrzyknięcie związku. Na stronie 4 można zebrać dane dla klatek 1-4 po 5 myszy każda, a na stronie 5 można zarejestrować klatki 5-8, co jest standardową liczbą zwierząt do testów złożonych w naszych rękach. Arkusze punktacji na stronach 6-7 są używane przez zaślepionego obserwatora, który przeprowadza obserwację, obsługę i delikatne potrząsanie klatką przez 1 godzinę po każdym wstrzyknięciu związku. Ponownie, wyniki napadów można odnotować w sumie dla ośmiu klatek na tych przykładowych arkuszach wyników. Ostatnia strona 8 może być wykorzystana do zapisania wszelkich innych obserwacji lub notatek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Jest to pierwszy oparty na zakażeniu model gryzoni w padaczce, który umożliwia badanie rozwoju ostrych i przewlekłych napadów. Pomoże to w identyfikacji celów terapeutycznych i nowych związków stosowanych w zapobieganiu chorobom lub ich modyfikacji w przypadku jednej z najczęstszych etiologii padaczki.

Jak opisano powyżej, konieczne może być dokładne rozważenie partii i miana wirusa, aby upewnić się, że odpowiedni odsetek myszy leczonych TMEV wykazuje napady wywołane obchodzeniem się z wirusem. Jeśli zwierzęta mają mniej napadów niż zwykle, należy użyć partii N = 20 zwierząt, aby sprawdzić skuteczność wirusa. Jeśli jego aktywność jest zmniejszona (mniej niż 50%), nadszedł czas, aby wykonać nowe porcje i przetestować je na N = 20 zwierzętach. Jeżeli nowe podwielokrotności nie są bardziej wydajne, należy oczyścić nową partię wirusa. W przypadku niektórych transgenicznych linii myszy może być konieczne użycie niższego miana wirusa; Dlatego miano wirusa należy rozcieńczyć w razie potrzeby po wstępnych eksperymentach. Większość dostępnych danych na temat myszy B6 pochodziła z Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA lub Charles River, Sulzfeld, Niemcy); jednak potwierdzono podobne częstości napadów u myszy B6 uzyskanych od Harlana (Eystrup, Niemcy)8. Wskaźniki napadów u zwierząt transgenicznych z tłem B6 są porównywalne z myszami B6 typu dzikiego, ale mogą się różnić, jeśli zmiany genetyczne mają wpływ na inwazję wirusa, odpowiedź zapalną lub neurodegenerację21. Ostre napady są obserwowane spontanicznie, ale wywołują je obchodzenie się z nimi i hałas, dlatego niezwykle ważne jest, aby postępować ze wszystkimi zwierzętami w podobny sposób, gdy porównuje się częstość napadów. Sesje przenoszenia dwa razy dziennie wcześniej zapewniały duże obciążenie napadami i większy odsetek myszy wykazujących drgawki w dniach 3-7 po zakażeniu 6,8,19. Można również zastosować dodatkowe sesje postępowania (dzień 1 i dzień 2) w celu zwiększenia obciążenia napadami. Ponadto przed każdą sesją kontaktową można obserwować zwierzęta, aby upewnić się, że nie występują spontaniczne napady. Na przykład głośne środowisko laboratoryjne może powodować napady padaczkowe, które z kolei mogą sprawić, że zwierzęta będą oporne na napady wywołane obchodzeniem się z nimi w czasie testów.

Podczas gdy zakażenie TMEV wywołuje napady padaczkowe wywołane obchodzeniem się z ciałem u większości myszy, nie wiadomo, dlaczego niektóre zwierzęta są oporne na to leczenie. Jak opisano powyżej, może się zdarzyć, że napady elektrograficzne (z minimalnymi lub żadnymi powiązanymi zachowaniami) występują i zwykle nie są określane ilościowo bez jednoczesnego zapisu EEG. Może się również zdarzyć, że niewielkie różnice w miejscu wstrzyknięcia ułatwiają zmniejszenie efektu wirusowego w mózgu; Jednak zgłaszano napady padaczkowe po zakażeniu kory mózgowej i prążkowia 5,6,8,9 z powodu tropizmu wirusa do hipokampa. W przypadku badań przesiewowych leków w tym modelu, w celu zidentyfikowania zmniejszenia liczby napadów (np. 50% zmniejszenia obciążenia napadami), wymagana jest większa liczba zwierząt dla każdej grupy (np. N = 20). Co więcej, zmienność zachowań napadowych w tym modelu wymaga większych różnic w efektach leku i nośnika, aby zidentyfikować znaczące zmniejszenie napadów. Dlatego jednym z ograniczeń tego modelu jest wymóg większych rozmiarów grup. Niemniej jednak wystarczająca liczebność grup pozwala również na identyfikację działania przeciwpadaczkowego i przeciwzapalnego w tym modelu19.

