Badanie interakcji przestrzennych między astrocytami a neuronami w oczyszczonych mózgach

Podsumowanie

Połączenie transdukcji wektora wirusowego i oczyszczania mózgu za pomocą metody CLARITY pozwala na badanie dużej liczby neuronów i astrocytów jednocześnie.

Streszczenie

Połączenie transdukcji wektora wirusowego i oczyszczania tkanek za pomocą metody CLARITY umożliwia jednoczesne badanie kilku typów komórek mózgowych i ich interakcji. Transdukcja wektorów wirusowych umożliwia znakowanie różnych typów komórek w różnych kolorach fluorescencji w tej samej tkance. Komórki można zidentyfikować genetycznie na podstawie aktywności lub projekcji. Korzystając ze zmodyfikowanego protokołu CLARITY, potencjalna wielkość próbki astrocytów i neuronów wzrosła o 2-3 rzędy wielkości. Zastosowanie CLARITY pozwala na obrazowanie całych astrocytów, które są zbyt duże, aby zmieścić się w całości w plasterkach, oraz na badanie somatów wraz ze wszystkimi ich procesami. Ponadto daje możliwość zbadania interakcji przestrzennej między astrocytami a różnymi typami komórek neuronalnych, a mianowicie liczby neuronów piramidowych w każdej domenie astrocytarnej lub bliskości między astrocytami a określonymi populacjami neuronów hamujących. W niniejszym artykule szczegółowo opisano, w jaki sposób metody te mają być stosowane.

Wprowadzenie

W ostatnich latach wiedza na temat funkcji astrocytów i ich interakcji z obwodami neuronalnymi znacznie wzrosła. Astrocyty mogą wpływać na plastyczność^1,2, wspomagać regenerację neuronów po urazie^3,4, a nawet indukować de novo wzmocnienie neuronów, przy czym ostatnie badania wykazały znaczenie astrocytów w nabywaniu pamięci i nagrodzie, wcześniej uważanych za funkcje czysto neuronalne^5,6,7. Cechą szczególnie interesującą w badaniach nad astrocytami jest przestrzenne rozmieszczenie komórek, które utrzymują unikalną organizację przestrzenną w hipokampie i innych strukturach mózgu^8,9,10. W przeciwieństwie do dendrytów neuronalnych, które przeplatają się między somatami komórkowymi, astrocyty hipokampa zamieszkują wizualnie rozróżnialne terytoria z niewielkim nakładaniem się ich procesów, tworząc odrębne domeny^8,11,12,13. Dowody potwierdzające udział astrocytów w obwodach neuronalnych nie potwierdzają braku szczegółowego opisu anatomicznego takich populacji i neuronów w ich domenach¹⁴.

Procedury transdukcji wektorów wirusowych, wraz ze zwierzętami transgenicznymi (TG), zostały spopularyzowane jako zestaw narzędzi do badania struktur, funkcji i interakcji między komórkami mózgu^15,16. Wykorzystanie różnych promotorów pozwala na celowanie w określone komórki zgodnie z ich właściwościami genetycznymi, poziomami aktywacji^17,18 lub celami projekcji. Różne wirusy mogą wyrażać różnokolorowe fluorofory w różnych populacjach. Wirus może być łączony z endogenną ekspresją fluoroforów w TG lub zwierzęta TG mogą być używane bez potrzeby stosowania wirusów. Techniki te są szeroko stosowane do znakowania neuronów, a niektóre laboratoria zaczęły ich używać z modyfikacjami wyspecjalizowanymi w celowaniu w inne typy komórek, takie jak astrocyty^5,9,19.

Technika CLARITY, po raz pierwszy opisana w 2013 roku^20,21, umożliwia badanie grubych warstw mózgu, czyniąc cały mózg przezroczystym, pozostawiając nienaruszone mikroskopijne struktury. Dzięki połączeniu tych dwóch metod – transdukcji wektora wirusowego i oczyszczania tkanek – dostępna jest obecnie możliwość badania interakcji przestrzennych między różnymi populacjami typów komórek. Większość badań interakcji astrocytów-neuronów przeprowadzono na cienkich wycinkach mózgu, co dało obrazy niekompletnych astrocytów ze względu na ich duże domeny, co radykalnie ograniczyło liczbę analizowanych komórek. Zastosowanie techniki CLARITY pozwala na jednoczesną charakterystykę populacji komórek w dużych objętościach w rozdzielczości pojedynczej komórki. Obrazowanie fluorescencyjnie znakowanych populacji komórek w czystych mózgach nie zapewnia rozdzielczości synaptycznej, ale pozwala na dokładne scharakteryzowanie interakcji przestrzennych między astrocytami a różnymi typami komórek neuronalnych.

