Artykuł metodologiczny

Model padaczki o etiologii zakaźnej z wykorzystaniem wirusa mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera

3.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63673

⸱

23 czerwca 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Utah, 2Interdepartmental Program in Neuroscience, University of Utah, 3Faculty of Veterinary Medicine, Institute of Pharmacology and Toxicology, Freie Universität Berlin

W tym artykule

Podsumowanie

Zakażenie śródmózgowe wirusem mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera (TMEV) u myszy C57BL/6 powiela wiele wczesnych i przewlekłych objawów klinicznych wirusowego zapalenia mózgu i późniejszej padaczki u ludzi. W artykule opisano zakażenie wirusem, objawy i histopatologię modelu TMEV.

Streszczenie

Jedną z głównych przyczyn epilepsji jest infekcja ośrodkowego układu nerwowego (OUN); około 8% pacjentów, którzy przeżyją taką infekcję, rozwija epilepsję w konsekwencji, przy czym wskaźniki te są znacznie wyższe w mniej rozwiniętych gospodarczo krajach. Praca ta zawiera przegląd modelowania padaczki o etiologii zakaźnej i wykorzystania jej jako platformy do testowania nowych związków przeciwpadaczkowych. Przedstawiono protokół indukcji padaczki przez niestereotaktyczne wstrzyknięcie domózgowe wirusa mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera (TMEV) u myszy C57BL / 6, który powiela wiele wczesnych i przewlekłych objawów klinicznych wirusowego zapalenia mózgu i późniejszej padaczki u ludzi. Opisano kliniczną ocenę myszy podczas zapalenia mózgu w celu monitorowania aktywności napadowej i wykrywania potencjalnych skutków przeciwpadaczkowych nowych związków. Ponadto przedstawiono histopatologiczne konsekwencje wirusowego zapalenia mózgu i napadów padaczkowych, takich jak uszkodzenie hipokampa i zapalenie nerwów, a także konsekwencje długoterminowe, takie jak spontaniczne napady padaczkowe. Model TMEV jest jedną z pierwszych translacyjnych, opartych na infekcjach, eksperymentalnych platform, która pozwala na badanie mechanizmów rozwoju padaczki w wyniku zakażenia OUN. W związku z tym służy również do identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych i związków dla pacjentów zagrożonych rozwojem padaczki po zakażeniu OUN.

Wprowadzenie

Jedną z częstych konsekwencji wirusowego zapalenia mózgu są napady padaczkowe. Wiele infekcji wirusowych wywołuje objawowe drgawki w ostrej fazie infekcji; Ryzyko takich napadów wzrasta o ponad 20% wśród ogółu społeczeństwa1,2,3. Pacjenci, którzy przeżyją zakażenie, mają również zwiększone ryzyko rozwoju przewlekłej padaczki o 4%-20% w ciągu miesięcy lub lat po zakażeniu1,4. Wirus mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera (TMEV) został zidentyfikowany jako odpowiedni wirus do badania ostrych i przewlekłych napadów padaczkowych w mysim modelu wirusowego zapalenia mózgu5,6,7. TMEV jest bezotoczkowym, jednoniciowym wirusem RNA o dodatnim znaczeniu z rodziny Picornaviridae i tradycyjnie był używany do badania demielinizacji rdzenia kręgowego myszy SJL, przed którą myszy C57BL / 6 (B6) są chronione, ponieważ mają zdolność do szybkiego usuwania wirusa po zakażeniu. Jednak TMEV wywołuje ostre napady u 50%-75% samców i samic myszy B6 w ciągu pierwszego tygodnia po zakażeniu (pi), podczas gdy około 25%-40% rozwija przewlekłą padaczkę od tygodni do miesięcy pi2,5,6,8,9. Oprócz napadów padaczkowych, myszy wykazują również wspólną histopatologię padaczkowego hipokampa z neurodegeneracją i glejozą5,6,8,10,11,12. Co więcej, myszy B6 zakażone TMEV osiągają znacznie gorsze wyniki w testach behawioralnych dotyczących uczenia się i pamięci oraz mają współistniejące choroby poznawcze, co obserwuje się również u pacjentów klinicznych z padaczką13,14,15.

Tradycyjnie, modele epilepsji i napadów wykorzystują albo zastosowanie substancji chemokonvulsantowych, albo stymulacji elektrycznej do wywołania napadów; jednak modele te nie mają poprawności konstrukcyjnej i często wykazują poważniejsze napady i uszkodzenia mózgu niż są obserwowane u pacjentów klinicznych16. Nie ma modelu, który byłby odpowiedni dla każdego pytania badawczego17. Wykorzystanie modelu TMEV jest szczególnie interesujące, jeśli bada się czynniki predysponujące do rozwoju napadów po zakażeniu OUN lub jeśli związki są badane pod kątem ich skuteczności przeciwpadaczkowej.

Ponieważ model TMEV został stworzony i używany w kilku różnych laboratoriach na całym świecie, autorzy zidentyfikowali wiele szczegółów, które pozwalają na udaną implementację modelu, np. specyfikę różnych szczepów wirusa i myszy. Najbardziej wiarygodną indukcję napadów padaczkowych uzyskano przy użyciu szczepu Daniela myszy TMEV i B6J2,5,6,8,9. Model jest obecnie używany przez National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) jako platforma do identyfikacji nowych leków przeciwko padaczce i napadom padaczkowym18,19. Niniejszy artykuł zawiera szczegółowy protokół indukcji wirusa i monitorowania klinicznego, aby umożliwić innym badaczom wykorzystanie tego modelu wirusowego zapalenia mózgu do dalszego zrozumienia mechanizmów choroby, a także do testowania leków.

