Niniejszy protokół szczegółowo opisuje przygotowanie i wizualizację utrwalonej tkanki poczwarki Drosophila notum. Może być stosowany zarówno do nienaruszonej, jak i zranionej tkanki, a oryginalna architektura tkanki zostaje zachowana. Procedury preparowania, mocowania i barwienia są opisane w tym artykule.
Artykuł metodologiczny
Preparowanie, naprawianie i wizualizacja poczwarki Drosophila notum
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Poczwarki Drosophila melanogaster są nieruchome przez kilka dni podczas metamorfozy, podczas których rozwijają nowe ciało z cienką, przezroczystą powłoką dla dorosłych. Ich bezruch i przezroczystość sprawiają, że idealnie nadają się do eksperymentów z obrazowaniem na żywo in vivo. Wiele badań koncentrowało się na grzbietowej monowarstwie nabłonka poczwarki ze względu na jej dostępność i stosunkowo duży rozmiar. Oprócz badań nad mechaniką i rozwojem nabłonka, notum było idealną tkanką do badania gojenia się ran. Po urazie cały proces naprawy nabłonka można uchwycić za pomocą obrazowania na żywo w ciągu 6-12 godzin. Pomimo popularności notum do obrazowania na żywo, bardzo niewiele opublikowanych badań wykorzystywało stałe próbki notum. Utrwalanie i barwienie są powszechnymi metodami dla prawie wszystkich innych tkanek Drosophila, wykorzystując duży repertuar prostych barwień komórkowych i przeciwciał. Jednak kość poczwarkowa jest delikatna i podatna na zwijanie się i zniekształcenia po usunięciu z ciała, co utrudnia uzupełnienie obrazowania na żywo. Protokół ten oferuje prostą metodę utrwalania i barwienia poczwarki, zarówno w stanie nienaruszonym, jak i po zranieniu laserowym. Dzięki tej technice brzuszna strona poczwarki jest przyklejana do szkiełka nakrywkowego w celu unieruchomienia poczwarki, a notum jest ostrożnie usuwane, mocowane i barwione. Nabłonek notum jest montowany na szkiełku podstawowym lub między dwoma szkiełkami nakrywkowymi, aby ułatwić obrazowanie od strony grzbietowej lub brzusznej tkanki.
Wprowadzenie
Poczwarka Drosophila melanogaster jest coraz częściej wykorzystywana do badań obrazowych na żywo w ostatnim dziesięcioleciu, ponieważ zwierzę jest zarówno nieruchome, jak i ma przezroczysty naskórek na tym etapie1,2,3,4,5,6,7. Jednak wycinek poczwarki jest trudny do wypreparowania i naprawienia, co utrudnia uzupełnienie badań obrazowania na żywo o barwienie przeciwciał i komórek. Ogólnym celem tej pracy jest stworzenie powtarzalnego protokołu preparowania i utrwalania naczynku poczwarki do barwienia przeciwciał i komórek na nowych lub wcześniej obrazowanych na żywo próbkach.
Gdy larwy rozpoczynają metamorfozę, naskórek odrywa się od naskórka larwy, tworząc twardą kopertę poczwarki8. Plan ciała larwy jest rozkładany na czynniki pierwsze i opracowywany jest nowy plan ciała dorosłego osobnika. W tym czasie poczwarki są nieruchome, co czyni je idealnymi do obrazowania na żywo. Jedną z często obrazowanych tkanek jest poczwarka notum, dorosły jednowarstwowy nabłonek, który tworzy się w klatce piersiowej grzbietowej. Notum jest wizualnie dostępne po prostym rozebraniu w celu usunięcia koperty poczwarki9. Całe zwierzę może być następnie zamontowane, a notum może być obrazowane na żywo przez wiele godzin lub dni, co czyni go idealną tkanką do badania zachowań komórek nabłonkowych podczas rozwoju, homeostazy i po zranieniu10,11,12,13,14. Jednak notum jest trudne do wycięcia i naprawienia, ponieważ jest kruche i pokryte cienkim przezroczystym naskórkiem dorosłego, który jest hydrofobowy. Ten hydrofobowy naskórek sprawia, że po usunięciu z reszty ciała jest podatny na zwijanie się w roztworach wodnych. W związku z tym rozwarstwienie i utrwalenie notum było zgłaszane rzadko, a sekcja często nie jest opisana15,16,17,18. Bez szczegółowego protokołu w literaturze badacz Drosophila ma ogromne trudności z uzupełnieniem obrazowania na żywo o barwienie poczwarek.
Ta technika ma na celu powtarzalne preparowanie i utrwalanie próbek, które wcześniej były obrazowane na żywo, w tym tych, które zostały zranione laserowo. Ponieważ obrazowanie na żywo wymaga usunięcia koperty poczwarki, ta technika preparacji rozpoczyna się od usunięcia przedniej części poczwarki, w przeciwieństwie do poprzednich protokołów, które przypinały lub dzieliły poczwarki na pół w obrębie przypadku poczwarki4,19,20. Notum jest delikatną tkanką, a zranienie może pogorszyć jej kruchość. Tak więc, aby podtrzymać tę delikatną tkankę, powłoka (nabłonek i przyczepiony przezroczysty naskórek dorosłego osobnika) notum oraz część głowy i brzucha są wycinane z dala od reszty poczwarki, zawsze zanurzając się w środowisku wodnym. Ta metoda zmniejsza prawdopodobieństwo, że tkanka zwija się i staje się bezużyteczna. Technika ta skutecznie zabarwiła zranioną tkankę notum już po 30 minutach od zranienia (Ryc. 1E-H) i po 3 godzinach od zranienia (Ryc. 1I-L). Oczekuje się, że protokół ten będzie skuteczny przez cały czas rozwoju notum lub gojenia się ran. Obecna technika będzie pomocna dla badaczy, którzy chcą połączyć możliwości obrazowania na żywo cewki śródmieścia poczwarki z obfitością dostępnych odczynników immunohistochemicznych.