Z tego powodu wykorzystaliśmy te najnowocześniejsze techniki do zbadania właściwości astrocytów w całym grzbietowym CA1, obrazując wszystkie blaszki (Stratum Radiatum, warstwa piramidalna i Stratum Oriens). Zmierzyliśmy dziesiątki tysięcy astrocytów (z penetracją wirusa >96%⁵), analizując w ten sposób informacje o całej populacji astrocytów wokół CA1. Dzięki efektywnej penetracji markerów neuronalnych mogliśmy zarejestrować interakcje między całą populacją astrocytów CA1 a czterema typami komórek neuronalnych - parwalbuminą (PV), somatostatyną (SST), neuronami hamującymi VIP i pobudzającymi komórkami piramidowymi⁹.

Kilka eksperymentów zostało przeprowadzonych przy użyciu kombinacji fluorescencji zwierząt TG i różnokolorowych wektorów wirusowych (wszystkie komórki hamujące), podczas gdy inne (pobudzające) wykorzystywały dwa wektory wirusowe wyrażające różne fluorofory pod różnymi promotorami⁹. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół, w tym znakowanie pożądanych komórek w mózgu, uczynienie mózgu przezroczystym za pomocą zmodyfikowanej procedury CLARITY, a także obrazowanie i analizowanie całych struktur mózgu przy użyciu różnych procedur i oprogramowania.

Protokół

Protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Hebrajskiego i spełniały wytyczne Przewodnika Narodowego Instytutu Zdrowia dotyczącego opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Transdukcja wektora wirusowego

UWAGA: Transdukcja wektora wirusowego służy do ekspresji fluoroforów w mózgu.

1. Użyj atlasu (np. atlasu mózgu Allena), aby zlokalizować odpowiednią koordynację obszaru docelowego.
   UWAGA: Atlasy 3D można znaleźć w Internecie (np. http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer).
2. Za pomocą chirurgii stereotaktycznej wstrzyknij wektory wirusowe do odpowiedniej struktury mózgu. Zobacz ⁹, aby zapoznać się ze szczegółowym protokołem.
3. Poczekaj 3-6 tygodni na ekspresję fluoroforu.
   UWAGA: Wystarczy krótki okres czasu, jeśli trzeba oznaczyć tylko ciała komórek. Potrzebny będzie długi okres czasu, jeśli projekcje aksonalne są istotne dla pytania, ponieważ ekspresja fluoroforów w aksonach, które mogą mieć kilka milimetrów długości, trwa dłużej.
4. Wcześniej zweryfikuj specyficzność i penetrację ekspresji fluoroforu (zarówno ekspresji wirusa, jak i zwierząt TG) (Rysunek 1A). Przed przystąpieniem do procedury CLARITY należy wyznaczyć co najmniej jeden mózg dla cienkich plasterków i upewnić się, że ekspresja fluoroforu jest zarówno silna, jak i specyficzna dla cechy komórki docelowej.

2. PRZEJRZYSTOŚĆ

UWAGA: Ta metoda sprawia, że mózg staje się przezroczysty w ciągu 2-6 tygodni.