Poniższy protokół odzwierciedla badanie przeznaczone do testowania związków w tym modelu, chociaż można przeprowadzić wiele innych rodzajów badań. Myszy są znieczulane na krótko przed wstrzyknięciem szczepem TMEV Daniela w obszar skroniowy prawej półkuli (tylna i przyśrodkowa do prawego oka). W zależności od pytania badawczego, jeśli wymagane są niezakażone zwierzęta kontrolne, myszy otrzymują sterylną sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, pH 7,4, w tym KH2PO4 [1,06 mM], NaCl [155,17 mM] i Na2HPO4·7H2O [2,97 mM]) zamiast TMEV. Wcześniejsze doświadczenia na myszach zakażonych TMEV wykazały, że napady wywołane obchodzeniem się z dzieckiem występują między 3. a 7. dniem po zakażeniu. Częstotliwość wstrzykiwania, droga i czas testowania związków doświadczalnych różnią się w zależności od ich właściwości. Zaleca się szczepienie wirusa w piątek, co pozwala na monitorowanie napadów w dniach 3-7 w następnym tygodniu, od poniedziałku do piątku. Podczas tygodnia monitorowania napadów można podawać eksperymentalne związki (i.p.) dwa razy dziennie (w odstępie co najmniej 4 godzin), chyba że kinetyka lub mechanizm działania związku sugerują inaczej. Monitorowanie napadów padaczkowych podczas leczenia można przeprowadzić we wcześniej ustalonym punkcie czasowym. Czas wstrzykiwania i obserwacji różni się w zależności od poszczególnych związków. Zwierzętom wstrzykuje się badany związek lub nośnik zamiast związku narkotykowego. Te dwie grupy mogą być traktowane i obserwowane analogicznie do grupy eksperymentalnej. Podczas eksperymentu jedna osoba zajmująca się myszami i oceniająca napady powinna być ślepa na leczenie.

Protokół

Wszystkie opisane procedury zostały zatwierdzone przez odpowiednie organy nadzorcze. Zwierzęta utrzymywano zgodnie z zaleceniami zawartymi w „Guide for Care and Use of Laboratory Animals” (National Research Council) oraz zgodnie z polityką Public Health Service i Institutional Animal Care and Use Committee na University of Utah, protokół dotyczący zwierząt (numer: 21-11009, Dept. of Pharmacology and Toxicology) oraz na Freie Universität Berlin (protokół: G0015/21, LAGeSo Berlin, Institute of Pharmacology and Toxicology). Wyniki przedstawione na Ryc. 3 oraz Ryc. 5 zostały zatwierdzone w ramach decyzji 33.9-42502-04-11/0516 i 33.9-42502-04-15/1892 (LAVES Oldenburg, Dept. of Pharmacology, Toxicology, and Pharmacy, University of Veterinary Medicine Hannover).

1. Rozważania i przygotowania do zaprojektowania badania

  1. Wirus
    1. Szczep TMEV Daniel został uprzejmie udostępniony przez Roberta Fujinamiego z University of Utah. Pierwotnie wyizolowano go z myszy z kolonii Harvarda20. Przed pracą z TMEV należy sprawdzić specyficzną klasyfikację i przepisy dotyczące czynników biologicznych w odpowiednich krajach oraz skonsultować się z personelem ds. bezpieczeństwa biologicznego w instytucji w celu zapewnienia zgodności z przepisami. Zazwyczaj TMEV jest klasyfikowany jako BSL 2, w zależności od szczepu i modyfikacji genetycznych. Standardowa dawka niezbędna do wywołania napadów u większości zwierząt wynosi 3 x 105 jednostek tworzących płytki (PFU).
      UWAGA: Dawka może wymagać dostosowania, na przykład w przypadku użycia myszy transgenicznych. Ogólnie rzecz biorąc, miana od 2 x 104 PFU do 2,44 x 107 PFU były skutecznie stosowane w celu wywołania napadów. Zwierzęta kontrolne otrzymują sterylny PBS i nie wykazują napadów. Wirus nie infekuje ludzi; niemniej jednak eksperymentatorzy powinni przez cały czas nosić ŚOI (fartuch laboratoryjny, rękawiczki, okulary ochronne), a truchła myszy i ściółka powinny zostać poddane autoklawowaniu przed utylizacją.
  2. Zwierzęta
    1. Do wywoływania i badania napadów należy używać myszy B6J , ponieważ inne szczepy myszy niekoniecznie wykazują napady, np. myszy SJL/J, FVB/N lub Balb/c5. Nie stwierdzono różnic między myszami żeńskimi a męskimi w częstotliwości występowania ostrych napadów5. Eksperymenty należy przeprowadzać na myszach w wieku od młodzieńczego do dorosłego (począwszy od 5-6 tygodnia życia).
  3. Dieta
    1. Ustalono, że dieta jest jednym ze źródeł zmienności w ciężkości choroby między laboratoriami; w związku z tym dietę należy rozważyć jako potencjalny czynnik zmienności22.
  4. Wielkość grupy
    1. Ponieważ nie wszystkie zwierzęta rozwijają ostre lub przewlekłe napady w tym modelu, do testowania związków należy użyć około 20 myszy na grupę.
  5. Dobrostan zwierząt
    1. Jeśli u jakiejkolwiek myszy wystąpią istotne działania niepożądane w wyniku infekcji lub podania badanego związku (np. letarg, zaniedbana pielęgnacja, nadmierne zaczerwienienie i ropna wydzielina z rany) po czasie obserwacji określonym przez lokalne wytyczne IACUC (np. 48 h), należy przeprowadzić humanitarną eutanazję myszy.
    2. Każdą mysz wykazującą ekstremalny spadek masy ciała (>20%) w okresie infekcji należy poddać humanitarnej eutanazji.
    3. Jeśli zwierzęta nie jedzą prawidłowo, należy zapewnić im dostęp do dodatkowych granulatów zwilżonych pediatrycznym roztworem elektrolitów lub podobnym preparatem.