Protokół
Drosophila melanogaster (muszki owocowe) były utrzymywane w temperaturze 25 °C na standardowym podłożu z mąki kukurydzianej i melasy. Badania przeprowadzono na poczwarkach histonów H2A znakowanych EGFP (w[*]; P{w+mC=His2Av-EGFP.C}2/SM6a). Muchy zostały pozyskane z publicznego centrum hodowlanego (patrz tabela materiałów).
1. Unieruchomienie poczwarek
- Nałóż 2-calowy pasek taśmy dwustronnej na szkiełko mikroskopowe.
- Zidentyfikować białe poczwarki w fiolkach podniesionych w temperaturze 25 °C i użyć markera, aby wskazać ich położenie poza fiolką. Przywrócić temperaturę fiolek do 25 °C.
UWAGA: Białe poczwarki charakteryzują się bezruchomością, białym kolorem i przetchlinkami. Tworzą się one 0-1 h po utworzeniu poczwarki (APF), czyli etapie P18. - 12-15 h później ostrożnie usuń 3-4 wskazane poczwarki (bez ich przebijania) za pomocą lunety preparacyjnej i zbierz je na szkiełku mikroskopowym obok taśmy.
UWAGA: Poczwarki będą teraz w stadium P5 z woreczkiem z wyciętą głową widocznym na przednim końcu poczwarki8. - Umieść poczwarki w odległości co najmniej jednej szerokości poczwarki na taśmie brzusznymi stronami do dołu.
- Umieść kroplę kleju na folii parafinowej (patrz tabela materiałów) lub w pokrywie probówki wirówkowej. Zanurz końcówkę końcówki pipety o pojemności 0,1–10 μl (bez pipety) w kropli kleju. Postukaj dwukrotnie końcówką pipety w szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 60 mm (1,5 grubości), w odległości 1 cm x 1 cm od narożnika, tworząc linię kleju o długości ~1/2 długości poczwarki.
- Ustaw pipetę 0,2-2 μl (P2) na 2 μl, a pipetę 200 μl (P200) na 200 μl i dopasuj je do końcówek, aby były gotowe do napełnienia 1x PBS + 0,1 mM Ca2+, które szybko zestalą klej w kontakcie.
- Włóż kleszcze (patrz Tabela Materiałów) w pobliżu boku głowy i delikatnie zdejmij obudowę od przedniej do tylnej9. Usuń jak najwięcej obudowy. Chwyć rozwijające się nogi poczwarki kleszczami i ostrożnie wyciągnij poczwarkę z etui.
UWAGA: Niewielkie pęknięcie brzusznej części poczwarki nie będzie szkodliwe dla tej procedury. - Połóż poczwarkę w rogu szkiełka nakrywkowego.
- Chwyć poczwarkę w tylnym odwłoku lub rozwijającym się skrzydle kleszczami, podnieś i umieść brzuszną stronę poczwarki w dół w linii kleju adhezyjnego.
- Szybko napełnij pipetę P2 2 μl 1x PBS + 0,1 mM Ca2+ i trzymając ją w powietrzu, wyrzuć tylko tyle, aby utworzyć mały pęcherzyk na końcówce (0,25-0,5 μL).
- Dotknąć małego pęcherzyka roztworu po jednej stronie poczwarki u podstawy klatki piersiowej, a następnie powtórzyć po drugiej stronie.
UWAGA: Spowoduje to zestalenie niewielkiej ilości kleju klejącego, aby utrzymać poczwarkę na miejscu. Ogólnie rzecz biorąc, wszystkie rozwiązania nie będą stosowane. - Napełnij pipetę P200 200 μl 1x PBS + 0,1 mM Ca2+, a następnie umieść końcówkę pipety na klatce piersiowej i wyrzuć zawartość, aby całkowicie zanurzyć poczwarki. Pozostała część kleju natychmiast zestala się.
- Usuń ~100 μl roztworu PBS, aby poczwarka była ledwo zanurzona przed natychmiastowym przejściem do następnego kroku.
UWAGA: W przypadku próbek niezranionych należy rozpocząć od kroku 1.1. W przypadku zranionych, częściowo wypreparowanych próbek należy rozpocząć od kroku 1.5. Ranienie za pomocą ablacji laserowej zostało opisane wcześniej14,21. Etapy unieruchomienia, rozwarstwienia i montażu należy wykonać przy użyciu mikroskopu preparacyjnego.
2. Analizowanie notum
- Chwyć parę nożyczek do mikrodysekcji, opierając jedną stronę rękojeści o palec wskazujący i środkowy ręki dominującej, tak aby kciuk ręki dominującej przykładał siłę cięcia (Rysunek 2A,B).
- Ustabilizuj szyjkę nożyczek przy środkowym palcu ręki niedominującej, jednocześnie usztywniając szkiełko nakrywkowe palcem serdecznym ręki niedominującej.
- Odetnij środek grzbietowej części brzucha, aby utworzyć mały otwór, ~0,2-0,5 mm. Część hemolimfy zwykle się wylewa i jest dobrym wskaźnikiem naruszenia.