1. Przeprowadzić perfuzję przezczaszkową u zwierząt przy użyciu zimnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS. Wyjąć mózg i przechowywać go przez noc w PFA w temperaturze 4 °C w probówce o pojemności 50 ml lub podobnym pojemniku.
   UWAGA: Przed wykonaniem perfuzji przezczaszkowej zwierzę musi być głęboko znieczulone. W przykładach przedstawionych w tym protokole wszystkie zwierzęta zostały znieczulone przy użyciu ketaminy i ksylazyny (odpowiednio 90% i 10%).
2. Zastąp PFA roztworem hydrożelu (HS; patrz Tabela 1) przez 48 godzin w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Na tym etapie nie pozwól, aby materiały stały się cieplejsze niż temperatura chłodzenia (4-8 °C), w przeciwnym razie hydrożel ulegnie polimeryzacji. HS używany w tym protokole zawiera 2% akrylamidu, w przeciwieństwie do poprzednich protokołów sugerujących 4%²² lub 1%¹⁷. Korzyść w wysokości 2% jest szczegółowo opisana w sekcji dyskusji. Przygotowując HS, pracuj na lodowatej powierzchni. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
3. Odgazowanie
   UWAGA: Celem tego etapu jest usunięcie całego wolnego tlenu z tkanki, ponieważ_O2 zakłóca proces polimeryzacji. Można stosować dowolny gaz inny niż_O2 (np. N₂, CO_{2 );} Zalecany jest N₂.
   1. Przenieś_N2 ze zbiornika za pomocą elastycznej rurki o średnicy 5 mm (wewnętrznej), podłączonej do igły 19 G na jej końcu (Rysunek 1B).
   2. Wykonaj dwa małe otwory (o szerokości igły) w nasadce rurki: jeden do wprowadzenia gazu, a drugi, aby powietrze mogło opuścić rurkę (Rysunek 1C).
   3. Przymocuj rurę od gazu_N2 do rurki i wymieniaj gazy na około 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
   4. Zdejmij rurę i natychmiast uszczelnij otwory plasteliną na każdej rurze (Rysunek 1D).
4. Odgazowane, szczelnie zamknięte probówki przenieść do łaźni o temperaturze 37 °C na 3,5 godziny w celu polimeryzacji HS, który stanie się żelem. Uważaj, aby nie potrząsnąć rurkami (Rysunek 1E).
5. Wyjmij mózg z probówki i delikatnie usuń spolimeryzowany żel z jego otoczenia za pomocą chusteczek laboratoryjnych. Upewnij się, że żadne resztki żelu nie pozostały przyczepione do powierzchni tkanki, ponieważ mogą one reagować z roztworem w kolejnych krokach, hamując proces oczyszczania tkanek (Rysunek 1F).
   UWAGA: Ponieważ żel zawierał PFA, ekstrakcja powinna odbywać się pod wyciągiem.
6. Pokrój mózg, jeśli pytanie, które masz pod ręką, wymaga tylko jego części. Podziel go na pół lub na bardzo grube plasterki, które zawierają wszystkie obszary zainteresowania (Rysunek 1G).
7. Umieścić plastry w pierwszym roztworze czyszczącym (CS1, patrz tabela 2) w nowym pojemniku i wstrząsać z prędkością 70 obr./min przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
8. Postępuj zgodnie z krokami opisanymi poniżej, aby przenieść mózg z CS1 do drugiego roztworu oczyszczającego (CS2, patrz Tabela 2).
   1. Przygotuj wcześniej perforowaną rurkę do mózgu (Rysunek 1H).
   2. Podgrzej CS2 do temperatury 40-45 °C w zlewce wystarczająco dużej, aby pomieścić probówkę. Zrób to na płycie grzejnej za pomocą mieszadła. Upewnij się, że temperatura nie osiąga 55 °C, aby zapobiec bieleniu wyrażonych białek.
   3. Umieść zlewkę wypełnioną CS2 i perforowaną rurkę na mieszadle (zlewka o pojemności 2 l w Rysunek 1I). Ustaw umiarkowaną szybkość mieszania, która spowoduje przepływ płynu bez zniekształcania tkanki.
      UWAGA: W ciągu 2-6 tygodni tkanka stanie się przezroczysta (proces rozpoczyna się na obrzeżach i przesuwa się do wewnątrz w kierunku centralnych struktur mózgu). Decyzja o tym, kiedy tkanka jest "wystarczająco czysta", zależy od osobistego osądu. Mózg powinien być wystarczająco przezroczysty, aby można go było obrazować pod mikroskopem bez zakłóceń (Rysunek 1J nie jest wystarczająco wyraźny; Rysunek 1K wystarczająco wyraźny). Przekroczenie punktu, w którym tkanka jest wystarczająco czysta, może spowodować utratę sztywności tkanki.
9. Przenieść z CS2 do PBST (0,5% Triton X-100 w PBS, patrz tabela 2) w nowym pojemniku w temperaturze 37 °C z łagodnym wstrząsaniem (70 obr./min) przez 24 h.
   UWAGA: W PBST tkanka stanie się biaława (Rysunek 1L). Przejrzystość powróci (i poprawi się) po osadzeniu w roztworze dopasowywania indeksu refrakcji (RIMS, patrz krok 2.14).
10. Wymień PBST na nowy PBST. Przechowywać w tych samych warunkach (37 °C z łagodnym wstrząsem) przez kolejne 24 godziny.
11. Wymień PBST ponownie na nowy PBST i utrzymuj w RT przez 24 godziny.
12. Przejazd do PBS w RT na 24 godziny.
13. Wymień PBS i pozostaw w RT na dodatkowe 24 godziny.
14. Wyjąć mózg z PBS i przenieść go do RIMS w temperaturze 37 °C przez noc.
    UWAGA: Początkowo zmarszczki w RIMS mogą otaczać mózg. Protokół ten został zaprojektowany i zweryfikowany przy użyciu dwóch specyficznych komercyjnych RIMS (patrz Tabela 3). Protokół nie powinien się jednak różnić w przypadku korzystania z innych RIM-ów (komercyjnych lub własnej produkcji).
15. Utrzymuj tkankę w temperaturze pokojowej przez kolejne 24 godziny lub do momentu, gdy roztwór osiągnie pełną równowagę, tj. gdy tkanka stanie się przezroczysta, a roztwór nie będzie już zawierał żadnych widocznych zmarszczek (Rysunek 1M).
16. Jeśli tkanka jest przezroczysta, przystąp do przygotowania komory. Jeśli w tym momencie tkanka stanie się biała, a nie przezroczysta (z powodu agregatów resztkowych cząsteczek SDS), należy ponownie oczyścić próbkę, powtarzając kroki 2.9 i 2.10, a następnie przenieść tkankę do CS2 (krok 2.8) na kilka dni, a następnie wszystkie kroki aż do kroku 2.15.