2. Inokulacja wirusem

  1. Sterylizacja strzykawki do iniekcji
    1. Zdjąć nasadkę ze strzykawki insulinowej. Nałożyć rurkę polietylenową jako kołnierz wokół igły, aby zapewnić odpowiednią głębokość iniekcji wynoszącą 2,5 mm. Zanurzyć strzykawkę w etanolu na 30 min. Naświetlać strzykawkę światłem UV przez 30 min.
    2. Nałożyć nasadkę z powrotem na igłę. Zawinąć strzykawkę w worek do sterylizacji i zakleić. Oznaczyć datą przygotowania.
  2. Iniekcja wirusa
    1. Wyjąć alikwoty szczepu TMEV Daniela z zamrażarki −80 °C. Rozmrozić wirusa i przechowywać go w lodzie. Unikać wielokrotnego rozmrażania i zamrażania wirusa. Napełnić strzykawkę zawiesiną wirusową (3 x 105 PFU rozcieńczonych w 20 µL PBS lub pożywki DMEM).
      UWAGA: Wirus jest zakaźny dla myszy, ale nie dla ludzi.
    2. Oczyścić blat środkiem dezynfekującym i pracować pod wyciągiem. Inokulacja wirusem nie jest sterylna, lecz powinna być przeprowadzona w warunkach maksymalnej czystości.
    3. Przenieść mysz do komory indukcyjnej i zastosować 2% izofluranu w tlenie w celu indukcji znieczulenia. Osiągnięcie tolerancji chirurgicznej zajmuje kilka minut; dostosować stężenie w zależności od oddechu zwierzęcia i głębokości znieczulenia.
    4. Przenieść znieczuloną mysz z komory znieczulającej pod dygestorium. Sprawdzić tolerancję chirurgiczną, np. poprzez uciśnięcie palca u nogi. Cała procedura trwa mniej niż 30 s, więc zwierzę nie musi wdychać izofluranu podczas iniekcji. Nałożyć maść do oczu, aby zapobiec wysychaniu rogówki. 
    5. Oczyścić głowę zwierzęcia gazikiem nasączonym alkoholem. Lekko przechylić głowę myszy w lewo, tak aby miejsce iniekcji było skierowane ku górze.
    6. Lekko odciągnąć skórę do tyłu, wprowadzić igłę do głowy i wstrzyknąć 20 µL dokoryowo na głębokość 2,5 mm w obszarze skroniowej półkuli prawej (tylno-przyśrodkowo względem prawego oka).
    7. Wykonać iniekcję jednostronnie w tej samej półkuli u wszystkich zwierząt. Jako punkty orientacyjne dla lokalizacji kory ciemieniowej wykorzystać oko i ucho. Położenie zostało wcześniej zweryfikowane histologicznie; patrz Rycina 1. Współrzędne iniekcji zgodnie z iniekcją stereotaktyczną w odniesieniu do bregmy wynoszą −2,0 (AP); +3,0 (ML); −1,5 (DV).
    8. Pozostawić strzykawkę w miejscu na 5-15 s. Zapisać, czy wystąpił wyciek z miejsca iniekcji lub czy widoczne są pęcherzyki powietrza – w takim przypadku przygotować nową strzykawkę. Ostrożnie wyciągając strzykawkę, lekko nią obrócić. Nałożyć maść do oczu, aby zapobiec wysychaniu podczas znieczulenia.
    9. OPCJONALNIE: Oznaczyć zwierzę na ogonie lub uchu zgodnie z lokalnymi procedurami (opcjonalnie, ale łatwo wykonać, gdy zwierzę jest nieprzytomne).
    10. Przenieść zwierzę do nowej klatki, która podczas wybudzania z znieczulenia jest ustawiona częściowo na macie grzewczej (35-40 °C). Nie pozostawiać zwierząt bez nadzoru, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję sternalną.
      UWAGA: Po wybudzeniu zwierzęta mogą ponownie przebywać w grupach (zwierzęta zakażone nie są łączone ze zwierzętami poddanymi procedurze mock).
    11. Monitorować masę ciała myszy przez pierwsze 7 dni pi, ponieważ po zakażeniu tracą one na wadze i mogą wymagać dodatkowego karmienia.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat procedury iniekcji TMEV. Od lewej do prawej: W przypadku iniekcji do prawej kory ciemieniowej, igłę wprowadza się nieco bocznie od umownej linii łączącej oko z przeciwnym uchem. Kołnierz służący do kontroli głębokości zaznaczono na żółto. Tor iniekcji jest widoczny na koronalnym przekroju mózgu, wskazanym przez strzałkę. Miejsce iniekcji odpowiada współrzędnym podanym nad strzałką. Prawy obraz przedstawia rozkład wirusa Theilera (kolor fioletowy) w obszarze CA1 formacji hipokampa. Rysunek został przygotowany przy użyciu biorender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