- Wykonaj małe nacięcia 0,5-0,75 mm przez powłokę od tyłu do przodu, otaczając tkankę grzbietową, aby ją odizolować. Aby stworzyć tkankę tak płaską, jak to możliwe, unikaj cięcia zbyt brzusznie; Tylko grzbietowa "kopuła" klatki piersiowej powinna zostać usunięta wraz z małymi odcinkami głowy i brzucha.
- Powtórz nacięcia od tyłu do przodu po drugiej stronie poczwarki.
- Obróć stolik preparacyjny, aby w razie potrzeby umożliwić czyste cięcie przez głowę.
UWAGA: Na tym etapie powłoka grzbietowa lub notum zostanie oddzielona od reszty poczwarki. Jeśli wydaje się oddzielony, ale nie można go łatwo przenieść, kilka nacięć poniżej notum może pomóc w jego usunięciu. - Dodaj ~200 μL 1x PBS do środka szkiełka nakrywkowego i utwórz kanał łączący go z oryginalną kroplą preparacyjną, delikatnie przeciągając końcówkę pipety po szkle nakrywkowym od nowej kropli do oryginału.
- Za pomocą kleszczy delikatnie popchnij lub przeciągnij izolowane nacięcie do środka szkiełka nakrywkowego i obróć tak, aby wewnętrzna strona była skierowana do góry. Nigdy nie usuwaj tkanki z kropli.
UWAGA: Konieczne jest odsunięcie notum od pierwotnego miejsca sekcji, aby uniknąć zasłaniania próbki przez resztki kleju podczas późniejszego obrazowania. - Przytrzymaj nacięcie kleszczami, wciskając się w część brzuszną lub głowę. Używając pary ostrych kleszczy i/lub delikatnych wydaleń 1x PBS z pipety 200 μl, usuń wszelkie pozostałe ciała tłuszczowe, pasma mięśniowe lub hemolimfę (jeśli są obecne), aby całkowicie odsłonić nabłonek jednowarstwowy i wyrównać ewentualne barwienie. Rozcięte notum powinno wyglądać tak, jak w Rysunek 3A.
- Gdy tkanka jest czysta, użyj pipety o pojemności 200 μl, aby usunąć jak najwięcej roztworu PBS (wraz z resztkami i brzuszną częścią poczwarki), monitorując za pomocą lunety preparcyjnej, aby uniknąć zasysania wycinki.
- Po usunięciu większości płynu użyj chłonnej chusteczki, aby ostrożnie zetrzeć resztę kleju i poczwarki, a także wszelkie inne zanieczyszczenia, które pozostają na szkiełku nakrywkowym.
UWAGA: Jeśli na szkiełku nakrywkowym pozostanie trochę kleju, nie spowoduje to problemu, o ile jest cieńsze niż sama tkanka grzbietowa. - Dodać 150-200 μL 4% PFA (w 1x PBS) i utrwalać przez 20 minut w temperaturze pokojowej. W zależności od prędkości rozwarstwienia, podczas utrwalania pierwszej poczwarki można wypreparować 1 lub więcej poczwarek.
- Usuń PFA i zastąp go 1x PBS, aby umyć notum raz przez 30 sekund.
- Jeśli przystępujesz do barwienia przeciwciałami, wykonaj 5-minutowe płukanie (3 razy) w 1x PBS lub 1x PBST (plik uzupełniający 1), aby przeniknąć do tkanki, jeśli antygen jest wewnątrzkomórkowy.
- Przechowywać próbkę w 1x PBS + 0,02% NaN3 przez noc w wilgotnej komorze lub, jeśli planowane jest barwienie tkanki, inkubować przez noc w roztworze blokującym (plik uzupełniający 1).
3. Barwienie notum
UWAGA: Do barwienia za pomocą przeciwciał lub barwienia komórkowego postępuj zgodnie z poniższymi krokami. -Notum nie może być usuwany z roztworu, ponieważ prawdopodobnie spowoduje to zwijanie się tkanki. W związku z tym należy dostosować protokoły barwienia do przeprowadzania w całości na szkiełku nakrywkowym i przechowywać w wilgotnej komorze przez dowolny czas dłuższy niż 5 minut. Monitorowanie próbek pod mikroskopem preparacyjnym może pomóc w zapobieganiu przypadkowemu zachłyśnięciu tkanki podczas mycia.
- Aby uwidocznić granice komórek, inkubować w 200 μl pierwszorzędowego mysiego przeciwciała IgG2a anty-FasIII (patrz tabela materiałów) w stężeniu 1:8 rozcieńczonym w buforze blokującym + 0,02% NaN3 przez noc w temperaturze 4 °C.
- Wypłukać nadmiar przeciwciał pierwszorzędowych (3 razy) 200 μl 1x PBS + 0,02% NaN3 przez 1 godzinę na pranie w temperaturze pokojowej.
- Przeprowadzić wtórną inkubację przeciwciał z 200 μl anty-mysiego IgGa2 o stężeniu 1:200 w Cy3 w buforze blokującym + 0,02% NaN3 przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
- Wypłukać nadmiar przeciwciał drugorzędowych (3 razy) 200 μl 1x PBS + 0,02% NaN3 przez 1 godzinę na pranie w temperaturze pokojowej.
- Aby uwidocznić jądra, inkubuj próbki w 1 μg/ml DAPI przez 45 minut, aby dać wystarczająco dużo czasu na przeniknięcie plamy przez pasma mięśniowe; utrwalenie w podłożu montażowym zawierającym DAPI nie jest skuteczne w przypadku tej tkanki.