3. Przygotowanie komory

UWAGA: Każda próbka wymaga szkiełka z komorą obrazowania, w której próbka zostanie umieszczona.

1. Umieść próbkę na środku szkiełka.
2. Za pomocą pistoletu do klejenia na gorąco utwórz ścianki na krawędziach szkiełka, prawie tak wysokie jak tkanka. Upewnij się, że zostawiłeś niewielką szczelinę (około 5 mm) w jednym z rogów (Rysunek 2A,B).
3. Nałóż 1-2 krople RIMS na próbkę, aby utrzymać wilgotność górnej powierzchni i zapobiec tworzeniu się pęcherzyków między szkiełkiem nakrywkowym a tkanką.
4. Natychmiast po nałożeniu kropli RIMS dodaj ostatnią warstwę gorącego kleju do ścianek (tak, aby osiągnęły wysokość mózgu/plasterka) i natychmiast przejdź (gdy gorący klej jest jeszcze płynny) do kroku 3.5.
5. Uszczelnij wierzch szkiełkiem nakrywkowym, kładąc go tak równomiernie, jak to możliwe, na wierzchu jeszcze ciepłej warstwy gorącego kleju (Rysunek 2C).
6. Napełnij komorę RIMS przez szczelinę pozostawioną w ściankach gorącego kleju (Rysunek 2D,E).
7. Zamknij szczelinę gorącym klejem. Nie zostawiaj powietrza w środku (Rysunek 2F).
8. Jeśli ścianki gorącego kleju wystają poza granice prowadnicy, przytnij krawędzie przedłużające ( Rysunek 2G).
9. Jeśli obiektyw używany do obrazowania jest zanurzony, dodaj kolejne 2-3 mm kleju do ścianek nad szkiełkiem nakrywkowym, aby roztwór zanurzeniowy działał przez dłuższy czas (Rysunek 2H).