3. Testowanie związków

  1. Przygotowanie związku
    1. Zapoznać się z instrukcjami dotyczącymi formulacji. Przygotować roztwór nośnika zgodnie z zaleceniami lub dostarczonymi instrukcjami. Jako przykład przedstawiono procedurę dla leku przeciwpadaczkowego lewetiracetamu (LEV). LEV redukuje obciążenie napadami do 30%-40% poziomu w grupie kontrolnej (nośnik) przy dawce 350 mg/kg. Nośnikiem zastosowanym w tym badaniu jest 0,5% metyloceluloza.
    2. Obliczyć dawki w zależności od związku. Odważyć lek zgodnie z obliczeniami. W celu leczenia 1 kg myszy odważyć 350 mg LEV.
    3. Przygotować roztwór zapasowy z odpowiednią objętością roztworu nośnika, zgodnie z instrukcjami formulacji (np. sonikacja, substancje pomocnicze nośnika itp.). Przyjmując objętość iniekcji 0,01 mL/g masy myszy, objętość iniekcji dla 1 kg wyniosłaby 10 mL z 350 mg LEV, co daje roztwór o stężeniu 35 mg/mL19. Podać wynik obliczeń i dawkę w mg/kg oraz objętość w mL.
      UWAGA: Przykładowy protokół znajduje się na stronie 2 Supplementary Material 1.
  2. Podawanie związku
    1. Przydzielić klatki losowo do grupy z nośnikiem lub grup związku. Myszy pozorownie zainfekowane (mock-infected) należy stosować w badaniach nad mechanizmami rozwoju epilepsji lub do celów walidacji, ale nie do rutynowego przesiewu leków.
    2. Zarejestrować warunki środowiskowe, takie jak temperatura, wilgotność, pora dnia itp.
    3. Wymieszać w wirówce (vortex) roztwór ze związkiem oraz roztwór nośnika. Pobrać nośnik lub związek do strzykawki i oznaczyć strzykawki kolorami, aby zapobiec pomyłkom.
    4. Zważyć zwierzęta. Upewnić się, że myszy B6J ważą >18 g w 3. dniu po infekcji (pi) (bez zaokrąglania). Podać masę ciała.
    5. Podać związek (np. poprzez iniekcję doszpikową lub inne odpowiednie drogi). Zapisać czas i drogę podania.
    6. Monitorować zwierzęta pod kątem wszelkich zmian behawioralnych po podaniu związku, zwłaszcza po pierwszych iniekcjach. W przypadku wystąpienia napadów określić intensywność napadu zgodnie ze skalą Racine'a23; patrz krok 3.2.
      UWAGA: Przykładowy protokół podawania związku znajduje się w Supplementary Material 1 na stronie 3, natomiast napady zaobserwowane podczas podawania należy odnotować w Supplementary Material 1 na stronach 4-5.
  3. Monitorowanie napadów indukowanych manipulacją
    1. Procedurę tę powinien przeprowadzić eksperymentator zaślepiony na rodzaj zastosowanego leczenia. Przenieść wszystkie klatki na blat. Obserwować zwierzęta pod kątem napadów 2 razy dziennie w fazie światła.
    2. Ocenić aktywność napadową według zmodyfikowanej skali Racine'a23: 0 = brak zmian w zachowaniu, 1 = ruchy pyska i twarzy, 2 = kiwanie głową, 3 = jednostronny klonus kończyny przedniej, 4 = obustronny klonus kończyn przednich z unoszeniem się na tylnych łapach, 5 = uogólniona aktywność toniczno-kloniczna z utratą napięcia posturalnego, czasami z podskakiwaniem, 6 = przedłużone i nadmierne podskakiwanie oraz hiperaktywność. Podać liczbę i intensywność napadów.
    3. Przesunąć długopisem po klatce, aby wywołać hałas.
    4. Przenieść każde zwierzę do innego pudełka i z powrotem.
    5. Delikatnie potrząsnąć klatką ruchem w przód i w tył, dbając o to, aby nie robić tego zbyt gwałtownie, by zwierzęta nie uderzyły o ścianki lub górną część klatki i nie były narażone na urazy fizyczne.
    6. Monitorować wszystkie zwierzęta w klatce pod kątem napadów. W dowolnym momencie, jeśli u myszy wystąpi napad, przenieść ją z powrotem do klatki macierzystej i zapisać stopień napadu bez dalszej stymulacji hałasem lub manipulacją.
    7. W przypadku zwierząt, u których nie wystąpiły napady spontanicznie ani po delikatnym potrząsaniu klatką, wywołać napady poprzez intensywniejszą manipulację: ostrożnie obrócić mysz, szybkim ruchem za ogon z lewej strony na prawą.
      UWAGA: Zwierzęta z napadami są nadpobudliwe i mogą gwałtownie podskakiwać.
    8. Ponownie zaobserwować zachowania napadowe u każdego zwierzęcia. Powtórzyć proces dla kolejnych klatek.
      UWAGA: Przykładowy protokół monitorowania napadów znajduje się w Supplementary Material 1 na stronach 6-7.
  4. Raportowanie danych dotyczących efektów związku
    1. Przeanalizować codzienną masę ciała za pomocą ANOVA z powtarzanymi pomiarami (RM).
    2. Wykorzystać dzienne skumulowane wartości obciążenia napadami do graficznej reprezentacji danych. Przedstawić dane dotyczące skuteczności (liczba zwierząt bez napadów stopnia 3-5 w skali Racine'a) jako liczbę zwierząt chronionych w stosunku do liczby badanych w każdej z grup (zazwyczaj N = 20). Następnie porównać dane między grupą z nośnikiem a grupą leczoną lekiem pod kątem odpowiedzi (wystąpienie lub brak napadów), stosując dokładny test Fishera.
      UWAGA: Zwierzę uznaje się za „chronione” przed napadami, jeśli wystąpił u niego napad stopnia 2 lub niższego; zwierzęta niechronione mają napady stopni 3-5.
    3. Przeanalizować dane dotyczące tolerancji w podobny sposób, jako liczbę zwierząt z zaburzeniami behawioralnymi lub efektami toksycznymi w stosunku do liczby badanych w każdej grupie. Odnotować wszelkie działania niepożądane, w tym zgony.
    4. Jeśli mniej niż 50% myszy po iniekcji nośnika wykazuje ostre napady, nie należy brać pod uwagę tych danych.