- Nadmiar DAPI wypłukać (3 razy) 200 μl 1x PBS + 0,02% NaN3 przez 5 minut na pranie w temperaturze pokojowej, a następnie pozostawić w 200 μl 1x PBS + 0,02% NaN3 na noc w temperaturze 4 °C lub natychmiast zamontować.
4. Montaż i wizualizacja notum
- Po barwieniu przygotować nowy szkiełko nakrywkowe (topper) 24 × 60 z podporami.
UWAGA: Ponieważ notum ma kształt kopuły, całkowite jego spłaszczenie powoduje zniekształcenie pomarszczonej tkanki. Utworzenie szczeliny między dwoma szkiełkami nakrywkowymi pozwala notum zachować swój normalny kształt. - Stwórz szczelinę ~200 μm, używając przekładek wykonanych z szkiełek nakrywkowych 22 x 22 (grubość nr 0, grubość ~100 μm), przyklejonych w odległości ~1 cm od siebie lakierem do paznokci na środku toppera.
- Aby przylegać, umieść przekładki na topperze i pomaluj dystalne krawędzie przekładek cienką warstwą lakieru do paznokci. Pozostaw do wyschnięcia.
UWAGA: Używaj tylko lakieru do paznokci, który jest cienki i rzadki; Gruby lakier do paznokci doda niepotrzebnie dodatkowej przestrzeni między szkiełkiem nakrywkowym a topperem. - Usunąć z próbki jak najwięcej roztworu wodnego.
- Natychmiast nanieść dwie krople (~100 μl) środka montażowego zapobiegającego blaknięciu (patrz tabela materiałów) na próbkę.
- W razie potrzeby użyj czystych, ostrych kleszczyków, aby umieścić notum na środku kropli medium montażowego zapobiegającego blaknięciu.
- Umieść szkiełko nakrywkowe z nacięciem na wsporniku o wymiarach ~10 x 40 mm, takim jak kawałek cienkiej pianki (wyciętej z materiału opakowaniowego wewnątrz pudełek nakrywkowych), aby podnieść próbkę, aby nie przylegała do powierzchni roboczej.
- Pod lunetą sekcyjną powoli opuść nakładkę na próbkę. Gdy środek montażowy zapobiegający blaknięciu zetknie się z nakładką, delikatnie zwolnij i pozwól, aby działanie kapilarne pociągnęło nakładkę w dół.
UWAGA: W ciągu pierwszych kilku sekund można dokonać drobnych korekt pozycji szkiełka nakrywkowego bez uszkadzania notum. - Umieść kolejny kawałek pianki na nakładce i użyj standardowego szkiełka mikroskopowego jako obciążnika, aby delikatnie nakłonić środek mocujący zapobiegający blaknięciu między szkiełkiem nakrywkowym próbki, nakładką i przekładkami.
- Po 5-10 minutach użyj chłonnej chusteczki, aby usunąć nadmiar środka montażowego zapobiegającego blaknięciu, delikatnie dotykając krawędzi szkiełka nakrywkowego.
- Delikatnie nałóż lakier do paznokci na każdy róg szkiełek nakrywkowych, aby je ze sobą skleić. Po wyschnięciu pomaluj wszystkie krawędzie szkiełek nakrywkowych, aby uszczelnić. Unikaj najpierw powlekania wszystkich krawędzi, ponieważ może to często przesunąć szkiełko nakrywkowe i uszkodzić tkankę grzbietową.
- Uwidocznić notum pod mikroskopią fluorescencyjną (patrz Tabela materiałów) przez stronę grzbietową i/lub brzuszną.
Wyniki
Przedstawiona technika sprawdza się w przypadku nienaranionego notum (Rycina 1A-D), umożliwiając badanie rozwoju i homeostazy tkanki, np. powstawania poliploidalnych komórek mechanosensorycznych szczecinek18 lub przepływu komórek nabłonkowych z kierunku przedniego do tylnego10. Protokół ten można również zastosować do notum poddanego ablacji laserowej (Rycina 1E-L), gdzie odpowiedź komórkową na uraz można analizować na żywo z wykorzystaniem endogennych fluoroforów, takich jak Histone2-EGFP (Rycina 1B,F,J). Barwienie immunohistochemiczne po utrwaleniu (krok 3) może ujawnić wiele struktur, takich jak Fascicylina III, która znakuje granice komórek (Rycina 1C,G,K). Dodatkowo do oceny zmian w zawartości DNA, w tym poliploidalności indukowanej urazem22, można zastosować barwienia ilościowe, takie jak DAPI (Rycina 1A,E,I).
Niniejszy protokół jest szczególnie korzystny, ponieważ może być stosowany po długotrwałych eksperymentach z obrazowaniem na żywo. Ponieważ poczwarki są nieruchome, można je obrazować przez wiele godzin (Rysunek 4A,B). Co istotne, protokół ten nie powoduje znaczących zmian w ogólnej architekturze ani morfologii nabłonka rany po sekcji (Rysunek 4B,C). Dzięki temu cechy tkanki mogą być obrazowane w trybie długoterminowym, a następnie poddane dalszej analizie za pomocą immunohistochemii lub barwień komórkowych.