4. Obrazowanie (konfokalne lub dwufotonowe)

1. Sprawdź, czy stolik może utrzymać komorę, ponieważ grubość komory może sięgać kilku milimetrów.
   UWAGA: Na przykład mikroskop konfokalny (patrz Tabela materiałów) używany w tym protokole jest wyposażony w kilka stopni (np. okrągły, prostokątny). Niezależnie od tego, który etap zostanie wybrany do utrzymania komory, nie ma znaczenia, o ile jego parametry pasują do rozmiarów komory.
2. Pracuj z obiektywem o wystarczającej odległości roboczej, tj. minimalnej odległości roboczej ≥3 mm, ponieważ obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania może mieć głębokość kilku milimetrów, a szkiełko nakrywkowe może nie być całkowicie proste, ponieważ zostało umieszczone ręcznie.
   UWAGA: W ramach demonstracji, wyniki przedstawione w Rysunek 1, Wideo 1 i Wideo 2 uzyskano pod mikroskopem dwufotonowym przy użyciu 16-krotnego obiektywu zanurzonego w wodzie z odległością roboczą 3 mm i powiększeniem 2,4, aby uzyskać pole widzenia 652 x 483 μm i stos z odstępami 0,937 μm między płaszczyznami.
3. Wykonaj obrazowanie wieloobszarowe, które może zająć kilka godzin, a nawet dni. Upewnij się, że w komputerze jest wystarczająco dużo wolnego miejsca, ponieważ rozmiar każdego obrazu może sięgać nawet kilkudziesięciu gigabitów.
   UWAGA: Obrazowanie CLARITY może skutkować znacznie większą ilością głębokich sekcji obrazu. W związku z tym intensywności używane do uchwycenia wyrażenia powinny być stosunkowo niskie, aby zapobiec nadekspresji podczas sumowania obrazu.
4. W przypadku obiektywów zanurzeniowych należy rutynowo sprawdzać płyn podczas obrazowania i w razie potrzeby uzupełnić go dodatkowym płynem.
   UWAGA: Podczas obrazowania danych przedstawionych na Filmie 3, woda była dodawana do powierzchni komory co 6-8 godzin, aby zwalczyć parowanie.
5. Po uzyskaniu obrazu przeglądaj go i analizuj za pomocą kilku różnych pakietów oprogramowania.
   UWAGA: Zalecane oprogramowanie obejmuje Imaris i SyGlass zarówno do wizualizacji, jak i analizy. Precyzyjny proces optymalnej rekonstrukcji astrocytów za pomocą oprogramowania Imaris został opisany wcześniej⁹. Krótko mówiąc, cechy Imaris użyte w tym badaniu to Filamenty do pełnej rekonstrukcji struktur komórkowych i Spoty do wyodrębnienia pozycji w przestrzeni wszystkich somatów.

Wyniki

Pomyślne usunięcie grubych warstw tkanki mózgowej skutkuje nowym zakresem pytań, które można zadać w odniesieniu do właściwości dużych populacji komórek, w przeciwieństwie do właściwości pojedynczych komórek lub sąsiednich grup komórek. Aby osiągnąć pomyślne wyniki, należy ściśle przestrzegać protokołu CLARITY, ponieważ istnieje szeroki zakres parametrów, które należy wziąć pod uwagę, aby zmniejszyć wariancję między próbkami (np. procent czystości, informacje o fluorescencji, parametry obrzęku).

Dyskusja

Metody oczyszczania tkanek stanowią rewolucyjne narzędzie w badaniach nad mózgiem, zachęcając do zadawania pytań, które wcześniej nie mogły zostać zadane. Skupiając się na właściwościach niewielkiej grupy komórek, pojedynczej komórki, a nawet pojedynczej synapsy, projekt CLARITY umożliwia teraz skupienie się na całkowitej populacji komórek lub cechach łączności dalekiego zasięgu przy użyciu odpowiednich fluoroforów.

Wynik połączenia ekspresji fluoroforu i procedury CLARITY nie jest binarny; Wi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
AAV1-GFAP::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		wektor wirusowy używany do wykrywania astrocytów
AAV5-CaMKII::eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		wektor wirusowy używany do wykrywania neuronów
AAV5-CaMKII::H2B-eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		wektor wirusowy używany do wykrywania jąder neuronalnych
AAV5-CaMKII::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		wirusowy używany do wykrywania neuronów
Akrylamid (40%)	Bio-rad	#161-0140
Bisakryloamid (2%)	Bio-rad	#161-0142
Kwas borowy	Sigma	#B7901	Masa cząsteczkowa - 61,83 g/mol
Mikroskop konfokalny, skanowanie, Obiektyw FV1000	Olympus		4x (UPlanSApo, 0,16 NA)
Oprogramowanie	ImarisBitplane, Wielka Brytania		Oprogramowanie umożliwiające analizę 3D obrazów
NaOH	Sigma	#S5881
PBS
PFA 4%	EMS#	15710
RapiClear	SunJin lab	#RC147002
RapiClear CS	SunJin lab	#RCCS002
SDS	Sigma	#L3771
Oprogramowanie			Oprogramowanie umożliwiające analizę 3D obrazów z wykorzystaniem wirtualnej rzeczywistości
Tris base 1 M	Bio-rad	#002009239100	Masa cząsteczkowa - 121,14 g/mol
Triton X-100	ChemCruz	#sc-29112A
Mikroskop dwufotonowy	Neurolabware		Laser Ti:szafirowy (Chameleon Discovery TPC, Coherent), lampy fotopowielacza GaAsP (Hamamatsu, H10770-40), filtr pasmowo-przepustowy (Semrock), obiektyw zanurzeniowy 16x (Nikon, 0,8 NA)
VA-044 Inicjator	Wako	#011-19365