Wyniki

Wpływ związków na napady ostre
Napady behawioralne są rejestrowane, jeśli wystąpią podczas wstrzykiwania leku (DI) lub podczas następujących po nim porannych/wieczornych sesji obsługi i monitorowania napadów. Napady zaobserwowane podczas obsługi mogą być przedstawione w formie mapy ciepła, co pokazano na Rysunku 2 dla LEV (350 mg/kg). Do analizy obciążenia napadami przyjmuje się średnią końcowych (dzień 7) skumulowanych wartości obciążenia napadami dla grupy traktowanej nośnikiem i porównuje się je za pomocą testu U Manna-Whitneya z grupą traktowaną związkiem (wartości obciążenia napadami obejmują dane zebrane podczas obserwacji po wstrzyknięciu). W celu oceny skuteczności związku stosuje się dokładny test Fishera, aby określić, czy istnieje statystyczna różnica w skuteczności między grupą traktowaną nośnikiem a grupą traktowaną lekiem. Analogicznie dane dotyczące tolerancji są analizowane za pomocą dokładnego testu Fishera. Analiza masy ciała jest przeprowadzana za pomocą ANOVA z powtarzanymi pomiarami w celu określenia zmian w przebiegu eksperymentu, a także różnic między myszami traktowanymi związkiem a myszami traktowanymi nośnikiem.

figure-results-1
Rycina 2: Mapa ciepła napadów behawioralnych po testowaniu z użyciem nośnika (0,5% metylocelulozy) lub LEV (350 mg/kg). Iniekcje podawano dwa razy dziennie na 1 h przed manipulacją i obserwacją napadów. Napady behawioralne rejestrowano, jeśli wystąpiły podczas iniekcji leku (DI) lub podczas następujących po niej porannych (AM) i wieczornych (PM) sesji manipulacji/monitorowania napadów. LEV (350 mg/kg) znacząco redukuje liczbę napadów obserwowanych podczas sesji manipulacji (35,9% obciążenia napadami w grupie nośnika) w ciągu 5-dniowego okresu obserwacji. Mapa ciepła została utworzona poprzez przedstawienie napadów stopnia 1-3 w kolorze zielonym, stopnia 4 w żółtym i stopnia 5 w pomarańczowym. Ta nowa rycina została opracowana na podstawie opublikowanego zbioru danych19. Kliknij tutaj, aby wyświetlić rycinię w większym rozmiarze.

Przewlekła padaczka
Poza zgłaszanym obciążeniem napadami w pierwszym tygodniu po infekcji (pi), istnieje kilka parametrów, które mogą być użyteczne w zależności od badania i postawionej hipotezy. W przypadku długoterminowego utrzymywania zwierząt, u części zainfekowanych osobników w ciągu kilku tygodni pi wystąpią spontaniczne napady padaczkowe, które pojawiają się rzadziej niż napady ostre i w związku z tym wymagają rejestracji EEG. Aby zarejestrować EEG u myszy, konieczne jest wszczepienie elektrod podczas zabiegu stereotaktycznego24. Rysunek 3 przedstawia różne zdarzenia padaczkowe w fazie przewlekłej zarejestrowane za pomocą EEG u myszy zainfekowanych TMEV8.

figure-results-2
Rysunek 3: Typowe zapisy EEG w fazie przewlekłej (14 tygodni po infekcji) po zakażeniu myszy wirusem DA. (A-C) Reprezentatywne zdarzenia EEG, w których nie zaobserwowano korelacji motorycznych, tj. (A) pojedyncze iglice, (B) grupy iglic, (C) a także napad elektrograficzny, prawdopodobnie ogniskowy. (D-F) Reprezentatywne zdarzenia EEG z korelacjami behawioralnymi. Mysz przedstawiona na panelu D miała zdarzenia przypominające napady z drżeniami mioklonicznymi (oznaczone jako „M”, którym towarzyszą artefakty ruchowe), ruchami stereotypowymi (oznaczonymi jako „head press”, gdy mysz dociskała głowę płasko do podłoża) lub zatrzymaniem behawioralnym; „Scr” opisuje artefakt ruchowy drapania, (E) oraz (F) pokazują typowe zmiany w EEG podczas uogólnionych napadów drgawkowych: (E) napad stopnia 3 w skali Racine'a o czasie trwania 22 s i częstotliwości 1 Hz oraz (F) napad stopnia 5 o czasie trwania 34 s i częstotliwości 5,4 Hz. Rysunek ten był publikowany wcześniej8 i został przedrukowany za zgodą wydawnictwa Elsevier. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Histologia
Ponieważ epilepsja i napady są u pacjentów zazwyczaj powiązane z patologią hipokampa, która jest odtwarzana w modelach eksperymentalnych, większość laboratoriów analizuje również zmiany w hipokampie lub wpływ potencjalnego leczenia przeciwdrgawkowego na patologię. Powszechnie analizowane parametry obejmują neurodegenerację i kurczenie się hipokampa, a także stan zapalny poprzez znakowanie specyficznych populacji komórek odpornościowych. Do takich analiz, na koniec eksperymentu, myszy poddaje się głębokiej anestezji aż do zatrzymania oddechu i znacznego spowolnienia akcji serca lub wystąpienia arytmii. Krew jest usuwana poprzez perfuzję wewnątrzsercową PBS, a następnie 4% paraformaldehydem (PFA)25 w celu utrwalenia tkanki. Tkanka jest następnie poddawana kriotomii i (immuno-)barwieniu26, a następnie analizom mikroskopowym.