Obrazowanie głębokich struktur tkankowych jest skomplikowane ze względu na ich nieprzezroczystość, a muszki Drosophila są pokryte woskową kutykulą8, co jeszcze bardziej utrudnia głębokie obrazowanie. Jednak dzięki tej technice wypreparowane notum można umieścić między dwiema lalkami szkieł Coverglass, co umożliwia obrazowanie monowarstwy nabłonka z obu stron: strony apikalnej przez kutykulę (Rysunek 5A-D) i/lub strony bazalnej nabłonka skierowanej w stronę jam ciała (Rysunek 5E-H). Te różne perspektywy są idealnie dostosowane do wizualizacji różnych struktur w obrębie tkanki. Na przykład widok apikalny jest idealny do wizualizacji granic komórek nabłonkowych i jąder położonych tuż pod kutykulą (Rysunek 5A-D). W widoku bazalnym sygnały apikalne są mniej widoczne (Rysunek 5E-H). Jednakże w widoku bazalnym można zaobserwować struktury bazalne na brzegu rany (Rysunek 5J,L żółte i białe strzałki). Struktury bazalne są znacznie jaśniejsze, ponieważ w widoku bazalnym występuje mniejsza przeszkoda niż w widoku apikalnym.
Rycina 1: Wypreparowane, utrwalone i barwione nota poczwarki Drosophila. (A-D) Notum nieuszkodzone. (E-H) Notum uszkodzone 30 min po ablacji laserowej. (I-L) Notum uszkodzone 3 h po ablacji laserowej. (A,E,I) Barwienie DAPI pokazuje jądra komórkowe. (B,F,J) Transgeniczna Histone2-EGFP, stosowana w obrazowaniu żywych komórek, jest widoczna po utrwaleniu i barwieniu. (C,G,K) Przeciwciało przeciwko FasIII pokazuje, że barwienie przeciwciałami działa prawidłowo na utrwalonym notum. (D,H,L) Obraz z nałożonymi kanałami. Obrazy zostały zarejestrowane za pomocą obiektywu 40x przy użyciu mikroskopii konfokalnej z dyskiem rotującym (spinning disc microscopy); przedstawiono maksymalne projekcje intensywności stosów Z z warstwami Z o grubości 0,3 µm. A-D reprezentuje 263 warstw Z. E-H reprezentuje 195 warstw. I-L reprezentuje 53 warstwy Z. Pomarańczowa przerywana linia oznacza margines rany. Pasek skali na obrazie L wynosi 25 µm i odnosi się do obrazów A-L. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Ułożenie dłoni podczas dyssekcji notum. (A-B) Widok z lewej i prawej strony ułożenia dłoni podczas trzymania nożyczek do mikrodysekcji. Aby zapobiec drżeniu rąk, szyjkę nożyczek opiera się o środkowy palec niedominującej ręki. Nożyczki muszą być ustawione równolegle do szkiełka mikroskopowego, aby uniknąć odkształcenia tkanki notum. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Prawidłowo wypreparowane notum vs. zwinięte notum. (A) Notum poczwarki po wypreparowaniu i oczyszczeniu, rozprostowane i gotowe do fiksacji. (B) Notum poczwarki zwinięte po wyjęciu z 1x PBS, co czyni je bezużytecznym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 4: Obrazy przed i po utrwaleniu są w dużej mierze podobne. Przedstawiono obrazowanie notum poczwarki wykazującej ekspresję Histone2-EGFP w jądrach komórkowych (A) na żywo przed ablacją oraz (B) 3 h po ablacji laserowej. (C) Notum zostało pobrane, wypreparowane i utrwalone zgodnie z protokołem, a następnie ponownie obrazowane po utrwaleniu. Miejsce zranienia zaznaczono czerwoną gwiazdką. Obrazy wykonano przy użyciu obiektywu 40x w mikroskopii dysku wirującego (spinning disc), z przekrojami Z co 0,3 µm. Pokazano projekcje maksymalnej intensywności dla 34 przekrojów Z przed zranieniem (A), 48 przekrojów Z 3 h po zranieniu (B) oraz 103 przekrojów Z po preparacji, utrwaleniu i barwieniu (C). Pasek skali na obrazie C wynosi 25 µm i odnosi się do obrazów A-C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5: Obrazowanie stron apikalnej i bazalnej zranionego notum. Na wszystkich panelach przedstawiono to samo zranione notum poczwarki. Rana jest zaznaczona czerwoną gwiazdką. Pomarańczowa linia przerywana wskazuje brzeg rany. (A-D) Notum jest obrazowane od strony apikalnej, przez kutykulę. (E-H) Notum jest obrazowane od bazalnej strony wewnętrznej. (I-L) Górne panele przedstawiają obraz X-Z notum, stroną apikalną do góry, z warstwą nabłonkową oznaczoną białym trójkątem. Pomarańczowa linia oznacza płaszczyznę apikalno-bazalną przekroju X-Y, pokazanego na dolnych panelach. Na dolnych panelach pomarańczowa linia wskazuje płaszczyznę powyższego obrazu X-Z. (I) Notum obrazowane apikalnie – przekrój apikalny. Górny widok X-Z pokazuje precyzyjne obrazowanie apikalnej warstwy nabłonkowej (biały trójkąt). Widok ten odpowiada widokowi w obrazowaniu na żywo. (J) Notum obrazowane apikalnie – przekrój bazalny, częściowo przesłonięty przez tkankę apikalną. Na stronie bazalnej widoczne są inne tkanki oznaczone żółtą strzałką (prawdopodobnie pasmo mięśniowe) i białymi strzałkami (prawdopodobnie komórki krwi). (K) Notum obrazowane bazalnie – przekrój apikalny, częściowo przesłonięty przez tkankę bazalną i strup rany (ciemny obszar centralny). (L) Notum obrazowane bazalnie – przekrój bazalny. Ten widok najlepiej ukazuje tkanki bazalne oznaczone żółtymi i białymi strzałkami. A,E: barwienie DAPI, B,F: Histone-EGFP, C,G: barwienie FasIII. Obrazy zostały zarejestrowane przy użyciu obiektywu 20x w mikroskopii z dyskiem wirującym. Przekroje Z wykonywano co 0.9 µm. A-D przedstawia maksymalną projekcję intensywności z 19 przekrojów. E-H przedstawia maksymalną projekcję intensywności z 17 przekrojów. Paski skali 25 µm w D,H,L odnoszą się odpowiednio do A-D, E-H, I-L. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Plik uzupełniający 1: Przygotowanie roztworów i buforów. Szczegółowo opisano przepisy na następujące roztwory: 1xPBS, 1x PBST, roztwór blokujący oraz utrwalacz z paraformaldehydem. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Kroki krytyczne