Zdecydowana większość obserwowalnych napadów w tym modelu występuje w okresie ostrej infekcji. Pomimo występowania zwyrodnienia hipokampa, aktywacji komórek odpornościowych i deficytów poznawczych obserwowanych u myszy leczonych TMEV, tylko u niewielkiej części leczonych zwierząt ostatecznie rozwijają się przewlekłe, spontaniczne drgawki. Tak niskie ogólne obciążenie napadami wymagałoby dużej liczby zakażonych myszy, aby prawidłowo badać spontaniczne napady w tym modelu, co wykracza poza zakres i możliwości wielu projektów. Wszczepienie elektrod wgłębnych i monitorowanie EEG również zwiększyłoby obciążenie zwierząt doświadczalnych. Podczas gdy elektrody głębokościowe mogą pomóc w identyfikacji spontanicznej aktywności napadowej, zmiany w anatomii hipokampa po infekcji mogą sprawić, że stałe umieszczanie elektrod będzie wyzwaniem.

Pilna potrzeba zidentyfikowania nowych metod leczenia padaczki wymaga opracowania modeli, które mogą być wykorzystywane jako szybka metoda przesiewowa w celu uzyskania skuteczności przeciwpadaczkowej. Ten model zapewnia funkcje odpowiadające na to pilne żądanie. Co więcej, fakt, że nie wymaga żadnej operacji stereotaktycznej, sprawia, że jest to odpowiedni i łatwy do wykonania model do badania związków przeciwpadaczkowych.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

SB jest wspierany przez grant startowy FU Berlin. KSW jest wspierany przez NS065434 R37 oraz Fundację ALSAM. LAB jest wspierany przez nagrodę D-SPAN 1F99NS125773-01. Dziękujemy dr Robertowi Fujinamiemu za dostarczenie nam wirusa Theilera oraz University of Utah Cell Imaging Core Facility za wsparcie mikroskopowe.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Papier chłonny-dowolny
Waga analitycznaMettler Toledo (Columbus, OH, U.S.A.)302165420,1 mg– 220 g 
Animal balanceOhaus (Parsippany, NJ, U.S.A.)STX22020,01 g– 2200 g 
Strzykawki do insuliny BD Lo-Dose U-100BD (Mississauga, ON, Kanada) BD329461Sterylne strzykawki Lo-Dose ze stałą igłą BD Micro-Fine IV - 1 ml
szczepu TMEV Danieladostarczony przez Roberta Fujinami (University of Utah)-3 x 105 jednostki tworzące płytkę nazębną podwielokrotność(i)
Środek dezynfekujący, np. VennoVet 1 superMenno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Niemcy-Zalecane przez weterynarzy kampusowych z mniej niż lub równym 5% alkoholu
Fisherbrand średnio sterylny Podkładka nasączona alkoholowa C7 Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone)22-363-750
FlurisoVETone (Boise, ID, USA)502017Izofluran 250 mL, 2%– 5%
Pochłaniacz oparów Labconco (Kansas City, Missouri, Stany Zjednoczone)--
Ogólna ochrona Jednorazowe białe fartuchy laboratoryjne SMS   Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone)17-100-810A
GraphPad Prism wersja 9 (La Jolla, Kalifornia, Stany Zjednoczone)
Wiadro na lód-dowolny
program Microsoft Excel Microsoft (Redmond, Waszyngton, Stany Zjednoczone)
Microsoft Word Microsoft (Redmond, Waszyngton, Stany Zjednoczone)
Klatka dla myszy-dowolna klatka dla myszy zawierająca co najmniej 5
igieł PrecisionGlide dla myszy BD (Mississauga, ON, Kanada)329652BD Końcówka ślizgowa z igłą PrecisionGlide Strzykawki do insuliny - 26 G x 3/8 - 0,45 mm x 10 mm
Samouszczelniająca się torebka sterylizacyjna Fisher Scientific (Hampton, Nowy Jork, Stany Zjednoczone)NC9241087 12,6 x 25,5 cm
Mała szklana kolba-dowolna, pojemność 25 ml
sterylna PBSThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)
MieszadłoCarl Roth GmbH & CO. KGX171.1Rozmiar w zależności od objętości roztworu
Płytka mieszającaCarl Roth GmbH & CO. KGAAN2.1
Strzykawka Luer-LokBD (Mississauga, ON, Kanada)309628Tylko strzykawka 1 ml
Myjka ultradźwiękowa, grzałka/zegar mechanicznyCole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.)EW-08895-23Sonikator do kąpieli - 0,5 gal, 115 V
Rozwiązanie pojazdu-w zależności od pojazdu złożonego
Vortex REAX Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Niemcy541-10000-00
10010056