figure-results-3
Rycina 4: Degeneracja hipokampa u myszy z epilepsją zainfekowanych TMEV. (A,B) Przekroje koronalne barwione fioletem krezylowym wykazują prawidłową cytoarchitekturę u myszy (A) kontrolnej (PBS) oraz degenerację hipokampa u myszy (B) TMEV w 2. miesiącu po infekcji (pi). Uwagi: powiększone komory boczne, zapadnięcie się alveus oraz ścieńczenie warstwy komórek piramidalnych. (C) Ilościowa ocena tych uszkodzeń wykazuje istotny spadek powierzchni hipokampa i odpowiadający mu wzrost powierzchni komór u myszy TMEV (N = 7) w porównaniu do myszy PBS (N = 6; dane przedstawiono jako średnia ± SEM; p < 0.001; test t Studenta). (D,E) Markowanie NeuN dodatkowo obrazuje skalę utraty komórek neuronalnych w przekrojach pobranych w 6. miesiącu pi. Strzałki wskazują obszary z całkowitą utratą komórek piramidalnych. (E) Zakręt zębaty wydaje się pozostać względnie nienaruszony nawet u myszy z epilepsją. Pasek skali = (A,B) 2 mm; (D,E) 0.5 mm. Ta rycina została opublikowana wcześniej6 i jest przedrukowana za zgodą Oxford University Press. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rysunek 5: Reprezentatywne mikrofotografie różnego stopnia nasilenia nacieku limfocytów T w przebiegu ostrego zapalenia mózgu 7 dni po zakażeniu. Przekroje seryjne obejmujące ipsilateralny grzbiet hipokampa barwiono przeciwciałami przeciwko CD3 w celu znakowania limfocytów T. (A,D) Prawidłowy hipokamp bez nacieku limfocytów T, widoczny u zwierząt z grupy kontrolnej (mock-infected). (B, E) Umiarkowany naciek limfocytów T, obserwowany u większości myszy zakażonych TMEV. (C, F) Silny naciek limfocytów T, stwierdzony jedynie u niektórych zakażonych myszy. Rysunek ten był publikowany wcześniej8 i jest przedrukowany za zgodą wydawnictwa Elsevier. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Plik uzupełniający zawiera formularz stosowany do testowania związków w modelu TMEV.Strona 1 zawiera opis schematu doświadczalnego. Informacje dotyczące związku, nośnika oraz przygotowania roztworu związku zapisuje się na stronach 1-2. Podawanie związku odnotowuje się na stronie 3. Arkusze oceny na stronach 4-5 służą do zapisywania napadów obserwowanych i kwantyfikowanych przez eksperymentatora wykonującego iniekcję związku. Na stronie 4 można zbierać dane dla klatek 1-4 (po 5 myszy w każdej), a na stronie 5 dla klatek 5-8, co stanowi standardową liczbę zwierząt stosowaną w naszych testach związków. Arkusze oceny na stronach 6-7 są wykorzystywane przez zaślepionego obserwatora, który przeprowadza obserwację, manipulacje i delikatne potrząsanie klatką 1 h po każdej iniekcji związku. Ponownie, na tych przykładowych arkuszach oceny można odnotować wyniki napadów dla łącznie ośmiu klatek. Ostatnia strona 8 może służyć do zapisywania wszelkich innych obserwacji lub uwag. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ilustracji.

Dyskusja

Jest to pierwszy oparty na zakażeniu model gryzoni w padaczce, który umożliwia badanie rozwoju ostrych i przewlekłych napadów. Pomoże to w identyfikacji celów terapeutycznych i nowych związków stosowanych w zapobieganiu chorobom lub ich modyfikacji w przypadku jednej z najczęstszych etiologii padaczki.

Jak opisano powyżej, konieczne może być dokładne rozważenie partii i miana wirusa, aby upewnić się, że odpowiedni odsetek myszy leczonych TMEV wykazuje napady wywołane obchodzeniem się z wirusem. Jeśli zwierzęta mają mniej napadów niż zwykle, należy użyć partii N = 20 zwierząt, aby sprawdzić skuteczność wirusa. Jeśli jego aktywność jest zmniejszona (mniej niż 50%), nadszedł czas, aby wykonać nowe porcje i przetestować je na N = 20 zwierzętach. Jeżeli nowe podwielokrotności nie są bardziej wydajne, należy oczyścić nową partię wirusa. W przypadku niektórych transgenicznych linii myszy może być konieczne użycie niższego miana wirusa; Dlatego miano wirusa należy rozcieńczyć w razie potrzeby po wstępnych eksperymentach. Większość dostępnych danych na temat myszy B6 pochodziła z Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA lub Charles River, Sulzfeld, Niemcy); jednak potwierdzono podobne częstości napadów u myszy B6 uzyskanych od Harlana (Eystrup, Niemcy)8. Wskaźniki napadów u zwierząt transgenicznych z tłem B6 są porównywalne z myszami B6 typu dzikiego, ale mogą się różnić, jeśli zmiany genetyczne mają wpływ na inwazję wirusa, odpowiedź zapalną lub neurodegenerację21. Ostre napady są obserwowane spontanicznie, ale wywołują je obchodzenie się z nimi i hałas, dlatego niezwykle ważne jest, aby postępować ze wszystkimi zwierzętami w podobny sposób, gdy porównuje się częstość napadów. Sesje przenoszenia dwa razy dziennie wcześniej zapewniały duże obciążenie napadami i większy odsetek myszy wykazujących drgawki w dniach 3-7 po zakażeniu 6,8,19. Można również zastosować dodatkowe sesje postępowania (dzień 1 i dzień 2) w celu zwiększenia obciążenia napadami. Ponadto przed każdą sesją kontaktową można obserwować zwierzęta, aby upewnić się, że nie występują spontaniczne napady. Na przykład głośne środowisko laboratoryjne może powodować napady padaczkowe, które z kolei mogą sprawić, że zwierzęta będą oporne na napady wywołane obchodzeniem się z nimi w czasie testów.