Optymalizacja trzech kroków znacznie zwiększy sukces tego protokołu. Po pierwsze, w kroku 1.5, oszczędzaj klej samoprzylepny nałożony na szkiełko nakrywkowe. Jeśli doda się zbyt dużo kleju adhezyjnego, poczwarki mogą zostać zakopane w grubej warstwie zestalonego kleju klejącego, co uniemożliwi rozwarstwienie, a jeśli zakryje samo notum, klej zasłania światło z próbki. Po drugie, podczas kroków 2.3-2.6 upewnij się, że usunięto tylko górną kopułę notum, wykluczając jak największą część tkanki bocznej. Jeśli zostanie dołączona, tkanka boczna zostanie ściśnięta podczas montażu i spowoduje, że środek nacięcia wygina się do wewnątrz, często umieszczając go poza odległością roboczą obiektywów o dużej aperturze numerycznej. Po trzecie, na etapie czyszczenia 2.9 należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić nabłonka jednowarstwowego. Jeśli w tkance brakuje dużych części lub nie można wykryć żadnego sygnału, ten krok może być winny.
Rozwiązywanie problemów
Problem 1: Po zamontowaniu poczwarka odchodzi od taśmy dwustronnej podczas sekcji. Jest to częsty problem, szczególnie dla początkujących. Najlepszym lekarstwem jest upewnienie się, że zewnętrzna strona pudełka poczwarki jest całkowicie sucha/wolna od resztek jedzenia. Wyjmowanie jedzenia za pomocą kleszczy i pozostawienie etui do wyschnięcia na powietrzu przez 10-15 minut pomoże przykleić się do taśmy. Alternatywnie użyj niedominującej ręki i pary kleszczy, aby przytrzymać poczwarki przy taśmie podczas sekcji. Jeśli problem będzie się powtarzał, nałożenie małej kropli lakieru do paznokci o pojemności 5-10 μl na podstawę tylnego końca etui i pozostawienie go do stwardnienia na ogół zapewnia wystarczającą przyczepność nawet dla najbardziej nierozsądnych poczwarek.
Problem 2: Notum zapada się podczas kroku 2.3 lub początkowe naruszenie powłoki nie jest płynne. Jeśli powłoka jest trudna do złamania, może być za dużo kleju z etapów unieruchomienia. Umieszczenie wypreparowanych poczwarek w mniej adhezyjnym kleju poprawi ten problem. Ponadto upewnij się, że nożyczki do mikrodysekcji są ostre. nożyczki nie będą w stanie przeciąć powłoki i mają tendencję do powodowania jej zapadania się do środka. Gdy hemolimfa wyleje się z poczwarek, upewnij się, że jedno z ostrzy tnących może wejść do poczwarki, nie powodując deformacji nacięcia. Jeśli nacięcie zapadnie się, a ostrze nie wejdzie w poczwarkę, kontynuuj cięcie, aż ostrze wejdzie w poczwarkę.
Problem 3: W kroku 2.4 nożyczki chwytają lub przeciągają powłokę. Jeśli nożyczki zaczynają chwytać lub ciągnąć powłokę, często pomaga przełączenie się na przeciwną stronę poczwarki i przystąpienie do "poluzowania" powłoki. Dalsze nożyczki do mikrodysekcji utrudnią uzyskanie czystych cięć przez powłokę i należy użyć zaostrzonych nożyczek.
Problem 4: Próbka zostaje przypadkowo zassana podczas barwienia (kroki 3.1-3.6). Wypreparowane notum jest trudne do zobaczenia, ponieważ jest przezroczyste. Pomocne może być umieszczenie ciemnoniebieskiego lub czarnego arkusza pod szkiełkiem nakrywkowym, aby zapewnić kontrast (dobrze sprawdza się stary stojak na końcówki do pipet). Dodatkowo wszystkie zmiany roztworu mogą być wykonywane pod mikroskopem preparacyjnym.
Problem 5: Nie wykryto żadnego sygnału/wykryto niejednolity sygnał. Po wykluczeniu problemów związanych z plamami, jeśli nie zostanie wykryty żaden sygnał lub jest on niejednolity, prawdopodobnie winowajcą jest krok 2.9 (czyszczenie). Brak lub niejednolity sygnał może pochodzić z uszkodzenia i usunięcia tkanki nabłonkowej podczas czyszczenia. I odwrotnie, słaby sygnał może być spowodowany okluzją z pasm mięśniowych / komórek tłuszczowych, jeśli nie zostaną one usunięte, ponieważ mogą ograniczyć dyfuzję barwników i przeciwciał do notum w stosunku do otaczającej tkanki. Jeśli tkanka jest uszkodzona, najlepszym rozwiązaniem jest delikatniejsza podczas czyszczenia. Jeśli natomiast plama jest widoczna, ale niejednolita, zaleca się zwiększenie wigoru/czasu poświęconego na etap czyszczenia, aby usunąć jak najwięcej mięśni i tkanki tłuszczowej. Co więcej, wydłużenie czasu trwania plamy może pomóc rozwiązać ten problem dzięki lepszemu czyszczeniu.