Bibliografia

  1. Getts, D. R., Balcar, V. J., Matsumoto, I., Müller, M., King, N. J. Viruses and the immune system: their roles in seizure cascade development. Journal of Neurochemistry. 104 (5), 1167-1176 (2008).
  2. Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Neurotropic viral infections leading to epilepsy: Focus on Theiler's murine encephalomyelitis virus. Future Virology. 6 (11), 1339-1350 (2011).
  3. Vezzani, A., et al. Infections, inflammation and epilepsy. Acta Neuropathologica. 131 (2), 211-234 (2016).
  4. Misra, U. K., Tan, C. T., Kalita, J. Viral encephalitis and epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 6 13-18 (2008).
  5. Libbey, J. E., et al. Seizures following picornavirus infection). Epilepsia. 49 (6), 1066-1074 (2008).
  6. Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Development of postinfection epilepsy after Theiler's virus infection of C57BL/6 mice. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (12), 1210-1219 (2010).
  7. Stewart, A. M., et al. Perspectives of zebrafish models of epilepsy: What, how and where next. Brain Research Bulletin. 87 (2-3), 135-143 (2012).
  8. Bröer, S., et al. Brain inflammation, neurodegeneration and seizure development following picornavirus infection markedly differ among virus and mouse strains and substrains. Experimental Neurology. 279, 57-74 (2016).
  9. Bröer, S., et al. Viral mouse models of multiple sclerosis and epilepsy: Marked differences in neuropathogenesis following infection with two naturally occurring variants of Theiler's virus BeAn strain. Neurobiology of Disease. 99, 121-132 (2017).
  10. Loewen, J. L., Barker-Haliski, M. L., Dahle, E. J., White, H. S., Wilcox, K. S. Neuronal Injury, gliosis, and glial proliferation in two models of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 75 (4), 366-378 (2016).
  11. Bell, L. A., Wallis, G. J., Wilcox, K. S. Reactivity and increased proliferation of NG2 cells following central nervous system infection with Theiler's murine encephalomyelitis virus. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 369(2020).
  12. Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Theiler's virus infection chronically alters seizure susceptibility. Epilepsia. 51 (8), 1418-1428 (2010).
  13. Buenz, E. J., Rodriguez, M., Howe, C. L. Disrupted spatial memory is a consequence of picornavirus infection. Neurobiology of Disease. 24 (2), 266-273 (2006).
  14. Tramoni-Negre, E., Lambert, I., Bartolomei, F., Felician, O. Long-term memory deficits in temporal lobe epilepsy. Revue Neurologique. 173 (7-8), 490-497 (2017).
  15. Ponds, R. W., Hendriks, M. Cognitive rehabilitation of memory problems in patients with epilepsy. Seizure. 15 (4), 267-273 (2006).
  16. Sloviter, R. S. Experimental status epilepticus in animals: What are we modeling. Epilepsia. 12, 11-13 (2009).
  17. Löscher, W. Animal models of seizures and epilepsy: Past, present, and future role for the discovery of antiseizure drugs. Neurochemical Research. 42 (7), 1873-1888 (2017).
  18. Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
  19. Metcalf, C. S., et al. Screening of prototype antiseizure and anti-inflammatory compounds in the Theiler's murine encephalomyelitis virus model of epilepsy. Epilepsia Open. 7 (1), 46-58 (2021).
  20. Daniels, J. B., Pappenheimer, A. M., Richardson, S. Observations on encephalomyelitis of mice (DA strain). Journal of Experimental Medicine. 96 (6), 517-530 (1952).
  21. Käufer, C., et al. Chemokine receptors CCR2 and CX3CR1 regulate viral encephalitis-induced hippocampal damage but not seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8929-8938 (2018).
  22. Libbey, J. E., et al. The effects of diet on the severity of central nervous system disease: One part of lab-to-lab variability. Nutrition. 32 (7-8), 877-883 (2016).
  23. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
  24. Kim, J. E., Cho, K. O. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy and EEG monitoring using radiotelemetry system in mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831(2018).
  25. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  26. Tu, L., et al. Free-floating immunostaining of mouse brains. Journal of Visualized Experiments. (176), e62876(2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model epilepsjiwirus Theilerazaka enie OUNmonitorowanie napad winiekcja wewn trzczaszkowauszkodzenie hipokampaneurostan zapalnyrejestracja EEGtestowanie zwi zk w przeciwdrgawkowych

Powiązane artykuły