Podczas gdy zakażenie TMEV wywołuje napady padaczkowe wywołane obchodzeniem się z ciałem u większości myszy, nie wiadomo, dlaczego niektóre zwierzęta są oporne na to leczenie. Jak opisano powyżej, może się zdarzyć, że napady elektrograficzne (z minimalnymi lub żadnymi powiązanymi zachowaniami) występują i zwykle nie są określane ilościowo bez jednoczesnego zapisu EEG. Może się również zdarzyć, że niewielkie różnice w miejscu wstrzyknięcia ułatwiają zmniejszenie efektu wirusowego w mózgu; Jednak zgłaszano napady padaczkowe po zakażeniu kory mózgowej i prążkowia 5,6,8,9 z powodu tropizmu wirusa do hipokampa. W przypadku badań przesiewowych leków w tym modelu, w celu zidentyfikowania zmniejszenia liczby napadów (np. 50% zmniejszenia obciążenia napadami), wymagana jest większa liczba zwierząt dla każdej grupy (np. N = 20). Co więcej, zmienność zachowań napadowych w tym modelu wymaga większych różnic w efektach leku i nośnika, aby zidentyfikować znaczące zmniejszenie napadów. Dlatego jednym z ograniczeń tego modelu jest wymóg większych rozmiarów grup. Niemniej jednak wystarczająca liczebność grup pozwala również na identyfikację działania przeciwpadaczkowego i przeciwzapalnego w tym modelu19.

Zdecydowana większość obserwowalnych napadów w tym modelu występuje w okresie ostrej infekcji. Pomimo występowania zwyrodnienia hipokampa, aktywacji komórek odpornościowych i deficytów poznawczych obserwowanych u myszy leczonych TMEV, tylko u niewielkiej części leczonych zwierząt ostatecznie rozwijają się przewlekłe, spontaniczne drgawki. Tak niskie ogólne obciążenie napadami wymagałoby dużej liczby zakażonych myszy, aby prawidłowo badać spontaniczne napady w tym modelu, co wykracza poza zakres i możliwości wielu projektów. Wszczepienie elektrod wgłębnych i monitorowanie EEG również zwiększyłoby obciążenie zwierząt doświadczalnych. Podczas gdy elektrody głębokościowe mogą pomóc w identyfikacji spontanicznej aktywności napadowej, zmiany w anatomii hipokampa po infekcji mogą sprawić, że stałe umieszczanie elektrod będzie wyzwaniem.

Pilna potrzeba zidentyfikowania nowych metod leczenia padaczki wymaga opracowania modeli, które mogą być wykorzystywane jako szybka metoda przesiewowa w celu uzyskania skuteczności przeciwpadaczkowej. Ten model zapewnia funkcje odpowiadające na to pilne żądanie. Co więcej, fakt, że nie wymaga żadnej operacji stereotaktycznej, sprawia, że jest to odpowiedni i łatwy do wykonania model do badania związków przeciwpadaczkowych.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

SB jest wspierany przez grant startowy FU Berlin. KSW jest wspierany przez NS065434 R37 oraz Fundację ALSAM. LAB jest wspierany przez nagrodę D-SPAN 1F99NS125773-01. Dziękujemy dr Robertowi Fujinamiemu za dostarczenie nam wirusa Theilera oraz University of Utah Cell Imaging Core Facility za wsparcie mikroskopowe.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Papier chłonny-dowolny
Waga analitycznaMettler Toledo (Columbus, OH, U.S.A.)302165420,1 mg– 220 g 
Animal balanceOhaus (Parsippany, NJ, U.S.A.)STX22020,01 g– 2200 g 
Strzykawki do insuliny BD Lo-Dose U-100BD (Mississauga, ON, Kanada) BD329461Sterylne strzykawki Lo-Dose ze stałą igłą BD Micro-Fine IV - 1 ml
szczepu TMEV Danieladostarczony przez Roberta Fujinami (University of Utah)-3 x 105 jednostki tworzące płytkę nazębną podwielokrotność(i)
Środek dezynfekujący, np. VennoVet 1 superMenno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Niemcy-Zalecane przez weterynarzy kampusowych z mniej niż lub równym 5% alkoholu
Fisherbrand średnio sterylny Podkładka nasączona alkoholowa C7 Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone)22-363-750
FlurisoVETone (Boise, ID, USA)502017Izofluran 250 mL, 2%– 5%
Pochłaniacz oparów Labconco (Kansas City, Missouri, Stany Zjednoczone)--
Ogólna ochrona Jednorazowe białe fartuchy laboratoryjne SMS   Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone)17-100-810A
GraphPad Prism wersja 9 (La Jolla, Kalifornia, Stany Zjednoczone)
Wiadro na lód-dowolny
program Microsoft Excel Microsoft (Redmond, Waszyngton, Stany Zjednoczone)
Microsoft Word Microsoft (Redmond, Waszyngton, Stany Zjednoczone)
Klatka dla myszy-dowolna klatka dla myszy zawierająca co najmniej 5
igieł PrecisionGlide dla myszy BD (Mississauga, ON, Kanada)329652BD Końcówka ślizgowa z igłą PrecisionGlide Strzykawki do insuliny - 26 G x 3/8 - 0,45 mm x 10 mm
Samouszczelniająca się torebka sterylizacyjna Fisher Scientific (Hampton, Nowy Jork, Stany Zjednoczone)NC9241087 12,6 x 25,5 cm
Mała szklana kolba-dowolna, pojemność 25 ml
sterylna PBSThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)
MieszadłoCarl Roth GmbH & CO. KGX171.1Rozmiar w zależności od objętości roztworu
Płytka mieszającaCarl Roth GmbH & CO. KGAAN2.1
Strzykawka Luer-LokBD (Mississauga, ON, Kanada)309628Tylko strzykawka 1 ml
Myjka ultradźwiękowa, grzałka/zegar mechanicznyCole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.)EW-08895-23Sonikator do kąpieli - 0,5 gal, 115 V
Rozwiązanie pojazdu-w zależności od pojazdu złożonego
Vortex REAX Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Niemcy541-10000-00
10010056