Problem 6: Tkanka notum ma zniekształcony/pomarszczony wygląd podczas obrazowania. Wypaczanie i marszczenie tkanki pochodzi z dwóch źródeł. Po pierwsze, ściśnięcie wycięcia podczas montażu spowoduje jego wygięcie i wypaczenie. Najlepszym rozwiązaniem jest usunięcie jak największej ilości tkanek bocznych, tak aby kopuła była jak najkrótsza i mogła zmieścić się między przekładkami szkiełka nakrywkowego. Po drugie, jeśli notum zostanie wygięte podczas sekcji, to zagięcie to nie wyprostuje się podczas montażu, dlatego należy zachować szczególną ostrożność, aby nie wypaczyć notum podczas sekcji. Przypadkowe zgięcie notum jest najczęstsze podczas odcinania powłoki od reszty poczwarek. Kuszące jest, aby nożyczki preparacyjne były ustawione pod kątem w stosunku do poczwarek, zamiast trzymać je w płaszczyźnie próbki jak poczwarki. Jednak nożyczki ustawione pod kątem powodują, że powłoka wygina się do góry podczas cięcia, zamiast pozostać płaska.
Istniejące metody, ograniczenia i przyszłe zastosowania
Wang i wsp.20 opisali porównywalny protokół preparacyjny do izolacji nabłonka poczwarki. Technika ta wymaga, aby poczwarka pozostała w swoim etui i została szybko przecięta skalpelem. Protokół ten jest niekompatybilny z wcześniej obrazowanymi próbkami na żywo, ponieważ obrazowanie na żywo wymaga usunięcia dużej części koperty poczwarki. Ponieważ poczwarki nie są sztywne, bisekcja poczwarki poza obudową zniekształciła tkankę, inspirując stworzenie tego protokołu. Opisana tutaj technika pozwala na izolację i utrwalenie notum i może być wykorzystana jako pierwszy krok dla szerokiej gamy innych metod, takich jak kriosekcja, hybrydyzacja in situ lub mikroskopia elektronowa.
Ta technika ma pewne ograniczenia. Po pierwsze, preparowanie, utrwalanie i barwienie notum jest bardziej czasochłonne niż obrazowanie na żywo fluorescencyjnie znakowanych białek w notum, co wymaga jedynie prostej sekcji w celu usunięcia przypadku poczwarki 9,23. Po drugie, w porównaniu z sekcjami innych tkanek Drosophila, ta sekcja jest trudniejsza ze względu na cienką, delikatną tkankę i hydrofobowy naskórek. Aby po prostu uwidocznić białka w nabłonku Drosophila, łatwiej jest przeprowadzić immunohistochemię na utrwalonych zarodkach, krążkach skrzydeł larw lub jajnikach. Jednak ta technika pozwala na połączenie mocy obrazowania na żywo z utrwalaniem i barwieniem, co czyni ją potężnym narzędziem po opanowaniu.
Technika preparacji/fiksacji ma pewne zalety w porównaniu z obrazowaniem na żywo. Struktury podstawowe (wewnętrzne) można lepiej rozwiązać za pomocą widoku podstawowego (ryc. 5L,J). Co najważniejsze, obrazowanie na żywo jest ograniczone do fluoroforów, które muszą być dostarczane genetycznie, co często wymaga długotrwałych schematów krzyżowania genetycznego. W przeciwieństwie do tego, obecny protokół pozwala na zastosowanie barwienia, immunohistochemii i innych technik, które wymagają sekcji i utrwalenia. To znacznie zwiększa liczbę sygnałów sondowanych w tkance, jednocześnie potencjalnie skracając czas oczekiwania na wyniki eksperymentalne.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Dr. M. Shane'owi Hutsonowi za stworzenie systemu ablacji laserowej używanego do ranienia poczwarek oraz jego wkład i opinie na temat rozwoju protokołu. Prace te były wspierane przez 1R01GM130130 dla APM i M. Shane'a Hutsona. JW był wspierany przez 2T32HD007502-21.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ½ ” Taśma dwustronna Scotch | Permanent Scotch 3M | 665 | |
| 0,1-10 &mikro; L uTIP końcówka do pipet | Biotix | M-0011-9FC | |
| 22 x 22 mm grubość nr 0 szkiełka nakrywkowe | Thomas Scientific | 1207Z28 | |
| 24 x 60 mm szkiełko nakrywkowe | Corning | 2980-246 | |
| 3M VetBond | 3M | 1469SB | Nazywane "klejem adhezyjnym" w protokole |
| Anti-FasIII pierwotne badania rozwojowe myszy IgG2a | Bank hybrydomy | 7G10 | |
| Chlorek wapnia | Fisher Chemical | c79-500 | |
| Cy3-sprzężony AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG2a | Jackson ImmunoResearch | 115-165-206 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-1mg | |
| Dumont #5 Kleszcze z drobną końcówką | Fine Science Tools | nr 11254-20 | |
| Dumont #5 Kleszcze z drobną końcówką: Blunt | Fine Science | Tools No. 11254-20 | Mocno używane i nienaostrzone kleszcze lub stępione osełką |
| Fisherbrand Podwójnie matowe szkiełka mikroskopowe | Fisher Scientific | 22-034-486 | |
| Fluorescencyjne źródło światła | Lumencor | Celesta 90-10512 | |
| Fly Stock: Histone H2A z tagiem EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 24163 | |
| Zatyczki piankowe do fiolek na muchy "Flugs" | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Komora nawilżana: Owinięty folią mały pojemnik wyłożony bibułą filtracyjną nasyconą wodą | Cole-Parmer | 759075D | Świetną nawilżoną komorę można wykonać ze styropianowego pudełka zawierającego kuwety Cole-Parmer, 759075D, wypełnionego 50 ml wody. |
| KimWipe | KimTech | 34155 | Nazywany "tkanką chłonną" w protokole |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Eclipse Ti2-E | |
| NIS Elements Software | Nikon | AR | |
| Parafilm | Pechiney Plastikowe opakowanie | PM-996 | |
| Paraformaldehyd (PFA) 16% | Ted Pella, Inc | 18505 | |
| Plastikowe fiolki | Genesee Scientific | 32-114 | |
| Azydek sodu (NaN3) | Fisher Scientific | 19038-1000 | |
| Stereofoniczny mikroskop do mikrodysekcji | Carl Zeiss | STEMI 2000 | |
| Vannas Nożyczki sprężynowe | Narzędzia do nauki | 15000-00 | Nowe lub świeżo naostrzone nożyczki |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | Nazywany "medium montażowym zapobiegającym blaknięciu" w protokole |
| Vecta Shield z DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Nie jest idealny dla poczwarki. |
| X-Light V2 Wirujący dysk | Crest Optyka | V2 L-FOV |
Bibliografia
- Valon, L., et al. Robustness of epithelial sealing is an emerging property of local ERK feedback driven by cell elimination. Developmental Cell. 56 (12), 1700-1711 (2021).
- Levayer, R., Dupont, C., Moreno, E. Tissue crowding induces caspase-dependent competition for space. Current Biology. 26 (5), 670-677 (2016).
- Couturier, L., et al. Regulation of cortical stability by RhoGEF3 in mitotic sensory organ precursor cells in Drosophila. Biology Open. 6 (12), 1851-1860 (2017).
- Couturier, L., Mazouni, K., Corson, F., Schweisguth, F. Regulation of Notch output dynamics via specific E(spl)-HLH factors during bristle patterning in Drosophila. Nature Communications. 10, 3486(2019).
- Fujisawa, Y., Shinoda, N., Chihara, T., Miura, M. ROS regulate caspase-dependent cell delamination without apoptosis in the drosophila pupal notum. iScience. 23, 101413(2020).
- Besson, C., et al. Planar cell polarity breaks the symmetry of par protein distribution prior to mitosis in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 25 (8), 1104-1110 (2015).
- Koto, A., Kuranaga, E., Miura, M. Apoptosis ensures spacing pattern formation of drosophila sensory organs. Current Biology. 21, 278-287 (2011).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
- Moreira, C., Regan, J., Zaidman-Rémy, A., Jacinto, A., Prag, S. Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration. Methods in Molecular Biology. 769, Clifton, N.J. 249-260 (2011).
- Guirao, B., et al. Unified quantitative characterization of epithelial tissue development. Elife. 4, 08519(2015).
- Cristo, I., Carvalho, L., Ponte, S., Jacinto, A. Novel role for Grainy head in the regulation of cytoskeletal and junctional dynamics during epithelial repair. Journal of Cell Science. 131 (17), 213595(2018).
- Bellaïche, Y., Gho, M., Kaltschmidt, J. A., Brand, A. H., Schweisguth, F. Frizzled regulates localization of cell-fate determinants and mitotic spindle rotation during asymmetric cell division. Nature Cell Biology. 3 (1), 50-57 (2001).
- Shannon, E. K. Multiple mechanisms drive calcium signal dynamics around laser-induced epithelial wounds. Biophysical Journal. 113 (7), 1623-1635 (2017).
- O'Connor, J. T., et al. Proteolytic activation of Growth-blocking peptides triggers calcium responses through the GPCR Mthl10 during epithelial wound detection. Developmental Cell. 56 (15), 2160-2175 (2021).
- Hartenstein, V., Posakony, J. W. Development of adult sensilla on the wing and notum of Drosophila melanogaster. Development. 107 (2), 389-405 (1989).
- Yeh, E., Zhou, L., Rudzik, N., Boulianne, G. L. Neuralized functions cell autonomously to regulate Drosophila sense organ development. The EMBO Journal. 19 (17), 4827-4837 (2000).
- Loubéry, S., et al. Uninflatable and notch control the targeting of sara endosomes during asymmetric division. Current Biology. 24 (18), 2142-2148 (2014).
- Kawamori, A., Shimaji, K., Yamaguchi, M. Dynamics of endoreplication during Drosophila posterior scutellar macrochaete development. PLoS One. 7 (6), 38714(2012).
- Couturier, L., Schweisguth, F. Notch Signaling: Methods and Protocols. Bellen, H. J., Yamamoto, S. , Springer. New York. 79-86 (2014).
- Wang, W., Yoder, J. H. Drosophila pupal abdomen immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. (56), e3139(2011).
- Kiehart, D. P., et al. Cell Biology (Third Edition). Celis, J. E., et al. , Academic Press. 87-103 (2006).
- Bailey, E. C., Dehn, A. S., Gjelsvik, K. J., Besen-McNally, R., Losick, V. P. A Drosophila model to study wound-induced polyploidization. Journal of Visualized Experiments. (160), e61252(2020).
- O’Connor, J. T., S, E. K., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. Mounting Drosophila pupae for laser ablation and live imaging of the dorsal thorax. STAR Protocols. , (2022).
Przedruki i uprawnienia