Bibliografia

  1. Getts, D. R., Balcar, V. J., Matsumoto, I., Müller, M., King, N. J. Viruses and the immune system: their roles in seizure cascade development. Journal of Neurochemistry. 104 (5), 1167-1176 (2008).
  2. Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Neurotropic viral infections leading to epilepsy: Focus on Theiler's murine encephalomyelitis virus. Future Virology. 6 (11), 1339-1350 (2011).
  3. Vezzani, A., et al. Infections, inflammation and epilepsy. Acta Neuropathologica. 131 (2), 211-234 (2016).
  4. Misra, U. K., Tan, C. T., Kalita, J. Viral encephalitis and epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 6 13-18 (2008).
  5. Libbey, J. E., et al. Seizures following picornavirus infection). Epilepsia. 49 (6), 1066-1074 (2008).
  6. Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Development of postinfection epilepsy after Theiler's virus infection of C57BL/6 mice. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (12), 1210-1219 (2010).
  7. Stewart, A. M., et al. Perspectives of zebrafish models of epilepsy: What, how and where next. Brain Research Bulletin. 87 (2-3), 135-143 (2012).
  8. Bröer, S., et al. Brain inflammation, neurodegeneration and seizure development following picornavirus infection markedly differ among virus and mouse strains and substrains. Experimental Neurology. 279, 57-74 (2016).
  9. Bröer, S., et al. Viral mouse models of multiple sclerosis and epilepsy: Marked differences in neuropathogenesis following infection with two naturally occurring variants of Theiler's virus BeAn strain. Neurobiology of Disease. 99, 121-132 (2017).
  10. Loewen, J. L., Barker-Haliski, M. L., Dahle, E. J., White, H. S., Wilcox, K. S. Neuronal Injury, gliosis, and glial proliferation in two models of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 75 (4), 366-378 (2016).
  11. Bell, L. A., Wallis, G. J., Wilcox, K. S. Reactivity and increased proliferation of NG2 cells following central nervous system infection with Theiler's murine encephalomyelitis virus. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 369(2020).
  12. Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Theiler's virus infection chronically alters seizure susceptibility. Epilepsia. 51 (8), 1418-1428 (2010).
  13. Buenz, E. J., Rodriguez, M., Howe, C. L. Disrupted spatial memory is a consequence of picornavirus infection. Neurobiology of Disease. 24 (2), 266-273 (2006).
  14. Tramoni-Negre, E., Lambert, I., Bartolomei, F., Felician, O. Long-term memory deficits in temporal lobe epilepsy. Revue Neurologique. 173 (7-8), 490-497 (2017).
  15. Ponds, R. W., Hendriks, M. Cognitive rehabilitation of memory problems in patients with epilepsy. Seizure. 15 (4), 267-273 (2006).
  16. Sloviter, R. S. Experimental status epilepticus in animals: What are we modeling. Epilepsia. 12, 11-13 (2009).
  17. Löscher, W. Animal models of seizures and epilepsy: Past, present, and future role for the discovery of antiseizure drugs. Neurochemical Research. 42 (7), 1873-1888 (2017).
  18. Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
  19. Metcalf, C. S., et al. Screening of prototype antiseizure and anti-inflammatory compounds in the Theiler's murine encephalomyelitis virus model of epilepsy. Epilepsia Open. 7 (1), 46-58 (2021).
  20. Daniels, J. B., Pappenheimer, A. M., Richardson, S. Observations on encephalomyelitis of mice (DA strain). Journal of Experimental Medicine. 96 (6), 517-530 (1952).
  21. Käufer, C., et al. Chemokine receptors CCR2 and CX3CR1 regulate viral encephalitis-induced hippocampal damage but not seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8929-8938 (2018).
  22. Libbey, J. E., et al. The effects of diet on the severity of central nervous system disease: One part of lab-to-lab variability. Nutrition. 32 (7-8), 877-883 (2016).
  23. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
  24. Kim, J. E., Cho, K. O. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy and EEG monitoring using radiotelemetry system in mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831(2018).
  25. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  26. Tu, L., et al. Free-floating immunostaining of mouse brains. Journal of Visualized Experiments. (176), e62876(2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model epilepsjiwirus Theilerazaka enie OUNmonitorowanie napad winiekcja wewn trzczaszkowauszkodzenie hipokampaneurostan zapalnyrejestracja EEGtestowanie zwi zk w przeciwdrgawkowych

Powiązane artykuły